DE1216280B - Verfahren zur Herstellung der N-Alkansulfon-oder N-Alkansulfinsaeuren von Neomycin, Framycetin, Dihydrostreptomycin oder Kanamycin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. α.:

C07c

C07g

Deutsche Kl.: 12 ο - 6

Nummer: 1216 280

Aktenzeichen: S 64080IV b/12 ο

Anmeldetag: 23. Juli 1959

Auslegetag: 12. Mai 1966

Es ist bekannt, daß basische Antibiotica, wie Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Hydroxystreptomycin, Neomycin, Framycetin und Kanamycin, die basische Gruppen enthalten — wie die Guanidingruppe — und/oder als Bausteine ihres Moleküls Aminozucker oder cyclische Aminoalkohole aufweisen, eine große antibiotische Wirksamkeit entfalten und einen breiten antibiotischen Wirkungsbereich besitzen, aber gleichzeitig eine ausgesprochen toxische Wirkung haben.

Die Toxizität wirkt sich bei einigen dieser Antibiotica, beispielsweise dem Neomycin, auf das achte Paar der Kopfnerven und die Nieren aus, so daß ihre parenterale Anwendung zu therapeutischen Zwecken ausgeschlossen ist. Bei den anderen, wie dem Dihydrostreptomycin, die trotz ihrer toxischen Wirkung parenteral verwendet werden können, müssen bei längeren Behandlungen gewisse Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden.

Die Toxizität dieser Antibiotica kann durch Be-Stimmung der Dosis Letalis 50 (bei deren Application die Hälfte der Versuchstiere eingehen) an Tierversuchen nachgewiesen werden. So ist jedes der obengenannten Antibiotica durch eine Dosis Letalis 50 gekennzeichnet, die in Milligramm des aktiven antibiotischen Ausgangsprodukts je Maus mit einem mittleren Gewicht von 20 g angegeben ist.

Die Toxizität dieser Antibiotica kann außerdem im Tierversuch durch Anwendung geringerer Dosen dieser Stoffe während einer mehr oder weniger langen Zeit (chronische Toxizität) ermittelt werden; während dieser Versuche beobachtet man die Gewichtsveränderungen der Tiere und untersucht am Ende der Versuche auf makroskopischem und mikroskopischem Wege die einzelnen Organe der Tiere auf gegebenenfalls vorhandene Schäden.

Man hat sich bereits seit längerer Zeit bemüht, die Toxizität dieser Antibiotica durch chemische Maßnahmen oder Modifikationen zu verringern; derartige Versuche führten zu Verbindungen, welche sich zwar als weniger toxisch erwiesen, aber gleichzeitig einen Teil der antibiotischen oder antibakteriellen Wirkung des Ausgangsproduktes verloren hatten. Dies trat insbesondere bei der N-Acetylierung des Neomycins und bei der Benzoylierung anderer basischer Antibiotica ein; die dabei gebildeten Stoffe übten überhaupt keine Wirkung mehr auf Bakterien aus.

Andererseits verringert die Bildung von Salzen der basischen Antibiotica mit Säuren, wie Pantothensäure oder Ascorbinsäure, die Toxizität wenig. Diese Maßnähme gibt daher keine befriedigenden Resultate, um die bei basischen antibiotischen Verbindungen be-Verfahren zur Herstellung der N-Alkansulfon-
oder N-Alkansulfinsäuren von Neomycin,
Framycetin, Dihydrostreptomycin oder
Kanamycin

Anmelder:

Societe Industrielle pour la Fabrication des
Antibiotiques, S. I. F. Α., Paris

Vertreter:

Dipl.-Ing. R. Beetz, Patentanwalt,

München 22, Steinsdorfstr. 10

Als Erfinder benannt:
Frederic Zuckerkandl, Paris;
Bernard Ores, Boulogne-sur-Seine;
Jean Phileppe, Paris (Frankreich)

Beanspruchte Priorität:
Frankreich vom 23. Juli 1958 (770 893),
vom 29. Mai 1959 (795 984)

sonders hoher Toxizität, wie dem Neomycin, mit Aussicht auf Erfolg anwenden zu können.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung neuer Derivate bekannter toxischer basischer Antibiotica, nämlich des Neomycins, Framycetins, Dihydrostreptomycins und Kanamycins, wobei die antibakterielle Wirkung der genannten Antibiotica erhalten bleibt und eine gegenüber den Ausgangsprodukten ganz wesentlich verringerte Toxizität erhalten wird. Dieser Unterschied in der Toxizität tritt vor allem in Erscheinung, wenn man die akute Toxizität als DL₅₀ und die chronische Toxizität durch Vergleich der Gewichtsveränderungen und der Beeinflussung von Körperorganen bestimmt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der N-Alkansulfon- oder N-Alkansulfinsäuren von Neomycin, Framycetin, Dihydrostreptomycin oder Kanamycin und deren Salzen, die weniger toxisch als die entsprechenden Antibiotica sind; dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man die genannten Antibiotica in Form der freien Basen oder von Salzen der Base mit einer schwachen Säure

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3 4

oder von Salzen, bei denen die freien Aminogruppen und der schwachen Säure nach an sich bekannten

der Base teilweise als Sulfat oder Hydrochlorid ge- Verfahren, z. B. einer doppelten Umsetzung zwischen

bunden sind, in an sich bekannter Weise in wäßriger den Sulfaten des Antibioticums und Alkali- oder

Lösung mit einem Salz einer a-Hydroxyalkansulfon- Erdalkalicarbonaten in situ gebildet wird. Dann läßt

säure oder «-Hydroxyalkansulfinsäure oder mit Ver- 5 man die Substanzen während wenigstens 1 Stunde

bindungen, die ein solches Salz unter den Reaktions- miteinander reagieren — da die Reaktion relativ

bedingungen in situ bilden, bei Temperaturen von langsam verläuft — und trennt schließlich nach prak-

15 bis 45 ⁰C unter ständigem Rühren 1 bis 24 Stunden tisch vollständiger Umsetzung das gebildete Konden-

umsetzt und entweder sationsprodukt in bekannter Weise ab, wie durch

. ,. ,.,,,. r, , , -KT A_{11 1Γ} ! i° Lyophilisation der Flüssigkeit oder Fällung durch ein

a) die gebildeten Salze der N-Alkansulfon- oder _{Lösungsmittel) in dem} ^e _das Verfahrensprodukt un- -sulfinsäuren der genannten Antibiotica in an sich löslich ist

bekannter Weise durch Gefriertrocknung oder _{Man kann an SteUe der Ä}_Hydroxyalkansulfin- und

Ausfallen nut einem mit Wasser mischbaren _a__Hydroxyalkansulfonsäuresalze eine reaktionsfähige

Lösungsmittel, m dem das Verfahrensprodukt _ij} Mischung verwenden, die zur Bildung dieser Salze

unlöslich ist, gewinnt oder innerhalb der Reaktionslösung führt, beispielsweise

b) für den Fall, daß von einem partiellen Sulfat oder entsprechend zusammengesetzte Mischungen aus Form-Hydrochlorid des Antibioticums ausgegangen aldehyd und Natriumbisulfit.

wurde, die wäßrige Lösung des gebildeten Salzes Bei einer besonderen Durchführungsart der Erfin-

entweder ₂o dung, die für die Anwendung in der Praxis vorzu-

1. gleichzeitig über einen Kationen- und einen ziehen ist, hält man die Mischung während 24 Stunden Anionenaustauscher leitet oder unter Rühren auf Umgebungstemperatur. Die Fällung

2. einer doppelten Umsetzung mit einem Salz ^de.^s das Verfahrensprodukt bildenden Derivats erfolgt unterwirft, dessen Kation mit dem Sulfat- mit ψε eines mit Wasser mischbaren Losungsmittels, oder Hydrochloridrest der Aminogruppe ein ^a5 ™» Äthanol, Methanol oder Aceton Vor dieser unlösliches Salz büdet und dessen Anion mit ^"ψ ^ka™ ^man. ^{die L}°^S™Z ^mt .Aktivkohle bedem Kation des Salzes der Alkansulfon- oder ^hand^ ^{und auf emen} pH-Wert zwischen 7 und 9 -sulfinsäure ein Salz büdet, das in dem zur anstellen, wenn man em besonders reines Produkt Ausfällung der Alkansulfon- oder -sulfinsäure erhalten will. . ^ j ■ verwendeten Lösungsmittel löslich ist, und 3° J>f erfindungsgemäß angestrebte Kondensation die auf diese Weise von Sulfat-, Chlorid- und ^erfolf ^{an de}* Aminfunktionen und führt zur Bildung Metallionen befreiten, freien N-Alansulfon- von Aminoalkansulfinaten oder Aminoalkansulfonaten oder -sulfinsäuren der genannten Antibiotica, ^des basischen Antibioticums, das als Ausgangsprodukt wie unter a) angegeben, gewinnt. verwendet wurde. Die Analyse dieser Stoffe hat

35 gezeigt, daß sie im Falle der Aminoalkansulfinate

Die erfindungsgemäß verwendbaren Antibiotica der allgemeinen Formel

enthalten Aminogruppen; es ist jedoch nicht not- „

wendig, daß alle diese Aminogruppen frei, d.h. K

unmittelbar reaktionsfähig, sind. So können die ^oder

Aminogruppen zum Teil durch. Salzsäure oder 40 (R — NH — R' —
Schwefelsäure neutralisiert sein. Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich dennoch durchführen, da entsprechen, in denen R' ein Alkylrest, M' ein Atom die freien Aminfunktionen mit den Salzen der «-Hy- eines einwertigen Metalls und M" ein Atom eines droxyalkansulfin- und/oder -sulfonsäuren zu Derivaten zweiwertigen Metalls bedeutet, wobei R — NH₂ das dieser Antibiotica kondensieren, deren Toxizität 45 Antibioticum in seinem basischen Zustand bedeutet, gegenüber den als Ausgangsprodukten benutzten wenn es nur eine einzige Aminfunktion aufweist. Antibiotica wesentlich verringert ist. Im Falle der Aminoalkansulfonate ist die entsprechende

Dies tritt beispielsweise ein, wenn man von dem Formel

handelsüblichen Salz des Kanamycins, und zwar dem " j> j^jj ^j gQ ^'

Monosulfat des Kanamycins, ausgeht, bei dem die 50 ³

Schwefelsäure nur zwei der Aminfunktionen des ° ^er

Kanamycins neutralisiert, während die beiden anderen C^- NH — R SO₃)₂M"

noch in der Lage sind, bei dem neuen Verfahren zu Besitzt das Molekül des Antibioticums ρ freie Amin-

reagieren, um ein weitgehend »entgiftetes« Derivat des funktionen, so entspricht dem die Formel R — (NHa)₂,

Kanamycins zu ergeben. 55 und die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren

Man kann als Ausgangsprodukt die freien Basen der erhaltenen Verfahrensprodukte den Formern
Antibiotica verwenden oder diese innerhalb der

Reaktionslösung in situ aus dem Chlorhydrat oder R — (NH — R' — SO₂M')j> ~*

Sulfat in bekannter Weise freisetzen. (R)₂ = [(NH — R' — SOj)₂M"]* ^v '

Nach einer Variante des neuen Verfahrens kann 60 . _ „ , . . „ ,,. ^ ·,

man als Ausgangsprodukt auch Salze des Antibioti- ^{im FaU der} Aminoalkansulfinate und

cums mit schwachen Säuren, wie den Carbonaten, R (NH R' SO₃M')jj

verwenden, aus denen das Antibioticum dann bei der /™ _ rmjj r' SO)M"!

erfindungsgemäßen Umsetzung freigesetzt wird. In 32p

wäßriger Lösung versetzt man das Salz des Antibioti- 65 im Falle der Aminoalkansulfonate.

cums und einer schwachen Säure mit einem Salz einer Es werden also jeweils so viel Molekülreste der a-Hydroxyalkansulfinsäure oder einer «-Hydroxy- α-Hydroxylalkansulfin- oder a-Hydroxyalkansulfonalkansulfonsäure, wobei das Salz des Antibioticums säure an den Ausgangsantibiotica gebunden, wie dieses

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5 6

freie bzw. freisetzbare Aminfunktionen, d. h. neu- die Aminfunktionen von R blockierenden Sulfat- oder tralisiert mit schwachen Säuren, aufweist. So zeigt Hydrochloridresten unlösliche Verbindungen bildet, beispielsweise die Analyse bei dem erfindungsgemäß die man abscheiden kann, und deren Anion sich mit hergesellten Derivat des Neomycins, das als freie M' oder M" zu einem Salz verbindet, das nach Zugabe Base sechs freie Aminfunktionen aufweist, daß sich 5 eines geeigneten Lösungsmittels, z. B. Aceton oder ein »entgiftetes« Derivat als Endprodukt erhalten Methanol, in der Lösung verbleibt, während das läßt, in dem sechs Molekulreste dieser Säuren nach- Derivat des Antibioticums ausgefällt wird,
weisbar sind; bei Verwendung von Kanamycin finden Bei dem Herstellungsverfahren, nach dem Versich nur vier solche Reste, bei dem Dihydrostrepto- bindungen der Formel (1) erhalten werden, wird eine mycin nur drei. io bekannte Kondensationsreaktion benutzt, die sich für Durch die von den oben angegebenen Formeln denjenigen Fall, daß ρ = 1 und das Metall einwertig definierten Derivate sind auch solche Derivate erfaßt, ist (also mit M' bezeichnet wird), in folgender Weise die unter Verwendung basischer Antibiotica erhalten schematisch darstellen läßt:
werden, bei denen ein Teil bzw. eine bestimmte
Anzahl der Aminfunktionen nicht frei ist, weil sie 15 R — NH₂ + HO — R' — SO₂M'

durch Schwefel- oder Salzsäuren neutralisiert sind. _>. H₂O -f R NH R' SO₂M'

Der Rest R enthält in diesem Falle beispielsweise q

neutralisierte Aminfunktionen und kann z. B. ge- °

schrieben werden: r _ NH₂ + HO — R' — SO₃M'

^a° -> H₂O + R —NH-R' —SO₃M'

\ Eine derartige Kondensationsreaktion kann bei

(NH₂X)₃ normaler Temperatur durchgeführt werden.

25 Sie findet in dieser Form nur dann statt, wenn

wobei X die Salzsäuregruppe bedeutet und die freie oder salzartig durch schwache Säuren gebundene

anderen Symbole die vorstehend genannte Bedeutung Amingruppen vorliegen, also in einem alkalischen

haben. bis schwach alkalischen Medium.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin Die Reaktion der sauer reagierenden Salze starker auf ein Verfahren, in dem die oben formelmäßig 30 Säuren der erfindungsgemäß verwendeten Antibiotica angegebenen Produkte von den Metallen M' und/oder mit Hydroxymethansulfinaten oder -sulfonaten ergibt M" und den mit einigen ihrer Amingruppen verbun- keine Kondensation; eine derartige Umsetzung führt denen Sulfat-oder Hydrochloridresten befreit werden. zu einer Salzbildung nach einer Reaktion der Art: Die nach diesem Verfahren erhaltenen neuen Verbindungen können durch die folgenden allgemeinen 35 R — NH₂ — HCl + HO — R' — SO₂M'
Formeln dargestellt werden: -» RNH₃ — SO_a — R'— OH + M'Cl

, (NH — R' — SO₂H)j, und liefert infolgedessen Verbindungen, deren Toxi-

R' ,2) zität praktisch genauso groß wie die Toxizität der

\ 40 als Ausgangsprodukte verwendeten Antibiotica ist.

(NH₂)₂ £)_as erfindungsgemäße Verfahren ist auf Streptomycin nicht anwendbar. Es kann keine Kondensation

, (NH — R' — SO₃H)₁) zwischen dieser Verbindung und den «-Hydroxyalkan-

P/ /"2 a) sulfon- oder a-Hydroxyalkansulfinsäuren erreicht

\ 45 werden. Dies ist wahrscheinlich auf die Anwesenheit

(NHa)₃ einer freien Aldehydgruppe in dem Molekül des

Streptomycins zurückzuführen.

Diese Verbindungen weisen ebenfalls noch eine Um das erfindungsgemäße Verfahren zweckmäßig

gegenüber den als Ausgangsprodukten verwendeten durchzuführen, soll man von vornherein die Mengen

Antibiotica ganz wesentlich verringerte Toxizität auf. 50 des jeweils einzusetzenden antibiotischen Ausgangs-

Um die Verbindungen entsprechend den Formeln (2) produkts und der für die Reaktion zu verwendenden

zu erhalten, behandelt man die Lösungen der Ver- Säuren berechnen.

bindungen gemäß der allgemeinen Formel Das erfindungsgemäße Verfahren führt stets zu einer

. _M„ ganz wesentlichen Verringerung der Toxizität der

, (NH — R' — SO₂M'/—j—j 55 Ausgangsstoffe, die selbst unter Berücksichtigung der

r- '^p Änderung der antibiotischen Wirksamkeit des Pro-

\ duktes einen ganz wesentlichen Vorteil für die An-

(NH₂X)₂ Wendung der Produkte ergibt.

Dabei kommt es nicht so sehr darauf an, daß die

mit Ionenaustauscherharzen, die den Lösungen einer- 60 nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen

seits die Metallatome M' und/oder M" und anderseits Derivate eine biologische Aktivität aufweisen, die

die Hydrochlorid- oder Sulfatreste entziehen, welche genauso groß ist wie die der als Ausgangsstoffe ver-

die Aminfunktionen blockieren; das umgewandelte wendeten Antibiotica; entscheidend ist das Verhältnis

neue Derivat des Antibioticums bleibt in der Lösung zwischen der biologischen Aktivität der Derivate zu

und kann anschließend abgetrennt werden. 65 ihrer verringerten Toxizität, d. h. der therapeutische

Man kann zur Durchführung dieser zweifachen Index.

Abtrennung auch ein Salz, z. B. Bariumacetat, ver- Um die vorteilhafte Änderung dieses Verhältnisses

wenden, dessen Kation in wäßriger Lösung mit den — die für die Produkte der Beispiele 1, 5 und 6 in

■diesen Beispielen angegeben ist — für zahlreiche andere Verfahrensprodukte klar zu zeigen, sind in der folgenden tabellarischen Zusammenstellung für eine Reihe dieser Produkte neben dem Molekulargewicht und dem optischen Drehvermögen die DL₅₀ und der Faktor der Verringerung der Toxizität (bezogen auf gleiche biologische Wirkung) angegeben. Die erste Spalte der Tabelle weist auf die Beispiele hin, in denen die Herstellung der betreffenden Derivate beschrieben ist.

Der Faktor der Toxizitätsverringerung ist" das Verhältnis der DL₅₀ des jeweiligen Derivats zu der DL₅₀ des als Ausgangsprodukt benutzten Antibioticums, multipliziert mit dem Aktivitätsverhältnis.

Wie in den Verfahrensbeispielen 1, 5 und 6 wurde dabei die DL₅₀ in Milligramm der Base berechnet;

d. h., wenn das erhaltene Derivat eine biologische Aktivität aufweist, die einer bestimmten Menge von Mikrogramm des Ausgangsantibioticums je Milligramm der in dem Produkt enthaltenen Base beträgt, wurde die DL₈₀ in Milligramm der Base angegeben, was der wahren biologischen Aktivität des Produktes entspricht.

Infolgedessen sind die Faktoren der Toxizitätsverringerung, die in der Tabelle angegeben sind, ein

ίο exaktes Maß für den Fortschritt, den man bei Anwendung der gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Derivate erreicht, da sie das einwandfreie Verhältnis der biologischen Aktivität des Derivats zu der Toxizität dieses Derivates mit den gleichen Verhältniswerten des Antibioticums vergleichen,, das als Ausgangssubstanz verwendet wurde.

Beispiel

Produkt

Molekular gewicht	Ml0	DL50	Fakior der Verringerung der Toxizität
1311	+36	30	51
929,8	-67	12,2	4
—	80±4	40	5,75
783	90±4	17,4	2,5
815.	81±3	27	3,9
641	112±3	49	7
672,7	102±4	50	7,2

Na-SaIz der Neomycino-hexamethansulf onsäure

Na-SaIz der Dihydrostreptomycino-trimethansulfonsäure

Na-SaIz der Kanamyeino-tetraraethansulfonsäure

Na-SaIz des Kanamycino-NjN'-dimethansuhinsäuremonosulfats

Na-SaIz des Kanamycino-NjN'-dimethansulfonsäuremonosulfats

Intramolekulares Salz der Kanamycino-dimethansulfinsäure

Intramolekulares Salz der Kanamycino-dimethansulfonsäure

Zur Erläuterung des erfindungsgemäßen neuen Verfahrens werden die folgenden Beispiele gegeben. Die in den Beispielen genannten Gewichtsangaben sind Mengen der Reagenzien, die sich auf reine, wasserfreie Produkte beziehen, soweit nicht anders erwähnt.

Beispiel 1

Zu 616 g Neomycinbase (1 Mol), gelöst in 6160 cm³ Wasser, gibt man 708 g (6 Mol) Natriumhydroxymethansulfinat hinzu, das sich mit den sechs Amingruppen des Neomycins kondensiert. Die Mischung wird während 24 Stunden bei Umgebungstemperatur dauernd gerührt. Die Lösung wird sodann durch Zugabe von 50 g Aktivkohle entfärbt, gefiltert und lyophilisiert. Man erhält ein weißes Pulver, das in Wasser löslich, jedoch in Methanol, Äthanol oder Äther unlöslich ist. Das erhaltene Produkt, das Neomycin-hexamethannatriumsuhinat, hat die Summenformel:

C₂₈H₅₂N₆O₂₅S₆Na₈; sein Molekklargewicht ist 1215.
Errechnet .... Na 11,349%, S 15,81%;

Die akute Toxizität des Produktes wurde durch intravenöse Injektion an weißen Mäusen von 20 g Körpergewicht bestimmt und einerseits mit derjenigen von Neomycintrisulfat, anderseits mit derjenigen einer unmittelbar vor Applikation hergestellten Mischung aus Neomycintrisulfat + Natriumhydroxymethansumnat (Molverhältnis 1: 6, verglichen, wobei im letzteren Falle die Mischung die beiden Komponenten in den gleichen Verhältnismengen enthielt, in denen sie jeweils in das Kondensationsprodukt eintreten. ,.

Die Injektionen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen, aber jeweils mit einem gleichmäßigen Volumen von 0,5 ml durchgeführt.

Die Resultate dieser Versuche ergeben sich aus der folgenden Zusammenstellung:

55

gefunden

Na 11,1%, S 15,9%.

Bei einer Titrierung nach der turbidimetrischen Methode (Trübungsmethode) ergab sich gegenüber einer Probe des Neomycinsulfats eine Aktivität von 330 meg der Neomycinbase 1 mg des neuen Derivats.

Dosis in Milligramm	Mortalität von je zehn Mäusen	Mischung	Neomycin-hexa-
Ausgangsprodukt je			methan-sulfinat
20 g Maus	Sulfat	1/10
0,53	2/10	4/10
0,583	5/10	8/10
0,641	7/10	10/10
0,705	9/10
0,775			1/10
21,5			3/10
27,5			5/10
30,0		9/10
36,0

ίο

Die DL₅₀, angegeben in Milligramm des Ausgangsprodukts je Kilogramm Lebendgewicht, sowie die voraussichtlichen Grenzen der DL₈₀ für eine Wahrscheinlichkeit von W= 95% wurden nach der Methode von D. J. Sp e ar man-Kar b er, Statistical method in biological essay, 1951, S. 524 — Ch. Griffin et Co., London, ermittelt.

Teststoff	DL50	Grenzen für ^ = 95%
Neomycintrisulfat Neomycintrisulfat + Natrium-hydroxymethansulfinat Neomycin-hexamethannatriumsulfmat	29,7 mg/kg 32,6 mg/kg 1,515 g/kg	28,2 bis 31,3 mg/kg 31,3 bis 34,1 mg/kg 1,435 bis 1,595 g/kg

Es ergibt sich, daß die Zugabe von Natriumhydroxymethansulfinat zu dem Neomycintrisulfat eine sehr geringe Verringerung der Toxizität erbringt; bei dem Neomycin-hexamethansulfinat ist jedoch die DL₆₀ um mehr als das 50fache gegenüber dem Neomycinsulfat erhöht; die Toxozität also auf weniger als ein Fünfzigstel herabgesetzt.

Chronische Toxizität

Ein erster Versuch, der an Gruppen von zehn weißen Ratten durchgeführt wurde und bei dem eine subcutane Applikation (sechs Injektionen je Woche) mit Dosen von 75 mg Neomycinsulfat je Kilogramm Lebendgewicht der Tiere gegeben wurden, zeigte, daß das Neomycinsulfat nach Ablauf von 4 Wochen schwere Nierenschädigungen irreversibler Art und den Tod von dreien der zehn Tiere bewirkt hatte. Die gleiche Menge Neomycin, die jedoch in Form des Neomycin-hexamethannatriumsulfinats gegeben wurde, hat nur geringfügige und nach Beendigung der Behandlung reversible Schäden ergeben. Keines der behandelten Tiere starb. Der Unterschied in der Art der Schäden, die von den beiden Produkten verursacht waren, ist groß und eindeutig bezeichnend. Die Behandlung wurde übrigens mit der oben angegebenen Dosis bei drei der zehn Ratten aus der Versuchsreihe mit dem »entgifteten« Neomycinderivat während weiterer 4 Wochen fortgesetzt; es konnte keine Verschlimmerung der chronischen Nierenreizung festgestellt werden.

Das Neomycin-hexamethannatriumsulfinat wurde in nicht mehr toxischen Dosen, beispielsweise mit 30 mg Neomycinbase je Kilogramm Tiergewicht und Tag, subcutan appliziert, und zwar bei fünfzehn Ratten während 13 Wochen; das Wachstum der Versuchstiere wurde nicht gestört, das Produkt wirkt sogar als Wuchsfaktor. Die makroskopische und mikroskopische Überprüfung der Organe zeigte am Schluß des Versuches, daß das Neomycia-hexamethannatriumsulfinat nur eine geringfügige bzw. vereinzelte Hypertrophie der Sekretionszellen einiger Nierengefäße verursacht hatte, die aber innerhalb der physiologischen Variationsgrenzen blieben. Demgegenüber bewirkt die gleiche Dosis von Neomycintrisulfat, mit dem fünfzehn Ratten einer anderen Versuchsgruppe behandelt wurden, eine akute Epithel-Nephritis. Außerdem zeigten die 4 Wochen nach Beendigung der Behandlung untersuchten Tiere, die Neomycintrisulfat erhalten hatten, bleibende und schwere Nephritisschäden, während die Nieren der mit Neomycin - hexamethannatriumsulfinat behandelten Tiere wieder normal geworden waren.

Die antibakterielle Wirksamkeit des Neomycinhexamethannatriumsulfinats wurde mit der des Neomycintrisulfats verglichen.

1. Verfahrensdurchführung

Die Einwirkung auf unterschiedliche Keime wurde nach der Methode der Reihenverdünnung in Nährbouillon geprüft.

Das Untersuchungsmedium ist eine Vorkultur von Nährbouillon, die 20 Stunden bei 37° C als ruhende Kultur bebrütet wurde. Nach Auszählen der Kultur nach der Methode Mac C r a i d y, A. Calmette-Manuel technique de microbiologie et de Serologie, 1948, S. 249 — Masson et Cie., wurde die Vorkultur verdünnt, so daß die Anzahl der Keime für einen Versuch 10³ je Milliliter war.

Die beiden miteinander zu vergleichenden Substanzen werden in sterilem, mineralfreiem Wasser gelöst. Die unterschiedlichen Verdünnungen werden in der Weise hergestellt, daß sie nach dem Gewichtsanteil des Salzes (Sulfat oder Hexamethansulfinat) gestaffelt wurden, so daß man die relative Wirksamkeit der beiden Produkte auf die unterschiedlichen Keime ermitteln kann.

2. Ergebnisse

Die Minimalkonzentrationen mit inhibitorischer

Wirkung ergaben sich gemäß der folgenden Tabelle (unter minimaler Inhibitorkonzentration versteht man die minimale Konzentration, die das Wachstum von Keimen unter Versuchsbedingungen verhindert).

Keimart	Neomycin trisulfat	Neomycin-hexa- methannatrium- sulfinat
45 E. CoIi 8018 E. CoU 8001 Klebsiella pneumoniae 8034 Klebsiella pneumoniae 8019 5o Pasteurella multocide 8089 Proteus vulgaris 8079 Staphyloccus 8026	12,8 34,5 4,8 5,5 9 15 34,5 12,8	20 *) 8,5 8,5 15 20 75 15

*) Kein zuverlässiges Ergebnis, denn es fanden sich Gläser mit ausgesprochenen inhibitorischer Wirkung, die von anderen Gläsern umgeben waren, in denen ein Keimwachstum erfolgte.

3. Folgerungen

Die antibakteriellen Wirkungsbereiche der beiden Produkte sind bei den für die Untersuchung verwendeten Keimen identisch. Die Wirksamkeiten liegen in der gleichen Größenordnung, wenn man sie auf jeweils gleiches Gewicht des Ausgangsproduktes bezieht.
B e i s ρ i e 1 2

72,5 g des basisch reagierenden Neomycinsalzes, das durch Behandlung des Neomycinsulfats mit

609 568/558

Bariumcarbonat erhalten wurden, wurden in 720 cm³ Wasser gelöst. Zu der so gebildeten Lösung wurden 83,14 g Natrium-hydroxymethansulfinat hinzugegeben. Die Mischung wurde während 20 Stunden bei Umgebungstemperatur ständig gerührt, dann durch Zugabe von 5 g Aktivkohle entfärbt. Schließlich wurde die Lösung in das 5fache Volumen Methanol eingegossen. Der sich daraufhin bildende Niederschlag wurde im Trockenofen unter Vakuum getrocknet. Er zeigt die gleichen kennzeichnenden Eigenschaften wie der im Beispiel 1 gewonnene Stoff.

Beispiel 3

15 g Neomycinbase, das dadurch erhalten wurde, daß man eine Lösung von Neomycinsulfat durch Anionentauscherharze hindurchlaufen ließ, wurden in 150 cm³ Wasser gelöst. Zu der so erhaltenen Lösung wurden 14,6 cm³ 30%iges Formaldehyd und 15,18 g Natriumbisulfit, gelöst in 33 cm³ Wasser, zugegeben. Es wurde während 18 Stunden gerührt, dann mit 4 g Aktivkohle behandelt und schließlich die Lösung lyophilisiert.

Das Endprodukt ist das Neomycin-hexamethannatriumsulfonat, ein weißes, wasserlösliches Pulver, das in Methanol, Äthanol und Äther unlöslich ist. [α]!,⁰ = 36°, in l%ig^er wäßriger Lösung (bezogen auf das wasserfreie Produkt);

Analyse:

Berechnet
gefunden

Na 10,5%;
Na 11,15%.

Beispiel 4

30

35

Na 10,5%;
Na 11,0%.

Beispiel 5

Es wurden 6,5 g Framycetinbase durch Behandlung von Framycetinsulfat mit Bariumhydroxyd gewonnen und in 70 cm³ Wasser gelöst. Zu der so erhaltenen Lösung wurden 7,45 g Formaldehydnatriumsulf oxylat hinzugegeben. Die Lösung wurde 20 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt, dann mit 4 g Aktivkohle behandelt und lyophilisiert.

Analyse:

Berechnet .
gefunden .

45 5fache Volumen an "Methanol zugegeben. Der dabei ausfallende Niederschlag wurde ausgeschleudert und im Trockenofen unter Vakuum getrocknet. ₅ ,

Das erhaltene Produkt, das Kanamycin-tetramethannatriumsulfinat entspricht der Summenformel:

C₂₂H₄₀N₄O₁₉S₄Na₄;

das Molekulargewicht ist 884,5.

Das spezifische optische Drehungsvermögen des bei diesem Beispiel erhaltenen Produktes ist in l%iger wäßriger Lösung [a]|° = 80°.

Das Infrarotspektrum des Produktes zeigt bei folgenden Wellenzahlen (in cmr¹) Absorptionsbanden: 3330, 1630, 1045, 950.

Die Titration des Kanamycin-tetramethannatriumsulfinats ergab 510 mcg/mg.

Die akute Toxizität des Produktes wurde auf intravenösem Wege bei weißen Mäusen von 20 g Körpergewicht im Vergleich zu der des Kanamycinmonosulfats und einer unmittelbar vor Applikation hergestellten Mischung aus Kanamycinmonosulfat und Natrium-hydroxymethansulfinat (Molverhältnis 1:4, d. h. in demjenigen Verhältnis, in dem diese Stoffe in das neue Kondensationsprodukt eintreten) bestimmt.

Die Injektionen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen stets mit einem gleichen Volumen von 0,5 ml vorgenommen.

. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Es wurden 25 g des Monosulfats des Kanamycins mit 8,3 g Bariumcarbonat in 250 cm³ Wasser behandelt. Man erhält so 20 g basisch reagierendes Kanamycinsalz in Lösung. Zu dieser Lösung wurden 19,5 g Natrium-hydroxymethansulfinat hinzugegeben. Die Lösung wurde unter Rühren 10 Stunden bei Umgebungstemperatur gehalten und anschließend mit 8 g Aktivkohle behandelt. Schließlich wurde das

Dosis in Milligramm	Mortalität von je zehn Mäusen	Mischung	Kanamycin-
Ausgangsprodukt je		0/10	tetramethan- natriumsulfinat
20 g Maus	Sulfat	6/10
4,75	0/10	8/10
5,42		8/10
5,97	2/10
6,64	3/10	10/10
7,30	6/10	10/10
8,07	9/10
23,70			1/10
30,00			1/10
33,00			3/10
36,00			5/10
39,00		9/10
49K)O

Die unterschiedlichen DL₅₀, angegeben in Milligramm des Ausgangsproduktes je Kilogramm Lebendgewicht sowie die Zuverlässigkeitsgrenzen der DL₅₀ für eine Wahrscheinlichkeit von 95 % wurden nach der Methode
mittelt.

von Spearmann-Karber er-

Teststoff	DL50	Grenzen für W= 95%
Kanamycinmonosulfat Kanamycinmonosulfat (1 Mol) und (4 Mol) Natrium- hydroxymethansulfinat Kanamycin-tetramethannatriumsulfinat Kanamycinmonosulfat-dimethannatriumsulfmat	348 mg/kg 282,3 mg/kg 1887,5 mg/kg 870 mg/kg	333,5 bis 367 mg/kg 264 bis 295,5 mg/kg 1796,5 bis 1984 mg/kg 817 bis 925 mg/kg

Es zeigte sich, daß die Beigabe von Natriumhydroxymethansulfinat zu dem Kanamycinmonosulfat eine leichte Erhöhung der Toxizität ergibt. Im Gegensatz hierzu ist die DL₅₀ des Kanamycin-tetramethannatriumsulfinats fünfmal größer; die akute Toxizität ist also nur ein Fünftel der des Kanamycinmonosulf ats.

Versuche mit diesem Produkt, die mit fünfzehn Ratten während der Dauer von 14 Wochen durchgeführt wurden und bei denen 300mg des Produktes (bezogen auf das Ausgangsprodukt) je Kilogramm und je Tag gegeben wurden, zeigten keine ungünstige Wirkung auf das Wachstum der Versuchstiere; das Produkt erwies sich im Gegenteil auch hier als Wuchsfaktor. Bei der anatomischen und pathologischen Überprüfung am Schluß der Versuche zeigten die fünfzehn Versuchstiere, die mit einer äquivalenten Menge des Kanamycinsulfats behandelt waren, eine akuteEpithel-Nephritismit deutlicher Gefäßerweiterung oder eine konträre Involution und Sklerose der gleichen Gefäße sowie Sklerose um die Glomeruli herum. Die Schäden der Zwischengewebe und der Glomeruli waren irreversibel.

Die mit Kanamycin-tetramethannatriumsulfinat behandelten Tiere zeigten eine Erweiterung der umgebenden Nierengefäße ohne Schädigung des Epithels, des Zwischengewebes und der Glomeruli. Die beobachteten Modifikationen waren nur sehr selten und reversibel.

Die antibakterielle Wirksamkeit des Kanamycintetramethannatriumsulfinats wurde mit der des Kanamycinmonosulfats verglichen. Die Bestimmung der

ίο kleinsten inhibitorisch wirkenden Konzentration der beiden Produkte erfolgte nach der Methode der serienweisen Verdünnungen in Nährbouillon; der Versuch wurde mit achtzehn unterschiedlichen Keimen durchgeführt.

Der Nährboden wurde gewonnen, indem man von einer Vorkultur in Nährbouillon ausging, die 20 Stunden bei 37°C als statische Kultur bebrütet wurde. Die Anzahl der Keime in jeder Vorkultur wurde nach der Methode von Mac C r a d y errechnet und auf einen Wert von 10³ je Milliliter gebracht. Die Lösungen erfolgten in sterilem, mineralfreiem Wasser.

Keime

Inhibitorische Minimalkonzentration

Kanamycin-mono-	Kanamycin-tetramethan-
sulfat	natriumsulfinat
25	25
25	25
12,8	25
3,2	3,2
3,2	. 3,2
1,6	1,6
12,8	25
25	25
12,8	6,4
3,2	3,2
6,4	3,2
100	100
100	100
25	25
6,4	6,4
6,4	6,4
12,8	12,8
6,4	12,8

Escherichia coli 8018

Escherichia coli 8001

Escherichia coli 8098

Klebsiella pneumoniae 8019 ..
Klebsiella pneumoniae 8022 ..
Klebsiella pneumoniae 8034 ..

Proteus vulgaris 8079

Proteus vulgaris 8138

Salmonella pullorum 8091 ...
Sahnonella Gallinarum 8092 .
Pasteurella multocida 8089 ...
Pseudomonas aeruginosa 8003
Pseudomonas aerugingsa 8004
Pseudomonas aeruginosa 8101

Staphylococcus 8026

Staphylococcus aureus 8140 ..

Enterococcus 8085

Bacillus subtilis 8035

Bei gleichen Ausgangsbedingungen sind die geringsten, inhibitorisch wirkenden Konzentrationen der beiden miteinander zu vergleichenden Stoffe bei vierzehn Keimen einander gleich. Die Abweichungen bei vier Keimen sind niemals größer als einem Faktor 2 (bedingt durch die Verdünnungsstufen) entsprechend und sind infolgedessen nicht als bezeichnend anzusehen.

Beispiel 6

Es wurden 18,3 g basisch reagierendes Dihydro-. streptomycinsalz durch Behandlung von Dihydrostreptomycinsulfat mit Bariumcarbonat in 100 cm³ Wasser hergestellt. Zu der dabei gebildeten Lösung wurden 11,7 g Natrium-hydroxymethansulfinat hinzugegeben. Der Ansatz wurde während 20 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, dann die Lösung mit 5,5 g Aktivkohle behandelt und in das 5fache Volumen Methanol geschüttet. Der sich bildende Niederschlag wurde ausgeschleudert und in einem Trockenofen unter Vakuum getrocknet. Das so erhaltene Produkt, das Dihydrostreptomycin-trimethannatriumsulfmat, entspricht der Summenförmel:

C₂₄H₄₄N₇O₁₈SgNa₃;

das Molekulargewicht ist 884. [φ° = —71°,inl°/_oiger wäßriger Lösung (bezogen auf das wasserfreie Produkt).

Die Überprüfung des antibakteriellen Wirkungsbereiches dieses neuen Derivates erfolgte im Vergleich mit dem Dihydrostreptomycinsesquisulfat an zwanzig sehr unterschiedlichen Mikrobenstämmen und brachte das Ergebnis, daß die Wirkung dieser beiden Verbindungen gegenüber den für die Prüfung verwendeten Keimen identisch ist, daß also bei dem neuen Derivat die antibakterielle Wirkung der Ausgangssubstanz voll erhalten bleibt.

Bei Versuchen zum Schutz infizierter Tiere, die durch Impfen an der Maus mit zwei Keimarten durchgeführt wurden, Klebsiella pneumoniae und Escherichia Coli,

hat das Dihydrostreptomycin-trimethannatriumsulfinat die gleiche Schutzwirkung wie das Dihydrostreptomycinsesquisulfat.

Die akute Toxizität wurde an der Maus und dem Meerschweinchen untersucht. Insbesondere die Versuche an der Maus mit intravenöser Applikation haben überraschende Wirkungen der Entgiftung gemäß der vorliegenden Erfindung gezeigt, wobei der Vergleich durchgeführt wurde mit Dihydrostreptomycinsesquisulfat und mit einer unmittelbar vor Applikation hergestellten Mischung von Dihydrostreptomycinsesquisulfat + Natrium - hydroxymethansulfinat in einem Molverhältnis von 1: 3, d. h. in einem Mischungsverhältnis, bei dem die Komponenten in dem gleichen Verhältnis verwendet wurden, wie sie in das erfindungsgemäße Kondensationsprodukt eintreten.

Die Injektionen erfolgten mit unterschiedlicher Konzentration und mit einem einheitlichen Volumen von 0,5 ml.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Dosis	Mortalität von je zehn Mäusen	Mischung	Dihydrostrep-
in Milligramm			tomycin-tri- methannatrium- sulfinat
Ausgangsprodukt 20 g je Maus	Dinydro- streptomycin- sulfat	1/10
2,75	1/10	4/10
3,00	4/10	7/10
3,30	7/10	10/10
3,60	9/10
3,90			3/10
13,60			4/10
15,00			7/10
16,50		9/10
18,10

Die 50 °/₀-Letaldosen, angegeben in Milligramm des Ausgangsproduktes je Kilogramm Gewicht, sowie die Grenzen der DL₆₀ für eine Wahrscheinlichkeit von W= 95 % wurden nach der Methode von Spearman-K a r b e r wie folgt errechnet:

Teststoff	DL50	Grenzen für W = 95 °/„
Dihydrostreptomycmsesquisulfat Dihydrostreptomycinsesquisulfat + Natrium-hydroxy- methansulfinat (1:3) Dwydrostreptomycin-trimethannatriumsulfinat	154 mg/kg 170,5 mg/kg 765 mg/kg	148 bis 163 mg/kg 155 bis 177,5 mg/kg 725 bis 805,5 mg/kg

Man sieht, daß die DL₆₀ der Mischung nicht wesentlich von der des Dihydrostreptomycinsesquisulfats abweicht. Das Toxizitätsverhältnis zwischen dem erfindungsgemäß hergestellten Derivat und dem Sulfat des Dihydrostreptomycins ergibt sich als reziproker Wert des Verhältnisses der DL₆₀ zu etwa 0,2, d. h. die Toxizität vermindert sich auf einen Wert von etwa einem Fünftel der Grundsubstanz.

Bei subkutaner Injektion haben die DL₅₀, die an drei Gruppen von neunzig Mäusen ermittelt wurden, die folgenden Werte:

a) Dihydrostreptomycinsulfat 1487,5 mg/kg

b) Mischung aus Dihydrostreptomycinsesquisulfat + Natriumhydroxymethansulfinat 1524 mg/kg

c) Dihydrostreptomycin-trimethannatriumsulfinat 3380,5 mg/kg

Ein Versuch mit subkutaner Applikation an einer Gruppe von fünfzehn Ratten, der 13 Wochen dauerte und bei dem eine Dosis von 600 mg/kg (angegeben in der Menge der Grundsubstanz) täglich verabfolgt wurde, hat keine nachteilige Einwirkung auf das Wachstum der Versuchstiere gezeigt, sondern im Gegenteil eine schnellere Gewichtsvermehrung ergeben, als die bei denjenigen Tieren beobachtet werden konnten, die unbehandelt blieben.

Bei einer anatomisch-pathologischen Überprüfung nach Beendigung des Versuches zeigten die fünfzehn Vergleichstiere, die mit einer äquivalenten Dosis von Dihydrostreptomycinsulfat behandelt wurden, einige geringfügige Nierenschäden und leichte Gewebeinfiltrationen. Die mit Dmydrostreptomycm-trimethannatriumsulfinat behandelten Tiere zeigen eine völlige Unversehrtheit der lomeruli und des Epithels. Auf pharrnakologischem Sektor ergibt das Dihydrostreptomycin-trimethannatriumsuMnat Reaktionen der Herzgefäße, der Muskeln und der Atmungsorgane, die 2- und 5fach geringer sind als bei der gleichen Dosis von Dihydrostreptomycinsesquisulfat.

Beispiel 7

Es werden 34 g Dihydrostreptomycinsulfat in 70 cm³ mineralfreiem Wasser gelöst. Zu der Lösung werden 13,7 g Bariumcarbonat hinzugegeben. Nach 3- bis 4stündigem Rühren wird die Lösung filtriert. Zu der klaren Lösung werden 38,5 cm³ einer Natriumbisuffitlösung von 28° Baumo und sodann 4,65 cm⁸ einer 30°/oigen Formaldehydlösung hinzugegeben und dann das Ganze unter Rühren 20 Stunden lang auf der Umgebungstemperatur gehalten. Die Lösung wird sodann mit 1,2 g Aktivkohle behandelt, anschließend durch das öfache Volumen von Methanol die Fällung durchgeführt. Der Niederschlag wird ausgeschleudert und in einem Trockenofen unter Vakuum getrocknet. Das gewonnene Produkt,-das Dihydrostreptomycintrimethannatriumsulfonat, entspricht der Summenformel:

C₂₄H₄₄N₇O₂₁S₃Na₃;

sein Molekulargewicht ist 932. [a]² _D ⁰ = —66°, in l%iger wäßriger Lösung (bezogen auf das wasserfreie Produkt).

Beispiel 8

In 150 cm³ Wasser werden 20 g Kanamycinmonosulfat gelöst. Zu der Lösung werden 6,7 g Bariumcarbonat hinzugegeben. Nach 4stündigem Rühren wird von dem inzwischen gebildeten Niederschlag abgetrennt. Zu der klaren Lösung werden 43,8 cm³ einer Natriumbisulfitlösung von 28°Baum£, sodann 12,3 cm³ einer 30%igen Formaldehydlösung zugegeben. Die Lösung wird mit Ig Aktivkohle behandelt und dann durch Zugabe des 6f achen Volumens an Methanol einer Ausfällung bewirkt. Der durch Schleudern von der Flüssigkeit getrennte Niederschlag

Yl 18

wird im Trockenschrank unter Vakuürh getrbck- erhältlich sind. Die DurchfluBmenge wird derart

met. geregelt, daß der pH-Wert der abfließenden Lösung ini

Das so erhaltene Produkt, das Kanamycin-tetra- Bereich von 7,5 liegt. Die die Kanamycin-dimethan-

methannatriumsulfonat, entspricht der Summenforrnel sulfinsäure enthaltende Lösung, deren Konstitution

r « M-n ς Wn · ⁵ der Formel (2) entspricht, wird zunächst mit Aktiv-

sein Molekulargewicht ist 948,5. · Das Infrarotspektrum des Produktes zeigt PCo-

Das Infrarotspektrum des Produktes zeigt bei sorptiönsbanden bei den folgenden WeHenzahlen

den folgenden WeHenzahlen (in cm-¹) Absorptions- (in cm-¹): 3330,1630,1515,1145,1040, 950.
banden: 3330, 1630, 1185, 1045. io . ^!

Beispiel 9 ' Beispiel 12

■ Es werden 50-g Kanainycinmonösulfät in 400 cm³ Es werden 146 g Kanamycinmonosulfat in 1000 cm^ entmineralisiertem Wasser gelöst und zu der Lösung ntineralfreiem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung gibt unter Rühren 20,3 g Natrium-hydroxymethansulfinat 15 man unter Rühren 59 g Natrium-hydroxymethansulfl·· (bezogen auf das reine trockene.Produkt) und 2 g öat (reines trockenes Produkt) hinzu. Die Mischung Aktivkohle hinzugegeben. Die Reaktionsmisehung wird — vor Licht geschützt — 12 Stunden lang bei wird während 8 Stunden unter Rühren sich selbst Umgebungstemperatur bewegt, und danach werden überlassen. Sodann wird gefiltert, um die Kohle zu 68,7 g Bariumacetat (mit einem Molekül .Wasser) entfernen und das Monosulfat <fes 'Kanamycin- ab hinzugegeben. Es wird, dann weiter 3 bis 5 Stunden rN^'-dimethannätriumsulfumts, das sich inzwischen lang gerührt und sodann das dabei gebildete Bariumgebildet hat, durch Zugabe des 5fach'erf Volumens an sulfat abfiltriert. Die Lösung wird mit 4 g Aktivkohle Methanol aus der Lösung ausgefällt, , Der weiße behandelt, die Kohle wieder entfernt und die Kana-Niederschlag wird gewaschen, ausgeschleudert und im mycin-dimethansulfinsäure durch Methanol gefällt, Trockenofen unter Vakuum getrocknet. ^ in dem'das Natriumacetat gelöst bleibt., .";.,

Das spezifische optische Drehungsvermögen dqs Das spezifische optische Drehungsvefmög'en des

Produktes in l°/piger wäßriger Lösung ist [a]f = 90°. erhaltenen Produktes ist in l%iger, wäßriger,Lösung:

Das Infrärotspektrum' des Produktes' weist bei (ix]f^= 109°. . '...'!

den folgenden Weilenzahlen (in cm"¹) Absorptions- . , ."."'"".''*

banden auf: 3330, 1630, 1515, 1115, 1040, 950. 30 ; Beispiel 13 . ./ ί

Beispiel 10 ' 58,l,g Kanamycinmonosulfat.werden,in''450CnI*

^: '58;i g '-Kanamycinmonosulfat werdett' in '400 cm³ mmeraKreiem Wasser gelöst, zu dieser Lösung werden

ÄineraUr'eiem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wird 67,9' cm³ Natriumbisumt von 28°Baumo und 2Öcm^

eine ' Mischung aus 67_ä9cm³ Natriumbisulfit von äs einer 3O°/₀igen Formaldehydlösung hinzugegeben. Es

28° Baum^ und 20 cm^s einer 30%igen- Formaldehyd- wird — vor Licht geschützt — während 12 Stunden be^

lösung zugegeben. Die ^Mischung wird* —' vor Licht Umgebungstemperatur geruhet. Dann wird die Lösung

geschützt. — während 10 Stunden bei Umgebungs- durch eine Säule hindurchgeleifet, die eine innige

temperatur gerührt. - ' ' ' '.'. Mischung der »Amberlite«®-Harze IR, 45. (400Qm^a^

Sodähn-werden 2 g Aktivkohle hinziigegeben, ein 40 Anionenaustauscher,OH-7Form)undIR.120(200cm³;

pH-Wert voh 7,5 eingestellt und^; fiÜtriert. Die klare Kationenaustauscher, H⁺-Form) enthält. Die Durch-

Lösung wird lyöphilisiert. Das erhaltene Produkt, das flußmenge wird derart geregelt, daß der pH-Weft

Monosulfat des Kanamycin-NjN-'-dimetäannatrium- der ausfließenden Lösung, etwa bei 7,5 liegt. Die so

sulfonats, zeigt sich in Form eines weißen Pulvers, behandelte Lösung, die die Kanamycin-dimethan-

dasin Wasser löslich, in MetKanol," Äther und Äthanol 45 sulfonsäure enthält, ■ wird zunächst mit 2,5gAktiv-

jedoch unlösüch ist. Summenforniel: kohle behandelt und dann das Derivat durch das

r n \rn sw u cr> 5fache Volumen an Methanol ausgefällt.

^20"38JN₄Oi₇O₂Na₂ · Ji_aby-4·; ^ Infrarotspektrum des Produktes zeigt Ab-

[&] ²S = 86°. ' sorptiönsbanden bei den folgenden WeHenzahlen

. , ■ . 50 (in cm-¹): 3330, 1630, 1505, 1040. " -

Analyse: ^J -

Berechnet .... Na 5,6 %> S 11,8.%;. Beispiel .14 , . '

gefunden .... Na6,02%, S 10,9%. . ..

."...-.· 'Es werden 58,1g KanamycinmonosuKat in 40Ocm⁸

Beispiel 11 55 mineraKreiem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wird

eine Mischung aus 67,9 cm³ Natriumbisulfit von

50 g Kanamycinmonosulfat werden in 480 cm³ 28° Baume und 20 cm³ einer 30%ig^en Formaldehyd-

mdneralfreiem Wasser gelöst. Zu dieser Lösung werden lösung zugegeben.. Die Mischung wird —■ vor Licht

unter Rühren 20,3 g Natrium-hydroxymethansulfinat geschützt — während 10 Stunden bei Umgebungs-

(berechnet nach wasserfreiem Produkt) zugegeben. 6b temperatur in Bewegung gehalten. Dann gibt man zu

Die Lösung wird — vor Licht geschützt — bei Um- der Lösung 27,3 g Bariumacetat (mit 1 Molekül

gebungstemperatur 10 Stunden unter gelegentlichem Wasser) hinzu. Nun wird 3 bis 4 Stunden gerührt und

Rühren sich selbst überlassen und sodann durch eine das ausgefällte Bariumsulfat abfiltriert. Die klare

Säule hindurchgeleitet, die Ionentauscherharze der Lösung wird mit dem 5fachen Volumen Methanol

Type »Amberlite«® enthält, und zwar eine innige 65 versetzt, wobei die Kanamycin-dimethansulfonsäure

Mischung der Harze, die unter den Kennbezeichnungen . ausgefällt wird. Das ausgefällte weiße Produkt wird ab-

IR. 45 (300 cm³; Anionenaustauscher, OH~-Form) geschleudert, mit etwas Methanol gewaschen und hn

und IR. 120 (150cm³; Kationenaustauscher, H+-Form) Trockenofen unter Vakuum getrocknet.

,....Na/5,670,. S 11,87ο;
... Na5,S%; S 11,1.%.

Beispiel 16

C₂₈H₄₂N₄O₁₇S₂Na₂;

; Das spezifische. optische Drehungsvermögen des Produktes ist in l%iger wäßriger Lösung [«]!? = 105°.

Beispiel 15 ' -■.

20 g Kanamycinmonosulfat werden in 125 cm³ mineralfreiem Wasser, gelöst. Zu dieser Lösung werden 10,5 g Natriymrhydroxymethansulfonat hinzu_r gegeben. Die Mischung.wird unter Rühren während 10 Stunden einer Reaktion überlassen. Dann fügt man 0,5 g Aktivkohle hinzu, läßt unter Rühren noch 1 Stunde stehen und filtriert. Der pH-Wert der Lösung, .wird auf 7,3 eingestellt und sodann das 4fache Volumen von Methanol zugegeben/Das erhaltene Produkt, das Monosulfat des Kanamycin-dimethannatriumsulfonats, wird gewaschen, abgeschleudert und im Trockenofen unter Vakuum getrocknet....

Analyse: ' "y"" ' ■ " ".

' Berechnet
gefunden

io

15 KanamycmpTNi-N'-dibutansulfonsäure erhalten. Der biologische Titer ist 620mcg/mg; die DL₅₀ bei der Maus ist 620mg/kg.. · -...-. ..·...

Summenförmei:' · ...··.,., ...

C₂₆Hs₀N₄O₁₇S₂Na₈;
Analyse ι '. . . . : :.·■■■..

^;" Berechnet'':"... Na 5,75%, S 7,99%;
^:v gefunden'-.'.".. Na 5,98%, S 8,50%. '

B e i s ρ i e 1 19

Zu 133 ecm einer wäßrigen Lösung des basischen Kanamycins, die 182,65 mg/cm³ der Kanamycinbase enthält, werden·^ g Acetaldehyd und 20,8 g Natriumbisulfit hinzugegeben. Der Ansatz wird unter Rühren Stunden auf 40⁰C gehalten. Anschließend wird mit Kohle behandelt, gefiltert und das Filtrat lyopbilisiert. Das Natriumsalz.der Kanamycino-N.,N',N'',N'"-tetraäthansulfonsäure, das,, sich dabei' bildet, hat-«inen biologischen. Titer von 3OQ mcg/mg. und eine DL₅₀ bei. der Maus von 545 mg/kg.

Summenf ormel:'

Zu einer wäßrigen Lösung, die. 24,2 g Kanamycin- as ,base (J/₂₀Mol) enthält und auf einen pH-Wert von 10 eingestellt ist, werden·;; 4,4 g (Υ_ασΜο1) Acetaldehyd und 10,4 g (V₁₀ MoI)'' Natriumbisulfit hinzugegeben. Man hält die Mischung — die durchgerührt wird — während 16 Stunden .auf .einer Temperatur in der Größenordnung von 35 bis 40⁰C. Dann behandelt _:man mit Kohle (2 g),, filtriert.und..lyophilisiert das .erhaltene Filtrat. Das.'.so gewonnene Derivat, das Natriumsalz der Kanämycino-NjN'-diäthansulfonsäure, besitzt einen biologischen Titer von 660 mcg/mg; dies bedeutet, das 1mg des filtrierten Salzes bzw. Derivats eine Aktivität äquivalent 660 meg der Base aufweist. Die DL₅₀ bei der Maus ist 990 mg/kg.

Summenformel:

Analyse:

Berechnet ...
gefunden ...

Analyse:

Berechnet.,.,
gefunden ...

_; C₂₈H₄₈N₄O₂₃S₁Na₄;

Na 9,16%, S 12,74%;
Na 9,30%, S 13,01%.

Claims (2)

Patentanspruch: 40 45 Na 6,2%, S 8,6%; Na 6,5%, S 8,8%. Beispiel 17 In diesem Beispiel wurde in der gleichen Weise gearbeitet wie im Beispiel 16, die 4,4 g Acetaldehyd wurden jedoch durch 5,8 g Propionaldehyd ersetzt. Das Verfahrensprodukt, das Natriumsalz der Kanamycino-N,N'-dipropansuhOnsäure, hat einen biologischen Titer von 615 mcg/mg; die DL50 bei der Maus ist 615 mg/kg, Summenförmei: Analyse: Berechnet gefunden C24H46N4O17S2Na2; Na 5,95%,'S 8,28 70; Na 6,03 V0, S 8,41%. Beispiel 18 60 , Unter den gleichen Verfahrensbedingungen wie oben, aber mit Verwendung von 7,2 g Butyraldehyd an Stelle des Acetaldehyde wurde das Natriumsalz der 65 Verfahren zur Herstellung der N-Alkansulfon- oder N-Alkansulfinsäuren von Neomycin, Framycetin, Dihydrostreptomycin oder Kanamycin und deren Salzen, die weniger, toxisch als die entsprechenden Antibiotica sind, dadurch gekennzeichnet, daß man die genannten Antibiotica in Form der freien Basen oder von Salzen der Base mit einer schwachen Säure oder von Salzen, bei denen die freien Aminogruppen der Base teilweise als Sulfat oder Hydrochlorid gebunden sind, in an sich bekannter Weise in. wäßriger Lösung mit einem Salz einer «-Hydroxyalkansulfonsäure oder <%-Hydroxyalkansulfinsäure oder mit Verbindungen, die ein solches Salz unter den Reaktionsbedingungen in situ bilden, bei Temperaturen von 15 bis 45°C unter ständigem Rühren 1 bis 24 Stunden umbesetzt und entweder a) die gebildeten Salze der N-Alkansulfon- oder -sulfinsäuren der genannten Antibiotica in an sich bekannter Weise durch Gefriertrocknung oder Ausfällen mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, in dem das Verfahrensprodukt unlöslich ist, gewinnt oder b) für den Fall, daß von einem partiellen Sulfat oder Hydrochlorid des Antibioticums ausgegangen wurde, die wäßrige Lösung des gebildeten Salzes entweder

1. gleichzeitig über einen Kationen- und einen Anionenaustauscher leitet oder

2. einer doppelten Umsetzung mit einem Salz unterwirft, dessen Kation mit dem Sulfat- oder Hydrochloridrest der Aminogruppe ein unlösliches Salz bildet und dessen Anion mit dem Kation des Salzes der Alkansulfon- oder -sulfinsäure ein

Salz bildet, das in dem zur Ausfällung der Alkansulf on- oder -suMnsäure verwendeten Lösungsmittel löslich ist, und die auf diese Weise von Sulfat-, Chlorid- und Metall-ionen befreiten, freien N-Alkansulf on- oder -sulfinsäuren der genannten Antibiotica, wie unter a) angegeben, gewinnt.

In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Auslegeschrift Nr. 1 021 363; französische Patentschrift Nr. 1 031 467; USA.-Patentschrift Nr. 2 791 531; Houben — Weyl, Methoden der organischen Chemie, Bd. 11, Teil 3 (1958) S. 92 bis 96; J. Amer. ehem. Soc, Bd. 71 (1949), S. 522 bis 526.

Bei der Bekanntmachung der Anmeldung sind zwei Prioritätsbelege ausgelegt worden.

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