Verfahren zur Herstellung von Impfstoffen
Es ist bekannt, dass natürliche Antigene grundsätzlich aus zwei Komponenten aufgebaut sind: dem für die Antigenität wesentlichen hochmolekularen Träger und den für die antigene Spezifität verantwortlichen niedermolekularen determinanten Gruppen (siehe 0. Westphal, Immunchemie, in Handbuch der Physiologischen Chemie, herausgegeben von Flaschenträger und Lehnartz, Band II/2 b, 894 ff., Springer Verlag, 1957). Bei den hochmolekularen Trägern handelt es sich in der Regel um Proteine oder proteinhaltige Stoffe. Auch die determinanten Gruppen sind bei verschiedenen Antigentypen ihrer Natur nach bekannt, und in einzelnen Fällen konnte ihre Struktur aufgeklärt werden.
Ferner ist bekannt, dass sich mit Hilfe der Azomethode von LANDSTEINER praktisch beliebige Gruppen R über die Phenylazogruppe an beliebige Proteine (soweit diese Aminosäuren mit kupplungsfähigen aromatischen Gruppen, wie Tyrosin, enthalten) kuppeln lassen, indem man das p-Aminophenylderivat der Gruppe R:
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diazotiert und in schwach alkalischer Lösung auf das Protein einwirken lässt.
Nach diesem Verfahren lassen sich künstliche Antigene herstellen, welche sich immunologisch gleich oder ähnlich verhalten wie natürliche Antigene mit den betreffenden determinanten Gruppen. So wurde z. B. die im polysaccharidischen Kapselantigen von Typ III-Pneumococcen als determinante Gruppe nachgewiesene Cellobiuronsäure an geeignete Träger gekuppelt. Die Injektion der erhaltenen künstlichen Antigens löste bei Tieren die Bildung von Antikörpern aus, welche nicht nur mit dem künstlichen Cellobiuronsäure-Antigen, sondern auch mit Typ III Pneumococcen reagierten. Die mit den künstlichen Antigenen aktiv immunisierten Tiere erlangten spezifischen Schutz gegen sonst tödliche Infektionen mit Typ III-Pneumococcen.
Diese und andere künstliche Antigene, deren determinante Gruppen mit denjenigen grampositiver Bakterien übereinstimmen, haben jedoch keine praktische Bedeutung erlangt, da zu Impfzwecken die relativ leicht zu gewinnenden natürlichen Polysaccharid-Antigene verwendet werden können.
Anders ist die Situation bei den Polysaccharid Antigenen, den sogenannten somatischen O-Antigenen, von vielen gramnegativen Bakterien, wie z. B. der Salmonellen (Typhus-Paratyphus-Gruppe), der pathogenen Colibakterien (Enteritis-Erreger) und andern. Die aus diesen gramnegativen Bakterien gewonnenen natürlichen Antigene zeigen unerwünschte toxische Eigenschaften (Endotoxin-Wirkungen) und sind deshalb für Impfzwecke zur Immunisierung von Tieren oder Menschen gegen die betreffenden Erreger nicht geeignet. Die Herstellung künstlicher Antigene, welche im geimpften Organismus die Bildung von gegen gramnegative Bakterien wirksamen Antikörpern hervorrufen, dabei aber keine Endotoxin-Wirkung besitzen, ist deshalb ein Ziel von grosser praktischer Bedeutung.
Um dieses Ziel zu erreichen, müsste nach herkömmlicher Auffassung die Struktur der in den Antigenen gramnegativer Bakterien auftretenden determinanten Gruppen aufgeklärt werden, und dann müssten solche Gruppen synthetisch hergestellt und mit geeigneten Proteinen gekuppelt werden. Es handelt sich bei diesen determinanten Gruppen um Oligosaccharide, deren genaue Struktur jedoch erst in vereinzelten Fällen ermittelt werden konnte, und die bisher noch nicht synthetisiert worden sind. Selbst wenn aber die Synthese von solchen determinanten Gruppen gelingt, würde die Herstellung künstlicher Antigene mit derartigen determinanten Gruppen stets schwierig und mit grossem Aufwand verbunden sein.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass man künstliche Antigene erhält, deren Injektion einen wirksamen Schutz gegen verschiedene klinisch wichtige gramnegative Bakterien vermittelt, wenn man 3,6-Didesoxyhexosen nach der Azomethode in oc- pyranosidischer Bindung an passende Trägerproteine kuppelt.
3,6-Didesoxyhexosen treten bekanntlich neben andern Monosacchariden als Bestandteile der determinanten Gruppen von Antigenen gramnegativer Bakterien auf. Von den 8 theoretisch möglichen stereo-isomeren Formen wurden bisher als Bausteine von O-Antigenen die folgenden 5 3,6-Didesoxyhexosen gefunden: Abequose (3-Desoxy-D-fucose), z. B. im Antigenfaktor 4 in O-Antigenen der Salmonella Gruppe B (z. B. Paratyphus B); Colitose (3-Desoxy L-fucose), z. B. im O-Antigen des für Neugeborene und Kinder hochpathogenen Enteritis-Erregers Escherichia coli 0 111; Tyvelose (3-Desoxy-D-rhamnose), z. B. im Antigenfaktor 9 im O-Antigen der Salmonella-Gruppe D (z. B. bei Typhus); Paratose (3,6 Didesoxy-D-glucose), z. B. im Lipopolysaccharid von S. paratyphi A; und Ascarylose (3-Desoxy-L-rhamnose), z. B. im Lipopolysaccharid von P. pseudotuberculosis Typ V.
Impft man einen Organismus mit künstlichen Antigenen, welche als determinante Gruppen lediglich 3,6-Didesoxyhexosen enthalten, so bilden sich in dem geimpften Organismus Antikörper, die nicht nur gegen homologe Antigene wirksam sind, sondern auch gegen Bakterien, deren Antigene die betreffende 3,6-Didesoxyhexose lediglich als Bestandteil ihrer determinanten Gruppen enthalten. Beispielsweise ergibt die Kupplung von p-Aminophenyl-cc- colito-pyranosid an Proteine, wie Serumalbumin, einen Impfstoff, welcher bei der Immunisierung zu Antikörpern führt, die nicht nur gegen das homologe Colitose-Antigen, sondern auch gegen den obengenannten pathogenen Enteritis-Erreger coli 0 111 gerichtet sind.
Diese Feststellung ist insofern von erheblicher praktischer Bedeutung, als sie die Möglichkeit erschliesst, unter Umgehung komplizierter polysaccharidischer Strukturen, wie sie in den natürlichen 0 Antigenen vorliegen, zu künstlichen Impfstoffen gegen gramnegative Bakterien zu gelangen, wobei sich gezeigt hat, dass diese Impfstoffe bei Verwendung geeigneter Träger im Gegensatz zu den üblichen bakteriellen Vaccinen oder den gereinigten endotoxischen O-Antigenen untoxisch sind. Sie können in beliebiger Dosierung, auch intravenös, ohne unerwünschte Nebenwirkungen injiziert werden, während die aus Bakterien isolierten O-Antigen-Komplexe beim Menschen bekanntlich bereits bei intravenösen Dosierungen in der Grössenordnung von 1/1000 ug/kg Fieberreaktionen verursachen.
Die Kupplungsprodukte von 3,6-Didesoxy-hexosen mit Proteinen sind die ersten nicht-giftigen Impfstoffe, welche bei geeigneter Applikation und Dosierung die Bildung von Immunkörpern gegen verschiedene klinisch wichtige, pathogene gramnegative Bakterien auslösen können.
Ausser zur aktiven Immunisierung können die erfindungsgemäss erhaltenen Antigene auch zur Gewinnung von Sera für diagnostische, prophylaktische und therapeutische Zwecke verwendet werden. Hierbei impft man geeignete Tiere mit den künstlichen Antigenen und provoziert so die Bildung von Antikörpern, die dann in aus solchen Tieren gewonnenen Sera enthalten sind. Diese Sera können zum immunologisch spezifischen Nachweis von Bakterien bzw. ihren Toxinen verwendet werden. Andrerseits kann man solche Sera als Heilsera zur passiven Immunisierung verwenden, beispielsweise zur Prophylaxe bei Epidemiegefahr oder zur Therapie bei bereits eingetretener Infektion durch den betreffenden Erreger.
Zur Darstellung der künstlichen Antigene geht man von 3,6-Didesoxy-hexosen aus, welche man entweder synthetisch oder durch kurze Säurehydrolyse aus den bakteriellen Lipopolysacchariden (darstellbar gemäss deutscher Patentschrift 918 405), Extraktion der Hydrolysate mit Aether und Reinigung durch Säulenchromatographie erhalten kann. Neben den einzelnen stereo-isomeren Formen von 3,6-Didesoxy- hexosen kann man zum Kuppeln auch Gemische davon verwenden, wobei man polyvalente Impfstoffe erhält.
Als Träger kommen mit dem geimpften Organismus verträgliche Proteine in Frage. Darunter sind solche zu verstehen, die bei der Erstinjektion ohne unerwünschte Nebenwirkungen in praktisch beliebigen Mengen verabreicht werden können, die also im pharmakologischen Sinne untoxisch sind. Bevorzugt werden Serumalbumin und -globulin der zu impfenden Tiergattung, in der Humanmedizin z. B. menschliches Serumalbumin.
Das Kuppeln der 3,6-Didesoxy-hexosen auf den Träger erfolgt nach dem Azoverfahren von LAND STEINER. Nach diesem Verfahren werden die 3,6 Didesoxy-hexosen zu den Tri-O-acylestern, vorzugsweise die Tri-O-acetylester, acyliert, welche durch Erhitzen mit p-Nitrophenol unter Zusatz eines geeigneten Katalysators in guter Ausbeute in die gut kristallisierenden p-Nitrophenyl-di-O-acyl-3,6-didesoxyhexoside verwandelt werden können. Nichtumgesetztes Triacylat kann man aus dem Reaktionsansatz zurückgewinnen. Nach Entacylierung, beispielsweise durch Behandeln mit Natriummethylat in Methanol, hydriert man die p-Nitrophenyl-3, 6-didesoxyhexoside katalytisch zu den entsprechenden p-Amino-phenyl Derivaten.
Diese können in schwach saurer Lösung bei 0-4 OC diazotiert und schliesslich zur gekühlten alkalischen Lösung der Proteine hinzugefügt werden, derart, dass auf 10 Gewichtsteile des Proteins etwa 0,5-1 Gewichtsteil der 3,6-Didesoxyhexose kommt. Es entstehen orange-rot gefärbte Lösungen der 3,6-Didesohyhexose-phenylazo-proteine, welche nach Dialyse, gegebenenfalls gegen physiologische Kochsalzlösung, zur Immunisierung verwendet werden können. An Stelle der Isomerengemische können auch die isolierten a- oder p-p-Aminophenyl-didesoxyhexoside diazotiert und an Proteine gekuppelt werden.
Die Immunisierungen können in der bei Azoproteinen üblichen Art und Weise durch im allgemeinen wiederholte intravenöse, subkutane, intrakutane, intramuskuläre Injektion oder Kombination dieser Injektionsart in Einzeldosen von 0,1 bis maximal 10 mg/kg erfolgen.
Beispiel I a) Darstellung von p-A minophenyl-a-colito-pyranose.
10 g Colitose (öl, im Vakuum über Phosphorpentoxid bei 45 OC getrocknet) werden in 200 ml Pyridin gelöst und 100 ml Essigsäureanhydrid hinzugefügt. Der Ansatz bleibt 24 Stunden bei Zimmertemperatur und weitere 2 Tage bei 4 OC stehen. Man giesst in ca. 2 Liter Eiswasser und extrahiert die klare gelbe Lösung viermal mit Chloroform. Der Chloroformextrakt wird zweimal mit Wasser, einmal mit verdünnter Salzsäure und wieder zweimal mit Wasser durchgeschüttelt, anschliessend über Natriumsulfat getrocknet und verdampft. Man erhält 16,5 g eines öligen Gemisches von Triacetyl-a- und -P-coli- tose, welches nach einigen Tagen in Nadeln auszukristallisieren beginnt. Das ölige Triacetat wird ohne weitere Reinigung umgesetzt.
19 g Triacetyl-colitose, 19 g p-Nitrophenol und 9,5 g Quecksilber-II-chlorid (gepulvert) werden in einem mit Absaugvorrichtung versehenen Kolben bei 12-15 mm Hg während 15 Minuten auf ca. 125 OC gehalten. Nach dieser Zeit destilliert keine Essigsäure mehr ab. Nach dem Abkühlen wird das schwach gelb gefärbte öl in Chloroform aufgenommen und die Lösung zweimal mit Wasser, viermal mit 0,5-n Natronlauge und wieder zweimal mit Wasser ausgeschüttelt. Nach dem Trocknen mit Natriumsulfat wird weitgehend eingeengt und mit wenig Methanol versetzt, worauf alsbald Kristallisation einsetzt. Die Kristalle von p-Nitrophenyl-diacetyl-a- und (weniger) -p-colito-pyranosid werden abgesaugt, mit wenig kaltem Methanol gewaschen und getrocknet. Ausbeute 12 g, entsprechend ca. 50 % der Theorie.
In der Mutterlauge findet sich noch nichtumgesetztes Triacetat, welches man aufarbeiten und wieder verwenden kann. Durch Umkristallisation aus Methanol erhält man die reine, in Methanol schwerer lösliche a-Form vom Schmelzpunkt 180 OC und [oc] D -2130 (0,1 Cr,ig, Methanol) in einer Ausbeute von 8-10 g. Die-Form bleibt in den methanolischen Mutterlaugen und wird, verunreinigt durch wenig a-Form, in Kristallen vom Schmelzpunkt 155 OC und [a] D + 0 erhalten.
10 g rohes p-Nitrophenyl-diacetyl-colitosid (Gemisch von a- und 8-Form), 400 ml wasserfreies Methanol und 10 ml 0,25-n Natriummethylat werden bei Zimmertemperatur unter gelegentlichem Schütteln stehen gelassen. Nach ca. 45 Minuten ist alles gelöst.
Man lässt noch 5 Stunden bei Zimmertemperatur und über Nacht bei 4 OC stehen. Zur Lösung fügt man nun 4 g des Ionenaustauschers IR 120 hinzu und schüttelt bis zur neutralen Reaktion. Es wird filtriert und bis auf 20-30 ml Volumen eingeengt. Beim Stehen scheiden sich 5-6 g p-Nitrophenyl-oc-colito-pyranosid vom Schmelzpunkt 209 OC und [a] D-200 (Methanol) ab. Die Mutterlauge wird weiter eingeengt und mit Aether versetzt, worauf sich 0,5-0,8 g g nahezu reines p-Mtrophenyl--colito-pyranosid vom Schmelzpunkt 81 OC und [a] D + 1200 abscheiden.
Die Hydrierung zum p-Aminophenyl-colitosid erfolgt vorteilhaft mit den gereinigten p-Nitrophenyl-a- und-p-colitosiden. 5 g p-Mtrophenyl-a.-colitosid werden in 50 ml Methanol gelöst und mit 250 mg vorhydriertem Platinoxyd unter H2-Normaldruck hydriert. Nach etwa 30 Minuten ist die theoretische Menge Wasserstoff aufgenommen, worauf vom Katalysator abfiltriert und die Methanollösung weitgehend eingeengt wird. Auf Zusatz von Aether scheiden sich 3,7 - 4 g p-Aminophenyl-a-colitopyranosid vom Schmelzpunkt 180 OC und [a] D-166 (Methanol) aus.
In gleicher Weise erhält man aus 2,7 g p-Nitrophenyl-p-colitosid 1,7 - 2 g p-Aminophenyl-p-colito- pyranosid vom Schmelzpunkt 75 OC und [a] D + 990 (Methanol).
Alle beschriebenen Operationen verlaufen in genau gleicher Weise, wenn man statt von Colitose von Abequose (dem optischen Antipoden der Colitose) ausgeht, wobei Ausbeuten und Schmelzpunkte gleich, die optischen Drehungswerte jedoch entgegengesetzt gefunden werden. Auch die übrigen 3,6-Didesoxy- hexosen oder 3,6-Didesoxyhexose-Gemische lassen sich in analoger Weise in die entsprechenden p-Aminophenylderivate überführen. b) Darstellung der Colitose-phenylazo-proteine.
1 g p-Aminophenyl-colito-pyranosid wird in 40 ml Wasser und 10 ml 1-n Salzsäure bei 0 OC gelöst. Zur Lösung gibt man nach und nach eine eisgekühlte Lösung von 300 mg Natriumnitrit in 10 ml Wasser.
Man lässt 20-30 Minuten bei 0 OC stehen. Die Diazoniumsalz-Lösung wird nun zu einer Lösung von 10 g Serumalbumin (Maus, Ratte, Meerschweinchen, Kaninchen, Rind, Pferd, Mensch u. a.) in 300 ml n/25 Natronlauge bei 0 OC zugetropft. Nach 90 Minuten bei 0 OC wird mit 2-n Salzsäure neutralisiert und die orangerote Azoproteinlösung dialysiert. Die Lösung wird anschliessend auf ein Volumen von 600 ml aufgefüllt, mit Natriumchlorid isotonisch gemacht und durch Zusatz von 60 mg Merthiolat steril gehalten.
Der Ansatz enthält dann ungefähr 1 mg Colitose und 16 mg Protein pro ml. Diese Lösung kann unmittelbar zur Immunisierung verwendet werden. In sonst gleicher Weise kann man auch Azoproteine mit einem geringeren oder höheren relativen Gehalt an 3,6 Didesoxyhexose herstellen.
In genau gleicher Weise lassen sich andere p Aminophenyl-3,6-didesoxyhexoside an Proteine kuppeln. Statt Serumalbuminen können auch andere Proteinträger nach Wahl verwendet werden. Die Azoproteine sind untoxische Antigene, welche die betreffende 3,6-Didesoxyhexose als immunologisch determinante Gruppe enthalten. c) Immunisierung
40 ml der gemäss b) unter Verwendung von Mäuse-Serumalbumin erhaltenen Colitose-phenylazo-protein-Lösung werden im Mörser unter aseptischen Bedingungen mit 40 ml Adeps lanae verrieben. Dazu gibt man 80 ml Paraffinöl, welches 2 mg hitzegetötete Tuberkelbazillen (Trockengewicht) pro ml enthält.
Der Zusatz von Adeps lanae und Paraffinöl mit Tuberkelbazillen (Freund'sches Adjuvans) bewirkt bekanntlich, dass man die Zahl der für die Immunisierung erforderlichen Injektionen beträchtlich herabsetzen kann. 300 Mäuse werden mit je 0,2 ml dieses Impfstoffes behandelt, und zwar wird 1/3 der Impfstoffmenge i. m. in einen Hinterschenkel gespritzt und je 1/3 an zwei verschiedenen Stellen s. c. 52 Tage nach der Impfung werden 50 Mäuse zur Bestimmung ihrer Resistenz gegen Infektion durch Colibakterien 0 111 B verwendet. Die Mäuse werden mit Bakteriensuspensionen verschiedener Verdünnungsgrade i. p. infiziert.
Die DLso liegt für die immunisierten Tiere bei einer Verdünnung der verwendeten Stammsuspension um das 10-fache, während sie für nicht immunisierte Kontrolltiere bei 800-facher Verdünnung liegt. d) Gewinnung von Sera
Die gemäss c) immunisierten, jedoch nicht für den Resistenzversuch verwendeten Mäuse werden entblutet. Aus dem Blut wird das Serum in an sich bekannter Weise abgetrennt. Dieses enthält Antikörper gegen Coli 0 111 B 4-Antigen und kann dementsprechend zum Nachweis dieses Erregers sowie zu seiner Be kämpfung bei drohender oder nach erfolgter Infektion, (passive Immunisierung) verwendet werden.
Beispiel 2 a) Darstellung von c-p-Aminopllenyl-abequosid (1,5)
1765 mg trockenen Abequose -Sirups werden in 35 ml Pyridin gelöst und mit 17 ml frisch destilliertem Acetanhydrid versetzt. Es wird 5 Stdn. bei Zimmertemperatur, dann über Nacht bei 4 OC stehen gelassen und danach in 1 Liter Wasser eingegossen und 1 Std. gerührt. Darauf wird dreimal mit ca. 100 ml Chloroform ausgeschüttelt. Die Chloroformauszüge werden mehrfach mit eiskalter, etwa 1 -n Schwefelsäure und dann mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und im Wasserstrahlvakuum eingedampft. Nach dem Trocknen bei 80 ob/10 Torr hinterbleiben 2850 mg sirupartige Triacetyl-abequose, entsprechend einer Ausbeute von 87 % der Theorie.
2620 mg dieses Sirups werden mit 2600 mg p Nitrophenol und 1300 mg Quecksilberchlorid 15 Min. im Wasserstrahlvakuum auf etwa 120 OC erwärmt unter häufigem Umschwenken der Schmelze. Nach dieser Zeit hat die Essigsäure-Dampfentwicklung fast völlig aufgehört und der Ansatz eine bräunliche Farbe angenommen. Es wird in Chloroform aufgenommen, zweimal mit Wasser, dreimal mit 0,5-n Natronlauge und wieder zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert, im Wasserstrahlvakuum eingedampft und bei 70-80 ob/10 Torr zur Gewichtskonstanz gebracht. Man erhält 2700 mg eines p-Nitrophenyl-di-O-acetyl-abequosid-Gemisches, entsprechend einer Ausbeute von 80 % der Theorie.
Dieses Gemisch wird in 105 ml absolutem Methanol gelöst, die Lösung auf 0 OC gekühlt, mit 2 ml 1-n Natriummethylat versetzt und über Nacht bei 0 OC stehen gelassen. Alsdann wird mit etwas mehr als der nötigen Menge (ca. 350 mg je ml 1 -n Natriummethylat) IR 120 neutralisiert, filtriert, im Wasserstrahlvakuum eingedampft, in frisch destilliertem, heissem Essigester aufgenommen, dreimal mit Wasser ausgeschüttelt, mit Natriumsulfat getrocknet und im Wasserstrahlvakuum eingedampft. Nach dem Trocknen bei 60 ob/0,5 Torr hinterblieben 1950 mg (=95% der Theorie) eines z.
T. kristallisierten Sirups, der alsdann wie folgt an Siliciumdioxyd chromatographiert wird:
1950 mg p-Nitrophenyl-abequosid-( 1,5) -Rohsirup werden in heissem Essigester gelöst, mit Aether auf 1:1 verdünnt und schnell auf die Säule gegeben. Dann wird mit Aether/Aethylacetat 19 : 1 eluiert, bis die ersten in feinen Nadeln kristallisierenden Fraktionen erscheinen. Alles Davorliegende wird zusammengegeben. Man erhält so ca. 1050 mg rohes-p-Nitro- phenyl-abequosid. Nun enthält die Säule nur noch cc-p-Nitrophenyl-abequosid, das mit Acetylacetat/Aceton 4:1 herausgeholt wird. Alle oc-p-Nitrophenyl- abequosid-Fraktionen werden vereinigt und aus siedendem Aceton bei -5 OC umkristallisiert.
Weitere Kristallisate erhält man durch Einengen und/oder Zusatz von Petroläther. Gewaschen wird mit Petrol äther/Aceton.
Man erhält 550 mg Substanz vom Schmelzpunkt 195-202 OC, dazu 250 mg Nebenfraktion (unrein). Die Ausbeute beträgt also 800 mg (= 39 , XO der Theorie).
602 mg sc-p-Nitrophenyl-abequosid-(1, vom Schmelzpunkt 196-201 OC werden in 60 ml Methanol mit 300 mg Pd (5 %) auf Tierkohle bei Atmosphärendruck hydriert. Die Wasserstoffaufnahme beträgt 148 ml in 15 Minuten (theoretisch: 150 ml). Anschliessend wird filtriert und eingedampft.
Man erhält 530 mg cc-p-Aminophenyl-abequosid- (1,5) (entsprechend einer Ausbeute von 99 % der Theorie). Die sirupartige Substanz wird in sehr wenig Methanol gelöst und mit etwas Aether und dann Petroläther bis zur beginnenden Trübung versetzt.
Beim Anreiben beginnt die Kristallisation, die über Nacht bei -5 OC vervollständigt wird. Durch Einengen und/oder Zugabe von mehr Petroläther können noch weitere Fraktionen gewonnen werden. Man erhält 350 mg Substanz vom Schmelzpunkt 176-181 OC sowie 150 mg Nebenfraktion (unrein). Die Ausbeute beträgt somit insgesamt 500 mg, entsprechend 93 % der Theorie. b) Darstellung von Ahequose-Antigenlösungen (a pyranosidische Bindung).
200 mg a-p-Aminophenyl-abequosid-(1, 1,5) werden in 8 ml Wasser gelöst und auf 0 OC abgekühlt. Dann werden 60 mg Natriumnitrit in 2,4 ml Wasser (0 OC) portionsweise unter Rühren zugegeben, worauf man 20 Minuten bei 0 OC stehen lässt. Danach wird je die Hälfte dieser Lösung zu einer Lösung von 1000 mg Eialbumin und 1000 mg Rinderserum-Albumin in je 30 ml n/25 Natronlauge (0 OC) zugegeben und 1 V Stunde bei 0 OC stehengelassen (starke Rotfärbung).
Anschliessend wird mit verdünnter Essigsäure unter starkem Rühren vorsichtig neutralisiert und 24 Stunden gegen Wasser dialysiert. Schliesslich füllt man auf je 100 ml auf und gibt je 900 mg Natriumchlorid und 10 mg Merthiolat zu. Eine solche Lösung enthält mindestens 0,5 mg an Protein gebundene Abequose/ ml und kann direkt für Injektionszwecke verwendet werden.