DE1543831C - Verfahren zur Herstellung von Erythromy cinglutamat - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Erythromycinglutamat.

Es wurde gefunden, daß diese Verbindung interessante pharmakologische Eigenschaften, insbesondere eine erhebliche antibakterielle Wirkung gegen erythromycin-empfindliche Keime besitzt und im Vergleich zu Erythromycin und bekannten Erythromycinsalzen überlegene Eigenschaften aufweist.

Das Erythromycinglutamat bewirkt nach der Verabreichung per os einen höheren Blutspiegel als nach der Verabreichung von äquivalenten Mengen Erythromycin in Basenform, als Propionylerythromycin oder Propionylerythromycinlaurylsulfat. Bei auf experimentellem Wege hervorgerufenen Infektionen durch pathogene grampositive Keime, wie Staphylokokken und Streptokokken, besitzt das per os oder auf parenteralem Wege verabreichte Erythromycinglutamat eine therapeutische Wirksamkeit, die derjenigen überlegen ist, die nach der Verabreichung der gleichen Dosis Erythromycin in Basenform oder in Form des Propionsäureesters beobachtet wird.

Außerdem besitzt das Erythromycinglutamat den Vorteil, daß es in Wasser gut löslich ist (in der Größenordnung von 10%), wobei es die für die Base typische antibiotische Aktivität beibehält, wobei zu beachten ist, daß der Antibiotikumgehalt im Blut und also die Aktivität des Produktes beim Lebewesen eine Funktion der Löslichkeit ist. Im Gegensatz hierzu ist das Erythromycin nur sehr wenig wasserlöslich, während das aus der USA.-Patentschrift 2 830 982 bekannte Erythromycinsulfamat bis zu etwa 3%, das aus der belgischen Patentschrift 647 805 bekannte Erythro- : mycinphosphat zu 5% sich in Wasser löst. Bei dem Erythromycinphosphat gemäß der belgischen Patentschrift handelt es sich um das Salz einer mittelstarken Säure (pK_t = 2,1). Der pH-Wert seiner wäßrigen Lösung ist hinreichend sauer, um einen Aktivitätsverlust des Antibiotikums nach sich zu ziehen. Daher wird in der belgischen Patentschrift 647 805 empfohlen, bei der Formulierung gemäß Beispiel 3 eine starke Menge Natriumeitrat zuzusetzen, um den pH-Wert und damit die Stabilität zu erhöhen, wenn die Zusammensetzung zum Zeitpunkt ihrer Anwendung in Wasser aufgelöst wird. Diese Anwendung eines Puffers ist erforderlich, um den Aktivitätsverlust des Antibiotikums zu vermeiden, denn Lösungen, die 250 bis 500 mg Erythromycinphosphat enthalten, verlieren nach 6 Tagen bei Raumtemperatur bis zu 10% ihrer Aktivität, wogegen die gepufferte Lösung nach 6 Tagen bei 25⁰C ihre Aktivität beibehält.

Im Gegensatz zu diesen beiden bekannten Salzen ist das erfindungsgemäße Erythromycinglutamat von einer schwachen Säure vom pK a, = 4 abgeleitet, und auf Grund des Vorhandenseins einer Aminogruppe beträgt der pH-Wert der wäßrigen Lösung dieses Salzes 6,3. Dieser pH-Wert liegt also in dem für die Stabilität des Antibiotikums günstigen Bereich, was eine Verabreichung auf parenteralem Wege ermöglicht.

Darüber hinaus ist zu bemerken, daß die Aktivität von Erythromycinglutamat 805 Einheiten pro Milligramm beträgt, während die theoretische Aktivität im Hinblick auf die Solvatation (5,5%) dem Wert von 785 Einheiten pro Milligramm entspricht. Das Erythromycin erfährt also, wenn es in Form des Glutamats vorliegt, keinen Aktivitätsverlust. Weiterhin läßt sich feststellen, daß in den Formulierungsbeispielen auf Basis von Erythromycinphosphat oder -sulfamat, wie es in der belgischen Patentschrift 647 805 bzw. der USA.-Patentschrift 2 830 982 beschrieben ist, der hauptsächliche Bestandteil (wenn man von der Quantität ausgeht) Zucker darstellt. Diese Anwesenheit von Zucker deutet auf den bitteren Geschmack hin, der ein Charakteristikum der meisten Erythromycinsalze ist. Im Gegensatz dazu besitzt das erfindungsgemäße Erythromycinglutamat keinen bitteren Geschmack, was in der Tatsache zum Aus_r druck kommt, daß seine Einführung in das Trinkwasser von Tieren keine Verringerung des Trinkwasserverbrauchs bewirkt.

. Das erfindungsgemäße neue Erythromycinsalz besitzt in festem Zustand ebenfalls eine gute Stabilität/ Wird es beispielsweise in festem Zustand einige Tage lang einer Temperatur von 50°C ausgesetzt, so erfährt es keine Veränderung.

Bei Versuchen mit dem Erythromycinglutamat und bekannten Verbindungen wurden die folgenden Ergebnisse erhalten:

1. Toleranz von Erythromycinglutamat bei Tieren a) Auf oralem Wege

Die Toleranz des Erythromycinglutamats wurde auf oralem Wege bei 13 Tage alten Küken bestimmt. Die 5 Tage lang durchgeführte Einmengung dieses Salzes in einer Menge von 0,50 g pro Liter in das Trinkwasser hatte keine Verminderung der verbrauchten Wassermenge und keine Wachstumsstörung der Tiere zur Folge

b) Auf intramuskulärem Wege

Auf intramuskulärem Wege wird 1 ecm wäßrige Erythromycinglutamatlösung mit einer Konzentration von 4% (bezogen auf die Erythromycinbase) in den Rückenlendenmuskel von Kaninchen injiziert; die Tiere wurden am 10. Tag nach der Injektion getötet und der Rückenlendenmuskel einer Autopsie unterzogen. Es konnte weder eine Spur der Injektion noch eine entzündete Stelle festgestellt werden.

Die Toleranz des auf oralem oder intramuskulärem Wege verabreichten Produkts ist daher zufriedenstellend. - .

2. Aktivität bei Tieren

A.¹ Bestimmung der Antibiotikumkonzentrationen im Blut

Die Verabreichung des Erythromycinglutamats auf oralem Wege bewirkt therapeutisch wirksame Blutspiegel. . :

■-...■ a) Bei der Ratte

An zwei Gruppen von zehn Ratten verabreicht man mittels einer Megehsonde eine einzige Dosis der wäßrigen Lösung von 50 mg Erythromycinglutamat pro Kilogramm. 15 Minuten nach der Verabreichung wird von jeder Ratte eine Blutprobe entnommen, und die antibiotische Aktivität wird nach der Diffusionsmethode in Agar-Nährmedium bei einem ρH-Wert von 8 bestimmt, wobei als Testkeim ein Stamm Streptococcus faecaJis ATCC 10 541 verwendet wird. Die Diffusionsmethode besteht darin, daß man eine Petrischale, die ein Agarmedium enthält, mit dem zu untersuchenden Keim besät. Mit Hilfe eines Locheisens (Durchmesser 1 cm) entfernt man eine runde Lamelle geringer Dicke. In diese kleine Öffnung

bringt man nun das zu untersuchende Antibiotikum verdünnt in das Serum ein. Das Produkt diffundiert in das Agar-Nährmedium, und nach 18 Stunden bei 37° C erscheint um jede öffnung eine runde Inhibierungszone proportional zur Aktivität der Antibiotikumslösung, und man vergleicht den Durchmesser mit dem, den nian mit bestimmten Erythromycinverdünnungen erhalten hat. Die Verdünnungen der zu titrierenden Serumproben werden mit Pferdeserum durchgeführt, wobei die Titrierung Vergleichsweise mit einer Standardprobe aus reiner Erythromycinbase erfolgt. Die Untersuchung wurde im Vergleich mit der gleichen Menge an Propionylerythromycin (bezogen auf die Erythromycinbase) durchgeführt. Die folgende Tabelle gibt die Durchschnittswerte der erhaltenen. Ergebnisse an:

1. Rattengruppe ...

2. Rattengruppe ...

Blutspiegel nach der Verabreichung von

Erythromycin-, glutamat

0,31 μ§/α:πι 0,33 μ

Propionylerythromycin

0,30 μg/ccm 0,30 μg/ccm

30

Die auf oralem Wege durch Erythromycinglutamat hervorgerufenen Blutspiegel sind den durch Propionylerythromycin hervorgerufenen um ein Geringes überlegen.

b) Beim Huhn

An Hühnergruppen wird eine einzige Dosis aus 100 mg/kg Erythromycinglutamat (bezogen auf die Erythromycinbase) mittels einer Magensonde (in wäßrigem Medium) verabreicht. Mittels zu verschiedenen Zeitpunkten von den Tieren entnommenen Blutproben wird die antibiotische Aktivität des Serums nach der Diffusionsmethode in einem Agar-Nährmedium bestimmt, wobei als Testkeim ein Stamm Staphylococcus aureus 209 P verwendet wird. Die bei der Messung der Inhibitionszonen, die im Vergleich zu einer Standardprobe aus der Erythromycinbase erfolgt, erhaltenen mittleren Werte (bezogen auf die Erythromycinbase) sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt. Die Bestimmung wurde im Vergleich zu Propionylerythromycinlaurylsulfat und Erythromycinthiocyanat durchgeführt, wobei diese Verbindungen in den gleichen Dosen wie das Erythromycinglutamat, bezogen auf die Erythromycinbase, verabreicht wurden.

B. Wirksamkeit »in vivo« gegen pathogene Keime

Die therapeutische Wirksamkeit des Erythromycinglutamats wurde bei durch pathogene grampositive Keime auf experimentellem Wege hervorgerufenen Infektionen bestimmt. Die Bestimmungen wurden im Vergleich zu Erythromycin und Propionylerythromycin durchgeführt.

a) Experimentelle Infektionen mit Staphylokokken

Gruppen von 10 auf intraperitoriealem Wege mit 0,30 ecm einer Kultur mit V₁₀₀ Staphylococcus aureus (Stamm TIN) infizierten Mäusen wurden zwei aufeinanderfolgende Tage lang durch Verabreichung von Erythromycinglutamat auf oralem oder subkutanem Wege behandelt. Die erste Dosis wurde in wäßriger Lösung sogleich nach der Einimpfung und die zweite 20 Stunden später verabreicht. Die Vergleichssübstanzen wurden unter den gleichen Bedingungen verabreicht, d.h. in wäßriger Suspension und in den gleichen Dosen. Die therapeutische Wirkung, die an Hand des Ausmaßes der Mortalität der Tiere, der Geschwindigkeit der Mortalität und des Ausmaßes der Nierenschäden (auf Grund der Toxizität der Staphylokokkenstämme) im Vergleich zu nicht behandelten Versuchstieren bestimmt wird, ist aus der folgenden Tabelle ersichtlich:

	Aktivität	des Serums	Erythromycin thiocyanat . μϊ/ccm
Zeit. : nach der Verabreichung	Erythromycin glutamat μΕ/κΐη	Propionyl- erythromycin- laurylsulfat	0,70 0,67 < 0,3
1 Stunde 2 Stunden 30 Minuten 3 Stunden 5 Stunden	2,1 0,9 0,56 <0,5	0,35 0,43

	Art der	Dosis pro	Thera
	Verab	Maus von	peutische
Verabreichte Substanz	reichung	20 g(bezogen	Wirkung
		auf reines
		Erythro
	oral	mycin)	100%
Erythromycin		2,55 mg	96%
glutamat	subkutan	1,7 mg	100%
		2,55 mg	100%
	oral	1,7 mg	100%
Freies		2,55 mg	80%
Erythromycin	oral	1,7 mg	57%
Propionyl-		2,55 mg	28%
erythromycin	subkutan	1,7mg	94%
		2,55 mg	86%
	1,7 mg

Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß die Blutspiegel des Erythromycinglutamats" günstiger sind als diejenigen der anderen Erythromycinverbindungen.

Diese Ergebnisse zeigen, daß das Erythromycinglutamat unter den gleichen Versuchsbedingungen sowohl bei der Verabreichung auf oralem als auch auf subkutanem Wege gegen die generalisierte Infektion mit Staphylokokken, die den Tod der Kontrolltiere schnell herbeiführt, eine therapeutische Wirkung besitzt, die derjenigen, von Erythromycin oder Propionylerythromycin, das in einer der reinen Base entsprechenden Dosis verabreicht wurde, eindeutig überlegen ist.

b) Experimentelle Streptokokken-Infektionen

Gruppen von 10 Mäusen, die durch Einimpfung einer Kultur von Streptococcus hemolyticus (Stamm M) infiziert wurden, wurden vier aufeinanderfolgende Tage lang durch orale Verabreichung einer wäßrigen Erythromycinglutamatlösung (Magensonde) behandelt. Die Vergleichssubstanzen wurden unter den gleichen Bedingungen verabreicht, d. h. in den gleichen, auf Erythromycin bezogenen Dosen, und zwar in

55

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Form einer wäßrigen Suspension. Die wie vorstehend unter a) bestimmte therapeutische Wirksamkeit geht aus der nachstehenden Tabelle hervor:

Verabreichte Substanz	Dosis pro Maus von 20 g (bezogen auf reines Erythromycin)	Therapeutische Wirkung
Erythromycinglutamat Erythromycinbase Propiony !erythromycin	2,55 mg 0,85 mg 2,55 mg 0,85 mg 2,55 mg 0,85 mg	100% . 67% - 77% 38% 78% 19%

Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daß das auf oralem Weg verabreichte Erythromycinglutamat gegen eine generalisierte Streptokokkeninfektion, die den raschen Tod der Versuchstiere herbeiführt, unter den gleichen experimentellen Bedingungen eine Wirkung besitzt, die derjenigen von Erythromycinbase und Propionylerythromycin, die in der reinen Base entsprechenden Dosen verabreicht wurden, überlegen ist.

Das Erythromycinglutamat kann zur Behandlung von Staphylokokken, Streptokokken, Pneumokokken sowie von durch spezifische Keime hervorgerufenen I nfektionskrankheiten, wie Diphterie und Gonokokkie, verwendet werden.

Die geeignete Dosierung liegt zwischen 50 und 500 mg pro Verabreichung und, je nach der Art. der Verabreichung, zwischen 0,5 und 5 g pro Tag bei Erwachsenen.,

Das Erythromycinglutamat wird dadurch hergestellt, daß man in an sich bekannter Weise entweder Erythromycin in Gegenwart von Wasser und gegebenenfalls eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels mit Glutaminsäure umsetzt oder ein lösliches Erythromycinsalz mit einem löslichen Glutaminsäuresalz in einer Mischung eines mit Wasser schwer mischbaren organischen Lösungsmittels, in dem Erythromycin löslich ist, und einer geringen Menge Wasser umsetzt.

Für die Umsetzung des Erythromycins eignet sich als organisches Lösungsmittel ein niederes aliphatisches Keton, wie Methyläthylketon oder Aceton, ein niederes aliphatisches Carbonsäureamid, z. B. Dimethylformamid, ein niederer aliphatischer Alkohol, wie n-Butanol, oder ein cyclischer Äther, wie Tetrahydrofuran oder Dioxan.

Die Isolierung des gebildeten Salzes wird in bequemer Weise durch Abnutschen durchgeführt, wenn man in einem wäßrigen Lösungsmittel arbeitet, in dem das Erythromycinglutamat unlöslich ist. Bleibt das Erythromycinglutamat in Lösung, dann wendet man eine lyophile Behandlung oder eine Konzentrierung an, der sich eine Zentrifugierung anschließt.

Arbeitet man nur in Wasser, dann können unmittelbar injizierbare Erythromycinglutamatlösungen erhalten werden.

Bei Durchführung der Umsetzung mit einem löslichen Erythromycinsalz wird Erythromycinacetat, -propionat' oder -laclat. als lösliches Glutaminsäuresalz ein Alkalisalz sowie ein Salz eines Amins oder eines niederen aliphatischen Aminoalkohols der Glutaminsäure und als mit Wasser schwer mischbares organisches Lösungsmittel ein niederes Alkylacetat, wie Äthylacetat, Butylacetat oder Amylacetat, oder ein chloriertes organisches Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, Methylenchlorid oder Dichloräthan, verwendet.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren

Beispiel 1

ίο 115g wasserfreie Erythromycinbase werden in. 1150 ecm einer azeotropen Mischung aus Methyläthylketon und Wasser gelöst, worauf der erhaltenen Lösung unter kräftigem Rühren 20 g wasserfreie Glutaminsäure zugesetzt werden und das Rühren dann noch 16 bis 20 Stunden fortgesetzt wird. Hierauf wird filtriert, das gebildete Produkt abgenutscht und über Nacht bei 50⁰C getrocknet. Man erhält 113 g (85% der Theorie) Erythromycinglutamat, das mit 5,5% Wasser solvatiert ist; F. 148 bis 150°C, [«]ϊ =.-55,3° (c = 1%, Wasser).

Das Produkt fällt in Form von farblosen Nadeln an, die in Wasser löslich sind. Das Produkt wird durch verdünnte wäßrige Säuren und Alkalien sowie durch die meisten der üblichen organischen Lösungs-

mittel zersetzt. ■

. Die 5%ige wäßrige Lösung besitzt einen pH-Wert von 6,1.

Die antibiotische Aktivität beträgt 805 y/mg, bezogen auf die reine Erythromycinbase.

. ' "

B e i s ρ i e 1 2

5 g Erythromycin und 1 g Glutaminsäure werden in 60 ecm Wasser suspendiert, worauf die Reaktionsmischung 1 Stunde gerührt wird. Dann wird filtriert und anschließend das Filtrat einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei 6 g Erythromycinglutamat erhalten werden.

Das erhaltene Produkt ist mit dem im Beispiel 1 beschriebenen identisch.

Beispiel 3

350 g Erythromycin werden in 31 Butylacetat gelöst, worauf eine Lösung von 80 g Mononairium-

. glutamat in 150 ecm Wasser zugegeben wird. Die Reaktionsmischung wird dann bei Zimmertemperatur einige Minuten gerührt, worauf 28,6 ecm Essigsäure zugegeben werden. Hierbei beobachtet man im Augenblick der Zugabe der Essigsäure die Bildung eines kolloiden Niederschlages (Gel) von Erythromycinacetat. Bei. dem anschließenden Rühren verschwindet das Gel in dem Maße, in dem sich ein kristalliner Niederschlag von Erythromycinglutamat durch doppelte Umsetzung bildet. [Erythromycinacetat + Natriumglutamat —+Erythromycinglutamat (fällt aus, da es in dem Milieu wenig löslich ist) + Natriumacetat]. Das Rühren wird 1 Stunde fortgeführt, ; dann wird abgenutscht; das Produkt mit Butylacetat gewaschen und bei 5O⁰C getrocknet. Man erhält 409 g Erythromycinglutamat, das ungefähr 8% Natriumacetat enthält.

B e i s ρ i e 1 4

Zu einem Gel von Erythromycinacetat. das durch Lösen von 40 g Erythromycin in 360 ecm Butylacetat mit 5% Wasser und anschließende Zugabe von 3.3 ecm Essig«}ure unter Rühren erhallen worden ist. werden 9.2 g Mononatriumglutamat unter Rühren zugegeben. Dabei beobachtet man eine rasche Kristallisation.

die von einer Verflüssigung des Gels begleitet ist. Nach 1 stündigem Rühren wird der Niederschlag abgesaugt, mit Butylacetal gewaschen und getrocknet. Man erhält so 46 g Erythromycinglutamat, dessen Eigenschaften mit dem nach Beispiel 3 gewonnenen Produkt identisch sind.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Erythromycinglutamat, dadurch gekennzeichnet,

   daß man in an sich bekannter Weise entweder Erythromycin in Gegenwart von Wasser und gegebenenfalls eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels mit Glutaminsäure umsetzt oder ein lösliches Erythromycinsalz mit einem löslichen Glutaminsäuresalz in einer Mischung eines mit Wasser schwer mischbaren organischen Lösungsmittels, in dem Erythromycin löslich ist, und einer geringen Menge Wasser umsetzt.

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