JPH0577657B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グラム陰性バクテリアに対する新規
な無毒性の免疫組成物及び新規なその製造法に関
する。本発明の特別な目的は緑膿菌
（Pseudomonas aeruginosa）の感染に対して効
果のある免疫組成物を製造することである。本発
明の更なる目的は以下の記述から明らかになるで
あろう。ここに本明細書において、部及び百分率
は断らない限り重量によるものとする。 グラム陰性バクテリアは、１つのペプチドグリ
カンの薄層によつて隔離された２つの細胞包囲膜
を有する。内側の、即ち細胞形質膜は、すべての
公知の活性な輪送系及び細胞包囲酵素の多くを含
んでいる。外側の膜は、独特な成分リポ多糖類
（脂質Ａ＋多糖類）及び独特な蛋白質の組合せが
特色である。Ｏ抗原−特異的多糖類は、あるバク
テリアに血清学的特異性を与える。また脂質成分
（脂質Ａ）に結合した中心多糖類もグラム陰性バ
クテリアに共通に存在する。これらの脂質Ａ、多
糖類及び蛋白質の複合体は抗原であり、また人間
において毒性反応を示し、従つて内毒素として考
えられている。 グラム陰性バクテリアからのリポ多糖類
（LPS）を含むワクチンは、人間の感染に対する
免疫のために使用されてきた。このワクチンは死
んだ細胞、細胞溶解質、又は精製LPSを含んでい
てよいが、その多くは有毒であつた。 緑膿菌での感染は一般的な固体群の中で普通の
ものではないけれど、緑膿菌の感染はある敏感な
患者群の場合に非常にしばしば観察される。火傷
の被害者及び免疫の抑制されたガン患者は、ひど
い時には致命的な緑膿菌の感染を受けるという異
常なほど高い危険性をもつたものとされてきた。
緑膿菌の感染は普通家庭ではなくて病院に居ると
きに受ける。 緑膿菌感染の患者を処置するために、抗生物質
が使用されてきた。しかしながら、抗生物質での
処置は費用がかかり、効果がしばしば不確かであ
り、微生物は抗生物質に耐えて生長しつづける。 緑膿菌を含めて多くの病原バクテリアに対し、
多くのワクチンが製造されてきた。例えば米国特
許第4157389号は、抗原として、感染−保護に普
通の抗原、緑膿菌から得られる原形の内毒素蛋白
質、緑膿菌から得られるエラスターゼ類毒素と緑
膿菌から得られるプロテアーゼ類毒素を含んでな
る、緑膿菌によつて引き起こされる感染に対して
３成分混合ワクチンを開示している。 緑膿菌によつて引き起こされる感染を防ぐのに
有効である緑膿菌のプロテアーゼ及びエラスター
ゼに由来する類毒素は米国特許第4160023号に記
述されている。 米国特許第3987164号は、予防的製薬学的調製
剤中に緑膿菌の細胞壁成分を活性成分として含ん
でなるワクチン調製剤を開示している。 緑膿菌によつて引き起こされるミンクの感染
は、米国特許第4096245号に従い、予防的調製剤
を、有効成分が主に蛋白質及び少量の緑膿菌に由
来する脂質と糖からなるワクチンの形でミンクに
投与することによつて防止することができる。緑
膿菌に由来する原形の内毒素蛋白質は米国特許第
4079126号に開示されている。特許の製造法にお
いては、原形の内毒素蛋白質を蛋白質分解酵素又
は還元剤で処理する、或いは更に還元剤で処理し
た後蛋白質分解酵素で処理する。 蛋白質抗原に共有的に結合した毒性の減ぜられ
たバクテリアの内毒素LPSは米国特許第4185090
号に記述されている。結合はハロアシルハライド
との反応で行なう。二塩基性酸の無水物でアシル
化したLPSが解毒される。蛋白質抗原に共有結合
された内毒素多糖類との組合せにおいて、それは
相乗的免疫原（imprunogen）効果を発現する。 米国特許第4285936号においては、緑膿菌培養
物の粗粘液物から無毒性の高分子量多糖類抗原を
分離するための方法及び該生活微生物に対する宿
主の免疫を誘導するための方法が記述されてい
る。最初に、バクテリア細胞を、粘液物から燐酸
塩緩衝液に溶解して分離する。溶解した汚染核酸
を除去した後、汚染LPS成分の脂質Ａ部分を酢酸
での加水分解により除去し且つ沈殿させる。残り
の脂質をクロロホルムで抽出する。次いで残存す
る核酸の殆んどすべてを、ヌクレアーゼで消化す
ることによつて除去し、残りの蛋白質をフエノー
ルで抽出する。水性層及びフエノール層を分離
し、水性層をゲル過に供して、カラムクロマト
グラフイにより多糖類抗原を分離する。この多糖
類抗原は無毒性での宿主の微生物に対する免疫応
答を減ずるのに非常に効果的である。 今回、グラム陰性バクテリアからの解毒された
多糖類に、炭素数４〜12の残基によつて共有結合
された該グラム陰性バクテリアに由来する解毒さ
れた蛋白質を含んでなる免疫組成物が発見され
た。本発明の新規な免疫剤は、最初にグラム陰性
バクテリアに由来するリポ多糖類の脂質Ａ部分を
分離して、脂質Ａを含まない解毒された多糖類を
得、これを選択的に酸化してそれにアルデヒド基
を生成させるという方法によつて製造される。選
択的に酸化した脂質Ａを含まない多糖類は、脂質
Ａを含まない多糖類のアルデヒド基及び解毒され
た蛋白質のカルボン酸基に対して反応性のある官
能基を含む炭素数４〜12の残基により、該アルデ
ヒド基を通して該グラム陰性バクテリアに由来す
る蛋白質に共有結合される。本発明の組成物は、
バクテリア感染を防ぐための非経口投与に対する
及び供与体の、グラム陰性バクテリアの抗体値を
増大させる目的で該供与体に投与するためのワク
チンとして有用である。そのような供与体から集
められた血液を集め且つ分画して、該抗体を非常
に高い力価で有する免疫血清グロブリンを得るこ
とができる。この高力価の免疫血清グロブリンは
特別なグラム陰性バクテリアの感染した患者に投
与してよい。 本発明の組成物が毒性又は内毒素活性を含まな
い高度の免疫原性を示すということは該組成物の
特別な利点である。確かに本免疫薬剤の免疫原性
は、元のリボ多糖類のそれに殆んど同等である。
ここに毒性又は内毒素活性を含まないとは、組成
物がマウスの体重低下を引き起こさず或いは体重
増加に失敗せず、またカブトガニ（Limulus）の
アメーバ様細胞の溶解質試験においてリポ多糖類
の1000分の１以下の活性しか有さないことを意味
する。脂質Ａを含まない多糖類及び解毒された蛋
白質がそれぞれ免疫原でないということを示すこ
とは重要である。更に脂質Ａを含まない多糖類及
び解毒された蛋白質の混合物も不活性である。 上述のように本発明の免疫組成物は、グラム陰
性バクテリアからの解毒された多糖類に、炭素数
４〜12の残基によつて共有結合されたグラム陰性
バクテリアに由来する解毒された蛋白質を含んで
なる。 以下の記述においては、緑膿菌に力点が置かれ
よう。しかしこれは単なる例示であつて、制限を
加えるものではない。本発明は、その範囲におい
て、グラム陰性バクテリア例えば大腸菌、プロテ
ウス種、セリシア（Serritia）種、クレブシエラ
種などに対する免疫組成物も含む。 緑膿菌に対する免疫組成物の製造の第１工程で
は、緑膿菌バクテリアのLPS−蛋白質複合体の蛋
白質部分を複合体の残りの部分から分離する。こ
れは種々の公知の化学的及び物理的方法によつて
達成することができる。例えば化学的方法例えば
グアナジニウムチオシアネート、双生イオン洗
剤、リゾチーム−エチレンジアミン四酢酸、ドデ
シル硫酸ナトリウム、ジメチルホルムアミドなど
を使用しうる。参照、例えばMoldowら、J.
Membrane Biol.，10，137−152（1972），
Hancockら、J.of Bacteriology，136，381−390
（1978），Stinnettら、同上、114，399−407
（1973），及びRobinsonら、FEMS Microbiol.
Lett.，５，131−134（1979）。蛋白質−LPS複合
体から蛋白質を抽出するための物理的方法の例と
しては、滲透圧シヨツク及び超音波のような手段
を使用しうる。蛋白質の抽出は上述の方法の組合
せによつて達成してもよい。 次いで抽出した又は分離した蛋白質を解毒す
る。この目的のために、蛋白質を穏やかな水性ア
ルカリ性加水分解に供して酵素及び内毒素のよう
な毒性成分を破壊する。一般にアルカリの濃度及
び温度及び処理の期間は、蛋白質を解毒するの
に、即ち蛋白質を人間に投与した時に無毒性にす
るの十分なものである。アルカリとしては、水酸
化ナトリウム又は水酸化カリウムを水又は溶媒溶
液中などで使用することができる。普通、蛋白質
１部を、0.1〜3.0Mアルカリの約0.1〜10.0部と混
合する。加水分解は一般に約45〜80℃の温度で約
0.5〜５時間行なわれる。加熱後、常法例えば超
過、凍結乾燥などにより、混合物から水を除去
する。約10000よりも少さい分子量の物質を混合
物から除去することが望ましい。これは公知の方
法により、例えば透析、超過などによつて達成
しうる。 LPSは公知の方法により、例えばWestphalら、
Z.Naturforsch，79，148〜155（1952）のフエノ
ール−水抽出法、トリクロル酢酸法（Staub，
Meth.Carbohydrate Chem.，５巻、92〜93頁、
1965年）、水性ブタノール法（Leiveら、Meth.
Enzymol，28巻、254〜262頁、1972年）などで
緑膿菌バクテリアから分離できる。Westphalら
の方法では、緑膿菌バクテリアをフエノール−水
混合物で抽出することによつてLPSを分離する。
粗LPSを超音波にかけ、リボヌクレアーゼ及びデ
オキシリボヌクレアーゼで消化する。プロナーゼ
での消化後、LPS調製物を透析及び超過に供し
て低分子量の種を除去する。 続いてこのように分離したLPSを穏やかな酸性
加水分解（Drewryら、Biochem.J.，149，93〜
106（1975））に供して脂質Ａ残基を除去する、即
ち脂質Ａを含まない解毒された多糖類を製造す
る。この目的のために、酢酸、塩酸などを使用し
てもよい。一般に、LPSを水性媒体中において
LPS部当り約１〜４部の割合で酸と混合する。例
えばLPSは、LPSの濃度が約１〜５mg／mlである
ように酸の0.5〜３％水溶液と混合すると良い。
次いで混合物である温度に、LPSの脂質Ａ部分を
除去するのに十分な期間、普通60〜100℃に約１
〜24時間加熱する。生成する沈殿は、LPSの脂質
Ａ部分を含んでなり、常法例えば遠心分離、傾
斜、過などによつて脂質Ａを含まない多糖類か
ら分離される。すべての脂質Ａの除去を確めるた
めに、脂質Ａを含まない多糖類を含む上澄液を凡
そ中性に調節し、クロル炭化水素−アルコールで
抽出する。 脂質Ａを含まない多糖類を含有する水性層を濃
縮し、そして脂質Ａを含まない多糖類を常法によ
り、例えばゲル過、カラムクロマトグラフイー
などにより精製し、次いで例えば回転蒸発及び凍
結乾燥で乾燥する。 次いで、脂質Ａを含まない多糖類を選択的に酸
化して、解毒した多糖類上にアルデヒド基を生成
させる。これは公知の方法により、例えばSand
−ersonら、Immunology，20，1061〜1065
（1971）に記述されている如き過ヨウ素酸酸化に
よつて行なうことができる。従つて脂質Ａを含ま
ない多糖類を過ヨウ素酸イオン源、例えば過ヨウ
素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムなどの、解
毒された多糖類にアルデヒド基を選択的に発生さ
せるのに十分な量で処理する。一般に、解毒され
た多糖類１〜20mg／mlを含有する水溶液を、暗所
中室温下に10〜24時間過ヨウ素酸塩１〜100mM
で混合する。反応をエチレングリコールの添加に
よつて停止し、選択的に酸化された脂質Ａを含ま
ない多糖類を、例えばカラムクロマトグラフイー
又はゲル過によつて精製し、次いで蒸発、凍結
乾燥などによつて処理して水を除去する。 選択的に酸化された脂質Ａを含まない多糖類
は、この多糖類のアルデヒド基に対して及び解毒
された蛋白質のカルボン酸基に対して反応性の官
能基を有する炭素数４〜12の残基によつて解毒さ
れた蛋白質に結合せしめられる。従つて解毒され
た蛋白質は少くとも２つのアミノ基を含有する炭
素数４〜12の残基と結合する。一般に過剰のアミ
ンを使用する。即ち例えば約３〜20部のアミン
を、緩衝媒体（PH5.0〜7.0）中約20〜40℃の温度
下に約１〜５時間、解毒された蛋白質１部と混合
することができる。好ましくは、この結合反応
は、アミノ基の、解毒された蛋白質上のカルボン
酸基への結合を促進する試剤の存在下に行なうこ
とが望ましい。この一般的に好適な試剤は、
Cuatrecasas，J.Biol，Chem.，245，3059〜3065
（1970）に記述されているようなカルボジイミド
である。普通、カルボジイミドはアミン量の約
0.5〜２部の量で存在する。上述のカルボジイミ
ドで促進されたアミド結合反応の後、混合物を通
常の手段、例えば透析又は透析過で処理して、
未反応のアミン化合物及びカルボジイミドを除去
する。好ましくは、上記反応混合物を、続くこの
誘導体化された解毒済み蛋白質の、上述の如く調
製した脂質Ａを含まない多糖類への結合反応にお
ける反応媒体と親和性のある緩衝系に対して透析
する。普通、緩衝系のPHは約7.0〜9.0である。 選択的に酸化した脂質を含まない多糖類は、こ
の脂質を含まない多糖類のアルデヒド基と反応す
るために存在するアミノ基を含む炭素数４〜12の
残基で誘導体化された解毒済み蛋白質に、シツフ
塩基反応で結合せしめられる。この結合反応で
は、反応を還元剤の存在下に行なうことが望まし
い。この目的のために好適な還元剤はBorchら、
J.Am.Chem.Soc.，93，2897〜2904（1971）に記
述されているようなシアノボロヒドリドである。
一般に乾燥した脂質Ａを含まない多糖類約１〜５
部及びシアノボロヒドリド２〜20部を、PH約7.0
〜9.0の緩衝系において誘導体化された解毒済み
蛋白質0.5〜３部と混合する。次いで反応混合物
を約24〜168時間約20〜50℃に保つ。生成物は炭
素数４〜12の残基によつて、解毒された脂質Ａを
含まない多糖類に共有結合された解毒済み蛋白質
を含んでなる。この時解毒された蛋白質はアミド
結合によつて炭素数４〜12の残基に結合し、また
脂質Ａを含まない多糖類はアミン結合によつて炭
素数４〜12の残基に結合する。この生成物はカラ
ムクロマトグラフイー、ゲル過などによつて精
製することができる。 本発明の免疫組成物は、検知しうる内毒素活性
及び毒性を有さず、非常に免疫原性である。ある
組成物は、人間のような宿主に、微生物に対する
免疫応答を誘導するのに効果的な量で投与するこ
とができる。またある組成物は、組成物が関係す
るグラム陰性バクテリアによる感染を防止するの
に効果的な量で宿主に投与することができる。本
組成物は単独で又は組合せて投与してもよい。投
与は皮下、筋肉内又は皮膚内に助剤を用いて又は
用いずに行ないうる。 本免疫組成物は、人間及び他の動物に対するワ
クチンを製造するための普通の方法で製造するこ
とができる。例えば免疫組成物を助剤の有無下に
適当な溶媒に溶解する。溶媒としては蒸溜水、生
理的食塩水及び燐酸塩で緩衝された水性塩化ナト
リウム溶液を用いてよい。助剤の例は水酸化アル
ミニウム、燐酸アルミニウム、燐酸カルシウム、
ミヨウバン及びフロイドの不完全助剤である。助
剤の量は必要とされる且つ免疫活性を増大させる
のに十分である量の範囲から適当に選択される。 本物質のマウスにおける免疫投薬量は、子牛の
血清アルブミン又はバクテリア蛋白質15〜52μｇ
に配合した低分子量（５×10³〜４×10⁴）の多糖
類5μｇである。 本免疫組成物は、関係するグラム陰性バクテリ
アに対する抗血清を製造するためにも使用するこ
とができる。抗体は抗血清から集めうる。抗血清
と抗体は特別なグラム陰性バクテリアによつて引
き起こされる感染を防止するために使用できる。
更に本免疫組成物を接種した供与体から集められ
た血液は、公知の方法で分画して、本発明の組成
物を投与してない供与体から得た血液から分画さ
れた免疫血清グロブリンと比較した場合に特別な
グラム陰性バクテリアに対する抗体を高い力価を
有する超免疫血清グロブリンを与える。そのよう
な免疫血清グロブリンは、患者に筋肉内投与で
き、或いは公知の方法により静脈内注射ができる
ように処理してもよい。例えば緑膿菌に由来する
免疫組成物を供与体に投与し、それから血液を集
め、分画して超免疫ガンマグロブリンを得ること
ができる。このようにして得た免疫血清グロブリ
ン又はガンマグロブリンは緑膿菌の感染を防ぐた
めに筋肉内投与できる。他に、超免疫血清グロブ
リンは、技術的に十分公知の方法に従つて静脈内
注射ができるようにすることができる。そのよう
な超免疫ガンマグロブリンは、酵素の結合した免
疫吸着評価法（ELISA）で決定して約１：8000
〜≧１：64000の緑膿菌に対する抗体力価を有す
る。これらの超免疫血清グロブリンは今まで存在
しなかつた。従つて本発明は、グラム陰性バクテ
リア、例えば緑膿菌に対するELISA抗体力価が
約１：8000〜≧１：64000の免疫血清グロブリン
を含む製薬学的調製剤も包含する。 ここに「製薬学的調製剤」とは、広い意味にお
いて、治療の目的ばかりでなく、技術的に公知の
如き薬剤の目的に、或いは組織培養に使用される
本発明の組成物を含む調製剤を包含する。治療用
が意図される製薬学的調製剤は、本組成物を治療
的量で、即ち予防又は治療の健康的尺度に対して
必要な量で含有すべきである。製薬学的調製剤を
薬剤として用いる場合には、それは組成物を薬剤
量で含有すべきである。同様に、組織培養又は培
養媒体に用いる場合には、組成物は所望の生長を
得るのに十分な量で本組成物を含有すべきであ
る。 次の例示である実施例は本発明を更に説明す
る。 実施例 １ 緑膿菌に由来する蛋白質の分離と解毒 緑膿菌免疫種３号（American Type Culture
Collection（ATCC）27314番）を、グルコース−
グルタミン−塩培地で生長させた。細胞を0.5％
ホルマリンで死亡させた。この死んだ細胞を、
5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA）及び
5mMのβ−メルカプトエタノールを含むPH7.8の
0.01Mトリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン
塩酸塩（Tris−HCl）緩衝液に懸濁させ、次いで
超音波処理した。破壊された細胞及び可溶性物質
を、室温下に18時間6Mグアニジウムチオシアネ
ートで抽出した。次いでグアニジニウムチオシア
ネートを、6M尿素に対して透析することによつ
て除去した。食塩水に溶解する画分は蛋白質を含
有した。 上述の食塩水に可溶な蛋白質を56℃で２時間、
1MNaOHで処理した。アルカリを酢酸で中和し
た。この工程では、脂質Ａに結合した脂肪酸エス
テル、即ち汚れたLPSの毒性残基が除去された。
この解毒した蛋白質をPM10フイルター
（Amicon，Lexington，MA）を用いる超過に
よつて濃縮した。この工程により、低分子量、即
ち＜10000の物質を除去した。 解毒した蛋白質は次の如く特徴づけられる： １ LPS内毒素活性なし。 ２ マウスにおいて最小毒性。 ３ カブトガニのアメーバ様細胞の溶解質評価に
おいて元の蛋白質の活性の1000分の１以下。 ４ 元の及び解毒したバクテリア蛋白質の双方に
対する抗血清と反応。 ５ HPLC（TSK Gel300SW）によると、解毒さ
れた蛋白質の80％が10〜30000MWの範囲にあ
り、20％が≧100000MWである。 実施例 ２ ジアミノブタンの、解毒された蛋白質への結合 0.05M燐酸塩で緩衝した食塩水（PH7.2）５ml
中の解毒されたバクテリア蛋白質（14mg）を、１
−（３−ジメチル−アミノプロピル）−３−エチル
カルボジイミド300mgの存在下に１，４−ジアミ
ノブタン（300mg）と結合させた。21℃で２時間
穏やかに撹拌した後、反応混合物を、PH8.3の
0.05M炭酸塩緩衝液41に対して４℃で４回透析す
ることにより過剰の試薬を除去し。アミノブチル
で誘導体化された解毒済み蛋白質はHPLC（TSK
Gel4000SW）によると85000MWの蛋白質を約94
％含有するものとして特徴づけられた。 実施例 ３ 緑膿菌からの脂質Ａを含まない他糖類の製造 実施例１における如く準備した緑膿菌の細胞か
ら、上述のWestphalらのフエノール水抽出法に
よつてLPSを分離した。粗LPSを含有する水層を
蒸留水に対して３〜４日間透析し、フエノールと
低分子量のバクテリア物質を除去した。この粗
LPSを15分間超音波処理してLPSミセルを溶解
し、次いで0.1M酢酸塩（PH5.0）中35℃で18〜24
時間、リボヌクレアーゼ及びデオキシリボヌクレ
アーゼで消化してRNA及びDNAの不純物を除去
した。LPSにおけるバクテリア蛋白質、リボヌク
レアーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼの汚染物
を、PH7.0で24時間、プロナーゼの消化に供した。
このLPSを、AmiconＲ○ 中空繊維カートリツジ
（HI×50）中を通して透析過及び超過するこ
とにより低分子量の核酸、ペプチド、及びアミノ
酸を除去し、精製した。 この精製したLPSを2.5mg／mlの濃度において
１％酢酸中で処理し、次いで87℃に18時間加熱し
た。脂質Ａの沈殿を遠心分離によつて除去した。
酢酸の上澄液をNaOHでPH7.0に調節し、
CHCl₃：メタノール（容量比２：１）混合物の２
容量で３〜５回抽出して残存する脂質Ａを除去し
た。多糖類を含む水性層を真空下に回転蒸発させ
て濃縮した。更にBioGel−A5m（2.6cm×100cm）
のカラムクロマトグラフイーにより脂質Ａを含ま
ない多糖類（PS）を分画した。BiioGel−A5m
クロマトグラフイーからの遅い画分をSephadex
Ｒ○ Ｇ−25（2.6×100cm）カラムで更に精製した。
SephadexＲ○ Ｇ−25からの主たる流出容量を一緒
にし、回転蒸発又は凍結乾燥で濃縮した。 この多糖類は次のように特徴づけられる： １ 内毒素（LPS）活性がない。 ２ マウスにおける毒性なし。 ３ カブトガニのアメーバ様細胞の溶解質評価に
おいてLPSの活性の1000分の１以下。 ４ 寒天ゲル中、LPSに対する抗血清と反応。 ５ マウスにおいて抗体或いは耐感染性を誘導し
ない。 ６ ５×10³〜４×10⁴のMW。 実施例 ４ 多糖類の選択的酸化 実施例３からの多糖類（2.5mg／ml）を、暗所
中室温下に19時間NaIO₄（32mM）で酸化した。
反応の終りにエチレングリコールを添加して過剰
のNaIO₄を分解し、溶液を室温で更に３〜４時間
放置した。選択的に酸化した多糖類をゲル過
（SephadexＲ○ Ｇ−25カラム，1.0cm×100cm）で更
に精製した。主たる炭水化物含有の画分を一緒に
し、凍結乾燥した。 選択的に酸化した多糖類は次のように特徴づけ
られる： １ 元の多糖類よりもアルデヒド基の数が増加。 ２ LPSに対する抗血清と反応。 ３ MW範囲の変化なし。 実施例 ５ 選択的に酸化した多糖類と誘導された解毒済み
蛋白質の結合 実施例４からの凍結乾燥した、選択的に酸化さ
れたPS（10mg）及びナトリウムシアノボロヒドリ
ド25mgを、誘導体化された解毒済み蛋白質4.4mg
を含有するPH8.3の0.5MNaHCO₃2.2ml中に溶解
し、反応を37℃で74時間行なつた。この反応混合
物をSephadexＲ○ Ｇ−100カラム（100cm×1.0cm）
でのゲル過によつて更に精製した。 このようにして得た生成物は次の如く特徴づけ
られる： １ 精製された多糖類が無毒性蛋白質に共有結
合。 ２ マウスにおける毒性なし。 ３ カブトガニのアメーバ様細胞の溶解質評価に
おいてLPSの活性の1000分の１以下。 ４ LPS及び解毒された蛋白質に対する抗血清と
反応。 ５ マウスにおいて血清抗体及び耐感染性を誘
導。 ６ 600000MWの範囲に約90％ 実施例 ６ マウスでの研究 【表】 【表】 結論：多糖類：蛋白質配合体で免疫にしたマウス
だけに、受動的な保護抗体の、感染及び刺激に
対する耐性が生じた。 【表】 結論：１ 非常に保護的な抗体が配合体ワクチン
の３回の注射後に生成した。 ２ 活性免疫性が免疫から少くとも２〓ケ月間
持続した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 解毒された多糖類に炭素数４〜12の残基によ
   つて共有結合された、グラム陰性バクテリアに由
   来する解毒された蛋白質を含有することを特徴と
   する毒性と内毒素をもたない、グラム陰性バクテ
   リアに対して有効な免疫組成物。 ２ 該解毒された蛋白質がアミド結合によつて炭
   素数４〜12の残基に共有結合されており、そして
   この残基は解毒された多糖類にアミン結合によつ
   て共有結合されている特許請求の範囲第１項記載
   の免疫組成物。 ３ グラム陰性バクテリアが緑膿菌
   （Pseudomonas aeruginosa）である特許請求の
   範囲第１項記載の組成物。 ４ 助剤を更に含有する特許請求の範囲第１項記
   載の組成物。 ５ 製薬学的調製物の形態である特許請求の範囲
   第１項記載の組成物。 ６ (a) グラム陰性バクテリアに由来するリポ多
   糖類の脂質Ａ部分を分離して、解毒された脂質
   Ａを含まない多糖類を得、 (b) 解毒された多糖類を選択的に酸化して、それ
   に反応性のアルデヒド基を生成させ、 (c) 該グラム陰性バクテリアに由来する蛋白質を
   解毒し、そして (d) 該蛋白質に対して及び該選択的に酸化した多
   糖類に対して反応性を有する炭素数４〜12の残
   基を用いて、該解毒された蛋白質を該選択的に
   酸化して解毒された多糖類に共有結合させる、
   ことを特徴とする、解毒された多糖類に炭素数
   ４〜12の残基によつて共有結合された、グラム
   陰性バクテリアに由来する解毒された蛋白質を
   含有する毒性と内毒素をもたない、グラム陰性
   バクテリアに対して有効な免疫組成物の製造方
   法。 ７ 炭素数４〜12の残基が少くとも２つのアミノ
   基を含有し、そして解毒された蛋白質をアミド結
   合によつてそれに結合させ、そして脂質Ａを含ま
   ない多糖類をアミン結合によつてそれに結合させ
   る特許請求の範囲第６項記載の方法。 ８ グラム陰性バクテリアが緑膿菌
   （Pseudomonas aeruginosa）である特許請求の
   範囲第６項記載の方法。