JPS58126797A - ジサツカライドトリペプチド及びジサツカライドテトラペプチドの製法 - Google Patents
ジサツカライドトリペプチド及びジサツカライドテトラペプチドの製法Info
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- JPS58126797A JPS58126797A JP57009237A JP923782A JPS58126797A JP S58126797 A JPS58126797 A JP S58126797A JP 57009237 A JP57009237 A JP 57009237A JP 923782 A JP923782 A JP 923782A JP S58126797 A JPS58126797 A JP S58126797A
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- disaccharide
- streptomyces
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- C07K—PEPTIDES
- C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
- C07K9/005—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure containing within the molecule the substructure with m, n > 0 and m+n > 0, A, B, D, E being heteroatoms; X being a bond or a chain, e.g. muramylpeptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、免疫増強作用、非特異的感染防御作用等を有
する有用なジサッカライドトリペプチド及びジサッカラ
イドテトラペプチドの製法に関するものである。
する有用なジサッカライドトリペプチド及びジサッカラ
イドテトラペプチドの製法に関するものである。
細菌細胞壁の構築単位であるペプチドグリカンが免疫増
強作用を有することはよく知られている〔生化学４８．
ｔｏ８１〜１１０７（１９７６） ）。従来、細菌細
胞壁に溶菌酵素を作用させて免疫増強作れた水溶性ペプ
チドグリカンは、種々の分子量のペプチドグリカンの混
合物であって、製造ととにその組成が異なり、従ってそ
の作用の強さも製造ごとに変動する。
強作用を有することはよく知られている〔生化学４８．
ｔｏ８１〜１１０７（１９７６） ）。従来、細菌細
胞壁に溶菌酵素を作用させて免疫増強作れた水溶性ペプ
チドグリカンは、種々の分子量のペプチドグリカンの混
合物であって、製造ととにその組成が異なり、従ってそ
の作用の強さも製造ごとに変動する。
米国特許第４，１８６，１９４号には、他の低分子ペプ
チドグリカンとともに、一般式（Ｉ）又は（１）Ｎ−Ａ
ｃＧｌｃ−Ｎ−Ａｃｙ ｌ−Ｍｕｒ喜 （’Ｉ ） 「 ｍｅｓｏ−ＤＡＰ −Ａｌａ Ｎ−ＡｃＧｌｃ−Ｎ−Ａｃｙｌ−Ｍｕｒ（式中、Ｎ−Ａ
ｃＧＩｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を、 Ｎ−
Ａｃｙｌ−ＭａｒはＮ−アシルムラミル基を、Ｌ−Ａｌ
ａはＬ−アラニル基ｆ、Ｄ−ＧｌｕはＤ−グルタミル基
を、ｍｅ ｓｏ −ＤＡ Ｐはメン−２，６−ジアミノ
ピメリル基又はメン−２，６−ジアミノピメリン酸を、
Ｄ−ＡｌａはＤ−アラニンを意味する。但し、Ｄ−グル
タミン及び／又はメソ−２，６−ジアミノピメリン酸残
基におけるカルボキシ基は遊離の形であってもアミド化
されていてもよい。） で表わされる化合物が単一物質として開示され、それら
が免疫増強作用を有すると述べられている。その製法と
して、ミコバクテリア、ノカルジア又は大腸菌の細胞壁
に溶菌酵素を作用させる方法が開示されている。しかし
具体的には。
チドグリカンとともに、一般式（Ｉ）又は（１）Ｎ−Ａ
ｃＧｌｃ−Ｎ−Ａｃｙ ｌ−Ｍｕｒ喜 （’Ｉ ） 「 ｍｅｓｏ−ＤＡＰ −Ａｌａ Ｎ−ＡｃＧｌｃ−Ｎ−Ａｃｙｌ−Ｍｕｒ（式中、Ｎ−Ａ
ｃＧＩｃはＮ−アセチルグルコサミニル基を、 Ｎ−
Ａｃｙｌ−ＭａｒはＮ−アシルムラミル基を、Ｌ−Ａｌ
ａはＬ−アラニル基ｆ、Ｄ−ＧｌｕはＤ−グルタミル基
を、ｍｅ ｓｏ −ＤＡ Ｐはメン−２，６−ジアミノ
ピメリル基又はメン−２，６−ジアミノピメリン酸を、
Ｄ−ＡｌａはＤ−アラニンを意味する。但し、Ｄ−グル
タミン及び／又はメソ−２，６−ジアミノピメリン酸残
基におけるカルボキシ基は遊離の形であってもアミド化
されていてもよい。） で表わされる化合物が単一物質として開示され、それら
が免疫増強作用を有すると述べられている。その製法と
して、ミコバクテリア、ノカルジア又は大腸菌の細胞壁
に溶菌酵素を作用させる方法が開示されている。しかし
具体的には。
ミコバクテリウム・スメグマチスの脱脂細胞壁にリゾチ
ーム及びムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（ミキソバ
クターＡＬ、由来）を作用させて得られる。ペプチドグ
リカン３両分のうちの最も低分子の両分を更に調整用電
気泳動に付して、式（Ｉ）においてＡｃｌがグリコリル
基、グルタミル基及びメソ−２，６−ジアミノピメリン
基のカルボキシ基がアミド化された物質を得たと述べて
いるにすぎない。大腸菌の細胞壁から調製した不溶性ペ
プチドグリカンにリゾチームを作用させた例でも、得ら
れるペプチドグリカン３画分のうちの最も低分子の画分
が、ジサッカライドテトラペプチド及びジサッカライド
トリペプチドの混合物であると述べているだけである。
ーム及びムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ（ミキソバ
クターＡＬ、由来）を作用させて得られる。ペプチドグ
リカン３両分のうちの最も低分子の両分を更に調整用電
気泳動に付して、式（Ｉ）においてＡｃｌがグリコリル
基、グルタミル基及びメソ−２，６−ジアミノピメリン
基のカルボキシ基がアミド化された物質を得たと述べて
いるにすぎない。大腸菌の細胞壁から調製した不溶性ペ
プチドグリカンにリゾチームを作用させた例でも、得ら
れるペプチドグリカン３画分のうちの最も低分子の画分
が、ジサッカライドテトラペプチド及びジサッカライド
トリペプチドの混合物であると述べているだけである。
従って、単一物質を単離・精製したというにはほど遠い
。
。
従来、細菌細胞壁のペプチドサブユニット間のＤ−アラ
ニル−メソ−２，６−ジアミノピメリン酸結合を特異的
に開裂するＤ−アラニル−メン−２，６−ジアミノピメ
リン酸エンドペプチダーゼ（以下エンドペプチダーゼと
記す）、として、ストレプトミセスｓｐ、Ｌ−３産生酵
素が知られているＣ Ｂｉｋｅｎ ＪｏｕｒｎａＩ １
９ 、７５−９１（１９７６）Ｌ しかし後記参考例か
ら明らかなように、この菌株のエンドペプチダーゼ産生
能は極めて低く、実用に供し得る量のエンドペプチダー
ゼを得るのは困難であった。
ニル−メソ−２，６−ジアミノピメリン酸結合を特異的
に開裂するＤ−アラニル−メン−２，６−ジアミノピメ
リン酸エンドペプチダーゼ（以下エンドペプチダーゼと
記す）、として、ストレプトミセスｓｐ、Ｌ−３産生酵
素が知られているＣ Ｂｉｋｅｎ ＪｏｕｒｎａＩ １
９ 、７５−９１（１９７６）Ｌ しかし後記参考例か
ら明らかなように、この菌株のエンドペプチダーゼ産生
能は極めて低く、実用に供し得る量のエンドペプチダー
ゼを得るのは困難であった。
本発明者らは、溶菌酵素として実用に供するに充りな量
のエンドペプチダーゼを得るべく鋭意研究を重ねた結果
、上記ストレプトミセスｓｐ。
のエンドペプチダーゼを得るべく鋭意研究を重ねた結果
、上記ストレプトミセスｓｐ。
Ｌ−３ｉエンドペプチダーゼ産生能の優れた菌株ストレ
プトミセス・ニトロスポレウスＳＫに変異させること、
及びストレプトミセス・グリビスポラスの培養液から高
活性の新規なエンドペプチダーゼを好収率で得ることに
成功し、これらに基づいて本発明を完成した。
プトミセス・ニトロスポレウスＳＫに変異させること、
及びストレプトミセス・グリビスポラスの培養液から高
活性の新規なエンドペプチダーゼを好収率で得ることに
成功し、これらに基づいて本発明を完成した。
本発明は、細胞壁構築成分として、アミン基がアセチル
化されたムラミン酸部分、イングルタミン及びアミド化
されたカルボキシ基を有するメン−２，６−ジアミノピ
メリン酸を含む細菌の細胞壁に、ストレプトミセス・グ
ロビスボラス由来のＮ−アセチルムラミダーゼ及びスト
レプトミセス・ニトロスポレウスＳＫ又はストレプトミ
セス・グロビヌポヲス由来のエンドペプチダーゼを作用
させ、更に必要に応じて加水分解することを特徴とする
一般式（厘） ｌ ｌ ＣＨ３Ｈ２ＮＣ０ＣＨ（ＣＨ２）２ 囮□ＣＯ ）（２ＮＣＨ（Ｃ）（２） ３ＣＨＣＯＲ２０ＮＨ２ （式中ｓ Ｒ１は水素原子又はアセチル基を意味し、Ｒ
２ハヒドロキシ基又は１−カルボキシエチルアミノ基を
意味する。） で表わされるジサッカライドトリペプチド及びジサッカ
ライドテトラペプチド並びにその塩の製法に関するもの
である。
化されたムラミン酸部分、イングルタミン及びアミド化
されたカルボキシ基を有するメン−２，６−ジアミノピ
メリン酸を含む細菌の細胞壁に、ストレプトミセス・グ
ロビスボラス由来のＮ−アセチルムラミダーゼ及びスト
レプトミセス・ニトロスポレウスＳＫ又はストレプトミ
セス・グロビヌポヲス由来のエンドペプチダーゼを作用
させ、更に必要に応じて加水分解することを特徴とする
一般式（厘） ｌ ｌ ＣＨ３Ｈ２ＮＣ０ＣＨ（ＣＨ２）２ 囮□ＣＯ ）（２ＮＣＨ（Ｃ）（２） ３ＣＨＣＯＲ２０ＮＨ２ （式中ｓ Ｒ１は水素原子又はアセチル基を意味し、Ｒ
２ハヒドロキシ基又は１−カルボキシエチルアミノ基を
意味する。） で表わされるジサッカライドトリペプチド及びジサッカ
ライドテトラペプチド並びにその塩の製法に関するもの
である。
本発明の方法によれば、水溶性で、強い生理活性を有し
、毒性が弱く、かつ構造決定された単一成分のペプチド
グリカンである式（１）の化合物を大量に得ることがで
きる。
、毒性が弱く、かつ構造決定された単一成分のペプチド
グリカンである式（１）の化合物を大量に得ることがで
きる。
式（１）で表わされる化合物には、Ｎ−アセチルグルコ
サミニル−β−１，４−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−ア
ラニル−Ｄ−イソグルタミニルーメソ−アミド化−２，
６−ジアミノピメリン酸（以下ＧＭＰ３− Ａと記す）
、Ｎ−アセチルグルコサミニル−β−１，４−Ｎ−アセ
チルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルー
メソ−アミド化−２，６−ジアミツピメリルーＤ−アラ
ニン（以下ＧＭＰ４−Ａ と記す）、Ｎ−アセチルグ
ルコサミニル−β−１、４−Ｎ 、 ６−０−ジアセチ
ルムラミル−し−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルーメ
ソ−アミド化−２，６−ジアミノピメリン酸（以下ＧＭ
Ｐ３−Ｂと記す）及びＮ−アセチルグルコサミニル−β
−１、４−Ｎ。
サミニル−β−１，４−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−ア
ラニル−Ｄ−イソグルタミニルーメソ−アミド化−２，
６−ジアミノピメリン酸（以下ＧＭＰ３− Ａと記す）
、Ｎ−アセチルグルコサミニル−β−１，４−Ｎ−アセ
チルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルー
メソ−アミド化−２，６−ジアミツピメリルーＤ−アラ
ニン（以下ＧＭＰ４−Ａ と記す）、Ｎ−アセチルグ
ルコサミニル−β−１、４−Ｎ 、 ６−０−ジアセチ
ルムラミル−し−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルーメ
ソ−アミド化−２，６−ジアミノピメリン酸（以下ＧＭ
Ｐ３−Ｂと記す）及びＮ−アセチルグルコサミニル−β
−１、４−Ｎ。
６−０−”アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソ
グルタミニルーメソ−アミド化−２゜６−ジアミツピメ
リＡ／−Ｄ−アラニン（以下ＧＭＰ４−Ｂと記す）が含
まれる。
グルタミニルーメソ−アミド化−２゜６−ジアミツピメ
リＡ／−Ｄ−アラニン（以下ＧＭＰ４−Ｂと記す）が含
まれる。
本発明の方法に用いられる細菌の具体例としては、ラク
トバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓｐｌａｎｔａｎｍ ） 、コリネバクテリウム・ジフ
テリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｎ ｄｉｐｈ
ｔｈｅｒｉａｅ ）等が挙げられるが。
トバシラス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ
ｓｐｌａｎｔａｎｍ ） 、コリネバクテリウム・ジフ
テリアエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｎ ｄｉｐｈ
ｔｈｅｒｉａｅ ）等が挙げられるが。
前者が好ましい。細胞壁のペプチドグリカン含有量を高
めるために、これらの細菌に薬剤耐性を持たせたり、あ
るいは人工的に細胞壁の特殊外層を欠損させて変異させ
てもよい。これらの細菌を常法により培養し、培養液か
ら菌体を分離し、これを物理的に破壊し、次いで高濃度
の食塩水で菌体内蛋白質を流出・除去し、更にトリプシ
ン処理して不要の蛋白質を除去することにより、原料の
細胞壁が得られる。また、このようにして得られた細胞
壁を０．０５〜０．５Ｎ、好ましくは０．１〜０．２Ｎ
のアルカリで処理したもの。
めるために、これらの細菌に薬剤耐性を持たせたり、あ
るいは人工的に細胞壁の特殊外層を欠損させて変異させ
てもよい。これらの細菌を常法により培養し、培養液か
ら菌体を分離し、これを物理的に破壊し、次いで高濃度
の食塩水で菌体内蛋白質を流出・除去し、更にトリプシ
ン処理して不要の蛋白質を除去することにより、原料の
細胞壁が得られる。また、このようにして得られた細胞
壁を０．０５〜０．５Ｎ、好ましくは０．１〜０．２Ｎ
のアルカリで処理したもの。
あるいは企画をα０５〜０．５Ｎ、好ましくは０．１〜
α２Ｎのアルカリで処理したのち−Ｌ記と同様に処理し
て調製した細胞壁全原料として用いてもよい。
α２Ｎのアルカリで処理したのち−Ｌ記と同様に処理し
て調製した細胞壁全原料として用いてもよい。
上記のようにして得られた細胞壁に２種の酵素、スなわ
ちＮ−アセチルレムラミダーゼ及ヒエンドベプチダーゼ
を作用させて細胞壁を溶解させる。この場合、先にＮ−
アセチルムラミダーゼを作用させるか、あるいは２種の
酵素を同時に作用させるのが好ましい。この反応では、
不要な開裂を避けるために、できるだけ精製した酵素を
使用すべきである。
ちＮ−アセチルレムラミダーゼ及ヒエンドベプチダーゼ
を作用させて細胞壁を溶解させる。この場合、先にＮ−
アセチルムラミダーゼを作用させるか、あるいは２種の
酵素を同時に作用させるのが好ましい。この反応では、
不要な開裂を避けるために、できるだけ精製した酵素を
使用すべきである。
Ｎ−アセチルムラミダーゼとしては、例えばストレプト
ミセス・グロビスポラスＢ −１８２９が産生する酵素
（以下Ｍ１−アセチルムラミダーゼと記す）が好ましく
用いられる。このＢ−１８２９株は工業技術院微生物工
業技術研究所及びアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）にそれぞれ徽工研菌寄第５９６号及び
ＡＴＣＣ２１５５３号として寄託されており、その菌学
的性質、培養方法及びその培養液からの酵素採取法は特
公昭４９−１６９５６号、特開昭４９−１１８８２１号
及び米国特許第３，９２９，５７９号に詳細に記載され
ている。
ミセス・グロビスポラスＢ −１８２９が産生する酵素
（以下Ｍ１−アセチルムラミダーゼと記す）が好ましく
用いられる。このＢ−１８２９株は工業技術院微生物工
業技術研究所及びアメリカンタイプカルチャーコレクシ
ョン（ＡＴＣＣ）にそれぞれ徽工研菌寄第５９６号及び
ＡＴＣＣ２１５５３号として寄託されており、その菌学
的性質、培養方法及びその培養液からの酵素採取法は特
公昭４９−１６９５６号、特開昭４９−１１８８２１号
及び米国特許第３，９２９，５７９号に詳細に記載され
ている。
エンドペプチダーゼとしては、例えばストレプトミセス
・ニトロスポレウヌＳＫ又はストレプトミセス・グロビ
スポラヌＢ −１８２９が産生する酵素が好ましく用い
られる。ＳＫ株は％ＢｉｋｅｎＪｏｕｒｎａｌ １９
、７５〜９１ （１９７６）に記載されているストレプ
トミセヌｓｐ、Ｌ−３ｆ、エンドペプチダーゼ産生能の
優れたものに本発明者らが変異させて創製したものであ
る。このＳＫ株（微工研菌寄第５４７５号）の創製（変
異）法、培養方法、菌学的性質及びその培養液からのエ
ンドペプチダーゼ（以下ＳＫ−エンドペプチダーゼと記
す）の採取法については後記参考例で詳述する。ストレ
プトミセス・グロビスボラスＢ −ｔ８２助ｆ産生する
エンドペプチダーゼ（以下ＡＭ３−エンドペプチダーゼ
と記す）の単離・精製は、Ｂ−１８２９株を特公昭４９
−１６９５６号に記載の方法で培養し、培養液から粗酵
素を採取し、後記参考例に示す方法で精製することによ
り行われる。ＡＭ３−エンドペプチダーゼは、後記のよ
うに物理化学的性質においてＳＫ−エンドペプチダーゼ
とは明らかに異なり、更にストレプトミセス・アルプス
Ｇ （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ Ｇ ）
が産生するＤＤカルボキシペプチダーゼ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ９．２９５５．２９６１（１９７０）
：］とは基質特異性が異なるので、新規なエンドペプチ
ダーゼである。
・ニトロスポレウヌＳＫ又はストレプトミセス・グロビ
スポラヌＢ −１８２９が産生する酵素が好ましく用い
られる。ＳＫ株は％ＢｉｋｅｎＪｏｕｒｎａｌ １９
、７５〜９１ （１９７６）に記載されているストレプ
トミセヌｓｐ、Ｌ−３ｆ、エンドペプチダーゼ産生能の
優れたものに本発明者らが変異させて創製したものであ
る。このＳＫ株（微工研菌寄第５４７５号）の創製（変
異）法、培養方法、菌学的性質及びその培養液からのエ
ンドペプチダーゼ（以下ＳＫ−エンドペプチダーゼと記
す）の採取法については後記参考例で詳述する。ストレ
プトミセス・グロビスボラスＢ −ｔ８２助ｆ産生する
エンドペプチダーゼ（以下ＡＭ３−エンドペプチダーゼ
と記す）の単離・精製は、Ｂ−１８２９株を特公昭４９
−１６９５６号に記載の方法で培養し、培養液から粗酵
素を採取し、後記参考例に示す方法で精製することによ
り行われる。ＡＭ３−エンドペプチダーゼは、後記のよ
うに物理化学的性質においてＳＫ−エンドペプチダーゼ
とは明らかに異なり、更にストレプトミセス・アルプス
Ｇ （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｕｓ Ｇ ）
が産生するＤＤカルボキシペプチダーゼ（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ９．２９５５．２９６１（１９７０）
：］とは基質特異性が異なるので、新規なエンドペプチ
ダーゼである。
原料の細胞壁の２種の酵素による溶解は、一般にｐＨ７
，０〜８．５の緩衝液中、防腐剤（例えばクロロホルム
、窒化ナトリウム等）の存在下、約３７℃で行われる。
，０〜８．５の緩衝液中、防腐剤（例えばクロロホルム
、窒化ナトリウム等）の存在下、約３７℃で行われる。
プ応終了点は、Ｎ−アセチルムラミダーゼを作用させる
場合には遊離する還元糖が一定に達した時であり、エン
ドペプチダーゼを作用させる場合には遊離アミノ基の生
成が一定に達した時である。反応時間は、酵素量並びに
細胞壁の敏及び性質によって異なるが、通常８〜６０時
間、好ましくは２４〜４８時間である。エンドペプチダ
ーゼは、常法に従って固定化し、連続使用してもよい。
場合には遊離する還元糖が一定に達した時であり、エン
ドペプチダーゼを作用させる場合には遊離アミノ基の生
成が一定に達した時である。反応時間は、酵素量並びに
細胞壁の敏及び性質によって異なるが、通常８〜６０時
間、好ましくは２４〜４８時間である。エンドペプチダ
ーゼは、常法に従って固定化し、連続使用してもよい。
例えば、＋
該酵素をＣＭ−セファデックスＣ−２５（Ｎａ タイ
プ。
プ。
ファルマシア社）にイオン結合により、あるいはジアゾ
化されたｐ−アミノベンジル−セルロースにジアゾカッ
プリングにより固定化して用いられる。反応混液からの
目的物の単離は、イオン交換クロマトグラフィー、シリ
カゲル等のカラムクロマトグラフィー、ゲ／Ｌ／諷過等
の手段全組み合わせて行うことができる。ラクトバシラ
ス・ブランクラムのアルカリで処理していない細胞壁を
原料に用いた場合には、ＧＭＰ３−Ａ。
化されたｐ−アミノベンジル−セルロースにジアゾカッ
プリングにより固定化して用いられる。反応混液からの
目的物の単離は、イオン交換クロマトグラフィー、シリ
カゲル等のカラムクロマトグラフィー、ゲ／Ｌ／諷過等
の手段全組み合わせて行うことができる。ラクトバシラ
ス・ブランクラムのアルカリで処理していない細胞壁を
原料に用いた場合には、ＧＭＰ３−Ａ。
ＧＭＰ ４−Ａ 、 ＧＭＰ ３−Ｂ及びＧＭＰ４−Ｂ
が得られ、アルカリで処理した細胞壁を用いた場合には
、 ＧＭＰ３−Ａ及びＧＭＰ４−Ａ が得られる。Ｇ
ＭＰ３−Ｂ及びＧＭＰ ４− Ｂはそれぞれ、酸性下に
加水分解することにより、定量的にＧＭＰ３−Ａ及びＧ
ＭＰ ４−Ａに変換することができる。本加水分解反応
は、０．０５〜０．５Ｎ、好ましくは０．１〜０．２Ｎ
の鉱酸水溶液中で行われる。
が得られ、アルカリで処理した細胞壁を用いた場合には
、 ＧＭＰ３−Ａ及びＧＭＰ４−Ａ が得られる。Ｇ
ＭＰ３−Ｂ及びＧＭＰ ４− Ｂはそれぞれ、酸性下に
加水分解することにより、定量的にＧＭＰ３−Ａ及びＧ
ＭＰ ４−Ａに変換することができる。本加水分解反応
は、０．０５〜０．５Ｎ、好ましくは０．１〜０．２Ｎ
の鉱酸水溶液中で行われる。
反応温度は通常４０〜８０℃、好ましくは６０℃前後で
あり、反応時間は通常２〜９時間、好ましくは５〜７時
間である。
あり、反応時間は通常２〜９時間、好ましくは５〜７時
間である。
式（璽）の化合物は、各種の無機塩絨もしくは有機塩基
又は無機酸もしくは有機酸と常法に従って処理すること
により、塩類に導くことができる。
又は無機酸もしくは有機酸と常法に従って処理すること
により、塩類に導くことができる。
式（鳳）の化合物及びその塩は、免疫増強作用。
非特異的感染防御作用等の生理活性を有し、医薬として
有用である。
有用である。
以下に、 ＧＭＰ３−Ａ 、 ＧＭＰ４−Ａ 、 ＧＭ
Ｐ３−Ｂ及びＧＭＰ ４−Ｂ についての生理活性試
験の結果を示す。
Ｐ３−Ｂ及びＧＭＰ ４−Ｂ についての生理活性試
験の結果を示す。
試験例１ 免疫増強作用（アジュバン１−活性）（１）
感作動物の調製 〔ドラケオ−ｚｖ６ＶＲ（ペンシルバニア リフイニン
グ社））、Ｉ：アラセルＡ（アストラケミカルインダス
トリーズ社） ） 、 （１／、Ｍリン酸緩衝生理食塩
水溶液〕をそれぞれ４：ｌ：ｓ（／Ｖ）の割合で含む％
型肌濁液１ ｔｄ当υ、結晶卵白アルブミン１■及び試
験化合物（変量、 ２００μｍ以下）を加えて調製した
液の０．２ ｍｅずつを、１群５匹の雌性ハートレイ系
モルモット（体重２００〜３０１）の左側後足踪内に１
回注射し、感作動物を調製した。
感作動物の調製 〔ドラケオ−ｚｖ６ＶＲ（ペンシルバニア リフイニン
グ社））、Ｉ：アラセルＡ（アストラケミカルインダス
トリーズ社） ） 、 （１／、Ｍリン酸緩衝生理食塩
水溶液〕をそれぞれ４：ｌ：ｓ（／Ｖ）の割合で含む％
型肌濁液１ ｔｄ当υ、結晶卵白アルブミン１■及び試
験化合物（変量、 ２００μｍ以下）を加えて調製した
液の０．２ ｍｅずつを、１群５匹の雌性ハートレイ系
モルモット（体重２００〜３０１）の左側後足踪内に１
回注射し、感作動物を調製した。
角膜反応
感作２週間後に角膜内に、 ２０ ｆｌ１９ｋｌ濃度の
結晶卵白アルブミン生理食塩水溶ｇ！を、直径が約５ｆ
ｆの一過性の白濁が生じるように注射する。
結晶卵白アルブミン生理食塩水溶ｇ！を、直径が約５ｆ
ｆの一過性の白濁が生じるように注射する。
４８時間後における角膜の濁りの程度（スコア）から細
胞性抗体生成増強の有無、すなわち遅延性アレルギー成
立の有無及びその程度を判定した。
胞性抗体生成増強の有無、すなわち遅延性アレルギー成
立の有無及びその程度を判定した。
皮膚反応
感作３週間後に脱毛した指部皮内に、１■／＋＋ｅ濃度
の結晶卵白アルブミン溶液０．１ ｄを注射し。
の結晶卵白アルブミン溶液０．１ ｄを注射し。
４８時間後の発赤の長、短径の平均値及び硬結注射部位
と反対側の対照部位の皮膚の厚さの比（ダブルシツクキ
ス法）から、遅延型アレルギーの成立の有無及びその程
度を判定した。
と反対側の対照部位の皮膚の厚さの比（ダブルシツクキ
ス法）から、遅延型アレルギーの成立の有無及びその程
度を判定した。
体液性抗体生成量
感作４週間後に心臓穿刺によって採血し、血清中の抗卵
白アルブミン量を窒素量（、μｆｋｌ）として定量し１
体液性抗体生成増加の有無及びその程度を調べた。
白アルブミン量を窒素量（、μｆｋｌ）として定量し１
体液性抗体生成増加の有無及びその程度を調べた。
試験結果を第１表に示す。
第１表 免疫増強作用
傘フロイントの不完全アジユバノド
試験例２ 非特異的感染防禦作用
体重約２３１の５ｔｄ−ｄｄ’７系雄性マウスを使用し
た。感染前３，２及び１日日に試験化合物の生理食塩水
溶液を静脈内投与する。投薬２４時間後に緑儂菌５１２
（感染両社２ｘｌＯ’／マウス）を腹腔的感染させ、感
染７日後の生存数を観察し第２表の結果を得た。
た。感染前３，２及び１日日に試験化合物の生理食塩水
溶液を静脈内投与する。投薬２４時間後に緑儂菌５１２
（感染両社２ｘｌＯ’／マウス）を腹腔的感染させ、感
染７日後の生存数を観察し第２表の結果を得た。
第２表 非特異的感染防御作用
生理食塩水投与群 ０／１６
以下に参考例及び実施例を挙げて本発明を更に具体的に
説明する。
説明する。
参考例１ ストレプトミセス・ニトロスポレウスＳＫ
の調製小谷らが奈良県橿原市の土壌から分離した親株ス
トレプトミセスｓｐ、Ｌ−３を可溶性デンプン１チ、酵
母エキス０．２％、ラクトバシラス・プランタラムＡＴ
ＣＣ８０１４の細胞壁０．１俤、寒天２チからなる斜面
培地（ｐＨ７，４）で１５回継代培養をくり返し、この
培地に親株を充分馴化させる。
の調製小谷らが奈良県橿原市の土壌から分離した親株ス
トレプトミセスｓｐ、Ｌ−３を可溶性デンプン１チ、酵
母エキス０．２％、ラクトバシラス・プランタラムＡＴ
ＣＣ８０１４の細胞壁０．１俤、寒天２チからなる斜面
培地（ｐＨ７，４）で１５回継代培養をくり返し、この
培地に親株を充分馴化させる。
この親株を上記培地で３０℃、７日間培養し。
充分胞子を着生させた後、胞子を無菌生理食塩水５．０
ｄで洗い取り、その０．５１１！／を、シャーレに流
し込んだ上記培地に塗抹し、３０℃で４日間培養する。
ｄで洗い取り、その０．５１１！／を、シャーレに流
し込んだ上記培地に塗抹し、３０℃で４日間培養する。
生成した大きな溶菌斑を伴ったコロニーを拾取し、上記
斜面培地に植えつける。
斜面培地に植えつける。
この操作を１５回くり返し、特にエンドペプチダーゼ産
生能の優れた１株を選出した。この単胞子分離操作で得
られた菌株を上記斜面培地に植え、胞子が充分Ｍ ＃Ｅ
、するまで培養する。胞子を無菌生理食塩水５．０ ｍ
ｌで洗い取り、２回遠心洗浄浮遊後シャーレに移し、紫
外線殺菌燈（東芝電気、１５Ｗ）で照射（１０分間、距
離約１５ｃｌＩ＋）シ、照射液の０．５ ｄを上記培地
を含むシャーレに塗抹し、特にコロニーの大きさに比べ
て大きな溶菌斑を示す菌株を拾い上げる。この操作を５
回くり返してＳＫ株を調製した。
生能の優れた１株を選出した。この単胞子分離操作で得
られた菌株を上記斜面培地に植え、胞子が充分Ｍ ＃Ｅ
、するまで培養する。胞子を無菌生理食塩水５．０ ｍ
ｌで洗い取り、２回遠心洗浄浮遊後シャーレに移し、紫
外線殺菌燈（東芝電気、１５Ｗ）で照射（１０分間、距
離約１５ｃｌＩ＋）シ、照射液の０．５ ｄを上記培地
を含むシャーレに塗抹し、特にコロニーの大きさに比べ
て大きな溶菌斑を示す菌株を拾い上げる。この操作を５
回くり返してＳＫ株を調製した。
このようにして変異させた新規ＳＫ株の菌学的性質は第
３〜６表に示すとおりである。
３〜６表に示すとおりである。
第３麦苗の形態
（以 丁 余 白）
第５表 生理的性質
第６表 炭素源の利用性
（グリドハム・ゴツトリーブ・寒天）
なお１本変異株の細胞壁中にはＬ 、 Ｌ −２，６−
ジアミノピメリン酸残基を含む。
ジアミノピメリン酸残基を含む。
ＳＫ株のこれらの菌学的性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａ
ｎｕａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ ８版、ＩＳＰの分類法、ヒュノター
の検索表と照合し、比較検討したところ、近級種として
はアクチノミセス・アトロリパセウス（Ａｃｔｔｎｏｍ
ｙｃｅｓ ａｔｒｏｌｉｖａｃｅｕｓ ）、ストレプト
ミセス・ハルステディ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈ
ａｌｓｔｅｄｉｉ）及びストレプトミセス・ニトロスポ
レウスが挙げられる。しかし、アクチノミセス・アトロ
リパセウスはその胞子表面構造に比（ｗａｒｔｙ ）が
みられる点において、またストレプトミセス・ハルステ
ディはその胞子の数が３〜１０ケである点において本変
異株とは一致しない。本変異株は、フラクトース及びラ
ムノースの利用性のパターンが僅かに異なるもののスト
レプトミセス・ニトロスポレウスと最も類似するので、
ストレプトミセス・ニトロスポレウスに属する新菌株と
認め、本変異株をＳＫ株と命名した。なお第７表に示す
ように、ＳＫ株と親株とはそのエンドペプチダーゼ産生
能において明確に区別される。
ｎｕａｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ ８版、ＩＳＰの分類法、ヒュノター
の検索表と照合し、比較検討したところ、近級種として
はアクチノミセス・アトロリパセウス（Ａｃｔｔｎｏｍ
ｙｃｅｓ ａｔｒｏｌｉｖａｃｅｕｓ ）、ストレプト
ミセス・ハルステディ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｈ
ａｌｓｔｅｄｉｉ）及びストレプトミセス・ニトロスポ
レウスが挙げられる。しかし、アクチノミセス・アトロ
リパセウスはその胞子表面構造に比（ｗａｒｔｙ ）が
みられる点において、またストレプトミセス・ハルステ
ディはその胞子の数が３〜１０ケである点において本変
異株とは一致しない。本変異株は、フラクトース及びラ
ムノースの利用性のパターンが僅かに異なるもののスト
レプトミセス・ニトロスポレウスと最も類似するので、
ストレプトミセス・ニトロスポレウスに属する新菌株と
認め、本変異株をＳＫ株と命名した。なお第７表に示す
ように、ＳＫ株と親株とはそのエンドペプチダーゼ産生
能において明確に区別される。
表中の数字はエンドペプチダーゼの生産量を示す。なお
エンドペプチダーゼの１Ｕは、ラクトバシラス・プラン
タラムＡＴＣＣ８０１４の細胞壁水性懸濁液、トリス−
塩酸緩衛液（ｐＨ８，（１）及び酵素液からなる溶ｔＬ
（最終緩衝液濃度： ０．０５Ｍ、６００ｎｍにおける
吸光度：０．５）４ｓｕを３７℃で装置した場合、６０
０ｎｍの吸光度が１分間に０．００１減少するに必要な
酵素蓋とする。
エンドペプチダーゼの１Ｕは、ラクトバシラス・プラン
タラムＡＴＣＣ８０１４の細胞壁水性懸濁液、トリス−
塩酸緩衛液（ｐＨ８，（１）及び酵素液からなる溶ｔＬ
（最終緩衝液濃度： ０．０５Ｍ、６００ｎｍにおける
吸光度：０．５）４ｓｕを３７℃で装置した場合、６０
０ｎｍの吸光度が１分間に０．００１減少するに必要な
酵素蓋とする。
ＯＤｏ：初発吸光度、 ＯＤｔ： １分後の吸光度但
し００３≦０Ｄｏ−〇Ｄｔ≦０１３ 本ＳＫ株及び親株が産生するエンドペプチダーゼの基質
に対する作用点は同一であるが、親株の酵素産生能があ
まりにも低すぎるため、両酵素が同一であるかどうかは
判らない。そこで本発明者らはＳＫ株が産生する溶菌酵
素をＳＫ−エンドペプチダーゼと命名し、親株が産生ず
るエンドペプチダーゼとは区別することにした。
し００３≦０Ｄｏ−〇Ｄｔ≦０１３ 本ＳＫ株及び親株が産生するエンドペプチダーゼの基質
に対する作用点は同一であるが、親株の酵素産生能があ
まりにも低すぎるため、両酵素が同一であるかどうかは
判らない。そこで本発明者らはＳＫ株が産生する溶菌酵
素をＳＫ−エンドペプチダーゼと命名し、親株が産生ず
るエンドペプチダーゼとは区別することにした。
このような菌学的性質を有するＳＫ株は適当な培地中で
培養される。培養は振盪培養あるいは静置培養のいずれ
でもよいが、２０〜４０℃、好ましくは３０℃前後にお
いて、１〜４日間、なかんずく２〜３日間振盪培養する
のが好ましい。
培養される。培養は振盪培養あるいは静置培養のいずれ
でもよいが、２０〜４０℃、好ましくは３０℃前後にお
いて、１〜４日間、なかんずく２〜３日間振盪培養する
のが好ましい。
培地は、ストレプトミセス属に属する微生物の培養に通
常用いられるものでおればいずれも使用できる。例えば
、グルコーヌ、デキストリン。
常用いられるものでおればいずれも使用できる。例えば
、グルコーヌ、デキストリン。
マルトーヌ、可溶性デンプンのような糖類、脱脂大豆、
酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス。
酵母エキス、ポリペプトン、肉エキス。
コーンスチープリカー、味液のような窒素源、食塩、硫
安、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸第二鉄
、硫酸亜鉛、塩化カルシウム。
安、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸第二鉄
、硫酸亜鉛、塩化カルシウム。
炭酸カルシウム、リン酸塩のような無機塩あるいはビタ
ミン類等を含むｐＨ６〜９．なかんずくｐＨ７〜８の培
地が用いられる。ラクトバシラヌデフンタラムやコリネ
バクテリウム・ジフテリア二のような微生物の企画又は
その細胞壁をＳＫ−エンドペプチダーゼ誘発剤（１ｎｄ
ｕｃｅｒ ） トして培地に加えてもよい。
ミン類等を含むｐＨ６〜９．なかんずくｐＨ７〜８の培
地が用いられる。ラクトバシラヌデフンタラムやコリネ
バクテリウム・ジフテリア二のような微生物の企画又は
その細胞壁をＳＫ−エンドペプチダーゼ誘発剤（１ｎｄ
ｕｃｅｒ ） トして培地に加えてもよい。
培養液からのＳＫ−エンドペプチダーゼの採取は、培養
液から菌体を除いた溶液について、陽イオン交換樹脂処
理、硫安塩析あるいはＣＭ−セファデックスＣ−２５（
Ｎａ＋タイプ）処理等を合理的に組み合わせることによ
り行うことができる。
液から菌体を除いた溶液について、陽イオン交換樹脂処
理、硫安塩析あるいはＣＭ−セファデックスＣ−２５（
Ｎａ＋タイプ）処理等を合理的に組み合わせることによ
り行うことができる。
参考例２ ＳＫ株の培養とＳＫ−エンドペプチダー
ゼの製造デキストリン２チ、脱脂大豆２チ、酵母エキス
０．５ ％ 、食塩０．２ ％ 、ラクトバシラス・プ
ランタラムＡＴＣＣ８０１４の細胞壁０．２４ ｉ含有
する培地（ｐＨ７，４） ５０ ｆｉにＳＫ株を２チの
接種量で接種した後１通気量５０Ｉ１．／分、攪拌速度
１８０回転／分の条件下、３０℃で３日間培養し、沖過
助剤２ ｋｇを加えてフィルタープレスで沖過する。漏
液５０２にアンバーライトＣＧ−５０（Ｈ”タイプ、ロ
ームアンドハース社）２．５Ｊｃｇ（湿潤重量）を加え
、、ｐＨ５，０に調整し１時間攪拌する。
ゼの製造デキストリン２チ、脱脂大豆２チ、酵母エキス
０．５ ％ 、食塩０．２ ％ 、ラクトバシラス・プ
ランタラムＡＴＣＣ８０１４の細胞壁０．２４ ｉ含有
する培地（ｐＨ７，４） ５０ ｆｉにＳＫ株を２チの
接種量で接種した後１通気量５０Ｉ１．／分、攪拌速度
１８０回転／分の条件下、３０℃で３日間培養し、沖過
助剤２ ｋｇを加えてフィルタープレスで沖過する。漏
液５０２にアンバーライトＣＧ−５０（Ｈ”タイプ、ロ
ームアンドハース社）２．５Ｊｃｇ（湿潤重量）を加え
、、ｐＨ５，０に調整し１時間攪拌する。
樹脂を分別水洗後、０．２Ｍ食塩水１０℃で溶出し、そ
の溶出ｇ！１ｐｕ７．５ に調整した後、８０チ飽和に
なるように硫安を加える。得られた沈殿を最少量の水に
溶解し、４℃で２日間水に対して透析した後、 ＣＭ−
セフアデツクスＣ−２５（Ｎａ＋タイプ、ファルマシア
社）のカラム（５，６ｘ ４０Ｃ１１）に付し、次いで
０〜０．５Ｍ ＮａＣ１の直線濃度勾配法で溶出する。
の溶出ｇ！１ｐｕ７．５ に調整した後、８０チ飽和に
なるように硫安を加える。得られた沈殿を最少量の水に
溶解し、４℃で２日間水に対して透析した後、 ＣＭ−
セフアデツクスＣ−２５（Ｎａ＋タイプ、ファルマシア
社）のカラム（５，６ｘ ４０Ｃ１１）に付し、次いで
０〜０．５Ｍ ＮａＣ１の直線濃度勾配法で溶出する。
０，０５〜０．１Ｍで溶出する画分を濃縮し、脱塩し、
凍結乾燥してＳＫ−エンドペプチダーゼ３００■を得た
。
凍結乾燥してＳＫ−エンドペプチダーゼ３００■を得た
。
参考例ａ ＡＭ３−エンドペプチダーゼの製造デキス
トリン２チ、脱脂大豆０．５％、ポリペプトン０．２％
１食塩０．２％、 ＭｇＳＯ４０，１％。
トリン２チ、脱脂大豆０．５％、ポリペプトン０．２％
１食塩０．２％、 ＭｇＳＯ４０，１％。
Ｎａ２ＨＰＯ４０，５％、 ＣａＣｌ２０．０２ ％か
らなる培地（ｐＨ７，５）７０１にストレプトミセス・
グロビスポラスＢ −１８２９株を１チの接種量で接種
した後、通気量７０２７分、攪拌速度２５０回転／分の
条件下、３０℃で３日間培養する。培養液を沖過し、ｒ
液７゜βにアンバーライトＣＧ−５０（Ｈタイプ） ６
．５ ｋｆｌを加えて１時間攪拌後、諷過する。分別し
た樹脂を充分に水洗した後、０．２ Ｍ Ｎａ２８ＰＯ
４（ｐ）（７，５）で溶出し、溶出液に硫安全６０チ飽
和になるように加える。得られた沈殿物を沖取し、少量
の脱イオン水に溶解し、電気透析器（セレニオン透析槽
Ｗ−ｏｂ型９日不練水）で２〜５時間脱塩を行う。
らなる培地（ｐＨ７，５）７０１にストレプトミセス・
グロビスポラスＢ −１８２９株を１チの接種量で接種
した後、通気量７０２７分、攪拌速度２５０回転／分の
条件下、３０℃で３日間培養する。培養液を沖過し、ｒ
液７゜βにアンバーライトＣＧ−５０（Ｈタイプ） ６
．５ ｋｆｌを加えて１時間攪拌後、諷過する。分別し
た樹脂を充分に水洗した後、０．２ Ｍ Ｎａ２８ＰＯ
４（ｐ）（７，５）で溶出し、溶出液に硫安全６０チ飽
和になるように加える。得られた沈殿物を沖取し、少量
の脱イオン水に溶解し、電気透析器（セレニオン透析槽
Ｗ−ｏｂ型９日不練水）で２〜５時間脱塩を行う。
その溶液をＣＭ−セファデックスＣ−２５（Ｎａ＋タイ
プ）のカラム（５，ＯＸ２０ｃｍ）に付し、次いで０−
０．０６ ＭＮａＣｌの直線濃度勾配法で溶出する。活
性画分を集めて濃縮し、セファデックスＧ−２５（ファ
ルマシア社）でゲ）Ｖ−過後、凍結乾燥してＡＭ３−エ
ンドペプチダーゼ８００■を得た。
プ）のカラム（５，ＯＸ２０ｃｍ）に付し、次いで０−
０．０６ ＭＮａＣｌの直線濃度勾配法で溶出する。活
性画分を集めて濃縮し、セファデックスＧ−２５（ファ
ルマシア社）でゲ）Ｖ−過後、凍結乾燥してＡＭ３−エ
ンドペプチダーゼ８００■を得た。
このようにして得られたＳＫ−及びＡＭ３−エンドペプ
チダーゼの酵素学的性質の比較結果を第８表に示す。
チダーゼの酵素学的性質の比較結果を第８表に示す。
第８表 ＳＫ−及びＡＭ漕素の性質
培養条件 通 気 通 気
酵素誘導必 要 不必要
至適 ｐＨｐＨ９，０ｐＨ８，５
至適温度 ５５〜６０℃ ５５〜６０℃至適緩衝液濃
度 ０．０２Ｍ ０．０４Ｍ分
子 量 １．６ Ｘ １０ ’
１．３ Ｘ １０’等 電 点 ｐＨ８，３ｐＨ
９，０テキスｌ−！ｊン２％、脱脂大豆０．５％ 、ポ
リベグ１−：１０．２１．食塩０．１７％、 ＭｇＳＯ
４０，１％ 、 Ｎａ２ＨＰ０．０．５％。
度 ０．０２Ｍ ０．０４Ｍ分
子 量 １．６ Ｘ １０ ’
１．３ Ｘ １０’等 電 点 ｐＨ８，３ｐＨ
９，０テキスｌ−！ｊン２％、脱脂大豆０．５％ 、ポ
リベグ１−：１０．２１．食塩０．１７％、 ＭｇＳＯ
４０，１％ 、 Ｎａ２ＨＰ０．０．５％。
ＣａＣ１ｚ ０．０２％からなる培地（ｐＨ７，５）７
Ｄ中で１通気量７０氾／分、攪拌速度２５０回転／分の
条件下、ストレプトミセス・グロビスポラスＢ −１８
２９株ヲ３０℃で３日間培養する。培養液全濾過し、炉
液７゜２にアンバーライトＣＧ−５０（Ｈ＋タイプ）
６．５に９を加えて１時間貫拌した後沖過する、樹脂を
０．２Ｍ Ｎａ ２ＨＰＯ４（ｐＨ７，５）で溶出し、
溶出液に硫安を６０チ飽和になるように加える。得られ
た沈殿物を炉腹し、少量の脱イオン水に溶解し、０゜０
５Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＣＭ−
セルロース（Ｎａ＋タイプ。
Ｄ中で１通気量７０氾／分、攪拌速度２５０回転／分の
条件下、ストレプトミセス・グロビスポラスＢ −１８
２９株ヲ３０℃で３日間培養する。培養液全濾過し、炉
液７゜２にアンバーライトＣＧ−５０（Ｈ＋タイプ）
６．５に９を加えて１時間貫拌した後沖過する、樹脂を
０．２Ｍ Ｎａ ２ＨＰＯ４（ｐＨ７，５）で溶出し、
溶出液に硫安を６０チ飽和になるように加える。得られ
た沈殿物を炉腹し、少量の脱イオン水に溶解し、０゜０
５Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化したＣＭ−
セルロース（Ｎａ＋タイプ。
バイオ−ラッド社）のカラム（３，Ｏｘ ７０Ｇ）に付
す。
す。
０．０５Ｍ及び０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で
段階的に溶出する。０．ＩＭ’！Ｊン酸緩衝液溶出画分
を透析した後、 ０．０５Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）で平衡化したＣＭ−セファデックスＣ−２５（Ｎａ
＋タイプ）のカラＬ（３，Ｏｘ ６０ｃｍ ）に付す。
段階的に溶出する。０．ＩＭ’！Ｊン酸緩衝液溶出画分
を透析した後、 ０．０５Ｍ！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）で平衡化したＣＭ−セファデックスＣ−２５（Ｎａ
＋タイプ）のカラＬ（３，Ｏｘ ６０ｃｍ ）に付す。
次いで０．０５Ｍ及び０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，
０）で段階的に溶出し、０．１Ｍ溶出画分を０．０５Ｍ
！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析スル。ｉ析
液’ｉセファデックスＧ−７５（７ア）ｖマシア社）で
ゲル濾過全行い、活性画分を脱塩し、濃縮したのち凍結
乾燥してＭｌ−アセチルムラミダーゼｌ、１０愕全得た
。
０）で段階的に溶出し、０．１Ｍ溶出画分を０．０５Ｍ
！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０）に対して透析スル。ｉ析
液’ｉセファデックスＧ−７５（７ア）ｖマシア社）で
ゲル濾過全行い、活性画分を脱塩し、濃縮したのち凍結
乾燥してＭｌ−アセチルムラミダーゼｌ、１０愕全得た
。
参考例５ 細胞壁の調製
ラクトバシラス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４の湿潤
菌体５２０ｖを生理食塩水４ｒに浮遊させ。
菌体５２０ｖを生理食塩水４ｒに浮遊させ。
これをダイノーラボラトリ−ミル（シンマルエンタープ
ライゼス社）を用いて破壊する。未破壊細胞を遠心分離
（８００ｘｉＰ、 １０分）し、上清懸濁液に食塩をＩ
Ｍになるように加える。次いで細胞壁を遠心分離（９，
０００ｘｓ’ 、 ３０分）し、大量の脱イオン水で４
回遠心洗浄する。洗浄細胞壁をα０５ Ｍリン酸緩衝ｇ
！（ｐＨ７，０）に懸濁し、トリプシン４．２ｆを加え
、３７℃で６時間装置する。
ライゼス社）を用いて破壊する。未破壊細胞を遠心分離
（８００ｘｉＰ、 １０分）し、上清懸濁液に食塩をＩ
Ｍになるように加える。次いで細胞壁を遠心分離（９，
０００ｘｓ’ 、 ３０分）し、大量の脱イオン水で４
回遠心洗浄する。洗浄細胞壁をα０５ Ｍリン酸緩衝ｇ
！（ｐＨ７，０）に懸濁し、トリプシン４．２ｆを加え
、３７℃で６時間装置する。
反応混液を冷却遠心（８００Ｘ ｒ、１５分）して粗大
物を除き、その上清を更に遠心（９，０ＯＯＸｆ、 ３
０分）して細胞壁を集める。細胞壁ｅ Ｏ，０５Ｍ Ｉ
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０） で３回遠心洗浄して精
製細胞壁８６ｆｔｋ得た。
物を除き、その上清を更に遠心（９，０ＯＯＸｆ、 ３
０分）して細胞壁を集める。細胞壁ｅ Ｏ，０５Ｍ Ｉ
Ｊン酸緩衝液（ｐＨ７，０） で３回遠心洗浄して精
製細胞壁８６ｆｔｋ得た。
参考例６ アルカリ処理細胞壁の調製
参考例５で得られた細胞壁８０？ｆｊ！：０．ＩＮ Ｎ
ａＯＨ４，４℃に懸濁し、室温で３０分〜２時間攪拌し
た後、濃塩酸で中和し１次いで遠心（９，０００ｘｓ’
、３０分）して細胞壁を集める。細胞壁を１Ｍ食塩及び
水で洗浄し、凍結乾燥してアルカリ処理細胞壁４０２を
得た。
ａＯＨ４，４℃に懸濁し、室温で３０分〜２時間攪拌し
た後、濃塩酸で中和し１次いで遠心（９，０００ｘｓ’
、３０分）して細胞壁を集める。細胞壁を１Ｍ食塩及び
水で洗浄し、凍結乾燥してアルカリ処理細胞壁４０２を
得た。
参考例７ アルカリ処理細胞壁の調製
ラクトバシラス・ブランクラムＡＴＣＣ８０１４の湿潤
全菌体１２１２を常水１℃に懸濁し、よく分散させた後
、固型のＮａＯＨ４ｆ’ｚ加え、 ＮａＯＨが完全に溶
解したのち室温で３０分間嘩拌する。濃塩酸でｐＨ値ヲ
７．０付近に戻した後、遠心分離（８００ｘｆ、１０分
）シ、沈殿物？：１回水洗する。得られたアルカリ処理
企画を参考例５と同様に処理して、アルカリ処理細胞壁
１８ｆを得た。
全菌体１２１２を常水１℃に懸濁し、よく分散させた後
、固型のＮａＯＨ４ｆ’ｚ加え、 ＮａＯＨが完全に溶
解したのち室温で３０分間嘩拌する。濃塩酸でｐＨ値ヲ
７．０付近に戻した後、遠心分離（８００ｘｆ、１０分
）シ、沈殿物？：１回水洗する。得られたアルカリ処理
企画を参考例５と同様に処理して、アルカリ処理細胞壁
１８ｆを得た。
７１−例８次Ｍ３−エンドペプチダーゼの固定化参考例
３で得られたＡＭ３−エンドペフ゛チダーゼ５００■を
０．０５Ｍリン酸緩＃液（ｐＨ８，０）２０屑ｌに溶解
した溶液を、常法に従ってジアゾ化したｐ−アミノベン
ジル−セルロース１．００（ｑに加え、４°Ｃで２０時
間攪拌して反応させた後、３７℃で１時間加温する。反
応終了後、固定化された酵素ｔｐ取し、０．２５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８，０）、次いで水で遊離の酵素を洗い
出した後、低温保存する。
３で得られたＡＭ３−エンドペフ゛チダーゼ５００■を
０．０５Ｍリン酸緩＃液（ｐＨ８，０）２０屑ｌに溶解
した溶液を、常法に従ってジアゾ化したｐ−アミノベン
ジル−セルロース１．００（ｑに加え、４°Ｃで２０時
間攪拌して反応させた後、３７℃で１時間加温する。反
応終了後、固定化された酵素ｔｐ取し、０．２５Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ８，０）、次いで水で遊離の酵素を洗い
出した後、低温保存する。
参考例３で得られたＡＭ３−エンドペプチダーゼ２００
ｆＲ９’ｉセファデックヌＧ −１００のカラム（２
，ＯＸ １００α）でのゲ）ｖＦ５過分画により更に精
製する。ここに得られた精製酵素ｔ、 ０．００１Ｍ
！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，５） ５０ｘｌに懸濁したＣ
Ｍ−セファデックスＣ−２５（Ｎａ＋タイプ、５．（ｌ
湿潤重量）［７１１１え、４℃で２４時間攪拌する。Ｃ
Ｍ−セファテ゛ックスＣ−２５’ｉ沖取し、上記緩衝液
５００＠／で充分洗浄してＡＭ３−エンドペプチダーゼ
結合ＣＭ−セファデックスＣ−２５’ｉ得た。
ｆＲ９’ｉセファデックヌＧ −１００のカラム（２
，ＯＸ １００α）でのゲ）ｖＦ５過分画により更に精
製する。ここに得られた精製酵素ｔ、 ０．００１Ｍ
！Ｊン酸緩衝液（ｐＨ６，５） ５０ｘｌに懸濁したＣ
Ｍ−セファデックスＣ−２５（Ｎａ＋タイプ、５．（ｌ
湿潤重量）［７１１１え、４℃で２４時間攪拌する。Ｃ
Ｍ−セファテ゛ックスＣ−２５’ｉ沖取し、上記緩衝液
５００＠／で充分洗浄してＡＭ３−エンドペプチダーゼ
結合ＣＭ−セファデックスＣ−２５’ｉ得た。
参考例５で得られた精製細胞壁４３ｆをトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８，５、最終濃度０．０２Ｍ）に懸濁し、超
音波処理により充分に分散させ、１２０℃で１０分間加
熱処理をする。冷後、参考例４で得られたＭｌ−アセチ
ルムラミダーゼ４３■および窒化ナトリウム２８０■金
加え、脱イオン水を加えて総量を４．３２となし、３７
℃で２４時間温装する。次いで参考例２で得られたＳＫ
−エンドペプチダーゼ１０５ｆｎ９’！に加え同温度で
２４時間攪拌した後、１００℃、２分間の加熱により反
応を停止させる。反応混ｅを冷却遠心（９，０ＯＯＸ？
、 ３０分）して不溶物を除き、その上清をＥＣＴＥ
ＯＬＡ−セルロース（ブラウン社）のカラム（ｓ、６ｘ
ｓｏ ｃｍ ）に通し、非吸着部分全５０℃以下で減
圧濃縮する。濃縮液全セファデックスＧ −５０（５，
６Ｘ ８３ＣＩ１１ ）とセファデックスＧ −２５（
５，６ｘ ７７エ）の連結カラムに通し、中分子量画分
を集めて５０’Ｃ以下で減圧濃縮する。この濃縮液をダ
ウエソクヌ５０Ｗ ｘ ２（Ｎａ十タイプ、ダウケミカ
ル社）にかけ、非吸着部分を同様に濃縮する。濃縮液を
シリカドライカラム（７Ｘ ７ｏｃｍ ）に通し、７０
チプロバノ”−１Ｖ７００ｙｘｌで展開し、 ＧＭＰ３
−Ａ、 ＧＭＰ、−Ａ、 ＧＭＰ３−Ｂ及びＧＭＰ ４
−Ｂ混在画分を集め濃縮する。この濃縮液を更にシリカ
ドライカラム（ナイロン製）に付し。
衝液（ｐＨ８，５、最終濃度０．０２Ｍ）に懸濁し、超
音波処理により充分に分散させ、１２０℃で１０分間加
熱処理をする。冷後、参考例４で得られたＭｌ−アセチ
ルムラミダーゼ４３■および窒化ナトリウム２８０■金
加え、脱イオン水を加えて総量を４．３２となし、３７
℃で２４時間温装する。次いで参考例２で得られたＳＫ
−エンドペプチダーゼ１０５ｆｎ９’！に加え同温度で
２４時間攪拌した後、１００℃、２分間の加熱により反
応を停止させる。反応混ｅを冷却遠心（９，０ＯＯＸ？
、 ３０分）して不溶物を除き、その上清をＥＣＴＥ
ＯＬＡ−セルロース（ブラウン社）のカラム（ｓ、６ｘ
ｓｏ ｃｍ ）に通し、非吸着部分全５０℃以下で減
圧濃縮する。濃縮液全セファデックスＧ −５０（５，
６Ｘ ８３ＣＩ１１ ）とセファデックスＧ −２５（
５，６ｘ ７７エ）の連結カラムに通し、中分子量画分
を集めて５０’Ｃ以下で減圧濃縮する。この濃縮液をダ
ウエソクヌ５０Ｗ ｘ ２（Ｎａ十タイプ、ダウケミカ
ル社）にかけ、非吸着部分を同様に濃縮する。濃縮液を
シリカドライカラム（７Ｘ ７ｏｃｍ ）に通し、７０
チプロバノ”−１Ｖ７００ｙｘｌで展開し、 ＧＭＰ３
−Ａ、 ＧＭＰ、−Ａ、 ＧＭＰ３−Ｂ及びＧＭＰ ４
−Ｂ混在画分を集め濃縮する。この濃縮液を更にシリカ
ドライカラム（ナイロン製）に付し。
イソ酪酸−０，５Ｍ Ｎ）（４０Ｈ（５： ３ Ｖ／Ｊ
”）で展開した後、ドライカラムを適当な長さに輪切に
する。
”）で展開した後、ドライカラムを適当な長さに輪切に
する。
次いで各輪切画分の一部を取り、薄層クロマトグラフィ
ーに付し、上記イソ酪酸−ＮＨ４０Ｈで展開し、いずれ
の輪切画分にペプチドグリカンが存在するかを確認する
。薄層クロマト的に単一のペプチドグリカンが含まれる
２群の輪切画分を集め、エーテル処理をしてイソ酪酸を
除去した後、水で抽出する。抽出液全濃縮し、ゲ／ｌ／
沖過により脱塩する。得られたＧＭＰ、−、ＧＭＰ４−
Ａ混在画分及びＧＭＰ３− 、 ＧＭＰ、−Ｂ混在画
分全それぞれＣＭ−セファデックスＣ−２５（Ｈ＋タイ
プ）のカラム（４，５Ｘ ａｏ ｃｍ）に付し２次いで
０．５ ｘ １０−” Ｎ塩酸２．ＯＡで溶出して、
ＧＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ、−Ａ及びＧＭＰ３−Ｂ、 Ｇ
ＭＰ４−Ｂを分画する。各化合物を主として含有する画
分を集め、０．０１ＮＮａＯＨで注意深く中和した後、
５０℃以下で減圧濃縮する。次いで。
ーに付し、上記イソ酪酸−ＮＨ４０Ｈで展開し、いずれ
の輪切画分にペプチドグリカンが存在するかを確認する
。薄層クロマト的に単一のペプチドグリカンが含まれる
２群の輪切画分を集め、エーテル処理をしてイソ酪酸を
除去した後、水で抽出する。抽出液全濃縮し、ゲ／ｌ／
沖過により脱塩する。得られたＧＭＰ、−、ＧＭＰ４−
Ａ混在画分及びＧＭＰ３− 、 ＧＭＰ、−Ｂ混在画
分全それぞれＣＭ−セファデックスＣ−２５（Ｈ＋タイ
プ）のカラム（４，５Ｘ ａｏ ｃｍ）に付し２次いで
０．５ ｘ １０−” Ｎ塩酸２．ＯＡで溶出して、
ＧＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ、−Ａ及びＧＭＰ３−Ｂ、 Ｇ
ＭＰ４−Ｂを分画する。各化合物を主として含有する画
分を集め、０．０１ＮＮａＯＨで注意深く中和した後、
５０℃以下で減圧濃縮する。次いで。
セファデックスＧ−２５のカラム（ｓ、ｏ ｘ ８０
ｃｍ ）でのゲル沖過により脱塩し、５０℃以下で減圧
濃縮した後、凍結乾燥してＧＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ４−
Ａ、 ＧＭＰ３−Ｂ 。
ｃｍ ）でのゲル沖過により脱塩し、５０℃以下で減圧
濃縮した後、凍結乾燥してＧＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ４−
Ａ、 ＧＭＰ３−Ｂ 。
ＧＭＰ、−Ｂ’ｉｉそれぞれ０．７ｆ 、 ０．７ｒ
、 １６ｒ 、 １４ｆ得た。
、 １６ｒ 、 １４ｆ得た。
これら４化合物の理化学的性質及び化学分析の結果を第
９表に示す。
９表に示す。
ｃ以 下 余 白）
また、４化合物にＮ−アセナルムラミル−Ｌ−アラニン
アミターセを作用させて得られた分解産物及びそれらし
てついての分析結果を第１０表に示す。なお、分析は公
知の方法に従って行い、構造の決定は機器分析（！１１
Ｓ、 ＧＣＭＳ、 ＮＭＲ，ＩＲ。
アミターセを作用させて得られた分解産物及びそれらし
てついての分析結果を第１０表に示す。なお、分析は公
知の方法に従って行い、構造の決定は機器分析（！１１
Ｓ、 ＧＣＭＳ、 ＮＭＲ，ＩＲ。
ＵＶ）及び酵素的分析によりｈっだ
（以 下 余 白）
実施例２ ＧＭＰ３−Ａ、ＧＭＰ４−Ａ、ＧＭＰ３
−Ｂ及びＧＭＰ４−Ｂの製造参考例５に記載の方法で得
られたラクトバシラス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４
のｍａｉ胞壁１．２００ｒ ｆ Ｉ） ン酸緩衝液（ｐ
）Ｉ ８．０ 、最終濃度α０４Ｍ）３０Ｒに懸濁し、
Ｍｌ−アセチルムラミダーゼ２４１．クロロホルム５０
＃Ｉ／ 、 ＣｏＣｌ□・６Ｈ２０１４，３？ 、 Ａ
Ｍ３−エンドペプチダーゼ０．５８ｆを加え、更に常水
を加えて６０２とし、３７℃で２４時間攪拌する。反応
液に濃塩酸を加えてｐＨ２，５〜３．０に調整し、不溶
物を遠心除去する。上浦液を希ＮａＯＨで注意深く中和
した後、ダイアイオン ＰＡ３１６（ＣＦ タイプ、三
菱化成）のカラム（１０×１４０ｃｍ ）に通し、夾雑
物全吸着除去する。非吸着画分をダイアイオンＰＫ２１
２ （Ｈ’タイプ、三菱化成）のカラム（１４ｘ １９
０ｃｍ ）に付し、次いで０．３Ｍ食塩水で溶出する。
−Ｂ及びＧＭＰ４−Ｂの製造参考例５に記載の方法で得
られたラクトバシラス・プランタラムＡＴＣＣ８０１４
のｍａｉ胞壁１．２００ｒ ｆ Ｉ） ン酸緩衝液（ｐ
）Ｉ ８．０ 、最終濃度α０４Ｍ）３０Ｒに懸濁し、
Ｍｌ−アセチルムラミダーゼ２４１．クロロホルム５０
＃Ｉ／ 、 ＣｏＣｌ□・６Ｈ２０１４，３？ 、 Ａ
Ｍ３−エンドペプチダーゼ０．５８ｆを加え、更に常水
を加えて６０２とし、３７℃で２４時間攪拌する。反応
液に濃塩酸を加えてｐＨ２，５〜３．０に調整し、不溶
物を遠心除去する。上浦液を希ＮａＯＨで注意深く中和
した後、ダイアイオン ＰＡ３１６（ＣＦ タイプ、三
菱化成）のカラム（１０×１４０ｃｍ ）に通し、夾雑
物全吸着除去する。非吸着画分をダイアイオンＰＫ２１
２ （Ｈ’タイプ、三菱化成）のカラム（１４ｘ １９
０ｃｍ ）に付し、次いで０．３Ｍ食塩水で溶出する。
得られた画分を希ＮａＯＨで注意深く中和した後、シリ
カゲ／Ｉ／（キーセルグル６０．メル２社）のカラＩ＾
（５，Ｏｘ ５０個）に付す。カラムをクロロホルム−
メタノール−水（１５：１０：２）１（ｌで洗浄し、次
いでクロロホルム−メタノール−水（１０°１０ ：
２ ） １５℃でＧＭＰ３−、 ＧＭＰ４−Ｂ混在画分
全溶出させ、次いでメタノ−Ｊｖｌｏｒｔｃ ＧＭｐ
３−＋ ＧＭＰ４−Ａ混在画分’ｘ ｍ 出すセる。両
画分ヲ５０℃以トで減圧ａ縮後、それぞれをダイアイオ
ンＨＰ−２０（三菱化成）のカラム（２０ｘ １３５
ｃｉ、）に付す。常水１ ｏｎ、次いで５チメタノール
１０２で溶出すると、水溶出画分からはＧＭＰ３−Ａ及
びＧＭＰ３−Ｂが、５％メタノール溶出画分からはＧＭ
Ｐ４−Ａ及びＧＭＰ ４−Ｂ が（４４られる。このよ
うにして得られたＧＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ４−Ａ、 Ｇ
ＭＰ３−Ｂ。
カゲ／Ｉ／（キーセルグル６０．メル２社）のカラＩ＾
（５，Ｏｘ ５０個）に付す。カラムをクロロホルム−
メタノール−水（１５：１０：２）１（ｌで洗浄し、次
いでクロロホルム−メタノール−水（１０°１０ ：
２ ） １５℃でＧＭＰ３−、 ＧＭＰ４−Ｂ混在画分
全溶出させ、次いでメタノ−Ｊｖｌｏｒｔｃ ＧＭｐ
３−＋ ＧＭＰ４−Ａ混在画分’ｘ ｍ 出すセる。両
画分ヲ５０℃以トで減圧ａ縮後、それぞれをダイアイオ
ンＨＰ−２０（三菱化成）のカラム（２０ｘ １３５
ｃｉ、）に付す。常水１ ｏｎ、次いで５チメタノール
１０２で溶出すると、水溶出画分からはＧＭＰ３−Ａ及
びＧＭＰ３−Ｂが、５％メタノール溶出画分からはＧＭ
Ｐ４−Ａ及びＧＭＰ ４−Ｂ が（４４られる。このよ
うにして得られたＧＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ４−Ａ、 Ｇ
ＭＰ３−Ｂ。
ＧＭＰ４−Ｂ 画分全それぞれ５０℃以１゛で減圧濃
縮後、ＣＭ−セファデックス＜ ｎｉタイプ′）のカラ
ム（ｉ５ｘ １３５ＣＩ１１ ） に例し、次いで０
．５ Ｘ １Ｏ−３Ｎ塩酸１０Ｑで溶出する。得られた
＋１！！ｌ’＋）をｆｆ、ＮａＯＨで中和した後、５０
℃以ドで減圧濃縮し、次いでセファデックスＧ−２５０
カフム（６，ＯＸ １６０ｃｍ ）でのゲルρ過により
脱塩する。溶出液を５０℃以−ドで減圧濃縮し、凍結乾
燥してＧＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ４−Ａ。
縮後、ＣＭ−セファデックス＜ ｎｉタイプ′）のカラ
ム（ｉ５ｘ １３５ＣＩ１１ ） に例し、次いで０
．５ Ｘ １Ｏ−３Ｎ塩酸１０Ｑで溶出する。得られた
＋１！！ｌ’＋）をｆｆ、ＮａＯＨで中和した後、５０
℃以ドで減圧濃縮し、次いでセファデックスＧ−２５０
カフム（６，ＯＸ １６０ｃｍ ）でのゲルρ過により
脱塩する。溶出液を５０℃以−ドで減圧濃縮し、凍結乾
燥してＧＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ４−Ａ。
ＧＭＰ３−Ｂ、 ＧＭＰ４−Ｂ ’ｉそれぞれ３８ｆ
’、 ３８ｊｉ’、 ６７．８ｆＦ。
’、 ３８ｊｉ’、 ６７．８ｆＦ。
５６．２ｙ−得た。
実施例３ ＧＭＰ、−Ａ及びＧＭＰ４−Ａの製造参考
例６に記載の方法で得られたラクトバシラス・プランタ
ラムＡＴＣＣ８０１４のアルカリ処理細胞壁１，２００
ｆをリン酸緩衝液（ｐＨ８，５，最終濃度０．０２Ｍ）
３ＯＮに懸濁し、よく分散させた後、Ｍｌ−アセチル
ムラミダーゼ２．４ｒ、クロロホルム５０ｍ１ 、 Ｃ
ｏＣｌ２’６Ｈ２０１４，３ｒ 、参考例８に記載の方
法で得られた固定化ＡＭ３−エンドペプチダーゼＬＯ１
ｉｌ（乾燥重量）を加え、更に常水？加えて６０Ａとし
、３７℃で４８時間攪拌する。反応液を脱水機に付して
固定化酵素を除去した後、上清液を濃塩酸でｐＨ２，５
〜３ｏに調整し、生じた沈殿を高速遠心で除去する。上
清液全希ＮａＯＨで注意深く中和した後、ダイアイオン
ＰＡ ３１６ （ＣＩ−タイプ）のカラム（１０ｘ １
４０ｃｍ）に通し、夾雑物を吸着除去する。非吸着画分
をタイアイオンＰＫ２１２（Ｈ＋タイプ）のカラム（１
４Ｘ ｚ９ｏｃ１４）に付し。
例６に記載の方法で得られたラクトバシラス・プランタ
ラムＡＴＣＣ８０１４のアルカリ処理細胞壁１，２００
ｆをリン酸緩衝液（ｐＨ８，５，最終濃度０．０２Ｍ）
３ＯＮに懸濁し、よく分散させた後、Ｍｌ−アセチル
ムラミダーゼ２．４ｒ、クロロホルム５０ｍ１ 、 Ｃ
ｏＣｌ２’６Ｈ２０１４，３ｒ 、参考例８に記載の方
法で得られた固定化ＡＭ３−エンドペプチダーゼＬＯ１
ｉｌ（乾燥重量）を加え、更に常水？加えて６０Ａとし
、３７℃で４８時間攪拌する。反応液を脱水機に付して
固定化酵素を除去した後、上清液を濃塩酸でｐＨ２，５
〜３ｏに調整し、生じた沈殿を高速遠心で除去する。上
清液全希ＮａＯＨで注意深く中和した後、ダイアイオン
ＰＡ ３１６ （ＣＩ−タイプ）のカラム（１０ｘ １
４０ｃｍ）に通し、夾雑物を吸着除去する。非吸着画分
をタイアイオンＰＫ２１２（Ｈ＋タイプ）のカラム（１
４Ｘ ｚ９ｏｃ１４）に付し。
次いで０．３Ｍ食塩水で溶出する。得られた両分を希Ｎ
ａＯＨで中和した後、タイアイオンＨＰ−２０のカラム
（２０ｘ １３５ＣＩｌ）に付し、水で溶出されるＧＭ
Ｐ ３−Ａ と５％メタノールで溶出されるＧＭＰ、
−Ａに分画する。このようにして得られたＧＭＰ３−Ａ
。
ａＯＨで中和した後、タイアイオンＨＰ−２０のカラム
（２０ｘ １３５ＣＩｌ）に付し、水で溶出されるＧＭ
Ｐ ３−Ａ と５％メタノールで溶出されるＧＭＰ、
−Ａに分画する。このようにして得られたＧＭＰ３−Ａ
。
ＧＭＰ、−Ａ 画分をそれぞれ逆浸透装置（ＲＯ−モジ
ュー／Ｌ’ＲＴ−１．住友化学）で脱塩濃縮した後、Ｃ
Ｍ−セファデックヌ（Ｈ″タイプのカラム（１５×１３
５ｃｉ）に付し、次いで０，０ＯＩＮ塩酸１Ｍで溶出す
る。得られた両分を希ＮａＯＨで中和した後、５０℃以
下で減圧濃縮し１次いでセファデックスＧ−２５のカラ
ム（６，Ｏｘ １６０ｃｍ）でのゲル沖過により脱塩す
る。溶出液を５０℃以ドで減圧濃縮し、凍結乾燥しテＧ
ＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ４−Ａ ’ｉｉそれぞれ１１０ｆ
、９０？得た。
ュー／Ｌ’ＲＴ−１．住友化学）で脱塩濃縮した後、Ｃ
Ｍ−セファデックヌ（Ｈ″タイプのカラム（１５×１３
５ｃｉ）に付し、次いで０，０ＯＩＮ塩酸１Ｍで溶出す
る。得られた両分を希ＮａＯＨで中和した後、５０℃以
下で減圧濃縮し１次いでセファデックスＧ−２５のカラ
ム（６，Ｏｘ １６０ｃｍ）でのゲル沖過により脱塩す
る。溶出液を５０℃以ドで減圧濃縮し、凍結乾燥しテＧ
ＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ４−Ａ ’ｉｉそれぞれ１１０ｆ
、９０？得た。
実施例４ ＧＭＰ３−Ａ及びＧＭＰ、−Ａの製造参考
例７に記載の方法で得られたラクトバシラス・プランタ
ラムＡＴＣＣ８０１４のアルカリ処理細胞壁１．２００
５’をリン酸緩＃液（ｐＨ８，５，最終濃度０．０２Ｍ
） ３０ｆｔに懸濁し、よく分散させた後、Ｍ、−ア七
チルムラミターセ２．４ｙ、クロロポルム５ｏ肩ｅを加
え、更に常水を加えて６０Ｑとし、３７℃で２４時間攪
拌する。反応液を濃塩酸でｐＨ２，５〜３．０に調整し
、生じた沈殿を高速遠心で除去する。上清ｇ！ｌ’ｅ濃
ＮａＯＨで中和した後、ダイアイオンＰＡ３１６（ＣＩ
−タイプ）のカラム（１０ｘ １４０ Ｃ１ｌ＋）に通
し、夾雑物を吸着除去する。非吸着画分を電気透析器（
セレニオン透析櫓ＤＵ〜Ｏｂ型）により脱塩した後、塩
酸でｐＨ６，５に調整する。参考例９に記載の方法で得
られたＡＭ３−エンドペプチダーゼ結合ＣＭ−セファデ
ックスＣ−２５ｉカラム（１０×１００Ｃ１１）に充填
し、３７°Ｃに保温しながら、上記溶液全流速１００ｍ
ｌ／分で通す。この操作を２〜３回くり返す。得られた
反応（＆をダイアイオンＰＫ２１２（Ｈ＋タイプ）のカ
ラム（１４ｘ １９０ｃｍ ）に付し。
例７に記載の方法で得られたラクトバシラス・プランタ
ラムＡＴＣＣ８０１４のアルカリ処理細胞壁１．２００
５’をリン酸緩＃液（ｐＨ８，５，最終濃度０．０２Ｍ
） ３０ｆｔに懸濁し、よく分散させた後、Ｍ、−ア七
チルムラミターセ２．４ｙ、クロロポルム５ｏ肩ｅを加
え、更に常水を加えて６０Ｑとし、３７℃で２４時間攪
拌する。反応液を濃塩酸でｐＨ２，５〜３．０に調整し
、生じた沈殿を高速遠心で除去する。上清ｇ！ｌ’ｅ濃
ＮａＯＨで中和した後、ダイアイオンＰＡ３１６（ＣＩ
−タイプ）のカラム（１０ｘ １４０ Ｃ１ｌ＋）に通
し、夾雑物を吸着除去する。非吸着画分を電気透析器（
セレニオン透析櫓ＤＵ〜Ｏｂ型）により脱塩した後、塩
酸でｐＨ６，５に調整する。参考例９に記載の方法で得
られたＡＭ３−エンドペプチダーゼ結合ＣＭ−セファデ
ックスＣ−２５ｉカラム（１０×１００Ｃ１１）に充填
し、３７°Ｃに保温しながら、上記溶液全流速１００ｍ
ｌ／分で通す。この操作を２〜３回くり返す。得られた
反応（＆をダイアイオンＰＫ２１２（Ｈ＋タイプ）のカ
ラム（１４ｘ １９０ｃｍ ）に付し。
次いで０．３Ｍ食塩水２０Ｑで溶１ｔ’、する。得られ
た画分金希ＮａＯＨで中和した後、ダイアイオンＨＰ−
２０のカラム（２０ｘ １３５ Ｃ？Ｉ＋）に付し、以
後実施例３と同様に処理してＧＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ、
−Ａをそれぞれ１００ｆ。
た画分金希ＮａＯＨで中和した後、ダイアイオンＨＰ−
２０のカラム（２０ｘ １３５ Ｃ？Ｉ＋）に付し、以
後実施例３と同様に処理してＧＭＰ３−Ａ、 ＧＭＰ、
−Ａをそれぞれ１００ｆ。
ｓｏｔ得た。
実施例５ ＧＭＰ３−Ｂ及びＧＮＰ ４−ＢからＧＭ
Ｐ３−Ａ及びＧＭＰ、−Ｂ １，００（ｑ’ｊｚ Ｏ，
ＩＮ Ｌｉ酸１０ｔｘｅに溶解し、６０”Ｃで８時間加
熱する。冷後、反応液を希ＮａＯＨでｐＨ６，０に調整
し、５０℃以下で減圧濃縮した後。
Ｐ３−Ａ及びＧＭＰ、−Ｂ １，００（ｑ’ｊｚ Ｏ，
ＩＮ Ｌｉ酸１０ｔｘｅに溶解し、６０”Ｃで８時間加
熱する。冷後、反応液を希ＮａＯＨでｐＨ６，０に調整
し、５０℃以下で減圧濃縮した後。
セファデックスＧ−２幻カラムでのゲルρ過により脱塩
する。溶出液を５０℃以Ｆで減圧７１縮し、凍結乾燥し
てＧＭＰ３−Ａ ９６０■を得た。。
する。溶出液を５０℃以Ｆで減圧７１縮し、凍結乾燥し
てＧＭＰ３−Ａ ９６０■を得た。。
ＧＭＰ４−８１，０００〜を用い、上記と同様に反応・
処理してＧＭＰ４−Ａ ９６６■を得た。
処理してＧＭＰ４−Ａ ９６６■を得た。
特許出願人 人日本製薬株式会社
代理人 坪井有四部
手 続 補 正 書（０発）
１．事件の表示
昭和５７年特許願第 ９２３７号
２、発明の名称
ジサッカライドトリペプチド及びジサッカライドテトラ
ペプチドの製法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪市東区道修町３丁目２５番地５、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６゜補正の内容 ｌ）明細書第４貞ドから１０行の「Ｌ）−グルタミン」
の次に「酸」を加入する。
ペプチドの製法 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住所 大阪市東区道修町３丁目２５番地５、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄 ６゜補正の内容 ｌ）明細書第４貞ドから１０行の「Ｌ）−グルタミン」
の次に「酸」を加入する。
２）明細書第５貞５行に「ＡＣｌ」とあるのをｊＡｃｙ
ｌＪと訂正する。
ｌＪと訂正する。
３）明細書第５＠５行の「グリコリル基」の次に「で」
を加入する。
を加入する。
４）明ａ曹第１１貞１１〜１２行に「微ユ］研菌寄第５
４７５号」とあるのを「微工研条寄第２１６号」と訂正
する。
４７５号」とあるのを「微工研条寄第２１６号」と訂正
する。
５）明細書第２４頁の表のドア行、その行全体を削除し
て次の式を挿入する。
て次の式を挿入する。
６）明細書第２８貞７行に「セレニオン」とあるのを「
セレミオン」と訂正する。
セレミオン」と訂正する。
７）明細書第３９頁７〜８行に１−β−エキソグルコー
スアミダーゼ」とあるのを［エキンーβ−Ｎ＝アセチル
グルコサミダーゼ」と訂正する。
スアミダーゼ」とあるのを［エキンーβ−Ｎ＝アセチル
グルコサミダーゼ」と訂正する。
８）明細書第４４頁６行に［セレニオン」とあるのを「
セレミオン」と訂正する。
セレミオン」と訂正する。
７、添付書類の目録
（１）微生物国際寄託についての受託証 １通以
上
上
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 細胞壁構築成分として、アミノ基がアセチル化されたム
ラミン酸部分、イソグルタミン及びアミド化されたカル
ボキシ基を有するメソ−２゜６−ジアミノピメリン酸を
含む細菌の細胞壁に、ストレプトミセス・グロビスポラ
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ
）由来のＮ−アセチルレムラミダーゼ及ヒストレプ
トミセヌ・ニトロスポレウスＳＫ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｎ１ｔｒｏｓｐｏｒｅｕｓ ＳＫ ）又はスト
レプトミセス・グロビスポラス由来のＤ−アラニル−メ
ソ−２，６−ジアミノピメリン酸エンドペプチダーゼを
作用させ、更に必要に応じて加水分解することを特徴と
する一般式 ％式％ （式中、Ｒ１は水素原子又はアセチル基を意味し、Ｒ２
ハヒドロキシ基又は１−カルボキンエチルアミノ基を意
味する。） で表わされるジサッカライドトリペプチド及びジサッカ
ライドテトラペプチド並びにその塩の製法。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57009237A JPS58126797A (ja) | 1982-01-22 | 1982-01-22 | ジサツカライドトリペプチド及びジサツカライドテトラペプチドの製法 |
| US06/455,581 US4515891A (en) | 1982-01-22 | 1983-01-04 | Process for the production of disaccharide-tripeptide and disaccharide-tetrapeptide |
| FR8300952A FR2520379B1 (fr) | 1982-01-22 | 1983-01-21 | Procede de preparation d'un disaccharide-tripeptide et d'un disaccharide-tetrapeptide possedant des proprietes immunostimulantes |
| DE19833301997 DE3301997A1 (de) | 1982-01-22 | 1983-01-21 | Verfahren zur herstellung von disaccharid-tripeptiden und disaccharid-tetrapeptiden |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57009237A JPS58126797A (ja) | 1982-01-22 | 1982-01-22 | ジサツカライドトリペプチド及びジサツカライドテトラペプチドの製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58126797A true JPS58126797A (ja) | 1983-07-28 |
| JPH0147153B2 JPH0147153B2 (ja) | 1989-10-12 |
Family
ID=11714787
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57009237A Granted JPS58126797A (ja) | 1982-01-22 | 1982-01-22 | ジサツカライドトリペプチド及びジサツカライドテトラペプチドの製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4515891A (ja) |
| JP (1) | JPS58126797A (ja) |
| DE (1) | DE3301997A1 (ja) |
| FR (1) | FR2520379B1 (ja) |
Families Citing this family (13)
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|---|---|---|---|---|
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| US5416070A (en) * | 1988-07-08 | 1995-05-16 | Immunotherapeutics, Inc. | Composition for macrophage activation |
| JP2928335B2 (ja) * | 1989-06-26 | 1999-08-03 | 株式会社ヤクルト本社 | 抗高血圧剤および飲食品 |
| WO1991006009A1 (en) * | 1989-10-16 | 1991-05-02 | Amgen Inc. | N-acetylmuramidase m1 |
| CH680192A5 (ja) * | 1989-12-13 | 1992-07-15 | Nestle Sa | |
| JP3516318B2 (ja) | 1995-03-07 | 2004-04-05 | 雪印乳業株式会社 | 新規エンドペプチダーゼ |
| JP2000210050A (ja) * | 1998-11-20 | 2000-08-02 | Asama Kasei Kk | 免疫調節活性分解物およびその製造方法並びにそれを用いた食品 |
| US6827940B1 (en) | 2000-05-25 | 2004-12-07 | Aidan Products, Llc | Immune-stimulating bacterial cell wall extracts |
| JP4300289B2 (ja) * | 2002-08-27 | 2009-07-22 | 国立大学法人 岡山大学 | 加水分解又は脱水縮合酵素、及び当該酵素の生産方法、並びに当該酵素を用いたアミドの合成方法 |
| US7112564B2 (en) * | 2003-04-09 | 2006-09-26 | Zylacta Corporation | Biodegradable glucosaminemuramyl peptides for apoptosis modulation |
| EP2540818A1 (en) * | 2008-09-04 | 2013-01-02 | OM Pharma | Immunomodulatory extracts from lactobacillus bacteria and methods of manufacturing and use thereof |
| US20100055082A1 (en) * | 2008-09-04 | 2010-03-04 | Jacques Alain Bauer | Immunomodulatory extracts from lactobacillus bacteria and methods of manufacturing and use thereof |
| CN117535211B (zh) * | 2024-01-09 | 2024-04-16 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种白喉杆菌的培养基组合及白喉类毒素的制备方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3929579A (en) * | 1969-06-07 | 1975-12-30 | Dainippon Pharmaceutical Co | Dental caries-inducing microorganism cells lytic enzyme |
| US4186194A (en) * | 1973-10-23 | 1980-01-29 | Agence Nationale De Valorisation De La Recherche (Anvar) | Water soluble agents effective as immunological adjuvants for stimulating, in the host the immune response to various antigens and compositions, notably vaccines containing said water soluble agents |
| JPS58198496A (ja) * | 1982-05-14 | 1983-11-18 | Dainippon Pharmaceut Co Ltd | グルコサミニルムラミルペプチド誘導体 |
-
1982
- 1982-01-22 JP JP57009237A patent/JPS58126797A/ja active Granted
-
1983
- 1983-01-04 US US06/455,581 patent/US4515891A/en not_active Expired - Fee Related
- 1983-01-21 FR FR8300952A patent/FR2520379B1/fr not_active Expired
- 1983-01-21 DE DE19833301997 patent/DE3301997A1/de not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE3301997A1 (de) | 1983-08-04 |
| FR2520379A1 (fr) | 1983-07-29 |
| US4515891A (en) | 1985-05-07 |
| FR2520379B1 (fr) | 1985-11-22 |
| JPH0147153B2 (ja) | 1989-10-12 |
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