DE2336397A1

DE2336397A1 - Alkylester von polyen-antibiotika

Info

Publication number: DE2336397A1
Application number: DE19732336397
Authority: DE
Inventors: Tiberio Bruzzese; Rodolfo Ferrari
Original assignee: Prodotti Antibiotici SpA
Current assignee: Prodotti Antibiotici SpA
Priority date: 1972-07-24
Filing date: 1973-07-17
Publication date: 1974-02-14
Also published as: BE802512A; JPS5310562B2; CA998996A; FR2193575B1; FR2193575A1; US3936526A; JPS49124002A; NL7309990A; GB1399139A

Description

Patentanwälte Dipl.-Ing. F. Ψειοκμανκ,

Dipl.-Ing. H.Weickmann, D1PL.-PHYS. Dr. K. Fincke H/WE/MY Dipl.-Ing. EA.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber

SPA Case 055 1 München «6, den

POSTFACH 860 820

MDHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 48 39 21/22

<983921/22>

SPA-Societa Prodotti Antibiotic! S.ρ.Α., Mailand / Italien 8, Via Blella

Alkylester von Polyen-Antibiotika

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Alkylestern von Polyen-Antibiotika aus natürlichen Polyenverbindungen. Die erfindungsgemäßen Ester besitzen wertvolle pharmakologische und mikrobiologische Eigenschaften.

Es wurde gefunden, daß die betreffenden Alkylester, von denen einige neu sind, sehr oft eine hohe Aktivität gegen zahlreiche Arten von Fungi, Hefen und Protozoa besitzen,? in einigen Fällen ist die Wirkung besser als die der ursprünglichen Polyene.

Weiterhin wurde gefunden, daß man bei der im folgenden beschriebenen neuen Veresterung im allgemeinen neue Derivate mit einer verminderten haemolytischen Wirkung auf rote Blutzellen und im allgemeinen mit geringer Toxizität erhält, im Gegensatz zu den natürlichen Polyenen, deren Toxizität oft ihre klinische Verwendung verhindert oder beschränkt hat.

In der Literatur sind nur sehr wenige Beispiele von Estern von natürlichen Polyenverbindungen beschrieben, und soweit der Anmelderin bekannt ist wurden nur einige Derivate beschrieben, die in allen Fällen Methylester sind, beispiels-

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weise der Partricin-methylester und der Nystation-methylester. Außer dem Partricin-methylester wurden diese Derivate im allgemeinen bei Strukturuntersuchungen der Ausgangsmaterialien als Abbauprodukte hergestellt.

Partricin-methylester, der in der britischen Patentanmeldung 52271/70 beschrieben ist, besitzt-eine erhöhte Aktivittät und verminderte Toxizität, verglichen mit der natürlichen Verbindung, von der er sich ableitet.

Soweit der Anmeldung bekannt ist, hat bis jetzt noch niemand nachweisen können, weshalb die Veresterung verbesserte biologische Eigenschaften wie erhöhte Aktivität und verminderte Toxizität ergibt.

Die Polyenantibiotika stellen eine große Gruppe von Verbindungen dar, die üblicherweise durch Metabolismus von verschiedenen Mikroorganismen der Streptomyces species gebildet werden. Im Hinblick auf ihre ungesättigte Struktur und darauf, daß sie konjugierte Doppelbindungen enthalten, werden sie in Gruppen eingeteilt wie in Hexaene, Pentaene und Heptaene, die von besonderem Interesse sind, und die Tetraene. Jede Gruppe ist durch ihr eigenes ultraviolettes Absorptionsspektrum charakterisiert, das als wichtiges Mittel für die Struktur Zuordnung gilt.

Obgleich die Formeln dieser Verbindungen in den meisten Fällen unbekannt sind oder nur teilweise festgestellt werden konnten, ist bekannt, daß die Verbindungen eine Hakrolid-Struktur besitzen, und weiterhin sind diese Verbindungen, was ihre physikalisch- chemischen Eigenschaften betrifft, im allgemeinen amphoter. Manchmal sind sie durch die Anwesenheit von nur einer funktionellen Gruppe, die sauer oder basisch sein kann, charakterisiert.

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Verwendet man diese amphoteren oder sauren Polyene als Ausgangsmaterialien, so kann man, wie überraschenderweise gefunden wurde, die entsprechenden Alkylester leicht daraus herstellen. Genaue analytische Untersuchungen der natürlichen Polyene haben gezeigt, daß sie oft aus einer Mischung aus verschiedenen Verbindungen mit ähnlichen Strukturen bestehen. Man kann daher die Polyene in Form einer solchen Mischung verestern oder man kann sie, sofern die einzelnen Bestandteile zur Verfügung stehen, getrennt verestern.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Alkylestern von Polyen-Antibiotika, wobei ein Polyen-Antibiotikum mit einem geeigneten Diazoalkan in Anwesenheit einer basischen Verbindung umgesetzt wird.

Die dabei erhaltenen Ester, bei denen die Alkylgruppe der Estergruppe 2 oder mehr Kohlenstoffatome enthält, sind neu.

Die Diazoverbindung wird im allgemeinen nur in geringem Überschuß verwendet, um die Bildung von Produkten mit höherem Alkylierungsgrad zu verhindern. Die Diazoalkane müssen mit der erforderlichen Sorgfalt behandelt werden, da sie giftig und potentiell explosiv sind. Die Reaktionszeit liegt im allgemeinen zwischen 1 und 24 Stunden und mehr bevorzugt zwischen 4 und 8 Stunden. Die Reaktionstemperatur wird im allgemeinen zwischen 0 und 5O⁰C oder, am meisten bevorzugt, bei Zimmertemperatur (15 bis 30°C) gehalten.

Nach Beendigung der Stickstoffentwicklung, was anzeigt, daß die Umsetzung beendet ist, kann der gewünschte Ester isoliert werden, beispielsweise durch Ausfällen mit einem geeigneten Lösungsmittel und anschließender Filtration. Gewünschtenfalls kann er aus geeigneten Lösungsmitteln umkristallisiert oder durch Säulenchromatographie gereinigt werden.

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Bei der Veresterungsreaktion sind bevorzugte Lösungsmittel beispielsweise Dimethylsulfoxyd, Dimethylformamid, Formamid, Dimethylacetamid, 2-Äthoxyäthanol, Pyridin und andere organische Lösungsmittel, die für die ursprünglichen Polyene ein hohes Lösungsvermögen besitzen und die zur gleichen Zeit gegenüber dem Diazoalkan, das bei der Umsetzung verwendet wird, inert sind. Im Gegensatz dazu werden Ausfällungsmittel mit niedrigem Lösungsvermögen zur Gewinnung der Reaktionsprodukte verwendet. Solche Lösungsmittel umfassen beispielsweise Äther, Benzol, überschüssiges Wasser u.a. Die rohen, dabei isolierten Ester können für analytische Zwecke unter Verwendung geeigneter Lösungsmittelmischungen wie Dimethylsulfoxyd/Äther, Dimethylsulfoxyd/Wasser, Dimethylacetamid/Wasser u.a. gereinigt werden.

Die chromatographische Reinigung wird im allgemeinen auf einer Säule aus Silikagel unter Verwendung mehr oder weniger komplexer Lösungsmittelmischungen als Eluierungsmittel, beispielsweise Pyridin/Petroläther oder Butanol/Äthanol/ Aceton/Ammoniak,durchgeführt.

Wie oben angegeben, wird die Veresterung der Polyen-Antibiotika in Anwesenheit einer basischen Verbindung wie Ammoniak durchgeführt, das in stöchiometrischen bis katalytischen Mengen zugegeben wird. Organische Basen wie beispielsweise Triäthylamin können ebenfalls verwendet werden.

Die Durchführung der Umsetzung bei einem alkalischen pH-Wert (beispielsweise pH 10 bis 10,5, bestimmt nach geeigneter Verdünnung bis zu 196) verhindert die Bildung bestimmter Nebenprodukte, von denen einige unbekannt sind, und daher sind die erhaltenen Produkte sehr rein, besitzen eine hohe mikrobiologische Aktivität.

Die erfindungsgemäßen Alkylester sind kristalline Feststoffe mit einer geringen gelben bis braunen Färbung, deren Schmelz-

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punkte nicht gut bestimmt werden können. Sie sind im allgemeinen in Wasser und in wäßrigen Lösungen von Alkali (in Abwesenheit von sauren Funktionen) und ebenfalls in Äther, Petroläther, Benzol und ähnlichen Verbindungen unlöslich. Sie sind wenig oder unlöslich in Alkoholen und in wasserfreiem Aceton, sie sind jedoch mäßig löslich, wenn diese Lösungsmittel 10 bis 20% Wasser enthalten. Sie sind jedoch sehr löslich in Dirnethylsulfoxyd, Pyridin, Formamid und Dimethylacetamid. Es ist interessant zu beobachten, daß einige von ihnen fähig sind, in verschiedenen Gewichtsverhältnissen mit unterschiedlichen Verbindungen, beispielsweise mit Natriumdesoxycholat, Natriumlaurylsulfat und anderen, die in der Literatur für die natürlichen Polyene beschrieben wurden, Komplexe zu bilden. Diese Komplexe ergeben wäßrige Lösungen, in denen die Verbindungen in kolloidaler Form fein dispergiert sind (Pseudolösungen). Dieses Verhalten zeigt, daß die Carboxylgruppe der Polyene für die Bildung dieser molekularen Komplexe nicht unentbehrlich ist.

Die erfindungsgemäßen Alkylester enthalten die unveränderte polyenische Struktur der Ausgangsmaterialien, was aus ihren ultravioletten Absorptionsspektren hervorgeht, die₉ bezogen auf die Wellenlänge der Absorptionsmaxiiaa, vollkommen unverändert sind, und sie zeigen nur geringe Änderungen in ihren Intensitätswerten, wie man es erwarten könnte. Gelegentliche ausgeprägte Modifizierungen, die man in den Verhältnissen zwischen den Intensitäten der verschiedenen Maxima, verglichen mit den natürlichen Verbindungen, findet, zeigen einen bestimmten Abbau der Verbindung mit einer dementsprechenden Verminderung der mikrobiologischen Aktität. Da diese Substanzen Verbindungen mit hohem Molekulargewicht sind, wird der Prozentgehalt bei der Elementaranalyse durch die eingeführten Substituenten nicht wesentlich geändert, und oft kann man die Elementar analyse für die Strukturzuordnung nicht verwenden.Das Verfahren und die bei der Umsetzung verwendeten Reagentien, die in Einklang mit den allgemeinen, in

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der Literatur beschriebenen VerÄhren stehen, zeigen an, daß die neuen Verbindungen die Struktur von Alkylestern besitzen. Dies wird durch das Verschwinden der Säurefunktion aus dem Ausgangsmaterial (Unlöslichkeit in Alkali) und durch das Infrarotspektrum bestätigt, welches eine starke Absorptionsbande mit Frequenzen, die im allgemeinen um 1700 cm liegen, zeigt und die der "stretching vibration" (Streckschwingung) der C=0-Gruppe eines Esters zuzuordnen ist. Die NMR-Spektren (Lösungen in Dimethyl-dcsulfoxyd) sind ebenfalls von Wert und enthalten charakteristische Peaks, die im Falle der Methylester eine chemische Verschiebung, verglichen mit dem Tetramethyl si lan, von ungefähr 3,5 ppm zeigen. Die Reinheit der erhaltenen Produkte, insbesondere das vollkommene Verschwinden der als Ausgangsmaterial verwendeten Polyene, wird leicht durch Dünnschichtchromatographie auf Sllikagel F254 geprüft. Mit diesem Verfahren und unter Verwendung von Lösungsmittelsystemen der Art Butanol/Äthanol/ Aceton/konz.wäßriger Ammoniumhydroxydlösung (2:5:1ϊ3) zeigen alle untersuchten polyenischen Ester Rf-Werte, die wesentlich höher sind als die der nichtbehandelten Verbindung, und damit ist eine gute Kontrolle der Reinheit möglich. Die Flecken können durch Belichtung mit ultraviolettem Licht bei geeigneten Wellenlängen sichtbar gemacht werden.

Im Hinblick auf ihre mikrobiologische Aktivität besitzen die erfindungsgemäßen Alkylester im wesentlichen das gleiche Wirkungsspektrum wie die natürlichen Polyene. Sie besitzen wenig oder keine Aktivität gegenüber gram-positiven und gramnegativen Bakterien, sie sind jedoch aktiv gegenüber zahlreichen Species von pathogenen Fungi, insbesondere Candida albicans. Wenn die ursprüngliche Verbindung ebenfalls eine Aktivität gegenüber bestimmten Protozoa, wie es oft der Fall ist, besitzt, insbesondere gegenüber Trichomonas, so wird diese Aktivität im allgemeinen beibehalten. Der Wirkungsgrad dieser Ester steht in direktem und genauem Zusammenhang mit dem der Ausgangsmaterialien, so daß er nicht als Ganzes für

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die gesamte Klasse der Verbindungen gilt, obgleich gezeigt wurde, daß. die untersuchten Heptaenester das Wachstum des gleichen Stammes von Candida albicans bei der gleichen Konzentration oder bei einer 2- bis Afachen oder noch geringeren Konzentration inhibieren, d.h. die Aktivität ist gleich oder besser. Die Tetraenester sind andererseits genauso aktiv, obgleich deren Wirkung manchmal stark vermindert ist, jedoch tritt selbst dadurch kein Verlust im theoretischen und praktischen Wert auf.

Die Toxizität der Alkylester ist recht niedrig und in einigen Fällen merklich niedriger als die der Ausgangsverbindungen. Die Versuche wurden durchgeführt, indem man Suspensionen in Carboxymethylcellulose verschiedenen Versuchstieren auf oralem und peritonealem Weg verabreichte. Die potentielle Toxizität der Polyene wird in starkem Ausmaß durch ihre sehr niedrige Löslichkeit in Wasser und in physiologischen Medien beeinflußt. Da dadurch die Möglichkeit einer Absorption stark beeinflußt wird, wurden nach Solubilisierung der Verbindungen mit Gallensäuren andere Versuche durchgeführt, um Wechsel in der Löslichkeit zu vermeiden, wodurch man irreführende Ergebnisse erhalten könnte. In diesem Fall beobachtete man auch eine beachtliche Zunahme in den LDcQ-Werten für die neuen veresterten Derivate. Die haemolytische Wirkung, eine Nebenwirkung, die die Möglichkeit, die heptaenischen Polyene klinisch zu verwenden, stark verminderte, ist in den neuen Derivaten bemerkenswert vermindert, und diese besitzen eine minimale haemolytische Konzentration, die bis um das 10- bis 2Ofache höher ist als die der Ausgangsmaterialien.

Als Ganzes gesehen, bewirken die mikrobiologischen und toxikologischen Eigenschaften der Alkylester und insbesondere die der Alkylester der Heptane, daß diese Verbindungen als therapeutische Mittel zur Bekämpfung von Pilz- und protozoalen Infektionen in Menschen, Tieren und Pflanzen eine große Bedeutung besitzen. 409807/1 1 19

Von besonderem Interesse ist ihre Verwendung auf dem Gebiet der dermatologischen Infektionen, die durch Candida albicans und Trichomonas vaginalis verursacht werden, entweder in Form von Salben, Cremes, Schaum und Tinkturen für die topische Verwendung oder in Form von Vaginalsuppositorien. Die niedrige Absorption durch die intestinalen Wände der meisten unlöslichen Derivate gibt den Hinweise, daß sie besonders nützlich sind, um die intestinalen mycotisehen Infektionen, die oft in Menschen nach verlängerter Behandlung mit antibakteriellen Mitteln wie mit Chloramphenicol und Tetracyclin auftreten, zu bekämpfen. Die Möglichkeit, die polyenischen Ester zu Trägerstoffen oder Arzneimittelträgerstoffen zuzufügen, die die meisten organischen und nichttoxischen Lösungsmittel enthalten können, zusammen mit ihrer Fähigkeit, wasserlösliche oder kolloidale, dispergierbare Molekularkomplexe mit zahlreichen Verbindungen wie mit Gallensäuren zu bilden, schließt die Möglichkeit der Absorption nach der oralen und parenteralen Verabreichung und ihre daraus folgende Wirksamkeit bei der Bekämpfung allgemeiner Infektionen nicht aus. Klinische Voruntersuchungen wurden mit einigen der Alkylester, beispielsweise mit Amphotericin-methylester, mit Erfolg durchgeführt.

Für die pharmazeutische Verwendung können die Alkylester mit geeigneten festen oder flüssigen pharmazeutischen Verdünnungsmitteln oder Trägerstoffen vermischt werden. Die Präparationen umfassen Salben und Tinkturen für die topische Verwendung, Tabletten, Brausetabletten, Dispersionspulver, Kapseln, Suspensionen in öl und ähnliche Zusammensetzungen für die orale Verwendung und Suppositorien. Eine große Vielzahl von Verdünnungsmitteln oder Lösungsmitteln wie injizierbare Öle und andere nichttoxische organische Lösungsmittel oder steriles Wasser kann für die Verabreichung auf parenteralem Weg verwendet werden. Die Alkylester können weiterhin auf zuvor beschriebene Weise solubilisiert werden, um die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen zu erleichtern.

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Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

10 g Amphotericin B werden in 100 ml Dimethylsulfoxyd gelöst. Anschließend wird eine Lösung aus Ammoniumhydroxyd tropfenweise unter Rühren in einer Menge zugefügt, die ausreicht, um den pH-Wert der Lösung auf ungefähr 10 zu erhöhen. Der pH-Wert der Lösung wird in einer Probe der Lösung nach Verdünnung auf 1% durch Zugabe einer Mischung aus Dimethylsulfoxyd/Wasser (1:1) gemessen. 100 ml einer 2,556igen Ätherlösung von Diazomethan werden dann vorsichtig zugegeben und die Reaktionsmischung wird bei Zimmertemperatur,während man langsam rührt, während 6 Stunden aufbewahrt. Nach dieser Zeit wird das Reaktionsprodukt durch Zugabe von überschüssigem Äther ausgefällt und der Niederschlag wird durch Filtration abgetrennti Nach Behandlung mit einer Mischung aus Aceton/Äther und anschließendem intensivem Waschen mit Wasser wird der gewünschte Amphotericin B-methylester in Form eines gelben, kristallinen Feststoffs erhalten. Dünnschichtchromatographische Analyse auf Platten mit Silikagel F254 unter Verwendung einer Mischung aus Butanol/Äthanol/Aceton/ konz.wäßriger Ammoniumhydroxydlösung (2:5:1:3) als Eluierungssystem zeigt einen einzigen Fleck mit einem Rf-Wert um 0,74 (Amphotericin B, Rf 0,41). Das ultraviolette Absorptionsspektrum in Äthanollösung zeigt Maxima bei 346, 364, 383 und 407 m/U wie das Ausgangsmaterial, während das Infrarotspektrum in Nujolsuspension (vergl. Fig. 1 der beigefügten Zeichnungen) eine Absorptionsbande bei 1713 cm zeigt, die der Stretchschwingung einer C=O-Estergruppe zuzuordnen ist.

Amphotericin B-methylester inhibiert das Wachstum eines Stammes von Candida albicans (minimale Hemmkonzentration) bei einer Verdünnung von 0,3 mcg/ml (Amphotericin B, MIC 0,6 mcg/ml) und er besitzt eine haemolytische Minimumkonzen-

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tration an Ratten-Erythrocyten nach 1 Stunde von 25 bis 50 mcg/ml (Amphotericin B, MHC 2,25- mcg/ml). Akute Toxizitätsversuche nach der intravenösen Verabreichung an Mäusen von Suspensionen des Produktes in amorpher Form (isoliert aus Dimethylsulfoxyd-Yiasser) ergeben LDcQ-Werte von ungefähr 60 mg/kg. (Amphotericin B besitzt unter den gleichen Versuchsbedingungen einen LDcQ-Wert von ungefähr 5 mg/kg). Verwendet man den Ester in kristalliner Form, so besitzt er bei oraler und pertitonealer Verabreichung bei verschiedenen Versuchstieren ebenso wie das natürliche Polyene eine sehr niedrige Toxizität.

Beispiel 2

5 g kristalliner Amphotericin B-methylester, erhalten gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, werden in 100 ml Dimethylsulfoxyd gelöst. Die erhaltene Lösung wird unter Rühren bei Zimmertemperatur zu 500 ml einer 0,5#igen Lösung aus Natriumdesoxycholat gegeben. Man erhält dabei einen amorphen Niederschlag. Dieses Material wird durch Zentrifugieren isoliert und zuerst mit einer 0,5%igen Lösung aus Natriumchlorid und dann gut mit destilliertem Wasser ge waschen.

Das Produkt wird erneut durch Zentrifugieren isoliert und dann in einer Lösung suspendiert, die 4,2 g Natriumdesoxycholat in 300 ml destilliertem Wasser enthält. Die Mischung wird 18 Stunden bei Zimmertemperatur aufbewahrt, wobei man gelegentlich rührt.

Der Amphotericin. B-methylester löst sich allmählich und schließlich wird die erhaltene Lösung filtriert, um Spuren an suspendiertem Material zu entfernen. Danach wird das FiI-trat zur Trockene durch Lyophilisierung oder durch sorgfältige Destillation im Vakuum eingedanpft. Der erhaltene Feststoff ist stabil und leicht in Wasser löslich. Die mikro-

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biologische Untersuchung und die spektrophotometrische Titration zeigen, daß er Amphotericin B-methylester in Prozentgehalten, die im allgemeinen über 5OSo liegen (ungefähr 50 bis 60?a), enthält und daß seine mikrobiologische Aktivität voll beibehalten 1st. Versuche im Hinblick auf die akute Toxizität werden mit dieser wasserlöslichen Verbindung mit Natriumdesoxycholat durchgeführt, und man erhält LDcQ-Werte von ungefähr 80 mg/kg (ausgedrückt als Amphotericin D-methylester) nach der intravenösen Verabreichung an Mäuse (Amphotericin B-Komplex mit Natriumdesoxycholat, IDeq ungefähr 4 mg/kg).

Beispiel 5

Zu einer Lösung aus 2 g Amphotericin B in 40 ml Dimethylsulfoxyd, die eine wäßrige Ammoniumhydroxydlösung wie in Beispiel 1 beschrieben enthält, fügt man tropfenweise 40 ml einer 1#igen Ätherlösung von Diazobutan. Die Reaktionsmischung wird langsam während 8 Stunden bei 25°C gerührt und dann wird überschüssiger Äther zugefügt. Man erhält ein gelbes, kristallines Produkt, das durch Filtration isoliert wird, gut mit Äther und dann mit Wasser gewaschen wird und im Vakuum bei Umgebungstemperatur getrocknet wird. Der Amphotericin B-butylester wird in hoher Ausbeute erhalten. Die physikalisch-chemische Analyse der Verbindung ergibt Werte, die sich nicht wesentlich von denen des entsprechenden Methylesters unterscheiden; Der Rf-¥@rt auf Silikagel bei der Dünnschichtchromatographie beträgt ungefähr 0,77, während im Infrarotspektrum die Absorptionsbande der Carbonylgruppe bei einer geringfügig niedrigeren Frequenz (1709 cm ) aufzutreten scheint.

Der Amphotericin B-butylester besitzt eine minimale Hemmkonzentration an Candida alMcans von ungefähr 1,2 mcg/ml und eine minimale haemolytische Konzentration bei Ratten-Erythrocyten nach 1 stündiger Versuchsdauer von ungefähr 50 mcg/ml.

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Das Produkt kann unter Verwendung von Natriumdesoxycholat auf die in Beispiel 3 beschriebene Weise solubilisiert werden. Die erhaltene Verbindung behält die mikrobiologische Aktivität von Amphotericin B-butylester bei und bildet eine stabile Pseudolösung in einem wäßrigen Medium.

B e i s ρ i e 1 4

5 g Ayfactin werden in 50 ml Dimethylsulfoxyd gelöst und eine geringe Menge an wäßrigem Ammoniumhydroxyd wird zugegeben, bis der pH-Wert ungefähr 10 beträgt. Dieser Wert wird nach Verdünnung auf Λ% mit Dimethylsulfoxyd/Wasser (1:1) bestimmt, anschließend werden 40 ml einer 2,5#igen Ätherlösung aus Diazomethan tropfenweise zugefügt, während man langsam rührt.

Nachdem die Reaktionsmischung wie in Beispiel 1 beschrieben aufgearbeitet wurde, erhält man eine quantitative Ausbeute an Ayfactin-methylester in Form eines gelben bis gelbbraunen kristallinen Feststoffs. Das Produkt hat einen Rf-Wert von ungefähr 0,75, bestimmt durch Dünnschichtchromatographie an Silikagel unter Verwendung der üblichen Lösungsmittelmischung Butanol/Äthanol/Aceton/konz.wäßriger .Ammoniumhydroxydlösung (2:5:1:3) (Ayfactin Rf ungefähr 0,48).

Das Ultraviolettspektrum in Pyridinlösung gibt maximale Absorptionswerte bei 346, 366, 388 und 410 mm wie auch das natürliche Polyen und das Infrarotspektrum (vergl. Fig. 2 der beigefügten Zeichnungen) besitzt einen Absorptionspeak der Ester-C=O-Gruppe bei ungefähr 1715 cm"¹.

Der Ayfactin-methylester besitzt eine minimale Hemmkonzentration bei Candida albicans von 0,3 bis 0,6 mcg/ml, die ungefähr gleich ist wie die des ursprünglichen Ayfactins. Das Produkt ist gegenüber Trichomonas vaginalis ebenfalls aktiv. Die Toxizitätsversuche ergeben einen LD_5Q-Wert über 1000 mg/kg

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"bei oraler Verabreichung und von ungefähr 30 mg/kg nach Verabreichung in Suspension bei Mäusen auf peritonealem Weg (Ayfactin, LDe₀ ungefähr 1 mg/kg i.p.).

Ester mit ähnlichen chemischen und biologischen Eigenschaften werden ebenfalls erhalten, wenn man die einzelnen Verbindungen Ayfactin A und Ayfactin B als Ausgangsmaterialien verwendet.

Beispiel 5

Eine Lösung aus 20 g Candicidin in Dimethylsulfoxyd wird mit einer Ätherlösung aus Diazomethan in Anwesenheit von wäßriger Ammoniumhydroxydlösung wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Man arbeitet auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben und erhält hohe Ausbeuten an Candicidin-methylester in Form eines dunkelgelben, kristallinen Pulvers. Das Produkt wird durch Dünnschichtchromatographie mit üblichen Verfahren charakterisiert" und besitzt einen Rf-Wert von ungefähr 0,77» (Candicidin Rf 0,48). Es besitzt ultraviolette Absorptionsmaxima in äthanolischer Lösung bei 340, 359, 378 und 400 nwu genau wie Candicidin. Die Estercarbonylbande tritt im Infrarot-Absorptionsspektrum bei ungefähr 1710 cm** auf (vergl. Fig. 3 der beigefügten Zeichnungen). Candicidin-methylester besitzt eine minimale Hemmkonzentration "bei Candida albicans von 0,15 bis 0,30 mcg/ml (Candicidin, MIC 0,15 mcg/ml) und eine minimale haemolytische Konzentration bei Ratten-Erythrocyten nach 1 Stunde von 5 bis 10 mcg/ml (Candicidin, MHC 0,3 bis 0,6 mcg/ml). Die akuten Toxizitätswerte, die man nach peritonealer Verabreichung an Mäuse von öligen Suspensionen in Carboxymethylcellulose erhält, ergeben LDcQ-Werte von ungefähr 15 mg/kg (Candicidin LDc₀ ungefähr 4 mg/kg).

B e i spi e 1 6

10 g Nystatin, gelöst in 100 ml Dimethylsulfoxyd, werden vorsichtig mit 80 ml einer 2#igen Ätherlösuag von Diazomethan in Anwesenheit von wäßriger Ammoniumhydroxydlösung wie in Bei-

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spiel 1 beschrieben behandelt. Die Reaktionsmischung wird, langsam während 4 Stunden bei 25⁰C ,gerührt und dann wird ein Überschuß an Äther zugefügt, um das Reaktionsprodukt auszufällen. Der Feststoff wird abfiltriert, mit Äther und dann mit Wasser gewaschen, wobei man das gewünschte Produkt in Form eines hellgelben, kristallinen Feststoffs erhält. Der erhaltene Nystatin-methylester besitzt einen Rf-Wert von 0,68 (Nystatin, Rf 0,39)» bestimmt durch Dünnschichtchromatographie an Silikagel, unter Eluierung mit Butanol/Äthanol/ Aceton/konz.wäßriger Ammoniumhydroxylösung (2:5:1:3). Er zeigt Absorptionsmaxima im ultravioletten Lichtspektrum, bestimmt in Äthanollösung, bei 292, 304 und 319 m/U, die die gleichen Frequenzen wie die Maxima für Nystation besitzen und zeigt einen Peak, der der C=0-Stretchvibration eines Esters zugeordnet wird, bei 1718 cm" im Infrarotspektrum (vergl. Fig. 4 der beigefügten Zeichnungen). Mikrobiologisch inhibiert Nystatin-methylester das Wachstum von Candida albicans bei 12 mcg/ml (Nystation, MIC 6 mcg/ml).

Beispiel 7

2 g Pimaricin in Dimethylsulfoxydlösung werden mit Diazomethan in Anwesenheit einer wäßrigen Ammoniumhydroxydlösung auf gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Der dabei erhaltene Methylester von Pimaricin besitzt einen Rf-Wert, wenn man die Chromatographie auf übliche Weise durchführt, von ungefähr 0,74 (Pimaricin, Rf 0,42). Das UV-Absorptionsspektrum in äthanolischer Lösung zeigt Absorptionsmaxima bei 290, 303 und 318 m/u wie das ursprüngliche Pimaricin. Der Ester besitzt eine starke Bande um 1710 cm" im Infrarotspektrum (vergl. Fig. 5 der beigefügten Zeichnungen). Das Produkt ist gegenüber Candida albicans nur mäßig aktiv und besitzt eine minimale Hemmkonzentration über 40 mcg/ml (Pimaricin, MIC 8 bis 10 mcg/ml) und zeigt keine oder nur geringe haemolytische Aktivität bei Ratten-Erythrocyten.

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Beispiel 8

Zu einer Lösung aus 2 g Heptaen-Antibiotikum DJ-400 in 40 ml Dimethylsulfoxyd fügt man eine konzentrierte Lösung aus Ammoniumhydroxyd in einer Menge, die ausreicht, um den pH-Wert der Lösung auf ungefähr 10 einzustellen (der pH-Wert wird nach Verdünnung auf Λ% durch Zugabe einer Mischung aus Dimethylsulfoxyd/Wasser, 1:1, bestimmt). 20 ml einer 2,5#igen Ätherlösung aus dem Diazomethan werden dann zugegeben, während man langsam rührt, wobei die Reaktionsmischung bei Umgebungstemperatur während 2 Stunden gehalten wird. Die Reaktionsmischung wird dann filtriert und überschüssiges Wasser wird zugefügt. Der Methylester des Antibiotikums DJ-400 wird erhalten. Er wird durch Filtration isoliert, gut mit Wasser und Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Der DJ-400-Methylester ist ein gelbes, kristallines Produkt.

Dünnschichtchromatographische Analyse an Siliakgel unter Verwendung des üblichen Lösungsmittelsystems zeigt einen Rf-Wert von ungefähr 0,77_t der höher ist als der Rf-Wert des Antibiotikums DJ-400, das als Ausgangsmaterial verwendet wurde. Das ultraviolette Absorptionsspektrum in äthanolischer Lösung ist im wesentlichen unverändert und zeigt Maxima bei 402, 381, 360 und 340 m/u, während das Infrarotspektrum in Nu^oI-suspension eine neue Absorptionsbande, zeigt, die der Stretchvibration der C=O-Estergrupe zuzuordnen ist.

Vom mikrobiologischen Standpunkt aus zeigt der Methylester des Antibiotikums DJ-400 eine bemerkenswerte Aktivität gegenüber Candida albicans und Trichomonas vaginalis.

Beispiel 9

3 g Antibiotikum DJ-400 werden in 60 ml Dimethylsulfoxyd gelöst. Die so erhaltene Lösung wird mit Ammoniumhydroxyd und dann mit einer Ätherlösung aus Diazopropan wie in Beispiel 8 beschrieben behandelt. Nach der üblichen Aufarbeitung wird

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der Propylester des Antibiotikums DJ-400 erhalten.

Das Produkt wird durch sein Infrarotspektrum identifiziert und durch Dünnschichtchromatographie (Rf-Wert ungefähr 0,80) charakterisiert. Auf gleiche Weise wie die anderen Alkylester zeigt der Propylester des Antibiotikums DJ-400 eine starke Aktivität gegenüber Candida albicans und Trichomonas vaginalis.

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Claims

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Patentansprüche

Verfahren zur Herstellung der Alkylester der Polyen-Antibiotika, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Polyen-Antibiotikura mit einem Diazoalkan in Anwesenheit einer basischen Verbindung umsetzt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei einem pH-Wert von 10 bis 10,5, bestimmt nach Verdünnung auf 1%, durchgeführt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die.basische Verbindung in stöchiometrischen bis katalytischen Mengen verwendet.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als basische Verbindung Ammoniak oder eine organische Base verwendet.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung bei einer Temperatur von 0 bis 50⁰C durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung I
durchgeführt wird.

daß die Umsetzung bei einer Temperatur von 15 bis 30⁰C
7. Alkylester der Polyen-Antibiotika, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. Alkylester der Polyen-Antibiotika, worin die Alkylgruppe der Estergruppe 2 oder mehr Kohlenstoffatome enthält.

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9. Amphotericin B-butylester.
10. Antibiotikum DJ-400-propylester.
11. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend mindestens einen Alkylester nach einem der Ansprüche 7 bis 10 zusammen mit einem festen oder flüssigen pharmazeutischen Verdünnungsmittel oder Träger.

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