Verfahren zur Herstellung neuer antibiotisch wirksamer Kondensationsprodukte von Rifamycin S
Gegenstand der Erfindung ist die Herstellung neuer antibiotisch wirksamer Kondensationsprodukte von Rifamycin S oder Rifamycin SV mit den Teilformeln IIa oder IIb im Naphthochinon bzw. Naphthohydrochinonring des Rifamycins S bzw. Rifamycin SV
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worin X für NH oder 0 steht und worin R zusammen mit den Kohlenstoffatomen d und e den Rest einer aromatischen Verbindung oder einer heterocyclischen Verbindung aromatischen Charakters darstellt.
Durch die obige Formel IIb werden auch für den Fall X=HN, die tautomeren Formen der Struktur
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umfasst.
R bedeutet zusammen mit den Kohlenstoffato- men d und e vor allem einen Arylen-, wie Phenylen- oder Naphthylenrest, oder einen Pyridylen- oder Pyrimidylecrest, die auch mono- oder polysubstituiert sein können.
Substituenten sind beispielsweise die Hydroxy-, Merkapto-, Niederalkyl-, Niederalkoxy-, Niederalkylthio-, Nitro-, Amino-, Carboxyl-, Sulfo-, Cyanogruppe oder Halogenatome. Besonders zu erwähnen sind folgende Verbindungen der obigen Formel IIb, worin
1. X=NH, edR = Phenylen
2. X=NH, edR = in p-Stellung zu e oder d durch
Chlor substituiertes Phenylen
3. X=NH, edR = Pyridylen der Formel
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4. X=NH, edR = Pyrimidylen der Formel
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5. X=NH, edR = in,p-Stellung zu e oder d durch
Methyl substituiertes Phenylen 6. X=NH, edR = in o-Stellung zu e oder d durch
Methyl substituiertes Phenylen 7. X=NH, edR = in o-Stellung zu e oder d durch Äthyl substituiertes Phenylen 8. X=NH, edR = in p-Stellung zu e und d je mit einem Methyl substituiertes Phe nylen 9. X=NH, edR = Naphthylen der Formel
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10.
X=O, edR = Phenylen 11. X=O, edR = in p-Stellung zu e durch Chlor sub- stituiertes Phenylen 12. X=O, edR = in p-Stellung zu e durch eineNitro- gruppe substituiertes Phenylen 13. X=O, edR = in o-Stellung zu e durch Chlor und p-Stellung zu d durch eine Nitro gruppe substituiertes Phenylen 14. X=O, edR = in o-Stellung zu d durch eine Carb oxylgruppe substituiertes Phenylen 15. X=O, edR = Naphthylen der Formel
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16. X=O, edR = in o-Stellung zu e durch Methyl sub stituiertes Phenylen 17. X=O, edR = in p-Stellung zu d durch Methyl sub stituiertes Phenylen 18. X=O, edR = in p-Stellung zu e durch Methyl sub stituiertes Phenylen 19. X=NH, edR = Tetrahydronaphthylen der Formel
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20.
Das 16,17,18,19-Tetrahydro-Derivat der obigen Ver bindung 1, sowie die entsprechenden Hydrochinon Derivate der Formel IIa, die mit den Nummern 1'-20' bezeichnet werden sollen.
Von besonderer Bedeutung ist obige Verbindung I, welcher die Formel
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oder, in der tautomeren Form
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zukommt, und welche als Rifamycin PH bezeichnet wird.
Die neuen Verbindungen sind tiefgefärbte Substanzen.
Die Chinone (IIb) und die Hydrochinone (IIa) sind leicht ineinander überführbar. Aus beiden können durch Umsetzung mit Alkalien wasserlösliche Salze hergestellt werden und zwar, falls in Formel II X=NH ist, vorteilhaft aus der chinoiden Form b, und falls in Formel II X=O ist, vorteilhaft aus der hydrochinoiden Form a. Falls die Verbindungen der Form a oder b basische Substituenten tragen, können sie auch Säureadditionssalze bilden; man verwendet hierzu vor allem Säuren, die zur Bildung therapeutisch verwendbarer Salze geeignet sind.
Als solche seien beispielsweise genannt: Halogenwasserstoffsäuren, Schwefelsäuren, Phosphorsäuren, Salpetersäure, Perchlorsäure; aliphatische, alicyclische, aromatische oder heterocyclische Carbon- oder Sulfonsäuren, wie Ameisen-, Essig-, Propion-, Bernstein-, Glykol-, Milch-, Äpfel-, Wein-, Zitronen-, Ascorbin-, Malein-, Hydroxymaleinoder Brenztraubensäure; Phenylessig-, Benzoe-, p-Aminobenzoe-, Anthranil-, p-Hydroxybenzoe-, Salicyl- oder p- Aminosalicylsäure, Embonsäure, Methansulfon-, Äthansulfon-, Hydroxyäthansulfon-, Äthylensulfonsäure; Halogenbenzolsulfon-, Toluolsulfon-, Naphthalinsulfonsäuren oder Sulfanilsäure; Methionin, Tryptophan, Lysin oder Arginin.
Diese oder andere Salze der neuen Verbindungen, wie z.B. die Pikrate, können auch zur Reinigung der erhaltenen Basen dienen, indem man die Basen in Salze überführt, diese abtrennt und aus den Salzen wiederum die Basen freimacht. Infolge der engen Beziehung zwischen den Basen in freier Form und in Form ihrer Salze sind im Vorausgegangenen und nachfolgend unter den freien Basen sinn- und zweckgemäss, gegebenenfalls auch die entsprechenden Salze zu verstehen.
Die Verbindungen der Formeln IIa oder IIb, Gemi sche davon und ihre Salze zeichnen sich durch eine hohe antibiotische Wirksamkeit aus. So zeigen sie eine hohe antibakterielle Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien und gegen Tuberkelbazillen und eine gute Wirksamkeit gegen gramnegative Bakterien. Eine besonders ausge prägte Wirkung weist das oben beschriebene Rifamycin
PH auf, das sowohl in vitro als auch in vivo vergleich baren bekannten Antibiotika, wie z.B. Rifamycin SV, überlegen ist, wie aus folgenden Tabellen hervorgeht.
In vitro-Aktivität von Rifamycin PH im Vergleich zu Rifamycin SV. Minimale Hemmkonzentration in /ml.
Rifamycin
Organismus PH SV S. aureus 10 0,06 0,01 14 < 0,008 0,06-0,008 3 < 0,008 0,008 2977 0,4 0,025 19 (PV 43) < 0,008 0,025 2999 < 0,008 0,06-0,01 Str. faecalis 51 1,5 30 E. coli 203 30 125-250 205 30 125-250 209 15 125-250 Salmonella 271 15 125-250 273 25 125 277 15 250 Klebsiella 327 30 125 Ps. aer. 313 30 125 314 30 125 Proteus 248 3 60 253 12,5 125-250 Tbc (Ravenel) 0,03 0,03 S. = staphylococcus; E = Escherichia; Ps. aer. = Pseudomonas aeruginosa; Str. = streptococcus;
Tbc. = Mycobac. tubercolosis Chemotherapie an der Maus mit Rifamycin PH und Rifamycin SV EDwo¯, 0 in mg/kg bei 1 X Applikation
Rifamycin PH Rifamycin
Organismus p.o. s.c. p.o. s.c.
S. aureus 10 0,5-1 0,25-0,5 70-150 10-15
S. aureus 2977 0,1
E. coli 205 250 (90%) > 500
Salm. typh 273 100 > 500
Klebsiella 327 100 > 500
Ps. aer. 313 100 250-500
S. = staphylococcus; E. = escherichia; Salm. typh. = Salmo nella typhimurium; Ps. aer = pseudomonas aeruginosa
Ein weiterer Vorzug des Rifamycins PH liegt darin, dass bei oraler Verabreichung relativ hohe Blutspiegel werte und eine gute Organverteilung erreicht werden.
Bei spielsweise ergeben sich folgende Werte, wenn man es in oralen Dosen von 10 bzw. 20 mg/kg der Maus appli ziert: Zeit Blutserum (ylml) Leber (ylg) Niere (r/g) Lunge (Y/g) Milz (ylg)
10 mg/kg 20 mg/kg 10 mg/kg 20 mg/kg 10 mg/kg 20 mg/kg 10 mg/kg 20,mg/kg 10 mg/kg 20 mg/kg ih 3,75 10,22 30,45 43,20 0,65 1,15 0,45 1,0 0 0,9
2h 12,18 12,02 27,60 39,65 1,40 1,55 1,55 1,65 1,1 1,3 5h < 0,2 0,31 2,95 15,50 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 8 < 0,2 h10,19 < 0,05 9,40 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05
Die Verfahrensprodukte können ausser als Antibiotika auch als Futtermittelzusätze und zur Konservierung von Nahrungsmitteln
verwendet werden.
Das Verfahren zur gleichzeitigen Darstellung der neuen Verbindungen der obigen r:ormeln IIa, IIb und IIc ist dadurch gekennzeichnet, dass man Rifamycin S mit einer Verbindung der Formel
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worin R zusammen mit den Kohlenstoffatomen d und e den Rest einer aromatischen Verbindung oder einer heterocyclischen Verbindung aromatischen Charakters und X=O oder NH ist, umsetzt. Je nach den Reaktions- und Isolierungsbedingungen wird das gewünschte Kondensationsprodukt, das allgemein ein Gemisch von Chinonund Hydrochinonform darstellt, vorwiegend als Chinon (IIb) oder als Hydrochinon (IIa) erhalten. Die beiden Formen können durch Oxydation bzw. Reduktion leicht ineinander übergeführt werden und lassen sich vo voneinander unterscheiden. Zur Oxydation genügt bereits der Sauerstoff der Luft.
Zur Reduktion kann beispielsweise Ascorbinsäure oder Dithionit verwendet werden.
Die verfahrensgemässe Umsetzung wird vorzugsweise in einem unpolaren Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol oder Äther, vorgenommen, wobei man äquivalente Mengen der Reaktionskomponenten verwendet und sie miteinander in genannten Lösungsmittel solange stehen lässt bis alles Rifamycin S reagiert hat. Dies ist in der Regel nach einigen Tagen der Fall. Die Reaktionszeit kann durch Erwärmen abgekürzt werden. Die Lösungen enthalten nun neben dem gewünschten Kondensationsprodukt auch noch Rifamycin SV und oxydiertes Reagens.
Zur Gewinnung des reinen Kondensationsprodukts ist es zweckmässig, eine Vorreinigung vorzunehmen:
A) Bei Kondensationsprodllkten vom Phenoxazintyp (X=O in Formel II) löst man den nach Eindampfen der Reaktionslösung erhaltenen Rückstand in Methanol oder Aceton und fällt durch vorsichtige Zugabe von konzentrierter Sodalösung das Kondensationsprodukt aus, während Rifamycin SV und zum Teil auch andere Verunreinigungen in Lösung bleiben.
B) Bei Kondensationsprodukten vom Phenazintyp (X=NH in Formel II) muss - wegen der höheren Acidität dieser Verbindungen - die oben beschriebene Umfällung aus Methanol oder Aceton mit Wasser statt Sodalösung vorgenommen werden. Wenn die durch die Umfällung angereicherten Kondensationsprodukte nicht direkt kristallisiert werden können, kann eine Adsorptionschromatographie angeschlossen werden. Notwendig ist dies in den Fällen, in denen wegen Unsymmetrie des kondensierenden Reagens ein Gemisch isomerer Kondensationsprodukte entsteht und eine Trennung der Komponenten beabsichtigt ist. Als Adsorbens kann Kieselgel verwendet werden, das mit einer 1 obigen Lösung von Essigsäure in Chloroform vorbehandelt wurde. Als Elutionsmittel dient bei den Phenoxyzinkörpern Chloroform mit 5% Aceton.
In der Regel reicht 1 kg Kieselgel für die Chromatographie von etwa 20 g Rohkondensationsprodukt.
In den meisten Fällen ist es vorteilhaft, vor der eigentlichen Reinigung eine Filtrierung durch kurze Kieselgelsäulen vorzunehmen. Isomerengemische von Phenazinkörpern, die durch Kondensation mit unsymmetrischen Reagentien vom Typ III (X=NH) entstehen, lassen sich nur durch mehrmals wiederholte Chromatographie unter den angegebenen Bedingungen trennen.
Für die Reinigung der Kondensationsprodukte kann die Chromatographie an Polyamidsäulen oder die fraktionierte Adsorption - Elution an Polyamidpulver im batch-Verfahren > y herangezogen werden. Die Reaktionsgemische werden aus methanolischer Lösung an das Polyamid adsorbiert und durch Elution mit Eisessig-Methanol-Gemischen verlierende Zusammensetzung fraktioniert eluiert.
Nach beendigter Kondensation kann man neben dem gewünschten Kondensationsprodukt vorhandenes reduziertes Ausgangsmaterial, also Rifamycin SV, im Reaktionsgemisch selbst, ohne Auftrennung oder Isolierung, zum Ausgangsmaterial, Rifamycin S, zurückoxydieren.
Nach erneuter Zugabe von Reagens, z.B. o-Phenylendiamin, kann man die Reaktion weiter ablaufen lassen.
Für diese Umwandlungen verwendet man vorteilhafterweise Oxydationsmittel wie z.B. Ammoniumpersulfat oder Kaliumferricyanid resp. Reduktionsmittel wie Ascorbinsäure. Man kann die Redoxprozesse in heterogener Mischung oder in homogener Phase ausführen. Beispielsweise kann das nach der Kondensation von Rifamycin S mit o-Phenylendiamin in benzolischer Lösung neben Rifamycin PH vorliegende Rifamycin SV durch Schütteln mit einer wässerigen Lösung von Kaliumferricyanid zum Rifamycin S zurückoxydiert werden.
Bei den beschriebenen Redoxprozessen können je nach Stärke des angewendeten Reduktions- bzw. Oxydationsmittels auch die Kondensationsprodukte vollständig in die Hydrochine bzw. Chinone übergeführt werden, so dass dadurch eine Vereinheitlichung der Verfahrensprodukte im Kondensationsgemisch erreicht wird.
An die chromatographische Reinigung der Kondensationsprodukte kann sich eine Kristallisation anschliessen.
Als Lösungsmittel zur Kristallisation der Kondensationsprodukte haben sich Methanol, Acetsch, Eisessig, Aceton, Äther, Benzol-Äther, Methanol-Wasser-Gemische, sowie obige Essigsäure bewährt. Gemische isomerer Phenazinkörper bilden oft Mischkristalle.
Die neuen Verbindungen können z.B. in Form pharmazeutischer Präparate Verwendung finden. Diese enthalten die Verbindungen in Mischung mit einem für die enterale, topicale oder parenterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen, festen oder flüssigen Trägermaterial. Für die Bildung desselben kommen solche Stoffe in Frage, die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z.B. Wasser, Gelatine, Lactose, Stärke, Stearylalkohol, Magnesiumstearat, Talk, pflanzliche öle, Benzylalkohole, Gummi, Propylenglykol, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z.B. als Tabletten, Dragees, Salven, Creams, Kapseln oder in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.
Gegebenenfalls sind sie sterilisiert und/oder enthalten Hilfsstoffe, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgiermittel, Lösungsvermittler oder Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks oder Puffer. Sie können auch noch andere therapeutisch wertvolle Substanzen enthalten. Die Präparate werden nach üblichen Methoden erhalten.
Die neuen Verbindungen können auch in der Tiermedizin, z.B. in einer der oben genannten Formen, verwendet werden.
Die in den Beispielen erwähnten Systeme A und B für die Dünnschichtchromatogramme sind an Kieselgel im System A oder B durchgeführt.
System A: Chloroform-Methanol 100 : 3, Platte im prägniert mit Zitronensäure (52 ml 5% wässrige Zitronensäurelösung pro 25 g
Kieselgel).
System B: Chloroform-Aceton 5 :1.
Die Rf-Werte sind auf den Rf-Wert von Rifamycin C= 1 bezogen und werden hierin als RfRo bezeichnet.
Die Konstitution der in den Beispielen erhaltenen Verbindungen ist jeweils in den Beispielen durch die Angabe der der Aufzählung aus den Spalten zu 3 zu entnehmenden Formel wiedergegeben.
Beispiel I
34,8g Rifamycin S werden zusammen mit 5,4 g o Phenylendiamin in 750 ml Benzol gelöst. Die Lösung wird solange stehengelassen, bis durch Dünnschichtchromatogramm kein Rifamycin S im Reaktionsgemisch mehr nachzuweisen ist. Dies ist nach einigen Tagen der Fall.
Danach wird die benzolische Reaktionslösung eingedampft und der Rückstand durch mehrmaliges Umfällen aus Methanol mit Wasser vorgereinigt. Nach zweimaliger Chromatographie an 300 bzw. 1000 g Kieselgel (mit einer obigen Chloroformlösung von Essigsäure vorbehandelt) mit dem Laufmittel Chloroform (enthaltend 1% Eisessig) werden 15g Kondensationsprodukt erhalten, das aus 80%iger Essigsäure langsam kristallisiert. Das chromatographisch reine Produkt bildet kleine, dunkelgrüne Kristalle, die bei 181 - 1830 schmelzen. RfRo = 0,53 (System A). Formel 1.
Beispiel 2
34,8 g Rifamycin S werden zusammen mit 6,1 g 3,4 Diaminotoluol in 750 ml Benzol gelöst. Die Lösung wird bei Zimmertemperatur solange stehengelassen, bis alles Rifamycin S reagiert hat (Dünnschichtchromatogramm).
Danach wird die Reaktionslösung eingedampft und der Rückstand durch mehrmaliges Umfällen aus Methanol mit Wasser grob vorgereinigt. Mehrmalige Chromatographie an mit Io/,iger Chloroformlösungen von Essigsäure vorbehandeltem Kieselgel mit dem Elutionsmittel Chloroform (enthaltend 1% Eisessig) liefert 9 g eines reinen Kondensationsproduktes vom Rf,o-Wert 0,42 (System A), das aus 80%iger Essigsäure in dunkelgrünen, glänzenden Blättchen kristallisiert und bei 199 - 2010 schmilzt. Formel5.
In den im Chromatogramm rascher wandernden Anteilen sind 4,5 g des isomeren Kondensationsproduktes vom RfRo-Wert 0,51 (System A) in reiner Form enthalten.
Formel 5.
Beispiel 3
Eine Lösung von 34,8 g Rifamycin S und 6,1 g 2,3 Diaminotoluol in 750 ml Benzol wird bei Zimmertemperatur bis zur vollständigen Reaktion stehengelassen. Anschliessend dampft man die Lösung ein, fällt den Rückstand mehrmals aus Methanol-Wasser um und chromatographiert das derart vorgereinigte Reaktionsprodukt in der unter Beispiel 1 beschriebenen Weise. Bereits einmalige Chromatographie an 1000g Kieselgel liefert ein kristallisiertes Produkt, aus dem sich durch wiederholte Kristallisation (abwechselnd) aus Methanol, verdünntem Methanol und Aceton das kristallisierte reine Isomere mit RfRo = 0,51 im System A erhalten lässt. Dunkelgrüne, rhombische Platten, die bei 190- 1910 schmelzen.
Ausbeute: 10 g. Formel 6.
Die Mutterlaugen geben nach dem Eindampfen ein Gemisch der zwei isomeren Kondensationsprodukte, in dem das zweite Isomere vom Rfno = 0,64 (System A) stark angereichert ist. Dieses zweite Isomere lässt sich durch sorgfältige, wie oben beschriebene Chromatographie in isomerenreiner Form gewinnen. Formel 6.
Beispiel 4
Aus der Reaktion von 34,8 g Rifamycin S und 6,8 g 2,3-Diaminoäthylbenzol lässt sich in analoger Arbeitsweise, wie unter den Beispielen 1 bis 3 beschrieben, ein Kondensationsprodukt gewinnen, aus dem durch wiederholte Kristallisation (abwechselnd) aus Methanol, verdünntem Methanol und Aceton das kristallisierte reine Isomere vom RfRo = 0,53 (System A) erhalten wird.
Dunkelgrüne Kristalle vom F. 180 - 1810. Ausbeute: 6 g.
Formel 7.
Die Mutterlauge nach der Kristallisation des obigen Isomeren hinterlässt nach dem Eindampfen 6,5 g kristallines Material, das zu etwa gleichen Teilen aus den beiden isomeren Kondensationsprodukten besteht. Durch Chromatographie in der beschriebenen Weise lässt sich daraus das in geringerer Menge entstandene Isomere vom RfRo = 0,73 (System A) isolieren. Formel 7.
Beispiel 5
Eine Lösung von 3,48 g Rifamycin S und 0,79 g 1,2 Diaminonaphthalin in 100ml Benzol wird bei Zimmertemperatur bis zur vollständigen Reaktion des eingesetzten Rifamycins S stehen gelassen. Danach dampft man die Lösung ein, fällt den Rückstand mehrmals aus Methanol-Wasser um und chromatographiert das derart vorgereinigte Reaktionsprodukt in der in den Beispielen 1-3 beschriebenen Weise (Kieselgel, Chloroform mit 1% Essigsäure). Bei sorgfältiger, wiederholter Chromatographie lässt sich das in grösserer Menge entstehende Isomere (RfRo = 0,39 im System A) in chromatographisch reiner Form gewinnen und aus Methanol und verdünntem Methanol kristallisieren. Dunkelgrüne tetraedrische Kristalle vom F. 205 - 2100. Ausbeute: 0,35 g.
Beispiel 6
Eine Lösung von 3,48 g Rifamycin S und 0,68 g 4,5 -Diamino-1,2-dimethylbenzol in 100 ml Benzol wird bei Zimmertemperatur bis zur vollständigen Reaktion des eingesetzten Rifamycins S stehengelassen. Danach dampft man die Lösung ein, fällt den Rückstand mehrmals aus Methanol-Wasser um und chromatographiert das derart vorgereinigte Reaktionsprodukt in der beschriebenen Weise (Kieselgel, Chloroform mit 1% Essigsäure). Man erhält das dunkelgrüne Kondensationsprodukt vom RfRo = 0,43 (System A). Formel 8.
Beispiel 7
34,8 g Rifamycin S und 5,45 g o-Aminophenol werden zusammen in 750 ml Benzol gelöst. Man lässt die Lösung bei Zimmertemperatur solange stehen, bis alles eingesetzte Rifamycin S reagiert hat. Dann dampft man zur Trockne, löst den Rückstand in Methanol und lässt wiederum stehen, bis das zuerst gebildete violette Kondensationsprodukt vollständig in ein rotes Produkt umgewandelt ist. Sodann fällt man das rote Kondensationsprodukt durch Zugabe von Sodalösung zur methanolischen Lösung des Reaktionsgemisches, wäscht die Fäl lung mit Wasser und verwirft das Filtrat, in dem sich die Hauptmenge der Verunreinigungen befindet. Man reinigt das rote Kondensationsprodukt durch Chromatographie an 1000 g Kieselgel mit dem Elutionsmittel Chloroform-Aceton 20: 1, wobei man die Acetonmenge allmählich bis zu einem Verhältnis von 5:1 steigert.
Man erhält in dieser Weise 16 g des amorphen, roten Kondensationsprodukts (RfRo = 0,98; System B), Formel 10. Dieses wird in ca. 150ml Methanol (rote Lösung) und trägt in die Lösung überschüssige Ascorbinsäure ein (Farbumschlag nach braun). Bei langsamem Zutropfen von mehr als 250ml Wasser scheidet sich die Hydrochinonform des Kondensationsproduktes in schwarzglänzenden Kristallen aus. Aus Methanol umkristallisiert schmilzt es bei 1800. Formel 10'.
Beispiel 8
Eine Lösung von 34,8 g Ryfamycin S und 6,15 g 3-Amino-2-hydroxytoluol in 750 ml Benzol wird bei Zimmertemperatur solange stehengelassen, bis alles eingesetzte Rifamycin S reagiert hat. Dann dampft man ein, löst den Rückstand in Methanol und fällt die beiden bei der Reaktion entstandenen Kondensationsprodukte mit Sodalösung aus. Man filtriert das ausgefallene Material, wäscht mit Wasser und löst wiederum in Methanol. Beim Stehen der methanolischen Lösung wandelt sich das zuerst entstandene violette Kondensationsprodukt allmählich in das stabilere rote Kondensationsprodukt um, welches aus Methanol langsam in grossen, derben, braunroten Kristallen abgeschieden wird. Zur vollständigen Reinigung kristallisiert man noch viermal aus Methanol.
Man erhält 19 g Kristalle vom F. 172 - 1740. RfRo = 0,89 (System B).
Die Verbindung kann auf folgende Weise ins Hydrochinon übergeführt werden:
Man löst das kristalline Kondensationsprodukt bei 600 in der eben ausreichenden Menge an Äthanol, lässt etwas abkühlen und setzt sodann tropfenweise eine wässrigalkoholische Lösung von Ascorbinsäure (uberschuss) zu. Nach kurzer Zeit scheiden sich Kristalle des Hydrochinons ab, die aus Methanol umkristallisiert werden können. Das Hydrochinon schmilzt bei 183 - 1840.
Beispiel 9
Man lässt eine Lösung von 11,60 g Rifamycin S und 2,05 g 4-Amino-3-hydroxytoluol in 200 ml Benzol solange bei Zimmertemperatur stehen, bis alles eingesetzte Rifamycin S reagiert hat. Darauf dampft man die Lösung ein, löst den Rückstand in Methanol und lässt wiederum stehen, bis das zuerst entstandene violette Kondensationsprodukt vollständig in das stabilere rote Kondensationsprodukt umgewandelt ist. Das rote Produkt wird durch Sodalösung aus seiner methanolischen Lösung ausgefällt, filtriert, mit Wasser gewaschen und zur vollständigen Reinigung an 400g Kieselgel ehromatographiert (Elutionsmittel Chloroform-Aceton 20:1). Man erhält 4g rotgefärbtes Kondensationsprodukt, RfRo = 0,98 (System B). (Formel 17).
Das rote Kondensationsprodukt kann in der in Beispiel 7 beschriebenen Weise durch Reduktion mit Ascorbinsäure in sein Hydrochinon übergeführt werden. (Formel 17').
Beispiel 10
Bei analoger Arbeitsweise, wie unter Beispiel 9 beschrieben, erhält man aus 11,60 g Rifamycin S und 2,05 g 3-Amino-4-hydroxytoluol 4,5 g rotes Kondensationsprodukt vom Rfao = 0,98 (System B). (Formel 18). Mit Ascorbinsäure entsteht daraus das entsprechende Hydrochinon. Formel 18'.
Beispiel 11
40 g Rifamycin S (spektrophotometrischer Titer 92%) und 6,2 g aus absolutem Alkohol umkristallisiertes o Phenylendiamin werden in 4 Liter über Natriumsulfat getrocknetem Äther gelöst und die Lösung 64 Stunden bei Raumtemperatur aufbewahrt. Der nach dieser Zeit gebildete Kristallbrei (29,7 g) wird abgenutscht. Im Filtrat können anhand des Ultraviolett-Absorption-Spektrums nur geringe Mengen des Kondensationsproduktes Rifamycin PH neben Rifamycin SV festgestellt werden. Das Filtrat wird verworfen und das Nutschgut, das anhand der polarographischen Analyse einen Gehalt von 58% Rifamycin PH aufweist, in 6,5 Liter Essigester gelöst und im Schütteltrichtér 18mal mit je 4 Liter Phosphatpuffer pH 6,24 extrahiert. Während dieser Extraktionen werden noch insgesamt 2,4 Liter Essigester zugegeben.
Vor den 2 letzten Extraktionen gibt man noch 1,5 Liter Hexan hinzu, um aus der organischen Phase das Rifamycin SV vollständig zu entfernen. Die Extrakte werden jeweils spektrophotometrisch und durch Dünnschichtchromatogramm analytisch kontrolliert. Nach beendeter Extraktion erhält man ein Volumen von 8,2 Liter Essigesterlösung, in denen gemäss spektrophotometrischer Analyse 15,3 g Rifamycin PH (Formel 1) enthalten sind. Nun wird diese Lösung mit 6 ml Natrium-Methylat mit einem Gehalt von 8,9% Natrium und 2,5 Liter Ligroin versetzt.
Die Lösung wird in Vakuum bis auf ca. 1 Liter konzentriert und man erhält so ein erstes Kristallisat des Natriumsalzes des Rifamycins PH (13 g). Aus den Mutterlaugen werden noch 2 weitere Kristallisate erhalten.
Die Analyse der verschiedenen Fraktionen ergab folgende Titer an freiem Rifamycin PH:
1. Kristallisat; 13 g; Polarographischer Titer 84,4%, spektrophotometrischer Titer 91,8%,
2. Kristallisat; 1,4 g; Polarographischer Titer 86,4%,
3. Kristallisat; 1,4 g; Polarographischer Titer 44,4%.
Die spektrophotometrischen und polarographischen Daten für Rifamycin PH und Rifamycins SV sind wie folgt:
UV-Spektrum in Phos- Polarographic in phat-Puffer ph 7.38 50%igem MeOH + 1% E:C, 50%igem Acetat mu lem Pufferph5,4 Rifamycin SV 314 308 anodisches Halb
445 204 Wellenpotential E1/2= +0,03V Rifamycin PH 343 331 kathodisches
515-520 90 Halb
Wellenpotential E1X2= -0,33V
35,5 g Rifamycin PH vom Titer 92,5% (entsprechend 32,8 g 100%ìgem Rifamycin PH) werden in 160 ml Methanol gelöst.
Bei einer 200 nicht übersteigenden Temperatur versetzt man diese Lösung mit 15,3 ml einer methanolischen Lösung von Natriummethylat mit einem Natrium-Titer von 6,5% (entsprechend einem Überschuss von 3% über die berechnete Menge). Die so erhaltene Lösung des Natriumsalzes wird mit 1,3 Liter Essigester verdünnt und das Gemisch bis auf ca. 200-250 ml konzentriert; der Rückstand wird sodann mit 0,5 Liter Essigester und 0,4 Liter Cyclohexan versetzt und hierauf auf ca. 200 ml eingedampft. Schon während des Eindampfens fällt das Natriumsalz aus. Zur vollständigen Ausscheidung lässt man 12 Stunden bei 4 - 50 stehen. Man nutscht das violettgefärbte Salz ab und wäscht es erschöpfend mit n-Hexan. Das Produkt wird sodann 48 Stunden bei 35 - 400 im Vakuum getrocknet.
Ausbeute: 31,4g; spektrophotometrischer Titer (auf die Säure bezogen): ca. 90%. Ausbeute auf die Säure bezogen: ca. 85%.
Das Salz löst sich in Wasser bis zu einer Konzentration von 15 - 20% auf; die Lösung ist intensiv rotgefärbt.
Man lässt eine Lösung von 3,48 g Rifamycin S und 0,81 g 6,7-Diamino-1,2,3,4-tetrahydronaphthalin in 100 ml Benzol bei Zimmertemperatur bis zur vollständigen Reaktion des eingesetzten Rifamycins S stehen. Das Reaktionsgemisch wird eingedampft, der Rückstand in Methanol gelöst und die methanolische Lösung durch eine Säule mit 100 g im Handel unter der Bezeichnung Ultramid BM 228 erhältliches Polyamidpulver filtriert. Man wäscht mit Methanol nach, bis das Filtrat annähernd farblos abfliesst. Durch Waschen des Polyamids mit Methanol, das 3% Essigsäure enthält, gewinnt man ein grüngefärbtes Eluat, das nach dem Eindampfen 1,57 g reines Kondensationsprodukt zurücklässt. RfRo = 0,53 (System A) Formel 19.
Man erhitzt 2,8 g Rifamycin S mit 0,50 g o-Phenylendiamin in 200 ml Toluol unter Stickstoff am siedenden Wasserbad. Nach einer Stunde setzt man der Lösung 0,15 g o-Phenylendiamin zu und erhitzt weiter bis zum Verschwinden des Rifamycins S. Nach dem Erkalten schüttelt man die toluolische Lösung mit einer wässrigen Lösung von überschüssigem Kaliumferricyanid aus. Nachdem man zur Abtrennung von amorphem Material und zur Erleichterung der Phasentrennung durch Celit filtriert hat, wäscht man die toluolische Lösung mit Kochsalzlösung, setzt ihr 0,25 g o-Phenylendiamin zu und erhitzt erneut unter Stickstoff am Wasserbad. Nach einer Stunde setzt man 0,04 g o-Phenylendiamin zu und erhitzt weiter bis zum Verschwinden des Rifamycins S. Danach wiederholt man den gesamten Vorgang der Oxydation, setzt der Lösung erneut 0,12 g o-Phenylendiamin zu und erhitzt wiederum etwa zwei Stunden lang.
Nun schüttelt man die toluolische Lösung mit 2-N-Salzsäure und mit Kochsalzlösung aus und dampft im Vakuum zur Trockne.
Den Rückstand löst man in Methanol und isoliert daraus das Rifamycin PH in der im Beispiel 30 beschriebenen Weise. Den Rückstand löst man in ca. 10ml Methanol und chromatographiert an 50 g im Handel unter der Bezeichnung Ultramid BM 228 erhältliches Polyamidpulver. Rifamycin SV wird als gelbe und Rifamycin PH als rote Zone festgehalten. Man wäscht mit Methanol, bis das Eluat annähernd farblos geworden ist. Nun wird zuerst durch Methanol, das 3% Essigsäure enthält, Rifamycin PH eluiert. Hierauf kann man das auf der Säule als gelbes Band zurückgebliebene Rifamycin SV durch Elution mit 30%iger Essigsäure enthaltendem Methanol zurückgewinnen. Das grüngefärbte Rifamycin PH enthaltende Eluat dampft man im Vakuum zur Trockne ein.
Zur Kristallisation löst man den grünen amorphen Rückstand in 5 ml Eisessig. Nach einigen Stunden kristallisiert reines Rifamycin PH. Man kristallisiert die Substanz mehrmals aus Benzol-Äther oder Aceton-Äther und erhält Kristalle vom Smp. 183 - 1840 (Koflerblock). Rifamycin PH bildet schwarz-grüne, glänzende Kristalle in Form von länglichen Prismen oder Blättchen, die beim Zerreiben eine schmutzig-grüne Färbung nehmen. Es ist leicht löslich in Methanol, Chloroform und Acetonitril, weniger leicht löslich in Aceton, Eisessig, Benzol, Methylenchlorid, Dioxan und schwerlöslich in Äther, Cyclohexan, Hexan und Wasser. Lösungen von Rifamycin Ph in Essigsäure sind grün gefärbt, während Dioxanlösungen blaue Farbe zeigen. Rifamycin PH formt mit Alkalien rotgefärbte Salze, deren wässerige Lösungen neutral reagieren.