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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Erythromycinglutamat.
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Es wurde gefunden, daß diese Verbindung interessante pharmakologische
Eigenschaften, insbesondere eine erhebliche antibakterielle Wirkung gegen erythromycin-empfindliche
Keime besitzt und im Vergleich zu Erythromycin und bekannten Erythromycinsalzen
überlegene Eigenschaften aufweist.
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Das Erythromycinglutamat bewirkt nach der Verabreichung per os einen
höheren Blutspiegel als nach der Verabreichung von äquivalenten Mengen Erythromycin
in Basenform, als Propionylerythromycin oder Propionylerythromycinlaurylsulfat.
Bei auf experimentellem Wege hervorgerufenen Infektionen durch pathogene grampositive
Keime, wie Staphylokokken und Streptokokken, besitzt das per os oder auf parenteralem
Wege verabreichte Erythromycinglutamat eine therapeutische Wirksamkeit, die derjenigen
überlegen ist, die nach der Verabreichung der gleichen Dosis Erythromycin in Basenform
oder in Form des Propionsäureesters beobachtet wird.
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Außerdem besitzt das Erythromycinglutamat den Vorteil, daß es in
Wasser gut löslich ist (in der Größenordnung von 10%), wobei es die für die Base
typische antibiotische Aktivität beibehält, wobei zu beachten ist, daß der Antibiotikumgehalt
im Blut und also die Aktivität des Produktes beim Lebewesen eine Funktion der Löslichkeit
ist. Im Gegensatz hierzu ist das Erythromycin nur sehr wenig wasserlöslich, während
das aus der USA.-Patentschrift 2 830 982 bekannte Erythromycinsulfamat bis zu etwa
3%, das aus der belgischen Patentschrift 647 805 bekannte Erythromycinphosphat zu
5% sich in Wasser löst. Bei dem Erythromycinphosphat gemäß der belgischen Patentschrift
handelt es sich um das Salz einer mittelstarken Säure (pK1 = 2,1). Der pH-Wert seiner
wäßrigen Lösung ist hinreichend sauer, um einen Aktivitätsverlust des Antibiotikums
nach sich zu ziehen. Daher wird in der belgischen Patentschrift 647 805 empfohlen,
bei der Formulierung gemäß Beispiel 3 eine starke Menge Natriumcitrat zuzusetzen,
um den pH-Wert und damit die Stabilität zu erhöhen, wenn die Zusammensetzung zum
Zeitpunkt ihrer Anwendung in Wasser aufgelöst wird. Diese Anwendung eines Puffers
ist erforderlich, um den Aktivitätsverlust des Antibiotikums zu vermeiden, denn
Lösungen, die 250 bis 500 mg Erythromycinphosphat enthalten, verlieren nach 6 Tagen
bei Raumtemperatur bis zu 10% ihrer Aktivität, wogegen die gepufferte Lösung nach
6 Tagen bei 25'C ihre Aktivität beibehält.
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Im Gegensatz zu diesen beiden bekannten Salzen ist das erfindungsgemäße
Erythromycinglutamat von einer schwachen Säure vom pK al = 4 abgeleitet, und auf
Grund des Vorhandenseins einer Aminogruppe beträgt der pH-Wert der wäßrigen. Lösung
dieses Salzes 6, 3. Dieser pH-Wert liegt also in dem für die Stabilität des Antibiotikums
günstigen Bereicli, was eine Verabreichung auf parenteralem Wege ermöglicht.
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Darüber hinaus ist zu bemerken, daß die Aktivität von Erythromycinglutamat
805 Einheiten pro Milligramm beträgt, während die theoretische Aktivität im Hinblick
auf die Solvatation (5,5%) dem Wert von 785 Einheiten pro Milligramm entspricht.
Das Erythromycin erfährt also, wenn es in Form des Glutamats vorliegt, keinen Aktivitätsverlust.
Weiterhin läßt sich feststellen, daß in den Formulierungsbeispielen auf Basis von
Erythromycinphosphat oder
-sulfamat, wie es in der belgischen Patentschrift 647 805
bzw. der USA.-Patentschrift 2 830 982 beschrieben ist, der hauptsächliche Bestandteil
(wenn man von der Quantität ausgeht) Zucker darstellt.
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Diese Anwesenheit von Zucker deutet auf den bitteren Geschmack hin,
der ein Charakteristikum der meisten Erythromycinsalze ist. Im Gegensatz dazu besitzt
das erfindungsgemäße Erythromycinglutamat keinen bitteren Geschmack, was in der
Tatsache zum Ausdruck kommt, daß seine Einführung in das Trinkwasser von Tieren
keine Verringerung des Trinkwasserverbrauchs bewirkt.
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Das erfindungsgemäße neue Erythromycinsalz besitzt in festem Zustand
ebenfalls eine gute Stabilität.
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Wird es beispielsweise in festem Zustand einige Tage lang einer Temperatur
von 50-C ausgesetzt, so erfährt es keine Veränderung.
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Bei Versuchen mit dem Erythromycinglutamat und bekannten Verbindungen
wurden die folgenden Ergebnisse erhalten : 1. Toleranz von Erythromycinglutamat
bei Tieren a) Auf oralem Wege Die Toleranz des Erythromycinglutamats wurde auf oralem
Wege bei 13 Tage alten Küken bestimmt.
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Die 5 Tage lang durchgeführte Einmengung dieses Salzes in einer Menge
von 0, 50 g pro Liter in das Trinkwasser hatte keine Verminderung der verbrauchten
Wassermenge und keine Wachstumsstörung der Tiere zur Folge b) Auf intramuskulärem
Wege Auf intramuskulärem Wege wird 1 ccm wäßrige Erythromycinglutamatlösung mit
einer Konzentration von 4% (bezogen auf die Erythromycinbase) in den Rückenlendenmuskel
von Kaninchen injiziert : die Tiere wurden am 10. Tag nach der Injektion getötet
und der Rückenlendenmuskel einer Autopsie unterzogen. Es konnte weder eine Spur
der Injektion noch eine entzündete Stelle festgestellt werden.
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Die Toleranz des auf oralem oder intramuskulärem Wege verabreichten
Produkts ist daher zufriedenstellend.
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2. Aktivität bei Tieren A. Bestimmung der Antibiotikumkonzentrationen
im Blut Die Verabreichung des Erythromycinglutamats auf oralem Wege bewirkt therapeutisch
wirksame Blutspiegel. a) Bei der Ratte An zwei Gruppen von zehn Ratten verabreicht
man mittels einer Megensonde eine einzige Dosis der wäßrigen Lösung von 50 mg Erythromycinglutamat
pro Kilogramm. 15 Minuten nach der Verabreichung wird von jeder Ratte eine Blutprobe
entnommen, und die antibiotische Aktivität wird nach der Diffusionsmethode in Agar-Nährmedium
bei einem pH-Wert von 8 bestimmt, wobei als Testkeim ein Stamm Streptococcus faecalis
ATCC 10 541 verwendet wird.
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Die Diffusionsmethode besteht darin, daß man eine Petrischale, die
ein Agarmedium enthält, mit dem zu untersuchenden Keim besät. Mit Hilfe eines Locheisens
(Durchmesser I cm) entfernt man eine runde Lamelle geringer Dicke. In diese kleine
Offnung
bringt man nun das zu untersuchende Antibiotikum verdünnt
in das Serum ein. Das Produkt diffundiert in das Agar-Nährmedium, und nach 18 Stunden
bei 37 C erscheint um jede Offnung eine runde Inhibierungszone proportional zur
Aktivität der Antibiotikumslösung, und man vergleicht den Durchmesser mit dem, den
man mit bestimmten Erythromycinverdünnungen erhalten hat. Die Verdünnungen der zu
titrierenden Serumproben werden mit Pferdeserum durchgeführt, wobei die Titrierung
vergleichsweise mit einer Standardprobe aus reiner Erythromycinbase erfolgt. Die
Untersuchung wurde im Vergleich mit der gleichen Menge an Propionylerythromycin
(bezogen auf die Erythromycinbase) durchgeführt. Die folgende Tabelle gibt die Durchschnittswerte
der erhaltenen Ergebnisse an :
| Blutspiegel nach der Verabreichung von |
| Erythromycin-Propionylerythro- |
| glutamat mycin |
| 1. Rattengruppe... 0,31 agZccm 0,30 j. Wccm |
| 2. Rattengruppe... 0,33 [g/ccm 0, 30 I, gSccm |
Die auf oralem Wege durch Erythromycinglutamat hervorgerufenen Blutspiegel sind
den durch Propionylerythromycin hervorgerufenen um ein Geringes überlegen. b) Beim
Huhn An Hühnergruppen wird eine einzige Dosis aus 100 mg/'kg Erythromycinglutamat
(bezogen auf die Erythromycinbase) mittels einer Magensonde (in wäßrigem Medium)
verabreicht. Mittels zu verschiedenen Zeitpunkten von den Tieren entnommenen Blutproben
wird die antibiotischeAktivität des Serums nach der Diffusionsmethode in einem Agar-Nähr-U,
aureus09Pverwendetwird.Die bei der Messung der Inhibitionszonen, die im Vergleich
zu einer Standardprobe aus der Erythromycinbase erfolgt, erhaltenen mittleren Werte
(bezogen auf die Erythromycinbase) sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefaßt.
Die Bestimmung wurde im Vergleich zu Propionylerythromycinlaurylsulfat und Erythromycinthiocyanat
durchgeführt, wobei diese Verbindungen in den gleichen Dosen wie das Erythromycinglutamat,
bezogen auf die Erythromycinbase, verabreicht wurden.
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Aktivität des Serums
| Propionyl- |
| Zeit Erythromycin-erythromycin-Erythromycin- |
| Y erythromycin- |
| nach der glutamat laurylsulfat thiocyanat |
| Verabreichung |
| eg'ccm, lglccm sg'ccm |
| 1 Stunde 2.1 0,35 0,70 |
| 2 Stunden 0, 9-0, 67 |
| 30Minuten |
| 3 Stunden 0,56 0,43- |
| 5 Stunden 0, 5-< 0, 3 |
Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß die Blutspiegel des Erythromycinglutamats günstiger
sind als diejenigen der anderen Erythromycinverbindungen.
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B. Wirksamkeit » in vivo « gegen pathogene Keime Die therapeutische
Wirksamkeit des Erythromycinglutamats wurde bei durch pathogene grampositive Keime
auf experimentellem Wege hervorgerufenen Infektionen bestimmt. Die Bestimmungen
wurden im Vergleich zu Erythromycin und Propionylerythromycin durchgeführt. a) Experimentelle
Infektionen mit Staphylokokken Gruppen von 10 auf intraperitonealem Wege mit 0,30
ccm einer Kultur mit zozo Staphylococcus aureus (Stamm TIN) infizierten Mäusen wurden
zwei aufeinanderfolgende Tage lang durch Verabreichung von Erythromycinglutamat
auf oralem oder subkutanem Wege behandelt. Die erste Dosis wurde in wäßriger Lösung
sogleich nach der Einimpfung und die zweite 20 Stunden später verabreicht. Die Vergleichssubstanzen
wurden unter den gleichen Bedingungen verabreicht, d. h. in wäßriger Suspension
und in den gleichen Dosen. Die therapeutische Wirkung, die an Hand des Ausmaßes
der Mortalität der Tiere, der Geschwindigkeit der Mortalität und des Ausmaßes der
Nierenschäden (auf Grund der Toxizität der Staphylokokkenstämme) im Vergleich zu
nicht behandelten Versuchstieren bestimmt wird, ist aus der folgenden Tabelle ersichtlich
:
| Dosis pro |
| Art der Maus von Thera- |
| Verabreichte Substanz Verab-20 g (bezogen peutische |
| reichung auf reines Wirkung |
| Erythro- |
| mycin) |
| Erythromycin-oral 2,55 mg 100% |
| glutamat 1,7 mg 96% |
| subkutan 2,55 mg 100% |
| 1,7 mg 100% |
| Freies oral 2,55 mg 100% |
| Erythromycin 1, 7 mg 80% |
| Propionyl-oral 2, 55 mg 57% |
| erythromycin 1, 7 mg 28% |
| subkutan 2,55 mg 94% |
| 1,7 mg 86% |
Diese Ergebnisse zeigen, daß das Erythromycinglutamat unter den gleichen Versuchsbedingungen
sowohl bei der Verabreichung auf oralem als auch auf subkutanem Wege gegen die generalisierte
Infektion mit Staphylokokken, die den Tod der Kontrolltiere schnell herbeiführt,
eine therapeutische Wirkung besitzt, die derjenigen von Erythromycin oder Propionylerythromycin,
das in einer der reinen Base entsprechenden Dosis verabreicht wurde, eindeutig überlegen
ist. b) Experimentelle Streptokokken-Infektionen Gruppen von 10 Mäusen, die durch
Einimpfung einer Kultur von Streptococcus hemolyticus (Stamm M) infiziert wurden,
wurden vier aufeinanderfolgende Tage lang durch orale Verabreichung einer wäßrigen
Erythromycinglutamatlösung (Magensonde) behandelt. Die Vergleichssubstanzen wurden
unter den gleichen Bedingungen verabreicht, d. h. in den gleichen, auf Erythromycin
bezogenen Dosen, und zwar in
Form einer wäßrigen Suspension. Die
wie vorstehend unter a) bestimmte therapeutische Wirksamkeit geht aus der nachstehenden
Tabelle hervor :
| Dosis pro Maus |
| von 20 g Therapeutische |
| (bezogen Substanz (bezogen auf Wirkung |
| reines |
| Erythromycin) |
| Erythromycinglutamat 2,55 mg 100% |
| 0,85 mg 67% |
| Erythromycinbase 2,55 mg 77% |
| 0,85 mg 38% |
| Propionylerythromycin 2,55 mg 78% |
| 0,85 mg 19% |
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen, daB das auf oralem Weg verabreichte Erythromycinglutamat
gegen eine generalisierte Streptokokkeninfektion, die den raschen Tod der Versuchstiere
herbeiführt, unter den gleichen experimentellen Bedingungen eine Wirkung besitzt,
die derjenigen von Erythromycinbase und Propionylerythromycin, die in der reinen
Base entsprechenden Dosen verabreicht wurden, überlegen ist.
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Das Erythromycinglutamat kann zur Behandlung von Staphylokokken,
Streptokokken, Pneumokokken sowie von durch spezifische Keime hervorgerufenen Infektionskrankheiten,
wie Diphterie und Gonokokkie, verwendet werden.
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Die geeignete Dosierung liegt zwischen 50 und 500 mg pro Verabreichung
und, je nach der Art der Verabreichung, zwischen 0,5 und 5 g pro Tag bei Erwachsenen.
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Das Erythromycinglutamat wird dadurch hergestellt. daß man in an
sich bekannter Weise entweder Erythromycin in Gegenwart von Wasser und gegebenenfalls
eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels mit Glutaminsäure umsetzt
oder ein lösliches Erythromycinsalz mit einem löslichen Glutaminsäuresalz in einer
Mischung eines mit Wasser schwer mischbaren organischen Lösungsmittels, in dem Erythromycin
löslich ist, und einer geringen Menge Wasser umsetzt.
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Für die Umsetzung des Erythromycins eignet sich als organisches Lösungsmittel
ein niederes aliphatisches Keton, wie Methyläthylketon oder Aceton, ein niederes
aliphatisches Carbonsäureamid, z. B.
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Dimethylformamid, ein niederer aliphatischer Alkohol. wie n-Butanol,
oder ein cyclischer Äther, wie Tetrahydrofuran oder Dioxan.
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Die Isolierung des gebildeten Salzes wird in bequemer Weise durch
Abnutschen durchgeführt, wenn man in einem wäßrigen Lösungsmittel arbeitet, in dem
das Erythromycinglutamat unlöslich ist. Bleibt das Erythromycinglutamat in Lösung,
dann wendet man eine lyophile Behandlung oder eine Konzentrierung an, der sich eine
Zentrifugierung anschließt.
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Arbeitet man nur in Wasser, dann können unmittelbar injizierbare
Erythromycinglutamatlösungen erhalten werden.
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Bei Durchführung der Umsetzung mit einem löslichen Erythromycinsalz
wird Erythromycinacetat, -propionat oder-lactat, als lösliches Glutaminsäuresalz
ein Alkalisalz sowie ein Salz eines Amins oder eines niederen aliphatischen Aminoalkohols
der Glutaminsäure und als mit Wasser schwer mischbares
organisches Lösungsmittel
ein niederes Alkylacetat. wie Athylacetat, Butylacetat oder Amylacetat, oder ein
chloriertes organisches Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, Methylenchlorid
oder Dichloräthan, verwendet.
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Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren
Beispiel 1 115 g wasserfreie Erythromycinbase werden in 1150 ccm einer azeotropen
Mischung aus Methyläthylketon und Wasser gelöst, worauf der erhaltenen Lösung unter
kräftigem Rühren 20 g wasserfreie Glutaminsäure zugesetzt werden und das Rühren
dann noch 16 bis 20 Stunden fortgesetzt wird. Hierauf wird filtriert, das gebildete
Produkt abgenutscht und über Nacht bei 50°C getrocknet. Man erhält 113g (85% der
Theorie) Erythromycinglutamat, das mit 5,5% Wasser solvatiert ist ; F. 148 bis 150-C,
[a] 2u 55, 3° (c = 1%, Wasser).
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Das Produkt fällt in Form von farblosen Nadeln an, die in Wasser
löslich sind. Das Produkt wird durch verdünnte wäßrige Säuren und Alkalien sowie
durch die meisten der üblichen organischen Lösungsmittel zersetzt.
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Die 5% ige wäßrige Lösung besitzt einen pH-Wert von 6,1.
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Die antibiotische Aktivität beträgt 805 y/mg, bezogen auf die reine
Erythromycinbase.
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Beispiel 2 5 g Erythromycin und 1 g Glutaminsäure werden in 60 ccm
Wasser suspendiert, worauf die Reaktionsmischung 1 Stunde gerührt wird. Dann wird
filtriert und anschließend das Filtrat einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei
6 g Erythromycinglutamat erhalten werden.
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Das erhaltene Produkt ist mit dem im Beispiel 1 beschriebenen identisch.
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Beispiel 3 350 g Erythromycin werden in 31 Butylacetat gelöst, worauf
eine Lösung von 80 g Mononatriumglutamat in 150 ccm Wasser zugegeben wird. Die Reaktionsmischung
wird dann bei Zimmertemperatur einige Minuten gerührt, worauf 28, 6 ccm Essigsäure
zugegeben werden. Hierbei beobachtet man im Augenblick der Zugabe der Essigsäure
die Bildung eines kolloiden Niederschlages (Gel) von Erythromycinacetat. Bei dem
anschließenden Rühren verschwindet das Gel in dem Maße, in dem sich ein kristalliner
Niederschlag von Erythromycinglutamat durch doppelte Umsetzung bildet. [Erythromycinacetat
+ Natriumglutamat-Erythromycinglutamat (fällt aus, da es in dem Milieu wenig löslich
ist) + Natriumacetat]. Das Rühren wird 1 Stunde fortgeführt, dann wird abgenutscht,
das Produkt mit Butylacetat gewaschen und bei 50c C getrocknet. Man erhält 409 g
Erythromycinglutamat, das ungefähr 8% Natriumacetat enthält.
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Beispiel 4 Zu einem Gel von Erythromycinacetat, das durch Lösen von
40 g Erythromycin in 360 ccm Butylacetat mit 5% Wasser und anschließende Zugabe
von 3,3 ccm Essigsäure unter Rühren erhalten worden ist, werden 9, 2 g Mononatriumglutamat
unter Rühren zugegeben.
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Dabei beobachtet man eine rasche Kristallisation,
die
von einer Verflüssigung des Gels begleitet ist.
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Nach l stündigem Rühren wird der Niederschlag abgesaugt, mit Butylacetat
gewaschen und getrocknet.
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Man erhält so 46 g Erythromycinglutamat, dessen Eigenschaften mit
dem nach Beispiel 3 gewonnenen Produkt identisch sind.