DE2130113B2 - Gentamicin B, Gentamicin B1 und Gentamicin X, Verfahren zu deren Gewinnung und diese Gentamicine enthaltende pharmazeutische Zubereitungen - Google Patents

Gentamicin B, Gentamicin B1 und Gentamicin X, Verfahren zu deren Gewinnung und diese Gentamicine enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

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DE2130113B2 DE2130113A DE2130113A DE2130113B2 DE 2130113 B2 DE2130113 B2 DE 2130113B2 DE 2130113 A DE2130113 A DE 2130113A DE 2130113 A DE2130113 A DE 2130113A DE 2130113 B2 DE2130113 B2 DE 2130113B2
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Description

mit folgender Zuordnung R'\ R2 und ]
Gentamicin B Gentamicin U, Gentamicin X
IO
15
20
25
30
OH H NH2
OH CH3 NH2
NH H OH
und deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze, Hydrate und Solvate.
2. Äthansolvate der Verbindungen gemäß Anspruch 1.
3. Verfahren zur Gewinnung von Gentamicin B, Gentamicin B1 und Gentamicin X gemäß Anspruch 1 aus einem auf mikrobiologischem Wege erhaltenem Gemisch von Gentamicinen durch Adsorption an und Desorption von einem schwach sauren Kationenaustauscher und anschließende Abtrennung einer Teilmenge von Gentamicin C, dadurch gekennzeichnet daß man das so erhaltene Gentamicin-Gemisch in der unteren Phase eines Lösungsmittelsystems, das aus Methanol, Chloroform und konzentriertem wässerigen Ammoniak im Volumenverhältnis 1:1:1 besteht löst, die Lösung an Silikagel chromatographiert, das Silikagel mit diesem Lösungsmittelsystem eluiert und die Gentamicine B, B< und X aus den jeweiligen Fraktionen gewinnt.
4. Pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch I zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.
Gewinnung wnd diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen,
Pie Antibiotika können durch den for die Herstellung von Gentamycin bekannten Fermentationsprozeß erhalten werden, Die Herstellung, Isolierung und Reinigung v<w Gentamycin wird in der US-PS 30 91572 beschrieben, Gentamycin, nun als Gentamicin bekannt, ist in dieser US-PS als Hauptkomponente beschrieben und wird darin als C-Komponente oder Gentamicin C bezeichnet In der Patentschrift werden auch die neben Gentamicin C hergestellten Antibiotika BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B) erwähnt, die als Gemisch einen niedrigen Grad von antibakterieller Aktivität zeigen und von Gentamicin C getrennt worden sind.
Durch die Verwendung von speziellen chromatographischen Systemen, die später beschrieben werfen, würfe festgestellt, daß die Substanzen, die in der US-PS 30 91 572 als Antibiotikum BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B) bezeichnet wurden, kein einheitliches Material darstellen, sondern zusammen aus einer Mischung von wenigstens 4 Komponenten bestehen. Es wurde gefunden, daß jede der Komponenten überraschende und unerwartete Anwendungsmöglichkeiten bietet
Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X sind zuvor nie voneinander getrennt worden. Es konnte festgestellt werfen, daß diese Substanzen wertvolle Eigenschaften als Antibiotika aufweisen, aber auch als Anthelminthika und als Mittel gegen Protozoen sind. Die Antibiotika Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X zeigen merklich reduzierte Nebeneffekte. Daher ist es vorteilhaft, Gentamicin B und Gentamicin Bi für länger dauernde Behandlungen von bakteriellen Infektionen einzusetzen. In der Behandlung von Helminthiasis, die durch bakterielle Infektionen oder das Auftreten von Protozoen erschwert ist kann die Anwendung der Antibiotika Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X ebenfalls sehr nützlich sein.
Die Antibiotika Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X sind einander strukturell ähnlich, wie durch Formel (I) gezeigt wird, die die planare Struktur der Verbindungen zeigt:
HO
H3CNH OH \ NH2
HO-<S (I)
R2CHR1
HO
HO
Die Erfindung betrifft neue Aminoglykosidantibioti-
ka, genannt Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentami- Gentamicin B
ein X, deren pharmazeutisch annehmbare Säureaddi- Gentamicin Bt
tionssalze, Hydrate und Solvate, ein Verfahren zu ihrer Gentamicin X
OH H NH2
OH CH3 NH2
NHj hl OH
Nach den neuesten Erkenntnissen der Forschung kann nunmehr mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit die Stereochemie der erfindungsgemäßen Verbindungen angegeben werden. Die Formel, umfassend die Stereoisomeren, ist wie folgt:
HO
H3C
NH2
NH2
Die Verbindungen dieser Erfindung bilden leicht Hydrate und Solvate, die sehr schwer zu breciren sind Daher basieren die physikalischen Konstanten von Gentamicin B und Gentamicin Bi auf den verhältnismäßig stabilen Hydraten oder Solvaten. Ferner muß berücksichtigt werden, daß, obwohl Gentamicin B] kristalline Solvate mit Äthanol bilden, diese keine reproduzierbaren Schmelzpunkte zeigen, sondern erweichen und gelegentlich viskose Flüssigkeiten über einen ziemlich breiten Temperaturbereich bilden.
Gentamicin X wurde bisher noch nicht in kristalliner Form erhalten. Es wird in Form einer weißen amorphen festen Substanz isoliert, die ebenfalls keinen bestimmten
Schmelzpunkt aufweist Die folgende Tabelle I enthält die physikalischen
Eigenschaften der hierin beschriebenen Antibiotika: (Alle Werte für Sauerstoff wurden als Differenz ermittelt)
Tabelle 1 Elementaranalyse Analysen
wert 		= 47,78
= 8,38
= 10,59
= 33,25 		+ 155°
(C = 0,3/H2O) 		Sulfat 30,35
6,59
7,49
8,48 		+ 116°
(C = 0,3/H2O)
Physikalische Konstanten berechneter
Wert·) 		C
H
N
O 		= 48,58
= 8,56
= 10,52
= 32,44 		+ 161°
(C = 0,3/H2O) 		31,26
6,83
7,34
8,72 		+ 117°
(C = 0,3/H2O)
Verbindung C = 47,70
H = 8,41
N = 10,60
O = 33,29 		C
H
N
O 		= 43,54
= 7,22
= 9,90
= 39,34 		+ 154°
(C = 0,3/H2O) 		31,96
6,57
8,64
8,70 		+ 121°
(= 0,3/H2O)
C = 47,22
H = 8,34
N = 10,41
O = 34,03 		C
H
N
0
Gentamicin B
berechnet für
C18H38N4O10-C2H5OH 		Analysen
wert
Gentamicin B1
berechnet für
C20H40N4O1O-C2H5OH 		C =
H =
N =
S =
Gentamicin X
C 19H38N4O ίο 		C =
H =
N =
S =
C =
H =
N -
Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X haben charakteristische Infrarotabsorptionsspektren in Mineralöl (Nujol), entsprechend den F i g. 1 (Gentamicin B), 3 (Gentamicin Bi) und 5 (Gentamicin X). Diese Spektren wurden mit den entsprechenden Solvaten der Antibiotika aufgenommen.
Diese Antibiotika haben auch charakteristische magnetische Kernresonanzspektren (NMR-Spektren), die in F i g. 2 (Gentamicin B), F i g. 4 (Gentamicin Bi) und Fig.6 (Gentamicin X) gezeigt werden. Alle NMR-Spektren wurden mit den freien Antibiotikabasen aufgenommen. Die Proben von Gentamicin X lagen jedoch in der hydratisierten Form vor und die von Gentamicin B und Gentamicin Bi in der Form von Äthanolsolvaten. Diese Spektren wurden mit einem Varian A-60-A SpeKtrometer mit ungefähr 0,4 ml einer Lösung, deren Konzentration ungefähr 20 mg/ml des Antiobitikums im Deuteriumoxid (D2O) betrug, aufgenommen. Die Spektren sind in ppm bezogen auf das Natriumsalz von 3-(Trimethylsilyl)-propansulfonsäure als internem Standard aufgezeichnet worden.
In der folgenden Tabelle il werden die charakteristischen Absorptionsbanden der F i g. 1,3 und 5 aufgeführt.
Tabelle II
Charakteristische Infrarotabsorptionsbanden (M-S.br)
Bezeichnungen: (Nujol)
M «· mittel; S -= stark; s = sehr; (Nujol)
schw — schwach; br =· breit; (schw, br)
su-Schulter (M)
Sulfat von Gentamicin B (M)
2,95-3,25 μ (Nujol)
3,40 μ (Nujol)
3,51 μ (schw)
4,85 μ (S, ε br)
6,16 μ (schw-M)
6,55 μ (sschw.br)
6,83 μ (schw, br)
7,26 μ
7,75 μ (M-S, br)
8,75 —9,75 μ (Nujol)
10,28 μ (Nujol)
12,95 μ (schw, br)
13,90 μ (M)
Sulfat von Gentamicin Bi (M)
2,95-3,25 μ (Nujol)
3,38 μ (Nujol)
3,50 μ (schw)
4,85 μ (S, s br)
6,16 μ (schw —M)
6,55 μ (schw)
6,83 μ (s - schw,
7,25 μ br)
7,75 μ (schw.br)
8.75-9,75 μ
10,27 μ (S. br)
10,75 μ (Nujol)
13,05 μ (M. br)
(schw, br)
13,90 μ (schw, su)
sulfat von Gentamicin X (M)
3.0-3,3 μ (M)
3,37-3.51 μ (Nujol)
3,65-4.33 μ (Nujol)
4,82 μ (schw — M)
5.94 μ (s-S, br)
6,17 μ (br.su)
6,54 U (schw, br)
6,83 μ (s-schw, br)
7,25 μ (Nujol)
7,75 μ (s—schw)
8,7-10,0 μ
1030 μ
1130 μ
13,03 μ
1330 μ
15,08 μ
Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X enthalten Aminogruppen oder substituierte Aminogruppen, die fähig sind, Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren zu bilden. Wenn solche Salze von mehrbasigen Säuren abgeleitet sind, können diese freie Säuregruppen und/oder Säuregrdppen, die mit anderen Basen neutralisiert sind, wie beispielsweise mit Alkalibasen, enthalten. (Der Ausdruck nichttoxische Salze, der in dieser Beschreibung verwendet wird, bezeichnet Salze, die keinen nachteiligen Nebeneffekt verursachen, wenn sie in üblicher Dosis angewendet werden.) Im allgemeinen können Salze mit anorganischen Säuren gebildet werden, indem man verdünnte Säure (1,0N) zu einer wässerigen Lösung des freien Antibiotikums gibt, den pH-Wert der Lösung auf ungefähr 4,5 einstellt und die so erhaltene Lösung gefriergetrocknet. Dementsprechend können Säureadditionssalze mit Salzsäure,
tu Schwefelsäure, Phosphorsäure usw. gebildet werden, sowie die entsprechenden Alkalisalze von zwei- und dreibasigen Säuren. Im allgemeinen sind die Salze von anorganischen Säuren wassserlöslich, aber im wesentlichen unlöslich in organischen Lösungsmitteln. Jedoch
i) können solche Salze, wie beispielsweise Hydrochloride, eine sehr beschränkte Löslichkeit in polaren organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise in niedrigen Alkoholen, haben. Salze von organischen Säuren, wie Kpicni^iciypicp VQn Käfbcnsäuren eingeschlossen zwei*
2(1 basige Säuren, wie beispielsweise Bernsteinsäure, Weinsäure, Maieinsäure, Fumarsäure, Glutarsäure usw., werden im allgemeinen hergestellt, indem man eine wässerige Lösung des Antibiotikums mit der stöchiometrischen Menge der Säure umsetzt und die so erhaltene
.'τ Lösung entweder gefriergetrocknet oder das Produkt ausfällt. Das Ausfällen kann erreicht werden, indem man ein mischbares organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Methanol oder ähnliches zusetzt. Auch Solvate von Säureaddi-
iii tionssalzen der Antibiotika können hergestellt werden.
Das Verfahren zur Gewinnung der Verbindungen erfolgt aus einem auf mikrobiologischem Wege erhaltenen Gemisch von Gentamicinen. Es umfaßt die Abtrennung einer Teilmenge von Gentamicin C nach
α Adsorption an und Desorption von einem schwach sauren Kationenaustauscher und ist dadurch gekennzeichnet, daß man das so erhaltene Gentamicin-Gernisch in der unteren Phase eines Lösungsmittelsystems, das aus Methanol, Chloroform und konzentriertem
4i) wässerigen Ammoniak im Volumenverhältnis 1:1:1 besteht, löst, die Lösung an Silikagel Chromatographien, das Silikagel mit diesem Lösungsmitteisystem eluiert und die Gentamicine B, Bi und X aus den jeweiligen Fraktionengewinnt.
Ein Gemisch, das Gentamicin B, Gentamicin Bi, Gentamicin X, Gentamicin A und G^.uamicin C enthält, wird durch das Bebrüten von Micromonospora purpurea und Micromonospora echinospora erhalten, wie es in der US-PS 30 91 572 beschrieben wird. Das so erhaltene Gemisch wird vorzugsweise einer Trennung durch Säulenchromatographie unterworfen, wöbe' man die untere Phase eines Losungsmittelsystems, das aus Methanol, Chloroform und Ammoniumhydroxid besteht, als Eluierungsmittel verwendet Vor dem Chromatographieren mischt man gleiche Teile der genannten Lösungsmittel, läßt absetzen und trennt die Schichten. Gentamicin C, das aus 3 Komponenten, nämlich Ci, Ci1 und C2 besteht, wird zuerst eluiert, worauf Gentamicin Bi, Gentamicin X, Gentamicin B und zuletzt Gentamicin A folgen.
Das Trennungsverfahren des Gemisches wird im folgenden genauer beschrieben:
Am Ende der Bebrütung werden die Antibiotika aus der Fermentationsbrühe extrahiert, wobei man den ganzen Antibiotikakomplex aus der Fermentationsbrühe auf einein Kationenaustauscherharz adsorbiert, vorzugsweise auf einem schwach sauren mit Carboxylgruppen (Methacrylsäure-Drvinylbenzol-Copolymeri-
sat). Das Harz wird vorzugsweise in der Ammonium-Form verwendet, und das rohe Antibiotikumgemisch wird mit verdünntem Ammoniumhydroxid eluiert. Das Eluat wird entfärbt, indem man es durch eine Säule leitet, die Aktivkohle oder vorzugsweise ein Anionen- r> austauschharz, insbesondere ein Harz des oben erwähnten Typs, enthält. Für das Entfärben des Eluats von obigem Harz wird vorzugsweise ein stark basischer Anicr.-'naustauscher in der OH-Form verwendet. Nach dem Entfärben wird das Eluat im Vakuum auf eine Lösung, die ungefähr 30 bis 60% Festkörper enthält, konzentriert, und für die Weiterbehandlung bereitgehalten. Zu diesem Zeitpunkt enthält die Lösung alle Antibiotika wie sie durch die Fermentation erzeugt worden sind im wesentlichen in dem Verhältnis, das r> dabei anfällt. Gentamicin C-Komponenten stellen ungefähr 60 bis 80% des Gemisches dar und die neben Gentamicin C erzeugten Antibiotika den Rest. Daher ist es vorteilhaft, wenigstens einen Teil des Gentamicin C abzuscheiden, um die neben Gentamicin C erzeugten .ίρ Antibiotika zu erhalten. Es gibt eine beachtliche Zahl von Harzen, die dafür geeignet sind. Beispiele für solche Harze sind Anionenaustauschharze, wie beispielsweise Amberlit® IRA-400, Amberlit® IRA-401, Dowex® 1-X2 und Dowex® 2-X4. Im allgemeinen sind poröse, stark r> basische Harze des quaternären Amintyps zweckmäßig. Es wird Dowex® 1-X2 in der OH-Form bevorzugt.
Die Komponenten von Gentamicin C werden davon unter Verwendung von deionisiertem Wasser, das einen ungefähren Widerstand von 50 000 bis ungefähr 150 000 κι Ohm aufweist, selektiv desorbiert. Die Säule kann vorzugsweise in Serie geschaltet sein und durch eine Leitfähigkeitsbrücke mit einem automatischen Fraktionssammler verbunden sein, so daß ein scharfer Anstieg der Leitfähigkeit im ausfließenden Lösungsmit- π tel den Fraktionensammler auslöst. Ähnlich wird ein Abfallen der Leitfähigkeit (Ansteigen des Widerstandes) gefolgt von einem scharfen Anstieg der Leitfähigkeit das Sammeln einer neuen Fraktion veranlassen. Die öofgiaii, mit der diese Säule betrieben wird, regelt zu -in einem wesentlicheil Grad die Menge von Gentamicin C. die in dem Grmisch der neben Gentamicin C erzeugten Antibiotika zurückbleibt, und beeinflußt zu einem gewissen Grad die Wirksamkeit der folgenden Säule, die zum Auftrennen der übrigen Antibiotika verwendet ·»> wird.
Die neben Gentamicin C erzeugten Antibiotika werden von der Dowex* 1-X2 Säule eluiert, nach dem die Gentamicin C-Komponenten entfernt worden sind. Das wässerige Eluat wird im Vakuum auf ein geeignetes > <> Volumen eingeengt und gefriergetrocknet. In dieser Stufe ist es vorteilhaft, das Antibiotikagemisch in heißem Methanol zu lösen und abzukühlen, wobei die Lösung gleichzeitig der Luft ausgesetzt wird. Gentamicin A adsorbiert Kohlendioxid aus der Luft, wobei es ein schwer lösliches Karbonat bildet, das aus der Methanollösung auskristallisiert, durch Filtrieren davon abgetrennt und anschließend im Vakuum getrocknet wird. Man konzentriert das Filtrat zu einem Rückstand und löst diesen in ungefähr 3 Volumteilen der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches bestehend aus Methanoi zu Chloroform zu Ammoniumhydroxid im Volumverhältnis 1 :1 :1, auf. Die so erhaltene Lösung bringt man auf eine entsprechend dimensionierte Säule aus vorzugsweise Silikagel auf und eluiert die Säule mit dem oben genannten Lösungsmittelgemisch, wobei man die Durchflußmenge kontrolliert. Gentamicin B und Gentamicin Bi können in kristalliner Form erhalten werden.
indem man die Rückstände der entsprechenden Fraktionen in Äthanol löst, die Lösung im Vakuum zu einem Rückstand einengt, diesen wieder in Äthanol auslöst, die Lösung wieder zu einer kristallinen Suspension einengt. Dieses Vorgehen ergibt im wesentlichen reines Gentamicin B und Gentamicin Bi in Form von Äthanolsolvaten, die ungefähr ein Mol Äthanol pro Mol Antibiotikum enthalten. Gentamicin X wird im allgemeinen als amorphes Produkt erhalten und verhält sich in dieser Beziehung wie die Gentamicin C-Komponenten.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, das gesamte Antibiotikagemisch, das auch die Gentamicin C-Komponenten enthält, der Silikagelchromatographie zu unterwerfen. Aber die so erzielte Trennung ist nicht so scharf wie die Trennung, bei der die Hauptmenge des Gentamicin C und des Gentamicin A abgetrennt werden, bevor die Silikagelchromatographie durchgeführt wird.
Beispiel I
A. Isolierung von Gentamicin C und den neben
Gentamicin C erzeugten Antibiotika aus der
Fermentationsbrühe
Man stellt den pH-Wert der Fermentationsbrühe, die entsprechend dem Verfahren der US-PS 30 91572 erhalten worden ist, mit 6 N Schwefelsäure auf 2,0 ein. Man rührt die Mischung während etwa 30 Minuten, filtriert durch ein entsprechend dimensioniertes Filter, das vorher mit einer etwa 2,5 cm dicken Schicht einer Filterhilfe beschichtet worden ist. Man stellt den pH-Wert des Filtrates mit 6N Ammoniumhydroxid auf ungefähr 7 ein und fügt Oxalsäure zu, bis ein pH-Wert von 4 erreicht ist. Diese Menge von Oxalsäure ist meist ausreichend, um die Kalziumionen in der Fermentationsbrühe als unlösliches Kalziumoxalat auszufällen. Man stellt den pH-Wert mit 6N Ammoniumhydroxid auf ungefähr 7 ein und rührt die Mischung während ungefähr 1 bis 4 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 35°C. Man filtriert die Mischung unter Verwendung eines entsprechend dimensionierten und beschichteten Filters und bewahrt das Filtrat. Man adsorbiert das Antibiotikagemisch an einem schwach sauren Kationenaustauscher mit Carboxylgruppen (Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolymerisat) (Ammonium-Form), indem man ungefähr 10 g Harz pro Liter des ursprünglichen Brühenvolumens einsetzt. Man wäscht das Harz mit deionisiertem Wasser farbfrei und eluiert die Antibiotika mit 2 N Ammoniumhydroxyd und konzentriert das Eluat im Vakuum zu einer Lösung, die ungefähr 50% Festkörper enthält.
B. Abtrennung der Gentamicin C-Komponenten von Gentamicin A, Gentamicin B, Gentamicin Bi und
Gentamicin X
Man bringt 1,3 m3 Dowex« 1-X2 Harz (OH-Form) in eine Chromatographiesäule ein, die 91 cm Durchmesser und wenigstens 244 cm Höhe aufweist und durch eine Leitfähigkeitsbrücke mit einem Fraktionsammler verbunden ist Man pumpt deionisiertes Wasser durch das Harzbett, bis das ausfließende Wasser einen Widerstand von wenigstens 65 000 Ohm hat Man bringt eine wässerige Lösung von ungefähr 1201, die ungefähr 60 kg Festkörper der Verfahrensstufe A enthält auf die Säule auf und adsorbiert das Antibiotikagemisch, wobei man dieses in einer Geschwindigkeit von ungefähr 2 Liter pro Minute durch die Säule leitet Man entwickelt
die Säule mit deionisiertem Wasser bei einer Geschwindigkeit von ungefähr 2 Liter pro Minute und sammelt die Fraktionen entsprechend der Leitfähigkeit der Eluate. Im allgemeinen werden 7 Fraktionen gesammelt, die zwischen ungefähr 14 und 750 Liter aufweisen. Die ersten 5 Fraktionen umfassen ungefähr 5001 und enthalten die Hauptmenge der Gentamicin C-Komponenten. Die verbleibenden 2 Fraktionen betragen ungefähr 1500 bis 16001 und enthalten die Hauptmenge von Gentamicin A, Gentamicin B, Gentamicin B| und Gentamicin X. Die zuletzt genannten zwei Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und entweder gefriergetrocknet oder durch Versprühen getrocknet.
C. Isolierung von Gentamicin A
Man löst 19,8 kg des Fermentationsproduktes, von dem der Hauptteil des Gentamicin C (Schritt B) entfernt worden ist, in 45 I heißem Methanol. Man klärt die Lösung durch Filtrieren, kühlt sie auf Raumtemperatur, wobei man sie der Luft aussetzt, und impft mit Gentamicin A. Gentamicin A kristallisiert in Form von farblosem Karbonat, das man abfiltriert, etwas mit Methanol wäscht und bei 80°C im Vakuum trocknet, wobei man 1119g des Produktes dieses Beispiels erhält.
Die Mutterlauge und die Waschlösungen vereinigt man, engt sie im Vakuum auf einen Rückstand ein und Chromatographien wie in Schritt D beschrieben wird.
D. Chromatographische Trennung von
Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X
Man füllt zwei in Serie miteinander verbundene Chromatographiesäulen von einer Größe von 152 cm χ 10 cm mit Silikagel, das vorher durch Kontakt mit der unteren Phase einer Mischung von Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxid in einem Verhältnis von 1:1:1 vorbereitet worden ist. Man stellt eine Lösung von 750 g des Rückstandes von Stufe C in einem möglichst kleinen Volumen her, etwa in 2 Litern der unteren Phase des oben genannten Lösungsmittelgemisches. Man bringt die Antibiotikalösung auf die erste Säule auf und eluiert die Säule mit einer Geschwindigkeit von etwa 3 bis etwa 4,5 I pro Stunde, wobei man die Fraktionen von je ungefähr 2 Litern sammelt. Man überwacht die ausfließende Flüssigkeit durch Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatten, wobei man dasselbe Lösungsmittelsystem verwendet, das auf der Säule verwendet wird. Man vereinigt die Fraktionen, die gleiche Antibiotika enthalten, und dampft sie zu einem Rückstand ein. Wenn die Menge von Gentamicin B, das eluiert wird, abnimmt oder verschwindet, eluiert man die Säule vollständig mit einer Mischung, die aus gleichen Volumenteilen Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxid besteht Die Fraktionen, die Gentamicin B und Gentamicin Bi enthalten, löst man in Äthanol auf und konzentriert die Lösung zu einem Rückstand. Die Wiederholung des vorherigen Schrittes führt zu einer kristallinen Suspension von Äthanolsolvat von Gentamicin B und Gentamicin Bi. Wenn man die vorher beschriebene chromatographische Trennung durchführt, erhält man Produkte in einer Menge und in einer Reihenfolge wie folgt:
Gentamicin C \
Gentamicin Bi/
Gentamicin Bi
Gentamicin Bi \
Gentamicin X)
Gentamicin X
Gentamicin X
Gentamicin B
Gentamicin B
Gentamicin B|
Gentamicin Al
67.8 g
12,3 g
74.9 g
85,8 g
165,0 g
[&]T 153.8°
]r 132°
198,6 g
42,0 g
157°
Die Fraktionen, die Gemische der Antibiotika enthalten, können neuerlich Chromatographien werden, um die Ausbeute der einzelnen Fraktionen zu erhöhen.
i> B e i s ρ i e I 2
Herstellung des Sulfates von Gentamicin B
Man löst 5,0 g Gentamicin B in 25 ml Wasser und stellt den pH-Wert der Lösung mit 1 N Schewelelsäure
.'ο auf 4,5 ein. Man behandelt die Lösung und filtriert. Man gießt unter heftigem Bewegen das Filtrat in ungefähr 300 ml Methanol, setzt die Bewegung während etwa 10 bis 20 Minuten fort und filtriert. Man wäscht den Rückstand mit Methanol und trocknet bei ungefähr
r> 60°C im Vakuum, um das Produkt dieses Beispiels zu erhalten.
Beispiel 3
Herstellung des Hydrochlorids von
Gentamicin Bi
Man löst 5,0 g B1 in 1000 ml Wasser. Man bereitet eine Säule vor, die 500 g eines schwach basischen Ionenaustauschharz im Chloridzyklus, vorzugsweise IR-45
υ (Handelsmarke von Rohm und Haas, Philadelphia), enthält. Man leitet die Antibiotikalösung durch die Säule, gefolgt von 500 ml Wasser. Man konzentriert die ausfließende Flüssigkeit im Vakuum auf ungefähr 100 ml und gefriertrocknet das Produkt, wobei man das
4(i Produkt dieses Beispiels erhält.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen zur Verabreichung bei bakteriellen Infektionen. Beispielsweise kann man einem Tier, das eine solche Infektion hat, eine therapeutisch wirksame
4") Menge von wenigstens einem der Antibiotika Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X, deren nicht giftigen pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze, Solvate und Hydrate verabreichen.
Gentamicin X und zu einem geringeren Ausmaß
><> Gentamicin B und Gentamicin Bi sind wirksam gegen Protozoen, wie Entamoeba histolytica, Histomonas meleagridis, Trichomonas foetus und Trichomanas vaginalis. Histomonas meieagridis ist ein Parasit, der Enterohepatitis bei Truthähnen verursacht, (»blackhead disease«).
Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X sind auch wirksam als anthelminthische Agentien gegen Madenwürmer, wie beispielsweise Syphazia obveata.
Es ist überraschend, daß Gentamicin B, Gentamicin
W) Bi und Gentamicin X Wirkung gegen Protozoen aufweisen. Es ist berichtet worden, daß Gentamicin C, das den vorhergenannten Antibiotika strukturell ähnlich ist, nur schwache Aktivität gegen T. vaginalis bei verhältnismäßig hohen Doesen zeigt. Es ist ferner von
f>5 Albach et al in American Journal of Tropical Medicine und Hygiene, 15, 885 (1965) berichtet worden, daß Gentamicin C verhältnismäßig unwirksam gegen E. histolytica ist
Im Hinblick auf diese Eigenschaften können Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X in vitro in Waschlösungen für sanitäre Zwecke verwendet werden, wie beispielsweise für das Reinigen von Laborgeräien, die mit Protozoen der oben genannten Art infiziert sind.
Diese Verbindungen sind besonders zweckmäßig bei intestinalen Erkrankungen, da sie nicht nennenswert vom Gastrointestinaltrakt absorbiert werden. So kann eine beachtliche Konzentration des therapeutischen Mittels eingenommen werden, ohne toxische Erscheinungen im Patienten zu verursachen und gleichzeitig kann das Mittel in Mengen vorliegen, die ausreichen, den infizierenden Organismus zu zerstören oder wenigstens werentlich einzudämmen. Um allgemeine bakterielle Infektionen des Systems zu bekämpfen,
Tabelle III
MIC (|xg/ml)
erfolgt die Verabreichung des Antibiotikums vorzugsweise mittels Injectionen.
Antibiotische Aktivität — in vitro
In der folgenden Tabelle III ist die minimale Inhibitionskonzentration (MIC) von Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X in Vergleich mit der MIC des bekannten Antibiotikums Kanamycin gegen eine Vielzahl von grampositiven und gramnegaliven Mikroorganismen zusammengestellt. Die Antibiotika wurden in der Form der freien Base eingesetzt. Die Untersuchungen wurden in einem Medium bestehend aus Hefe-Rindfleischbrühe mit einem pH-Wert von 7,4 ausgeführt.
Organismus
Gentamicin Il Gentamicin
Gentamicin X
Kanamycin
0,08
Aerobacter}
aerogenes f
Bacillus!
subtilis J
Escherichia coli
Klebsieila \
pneumoniae)
Pseudomtfnas)
aeruginosa 1
Surcina luten
Staphylococcus \
aureus I
Streptococcus]
pyogenes |
Shigella sp M 324
Salmonella sp. 1
Salmonella sp. 2
Salmonella sp. B
Antibiotische Aktivität — in vivo
Die Schutzaktivität von Gentamicin B, Gentamicin B1 und Gentamicin X wird ermittelt, indem man die betreffende Verbindung eine Stunde nach dem Verabreichen einer infizierenden Dosis des pathogenen Organismus subkutan verabreicht und die überlebenden
0,8 3,0 0,03 0,3
0,03-0,3 0,08-0,3 0,3 5
3,0 3,0 0,75 1
0,03-0,08 0,08 0,3-0,75 62,5
0,3 0,3 - 4
0,3-3,0 0,3-3,0 0,08-0,75 0,25
3,0 3,0 0,3-0,75 50
5,0 5,0
0,8 0,3 0,75
0,8 0,3 -
0,8 0,3
Versuchstiere 48 Stunden nach der Infektion zählt. Infizierte, nicht behandelte Kontrolltiere sterben in ungefähr 18 bis 24 Stunden. Im allgemeinen werden den Mäusen 5 bis 7 verschiedene Dosen verabreicht. Die Mäuse wiegen 20 g und sind in Gruppen von 7 bis IO Stück zusammengefaßt. Die PDw-Werte werden in der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt:
Tabelle IV
Schutzaktivität von Gentamicin B, B ι und X bei Mäusen
Microorganismus PD1n (mg/kg) Gentamicin B; Gentamicin X
Gentamicin B 30,0 4,0
Staphylococcus aureus Gray 20,0 50,0 -
Staphylococcus aureus W 50,0 2,5 -
Staphylococcus aureus 5,0
Smith 18,0 -
Streptococcus pyogenes C 15,0 4,0 -
Salmonella paratyphi B 5,0 2,0 7,0
Pseudomonas aeruginosa SC 2,0 - 1.5
Escherichia coli SC —
Akute Toxizität
Die akute Toxizität von Gentamicin B, Gentamicin Bi dieser Untersuchung sind in der folgenden Tabelle V und Gentamicin X wird ein männlichen CF-I Mäusen, zusammengestellt; die ungefähr je 20 g wiegen, ermittelt Die Resultate 5
Tabelle V Akute Toxizität von Gentamicin B, Gentamicin B, und Gentamicin X
Art der Verabreichung LD50 (mg/kg) Gentamicin B( Gentamicin X
Gentamicin B 230 225
Intravenös 228 1600 >1000
Intraperitoneal 1750 >1500
Subkutan >1500 > 250
Oral > 250
In vitro Aktivität gegen Trichomonas vaginalis
In der folgenden Tabelle V! ist die in vitro Aktivität wesentlichen durchgeführt, wie es von R. J. Schnitzer auf der Verbindungen dieser Erfindung gegen Trichomonas Seiten 289 - 331 in Experimental Chemotherap, Volume vaginalis zusammengefaßt Die Untersuchung wurde im 1. Academic Press, New York (1963) beschrieben wird.
Tabelle VI Verbindung
Minimaler Gehalt für 99% ([xg/ml) Minimaler Gehalt für ^g/ml)
Unterdrückung 48 SId. vollständigen Schutz 48Std.
(ug/ml) 25 25
24Std. 10-25 24Std. 25
25 2,5 >250 10
25 100 >250 100
- -
250 >250
Gentamicin B Gentamicin B1 Gentamicin X Gentamicin C
Vereinfachtes Triplicaseserummedium, Baltimore Biolgical Laboratories, Baltimore, Maryland. Gegen Entamoeba hystolytica hat Gentamicin X eine
minimale Inhibitionskonzentration von 4 mcg/ml (48 Stunden) und eine minimale Schutzkonzentration von 7 mcg/ml (48 Stunden).
Anthelminthische Aktivität in vivo
Gentamicin B und Gentamicin X zeigen anthelminthische Aktivität gegen Syphacia obvelata, wenn die Untersuchungen an Gruppen von 7 männlichen
Millerton Mäusen im wesentlichen nach O. D. Standen, Seite 701 -892, Experimental Chemotherapy, Volume 1. durchgeführt werden.
Tabelle VII mg/ kg/ % in Diät % infiziert Mittlere
Verbindung pro Tag Wurm menge
259 0,25 0 0
Gentamicin B 100 0,0625 0 0
Gentamicin B 39 0,02 0 0
Gentamicin B 8 0,008 67 29,5
Gentamicin B 310 0,25 0 0
Gentamicin X 62 0,05 83 27
Gentamicin X 0 0 100 53
Kontrollgruppe 0 0 100 22
Kontrollgruppe 0 0 75 6,8
Kontrollgruppe
2130Π3
Die Daten in Tabelle VH «eigen, daß Gentamicin B eine anthelminthische Aktivität gegen Syphaeia obvelata bei einer Mindestdosis von 39 mg/kg pro Tag bei Verabreichung an männliche Millerton Mäuse hat Gentamicin X erreicht einen totalen Erfolg bei 310 mg/kg pro Tag und einen teilweisen Erfolg bei 62 mg/kg pro Tag unter den gleichen Untersuchungsbedingungen,
Vermindertes Auftreten von Ataxia
Gentamicin B und zu einem geringeren Ausmaß Gentamicin Bi zeigen eine Eigenschaft, die recht ungewöhnlich für Aminoglykosidantibiotika ist Wenn man diese Verbindungen entsprechend den Untersuchungsmethoden, die von Weinstein, Wagman und Taber in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1965, Seiten 227—231, beschrieben sind, verabreicht, so
IO
benötigen diese Verbindungen eine wesentlich längere Zeit der Anwendung bei hohen Dosen um eine Störung des Streckreflexes und das Auftreten von Ataxia zu erreichen. Es scheint ein Zusammenhang zwischen hohen Dosen von aminoglykosidärtigen Antibiotika, die Ober eine ausgedehnte Zeit verabreicht werden, und vestibulären Schädigungen zn bestehen, wobei eines der ersten Symptome Ataxia ist Die Untersuchungsergebnisse in Tabelle VIII zeigen, daß Gentamicin B und Gentamicin B| in Vergleich zu Gentamicin C in Dosen verwendet werden können, die wesentlich über den normalen therapeutischen Dosen liegen. Ferner können sie in solchen Dosen für eine Zeit verwendet werden, die wesentlich fiber der normalen Zeit liegt, die benötigt wird, um Infektionen zu beheben, ohne Ataxia zu verursachen, wobei minimale wenn überhaupt auftretende toxische Erscheinungen festgestellt werden.
Tabelle VIII Chronische Toxizität bei Katzen nach täglicher subkutaner Verabreichung
Antibiotikum Dosis
(mg/kg/pro Tag) 		Anzahl von
Katzen 		Mittlere Tagzahl
bis zum Auftreten
von Attaxia
Gentamicin B1 240
60
40 		1
4
4 		21,0
69,0
108,0
Gentamicin C 60
40
20 		8
11
5 		13,5
17,5
31,4
Gentamicin B 240
60
40 		1
4
4 		21,0
81,0
>312*)
*) Die Untersuchung wurde am Ende von 385 Tagen beendet, als Ataxia an 2 von 4 Katzen nicht aufgetreten war. Die angegebenen Zahlen stellen das abgerundete Mittel dar.
Die Verbindungen dieser Erfindung Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X sind geeignet für orale, äußerliche und parenteral Verabreichung. Wenn sie oral verabreicht werden, können sie in Form von Tabletten, Kapseln, Elixieren und ähnlichem oder sogar in Mischung mit Tierfutter verwendet werden. In dieser Dosisform sind die Verbindungen besonders im Hinblick auf ihre Wirkung als Anthelminthika und als Mittel gegen Protozoen wirksam. Das trifft besonders zu, wenn sie bei der Behandlung von intestinaler ίο Amoebiasis oder nicht spezifischer Diarrhöe verwendet werden. Die Verbindungen dieser Erfindung können in Dosiseinheiten als einzige aktive Ingredentien vorliegen oder sis können in Verbindung mit anderen aktiven Ingredentien vorliegen, wie beispielsweise mit Beruhi- >-> gungsmitteln, da es bekannt ist, daß Infektionen und Infestationen oft Angstzustände hervorrufen. Wenn der Warmblüter oral behandelt wird, so ist die verabreichte Menge etwa 10 bis etwa 100 mg, vorzugsweise 20 bis 79 mg/kg Körpergewicht und Tag, vorzugsweise geteilt in 2 bis 4 Dosen.
Bei äußerlicher Anwendung liegen die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form von Cremen, Salben, Suppositorien und dergleichen vor. Solche Dosisformen sollten etwa I bis etwa 10% Antibiotikum enthalten, und sollten an der Stelle der Infektion 2 bis 4mal täglich aufgebracht werden.
Bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen können die Antibiotika Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X in Mengen von ungefähr 2 mg bis ungefähr 20 mg, vorzugsweise 5 b's 15 kg pro Kilogramm Körpergewicht angewendet werden.
Wie oben in Tabelle VIII gezeigt worden ist, können Gentamicin B und Gentamicin Bt in Hinblick auf ihre geringe Fähigkeit Ataxia zu verursachen für die Behandlung von schweren bakteriellen Infektionen verwendet werden, insbesondere für solche, die sich als wiederstandsfähig gegen andere antibakterielle Mittel erwiesen haben. Vorzugsweise wird Gentamicin B und/oder Gentamicin Bi parenteral verabreicht und zwar in Dosen von etwa 2 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag, geteilt in mehrere Dosen.
llicr/u 3 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    1, Gentamicin B, Gentamicin B, und Gentamicin X der allgemeinen Formel I
    NH,
    H°
    R1
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