DE2154436C3

DE2154436C3 - Als Partricin-methylester (SPA-S-160) bezeichneter Antibiotikakomplex mit Polyenstruktur

Info

Publication number: DE2154436C3
Application number: DE2154436A
Authority: DE
Inventors: Tiberio Bruzzese; Rodolfo Ferrari
Original assignee: HOLCO INVESTMENT Inc LUGANO (SCHWEIZ)
Current assignee: HOLCO INVESTMENT Inc LUGANO (SCHWEIZ)
Priority date: 1970-11-03
Filing date: 1971-11-02
Publication date: 1979-11-29
Also published as: NL7115123A; US3780173A; AU469517B2; FR2112426B1; NL154513B; BE774862A; JPS5550960B1; ZA717326B; DE2154436B2; CY932A; GB1359473A; AU3525171A; FR2112426A1; ES396597A1; DE2154436A1; MY7800206A; CA972349A

Description

(b) IR-Absorptionsroaxima bei 3360,1715, ,640, 1595, 1175, 1060, 1000, 848 und 763 cm-' gemessen in Kaliumbromid;

(c) UV-Absorptionspeaks bei 401,378,359 und 340 nm, in Ethanol bei einer Konzentration von etwa 0,01 mg/ml, die sich unter Einwirkung von UV-Licht auf 4 nm höhere Wellenlängen verschieben;

(d) einen Rf-Wert von etwa 0,8 an SiOrGeI, gelöst in einem Gemisch aus 2 Teilen Butanol, 5 Teilen Ethanol, 1 Teil Aceton und 3 Teilen.einsr 25%igen Ammoniumhydroxidlösung;

(e) Peaks im ¹³C-NMR-Spektrum in Deuterodimethylsulfoxid bei 208,2; 196,6; 173,1; 170,2; 153,8: 130,5; 125,1; 110,5;97,6;973;51,4; 173; 16,4und 12,8 ppm;

(f) einer durchschnittlichen MHK von 0,12μg/ml gegenüber Candida albicans-Stämmen;

(g) einer LD50 p.o. bei Mäusen oberhalb 2000 mg/kg; (h) sehr wenig löslich in Wasser und wäßrigem Alkali sowie Ether.fetrolether, Benzol;

mäßig löslich in Aceton und Alkoholen;

sehr gut löslich in Dimethylsulfoxid, Pyridin,

Dimethylformamid und Dimethylacetamid.

Der erfindungsgemäße Antibiotikakomplex weist einerseits eine sehr hohe Wirksamkeit gegen Pilze, insbesondere gegen Candida albicans, sowie eine Wirksamkeit gegenüber Trichomonas, andererseits eine wesentlich geringere Toxizität als die üblicherweise therapeutisch verwendeten, bekannten polyenischen Antibiotika auf.

Der erfindungsgemäße AntiSiotikakomplex wird vorliegend mit der USAN-Bezeichnung Partricin-methylester oder auch mit der internen Bezeichnung SPA-S-160 benannt (USAN = United States Adopted Name, d. h. in den ViStA. von staatlicher Seite geprägte Arzneimittelbezeichnung).

Die polyenischen Antibiotika sind eine große Klasse von Verbindungen, die von verschiedenen Mikroorganismen, beispielsweise Actinomyceten, weitverbreitet als Metabolite hergestellt werden. Aufgrund ihrer stark ungesättigten Struktur mit konjugierten Doppelbindungen, die durch ihr charakteristisches UV-Spektrum angezeigt werden, können sie als Tetraene, Pentaene, Hexaene und Heptaene klassifiziert werden. Diese Verbindungen sind häufig äußerst interessant wegen ihrer hohen Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Pilzen und Hefen und werden daher weitgehend therapeutisch angewendet, obwohl sie im allgemeinen nur eine geringe oder gar keine Wirksamkeit gegenüber Bakterien besitzen. Die Tatsache, daß die sensitiven Mikroorganismen nicht leicht Stämme bilden, die gegenüber diesen polyenischen Antibiotika resistent sind, und daß andererseits weder in der Gruppe der Sulfonamidverbindungen noch unter den Penicillinen und Tetracycline« befriedigende Mittel zur Heilung von Infektionen, die durch Pilze und Hefen verursacht werden, sind, hat dazu geführt, daß an diesen Produkten ein weiteres Interesse besteht.

Eine weitverbreitete Anwendung dieser polyenischen Antibiotika wurde jedoch durch ihre Toxizität verhin-

dert, die sich bei parenteral Verabreichung in Kopfschmerzen, Übelkeit, Erbrechen und in einem gleichzeitigen Ansteigen des Blutspiegels des Harnstoff-Stickstoffs oder des Nichtprotein-Stickstoffs und in der Erscheinung von Nierenschäden und hämolytischer Anämie zeigt

Der erfindungsgemäße Partricin-methylester ist erhältlich durch Umsetzung von Diazomethan mit Partricin (SPA-S-132), einem Antibiotikakomplex mit Heptaenstruktur, bestehend aus 2 Komponenten, Partricin A und B, wobei Patricin A sich von Partricin B durch die Anwesenheit einer zusätzlichen Methylgruppe, gebunden an ein Seitenkettenstickstoffatom, unterscheidet, der durch Kultivierung von Streptomyces aureofaciens NRRL 3878 unter aeroben Bedingungen bei 23 bis 30⁰C in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlehydratquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält, gebildet wird.

Die Umsetzung von Diazomethan mit Partricin wird durchgeführt, indem man eine Lösung von SPA-S-132 in einem geeigneten organischen Lösungsmittel mit einem geringen Oberschuß an Diazomethan behandelt, um die mögliche Bildung von Produkten mit größeren Reaktionsgraden zu verhindern, und dann das Reaktionsgemisch einige Stunden oder mindestens so lange, bis die Entwicklung von Stickstoff, die anzeigt, daß die Reaktion stattfindet, beendet ist, stehenläßt und anschließend das Reaktionsprodukt durch Zusatz eines geeigneten Lösungsmittels ausfällt Die Umsetzung wird vorteilhaft in Gegenwart basischer Substanzen, ω vorzugsweise organischer Basen wie Ammoniak und Triethylamin, in katalytischen bis stöchiometrischen Mengen im Vergleich zu Partricin durchgeführt Obwohl der Reaktionsmechanismus nicht vollständig bekannt ist scheint die Gegenwart dieser Substanzen die Bildung gewisser sekundärer Reaktionsprodukte, die sonst mittels Dünnschichtchromatographie erkannt werden, zu verhindern oder zu begrenzen, so daß ein Produkt mit hoher Reinheit und mikrobiologischer WirksamJ'eit erhalten wird.

Nach der angewandten Methode und dem angewandten Reaktionsmittel und in Anbetracht der in der Literatur beschriebenen Syntheseverfahren ist voraussichtlich dem erhaltenen Produkt die Struktur eines Methylesters des Antibiotikakomplexes Partricin zuzuschreiben, was durch die physikalisch-chemischen und die analytischen Eigenschaften bestätigt wird. Bei geeigneter Variation der Reaktionsbedingungen erhält man das vorstehende Produkt in unveränderter Reinheit und Ausbeute, die im allgemeinen fast quantitativ ist

Als Lösungsmittel werden für die Reaktion vorzugsweise Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Formamid, Ethylcellosolve, Pyridin und zahlreiche andere organische Lösungsmittel verwendet, die die Fähigkeit zur Lösung von Partricin besitzen.

Das verwendete Diazomethan, das ein giftiges gelbes Gas darstellt, das potentiell explosiv ist wird im allgemeinen in ätherischer Lösung angewendet, es können jedoch auch die vorstehenden Lösungsmittel sowie andere Lösungsmittel, z. B. Alkohole oder Benzol, eingesetzt werden. Die Gegenwart eines Überschusses an Diazomethan wird nach Methoden kontrolliert die für ähnliche Verfahren bekannt und in der Literatur beschrieben sind. Die Reaktion ist gewöhnlich in etwa 1 — 15 Stunden abgeschlossen und wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 0—40⁰C, insbesondere bei Raumtemperatur, durchgeführt

Als Lösungsmittel zum Ausfällen des Reaktionsproduktes eignen sich am besten Diethylether, Benzol und Wasser zugesetzt im Überschuß, sowie zahlreiche andere Lösungsmittel, die eine geringe Lösungsfähigkeit für das Produkt haben. Das so erhaltene Produkt, SPA-S-ItJO oder Partricin-methylester, kann dann gegebenenfalls unter Anwendung geeigneter Lösungsmittelgemische gereinigt werden. Wahlweise kann die Reinigung für analytische oder präparative Zwecke auch mit Hilfe der Säulenchromatographie über Silicagel durchgeführt werden, wobei als Eluierungsmittel rerschiedene Lösungsmittelgemische, ζ. Β. ein Gemisch aus Pyridin und Petrolether im Verhältnis 8 :2, eingesetzt werden.

Hinsichtlich der Eigenschaften des neuen Komplexes bleibt die polyenische Struktur von Partricin unverändert wie durch das charakteristische UV-Spektrum angezeigt wird, so daß sie als ein Heptaen klassifiziert werden kann. Sie unterscheidet sich von Partricin dadurch, daß sie keine freien Carboxylgruppen enthält und statt dessen einen Methylesterrest aufweist, wie durch das IR-Spektrum (aufgezeichnet in Suspension in Nujol) gezeigt wird, das eine Absorptionsbande bei 1715 cm-' enthält die auf die Streckschwingung der C - O-Bindung des Esters zurückzuführen ist die jedoch im Ausgangsmaterial nicht vorhanden ist oder wie auch durch das kernmagnetische Resonanzspektrum gezeigt wird, das in Lösung in Dimethylsulfoxid durchgeführt wurde, und in dem bei 3,25 ppm die charakteristische Spitze eines Methyirestes in einer Estergruppe vorhanden ist

Der erfindungsgemäße Partricin-methylester dürfte auch analog anderen polyenischen Antibiotika, für die das in der Literatur beschrieben wurde, einen lactonischen, makrocyclischen Kern, eine Aminogruppe und einige Hydroxylgruppen enthalten.

Wie inzwischen· ermittelt wurde, kann Partricin in die Komponenten A und B aufgetrennt werden. Für die Einzelbestandteile werden folgende Teilstrukturen vorgeschlagen:

CH,

H.,C

OH

CH,

AAAAAAAAk

O OH

CO₁H

Partricin A. R = CH-Partricin B. R = H

OH
OH OH

+ 3 weitere
Hydroxyl- und eine Ketogruppe

Der erfindungsgemäße Ester ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß er nur die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff, und zwar etwa in den folgenden Gewichtsmengen enthält:

Kohlenstoff	633%
Wasserstoff	7,8%
Stickstoff	3,2%
Sauerstoff	24,8%

wie in einer Probe, die frei von Feuchtigkeit und Asche war, bestimmt wurde. Außerdem ist der Ester dadurch gekennzeichnet, daß er, gelöst in Ethanol in Konzentrationen von etwa 0,01 mg/ml im UV-Licht die folgenden Absorptionsspitzen aufweist:

Maximum

Minimum

TU₁ ιιιμ

378 ηιμ
359 ηιμ
340 πιμ

367 ηιμ
348 πιμ

und schließlich durch die Tatsache, daß sein IR-Spektrum in Kaliumbromid (vgl. Figur) bei den folgenden Frequenzen IR-Absorptionsmaxima aufweist: 3360, 1715,1640,1595, 1175,1060,1000,848 und 763 cm-'.

Als weiteres Mittel zur Kennzeichnung des neuen Komplexes und zu seiner Unterscheidung von ähnlichen polyenischen Verbindungen einschließlich des bereits genannten Partricins hat dieser Ester bei der Dünnschichtchromatographie, die auf Silicagel-Streifen und unter Verwendung eines Gemisches aus Butanol, Ethanol, Aceton und 25%iger Ammoniumhydroxidlösung im Verhältnis 2:5:1:3 als Eluierungsmittel durchgeführt wurde, einen Rf-Wert von etwa 0,8. Die Flecken sind leicht zu identifizieren, indem man sie UV-Licht aussetzt. Besonders interessant ist das Verhalten des Produktes im Licht Wenn man die UV-Absorption einer verdünnten Lösung mißt, die längere Zeit dem Licht ausgesetzt ist, so beobachtet man. daß sich das sesamte SDektrum auf Wellenläneen verschiebt, die etwa 4 Γημ höher sind, und dann die Intensität der Absorptionsspitzen verändert wird. Dieses durch Licht induzierte, veränderte UV-Spektrum dürfte zeigen, daß SPA-S-160 ursprünglich nicht in der ausschließlichen »Trans«-Form vorliegt, sondern daß wahrscheinlich eine oder mehrere »Cis«-Doppelbindungen vorhanden sind, die wie bei anderen bekannten Heptaenen leicht eine Stereoisomerisierung durch Licht zur »Trans«-Fom eingehen.

Der Antibiotikakomplex Partricin-methylester oder SPA-S-160 ist ein gelber bis dunkelgelber, kristalliner Feststoff, der sehr wenig löslich in Wasser und wäßrigem Alkali (Abwesenheit von Säurefunktionen) sowie in Ether, Petrolether, Benzol u. dgl, mäßig löslich in anderen Lösungsmitteln, wie Aceton und Alkoholen, und sehr gut löslich in Dimethylsulfoxid, Pyridin, Ethylenglykolmonoethylether, Formamid, Dimethylformamid und Dimethylacetamid ist Mit einigen dieser Lösungsmittel, z. B. Methylformamid und Pyridin, bildet der neue Komplex anscheinend Molekülkomplexe, die ihm eine größere Löslichkeit in vielen wäßrigen und organischen Lösungsmittelsystemen verieihen.

Hinsichtlich der mikrobiologischen Wirksamkeit hat Partricinmethylester oder SPA-S-160 eine geringe oder gar keine Wirksamkeit gegenüber grampositiven und gramnegativen Bakterien, ist jedoch sehr wirksam

gegenüber zahlreichen pathogenen Pilzen, insbesondere gegenüber Candida albicans: die minimale Hemmkonzentration (MHK)₁ bestimmt an 6 Stämmen von Candida albicans, betrug auf einem Agarmedium nach 24 bzw. 48 Stunden Inkubation bei 35"C 0,12 bzw. 0,25 μg/ml. Im Vergleich dazu betrugen die MHK des bekannten Amphotericin B 0,25 bzw. l,0μg/ml und die des bekannten Nystatin 4 bzw. 8 μg/ml. Darüber hinaus hat sich Partricin-methylester als wirksam gegenüber Trichomonas vaginalis erwiesen, wobei die MHK gegenüber 6 Stämmen von T.vaginalis 2 μg/ml und gegenüber 2 weiteren Stämmen 4 μg/ml betrug, während die MHK des besten bekannten Mittels gegenüber T.vaginalis, nämlich Metronidazol, gegenüber 4 Stämmen von T.vaginalis 0,25 μg/ml und gegenüber 4 weiteren Stämmen 0,5 μg/ml betrug.

Im Gegensatz zu ähnlichen polyenischen Antibiotika ist die Toxizität des neuen Antibiotikakomplexes sehr

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die Hälfte der getesteten Tiere zu töten) beträgt über 4000 mg/kg bei Mäusen nach oraler Verabreichung. Ähnliche Toxizitätsergebnisse wurden für das neue Produkt bei anderen Tieren, z. B. Ratten, erhalten; diese Dosen sind außergewöhnlich hoch, wenn man sie mit allen bisher bekannten polyenischen Antibiotika vergleicht.

Es wurden auch klinische Versuche durchgeführt, die zeigte :, daß Partricin-methylester von besonderem Interesse zur Behandlung einer Vaginitis ist, die durch gemischte Organismen, d. h. C.albicans und T.vaginalis. hervorgerufen wurde, da Patricin-methylester sowohl gegenüber C.albicans als auch gegenüber T.vaginalis wirksam ist. Bisher wurde zur Behandlung derartiger gemischter Infektionen ein Kombinationspräparat aus Nystatin und Metronidazol eingesetzt Partricin-methylester erwies sich diesem Kombinationspräparat gegenüber als überlegen.

Die örtliche Anwendung von Patricin-methylester auf normale und skarifizierte Kaninchenhaut sowie auf die Bindehaut-Mucosa und auf das Hornhaut-Epithel ergab, daß der Ester ausgezeichnet toleriert wurde. Die minimalen hämolytischen Konzentrationen an roten Zellen in Kaninchen betragen etwa 40 bis 80 y/ml nach einer Stunde, was zu den höchsten Werten zählt die für Substanzen mit polyenischer Struktur und insbesondere mit heptaenischer Struktur bisher angegeben wurden.

Die vorstehend beschriebenen zahlreichen mikrobiologischen und pharmakologischen Eigenschaften machen den Antibiotikakomplex Partricin-methylester äußerst interessant in der Therapie zur Bekämpfung vieler Krankheiten, die durch Pilzinfektioiiüi bei Menschen, Tieren und Pflanzen verursacht werden. Besonders interessant ist die örtliche Anwendung des neuen Esters in Form einer Tinktur oder Salbe zur dermatologischen Anwendung und von Suppositorien oder Zäpfchen zur vaginalen Anwendung bei Pilzinfektionen und Infektionen durch Trichomonas. Bei Pflanzen kann die Substanz aufgesprüht oder mit Düngemitteln vermischt werden.

Die Beobachtung einer geringen Absorption des neuen Antibiotikakomplexes durch die Darmwand und seine hohe Wirksamkeit gegenüber Candida albicans machen es besonders brauchbar zur Bekämpfung von Darminfektionen durch orale Verabreichung. Diese Infektionen treten beim Menschen besonders häufig nach längerer Behandlung mit Antibiotika, wie beispielsweise Tetracyclinen und Chloramphenicol, mit antibakterieller Wirksamkeit auf.

Außerdem wurde beobachtet, daß die Anwendung bestimmter Molekülkomplexe von SPA-S-160, z. B. mit Dimethylacetamid, die Absorption des Komplexes verbessern kann, was wahrscheinlich auf die erhöhte Fähigkeit zur Lösung und Diffusion zurückzuführen ist. j Daher kann die Verbindung auch zur Bekämpfung zahlreicher allgemeiner Infektionen nach oraler oder pare;>'eraler Verabreichung von großem Interesse sein.

Für alle Anwendungen wird die neue Substanz mit einer geeigneten Menge eines pharmazeutisch brauch- in baren, festen oder flüssigen Trägers vermischt. Die Präparate schließen Tabletten, Brausetabletten, Pulver, Granulate, Kapseln und Suspensionen in öl oder andere Formen ein, die besonders zur oralen Verabreichung geeignet sind. ι ϊ

Der neue Antibiotikakomplex kann auch parenteral, d. h. durch Injektion, verabreicht werden, wobei flüssige, sterile Träger verwendet werden. Die Präparate können stprilp i_^^ciir!^iT'ⁱn in z. B. Dirr!eth"!°ceiu!7iiu oder Ethylcellosolve oder auch Suspensionen in Wasser oder ><> in injizierbaren Ölen einschließen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung; einige Beispiele enthalten auch pharmazeutische Präparate, die SPA-S-160 enthalten.

Beispiel!

35 g Partricin wurden in 280 ml Dimethylsulfoxid gelöst und tropfenweise mit 250 ml einer 2%igen etherischen Lösung von Diazomethan versetzt, die nach den in der Literatur angegebenen üblichen Methoden jo erhi^;ien worden war. Der Zusatz erfolgte bei Raumtemperatur unter langesamem Rühren, wobei die wegen der giftigen und gefährlichen Natur von Diazomethan erforderlichen Vorsichtsmaßnahmen ergriffen wurden. Es erfolgte sofort eine heftige Reaktion, r> wobei Stickstoff entwickelt wurde, die dann allmählich nachließ und beendet war, als die zugegebene Menge an Diazomethan einen stöchiometrischen Überschuß ausmachte.

Das so erhaltene Gemisch wurde unter Lichtausschluß über Nacht stehengelassen, wonach so viel Ether zugesetzt wurde, daß das Reaktionsprodukt ausgefällt wurde. Dieses Material wurde durch Filtration gesammelt und gewaschen, indem man es zuerst mit Ether bedeckte und dann mit Ether digerierte. Die so erhaltene Substanz, Partricin-methylester oder SPA-S-160, wurde im Vakuum bei Umgebungstemperatur auf ein konstantes Gewicht getrocknet, wobei eine fast quantitative Ausbeute erhalten wurde. Geringe Mengen an rest lichem Lösungsmittel, die etwa vorhanden waren, >o konnten leicht durch Waschen mit Wasser entfernt werden.

Falls erforderlich konnte die Substanz gereinigt werden, indem man sie mit geeigneten Lösungsmittelgemischen, wie Dimethylsulfoxid — Ether, Dimethylsulfoxid — Aceton — Ether, Dimethylacetamid — Wasser od. dgl, behandelte.

Beispiel 2

10 g Partricin wurden in 10OmI Dimethylacetamid gelöst und tropfenweise bei einer Temperatur von 26° C mit 70 m! einer 2%igen etherischen Lösung von Diazomethan versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde bei der gleichen Temperatur 6 Stunden lang langsam gerührt und dann mit soviel Äther versetzt, daß das Reaktionsprodukt ausgefällt wurde. Der Niederschlag wurde abfiltriert und sorgfältig mit Ether gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet, wobei eine fast quantitative Ausbeute von SPA-S-160 erhalten wurde.

Beispiel 3

50 g Partricin wurden in 500 ml Dimethylsulfoxid gelöst, dann wurden unter Rühren 3 ml konzentriertes Ammoniumhydroxid zugegeben, was ausreichte, um den pH-Wert der Lösung auf 9—9,2 zu bringen. Dieser wurde nach Verdünnung einer Probe auf 1% durch Zusatz eines Gemisches von Dimethylsulfoxid und Wasser im Verhältnis 1 : 1 gemessen. Dann wurden 350 ml einer etwa 2%igen etherischen Lösung von Diazomethan zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und dieses wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur langsam gerührt. Nach dieser Zeit wurde ein Oberschuß an Ether zugesetzt, um das Reaktionsprodukt auszufällen, das aus dem Lösungsmittelgemisch isoliert und unter Rühren mit 250 ml Aceton und dann mit überschüssigem Ether KoKonHojt v/'jrde E?2S 2¹Jf diese Weise in Suspension erhaltene kristalline Produkt wurde abfiltriert und mit Ether gewaschen, wobei das gewünschte Produkt erhalten wurde.

Beispiel 4

Eine Lösung von 50 g Partricin in 500 ml Dimethylsulfoxid wurde unter Rühren mit einer praktisch stöchiometrischen Menge an konzentriertem Ammoniumhydroxid, d. h. einer ausreichenden Menge, um den pH-Wert der Lösung auf etwa 11 zu bringen, versetzt. Dieser pH-Wert wurde nach Verdünnen einer Probe auf I % durch Zusatz eines Gemisches von Dimethylsulfoxid und Wasser im Verhältnis 1 :1 gemessen. Anschließend wurden tropfenweise rasch 350 ml einer etwa 2%igen etherischen Lösung von Diazomethan zugesetzt und anschließend weiter nach der Arbeitsweise von Beispiel 3 verfahren, um den Methylester von Partricin zu erhalten.

Beispiel 5

Es wurde eine Lösung von 100 g Partricin in 1000 ml Dimethylsulfoxid hergestellt und unter Rühren bei Raumtemperatur mit 6 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid und 700 ml einer 2^u/oigen etherischen Lösung von Diazomethan versetzt Das Reaktionsgemisch wurde 8 Stunden bei Raumtemperatur langsam gerührt; anschließend wurde der größte Teil des Ethers und das überschüssige Diazomethan unter vermindertem Druck abdestilliert, und dann wurde ein Überschuß an Wasser zugesetzt, um das Reaktionsprodukt auszufällen. Der Niederschlag wurde dann durch Filtration abgetrennt, sorgfältig mit Wasser gewaschen und im Vakuum getrocknet Das erhaltene Produkt wurde mit 95%igem wäßrigem Aceton aufgeschlämmt, um etwaige Verunreinigungen und Fraktionen giftigerer Substanzen zu extrahieren, anschließend wurde der gewaschene Feststoff filtriert und getrocknet, wobei eine hohe Ausbeute an Partricin-methylester in Form eines dunkelgelben kristallinen Feststoffs erhalten wurde.

Beispiel 6

20 g Partricin wurden in 160 ml Dimethylsulfoxid gelöst und anschließend mit 7 ml Triethylamin und 140 ml einer 2,3%igen etherischen Lösung von Diazomethan versetzt Das Gemisch wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend nach der Arbeitsweise von Beispiel 3 weiter verarbeitet, wobei der gewünschte Methylester von Partricin erhalten wurde.

Beispiel 7

Eine Lösung von 20 g Partricin in 250 ml IPyridin wurde rasch tropfenweise mit einem Überschuß einer 2,5%igen ätherischen Lösung von Diazomethan versetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei etwa 25⁰C stehengelassen, und anschließend wurde das Reaktionsprodukt nach der in Beispiel I beschriebenen Arbeitsweise isoliert und gereinigt.

Beispiel 8

12 g Partricin-methylester, die nach einer der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Arbeitsweisen erhalten wurden, wurden in 60 ml Pyridin gelöst, und die erhaltene Lösung wurde durch eine chromatographische Säule aus 400 g Silicagel (0,05 bis 0,20 mm) in einem Gemisch von Pyridin und Petroläther im Verhältnis 8 : 2 geschickt. Das gleiche Lösungsmittelgemisch wurde bei der anschließenden Eluierung verwendet. Während der Chromatographie wurden 100-mI-Fraktionen des Eluats gesammelt und zusammengegeben, nachdem man sie getrennt mittels Dünnschichtchromatographie (Platte auf Basis Kieselsäuregel mit Fluoreszenzindikator; Lösungsmittelsystem: Butanol — Ethanol — Aceton — konzentriertes Ammoniumhydroxid im Verhältnis 2:5:1 :3) auf ihre Reinheit getestet hatte. Die das reine Produkt enthaltende Lösung wurde mit überschüssigem Ether versetzt, um den gelösten Stoff auszufällen, dann wurde der Niederschlag durch Filtration gesammelt und sorgfältig mit Ether gewaschen, wobei ein praktisch reiner Partricin-methylester in Form eines mikrokristallinen gelben Pulvers erhalten wurde. Für analytische Zwecke konnte er, wenn nötig, weiter mit geeigneten Lösungsmittelgemischen, ζ. B. Dimethylsulfoxid — Ether, Dimethylsulfoxid — Wasser, Dimethylacetamid — Wasser, behandelt werden.

Beispiel 9 Vaginal-Suppositorien Jedes Vaginal-Suppositorium enthält:

SPA-S-160(Partricin-methylester) 0,025 g 4".

Dimethylacetamid 0,065 g

Polyethylenglykol-1540-monostearat 1,200 g

Cetylalkohol 0,610 g

Beispiel 10 Vaginal-Suppositorien Jedes Vaginal-Suppositorium enthält:

SPA-S-160 (Partricin-methylester) 0,025 g

Dimethylsulfoxid 0,075 g

Polyethylenglykol-1540-monostearat 1,200 g

Cetylalkohol 0,600 g

Beispiel 11 Vaginal-Suppositorien Jedes Vaginal-Suppositorium enthält:

SPA-S-160 (Partricin-methylester) 0 025 g

Dimethylacetamid 0,065 g

Polyethylenglykol-1540-monostearat 1,200 g

Polyethylenglykol 4000 0,610 g

Beispiel 12 Vaginal-Suppositorien Jedes Vaginal-Suppositorium enthält: SPA-S-160 (Partricin-methylester) 0,025 g

Fettsäure-triglyceride 1,775 g

Beispiel 13

Salbe

Zusammensetzung:

SPA-S-160(Partricin-methylester) 3 g

Dimethylacetamid 5 g

Lanolin 20 g

Cetylalkohol 32 g

Oleylalkohol 7,5 e,

Sorbitantrioleat 7,5 g

Polyethylenglykol-1540-monostearat 25 g

Beispiel 14

Salbe
Zusammensetzung:

SPA-S-160(Partricin-methylester) 3 g

Dimethylsulfoxid 6 g

Lanolin 20 g

Cetylalkohol 31 g

Sorbitantrioleat 10 g

Polyethylenglykol-1540-monostearat 30 g

Beispiel 15

Salbe

Zusammensetzung:

SPA-S-160 (Partricin-methylester) 3 g

Dimethylsulfoxid 6 g

Lanolin 20 g

Cetylalkohol 31 g

Oleylalkohol 10 g

Polyethylenglykol-1540-monostearat 30 g

Beispiel 16

Salbe

Zusammensetzung:
SPA-S-160 (Partricin-methylester) 3 g

Vaseline 70 g

Weißöl 27 g

Beispiel 17

Das als Ausgangsmaterial verwendete Partricin kann hergestellt werden, indem man Streptomyces aureofaciens NRRL 3878 etwa 24 bis 168 Stunden unter submersen aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 23 bis 30° C in einem wäßrigen Nährmedium züchtet, das eine assimilierbare Kohlehydratquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält Beispiele für geeignete Kohlehydratquellen schließen Saccharose, Glukose, Melassen, Stärke, Dextrin, Maismehl u. dgl. ein. Beispiele für geeignete Stickstoffquellen schließen Hefe, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl, Erdnußmehl, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Nitrate, Harnstoff und andere übliche bekannte Substanzen ein. Das Nährmedium enthält auch Mineralsalze und Calciumcarbonat als Puffersubstanz.

kg Mycel, das durch die vorstehend genannte submerse aerobe Züchtung von Streptomyces aureofaciens NRRL 3878 erhalten wurde, wird nach Ansäuern

auf einen pH-Wert von 1,8 bis 2 und anschließender Filtration isoliert. Das feuchte Mycel, das vorzugsweise Diatomeenerde oder andere geeignete Filterhilfen enthält, wird in 31 n-Butanol suspendiert, und das Gemisch wird durch Zusatz von Ammoniunihydroxid auf einen pH-Wert von 9,5 bis 10 gebracht. Die

Butanol-Fraktion wird durch Filtration abgetrennt und mit 1,51 Wasser mit einem pH-Wert von 1,5 gewaschen, und das n-Butanol wird im Vakuum auf etwa 150 ml eingeengt. Bei rascher Kühlung fällt das Partricin aus und wird dann nacheinander mit Butanol und dann mit Petrolether gewaschen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspreche;

I. Als Partricin-methylester (SPA-S-160) bezeichneter Antibiotikakomplex mit Folyenstruktur (Hep- taen), gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

Stickstoff und Sauerstoff in den folgenden Gewichtsprozenten:

(a) kristalliner gelber bis dunkelgelber Feststoff, enthaltend die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff und Sauerstoff in den folgenden Gewichtsprozenten:

Kohlenstoff 633% Wasserstoff 7,8% Stickstoff 3,2% Sauerstoff 24,8%

IO

(b) IR-Absorptionsmaxima bei 3360, 1715, 1640, 1595, 1175, 1060, 1000, 848 und 763 cm-· gemessen in Kaliumbromid;

(c) UV-Absorptionspeaks bei 401, 378, 359 und 340 nm, in Ethanol bei einer Konzentration von etwa 0,01 mg/ml, die sich unter Einwirkung von UV-Licht auf 4nm höhere Wellenlängen verschieben;

(d) einen Rf-Wert von etwa 0,8 an SiOrGeJ, gelöst in einem Gemisch aus 2 Teilen Butanol, 5 Teilen Ethanol, 1 Teil Aceton und 3 Teilen einer 25%igen Ammoniumhydroxidlösung;

(e) Peak·; im ¹³C-NMR-Spektrum in Deuterodimethylsulfoxid bei 208,2; 196,6; 173,1; 170,2; 153,8; 130,5; 125,1; 1 lC/,5; 97,6; 973; 51,4; 173; 16,4 und 12,8 ppm;

(f) einer durchschnittlichen MHK von 0,12μg/ml gegenüber Candida albicans-Stämmen;

(g) einer LD» p.o. bei Mäusen oberhalb 2000 mg/kg;

(h) sehr wenig löslich in Wasser und wäßrigem Alkali sowie Ether, Petrolether, Benzol; mäßig löslich in Aceton und Alkoholen; sehr gut löslich in Dimethylsulfoxid, Pyridin, Dimethylformamid und Dimethylacetamid.
2. Partricin-methylester nach Anspruch 1, erhältlich durch Umsetzung von Diazomethan mit Partricin (SPA-S-132), einem Antibiotikakomplex mit Heptaenstruktur, bestehend aus 2 Komponenten, Partricin A und B, wobei Partricin A sich von Partricin B durch die Anwesenheit einer xusätzlichen Methylgruppe, gebunden an ein Seitenkettenstickstoffatom, unterscheidet, der durch Kultivierung von Streptomyces aureofaciens NRRL 3878 unter aeroben Bedingungen bei 23 bis 30° C in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlehydratquelle und eine assimilierbare Stickstoffquelle enthält, gebildet wird.

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Die Erfindung betrifft einen als Partricin-metlhylester (SPA-S-160) bezeichneten Antibiotikakomplex mit Polyenstruktur (Heptaen), der gekennzeichnet ist durch die folgenden Eigenschaften:

(a) kristalliner gelber bis dunkelgelbei Feststoff enthaltend die Elemente Kohlenstoff, Wasserstoff, Kohlenstoff
Wasserstoff
Stickstoff
Sauerstoff

63,3% 7,8% 3,2%

24,8%