DE2408666C3

DE2408666C3 - Antibiotische Verbindungen, deren nicht-toxische, pharmakologisch verträgliche Salze und Hydrate und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE2408666C3
Application number: DE2408666A
Authority: DE
Inventors: Yoshio Abe; Takayuki Naito; Susumu Nakagawa
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1973-02-23
Filing date: 1974-02-22
Publication date: 1978-10-19
Also published as: DK140259C; NL7402456A; DE2408666B2; FR2218879A2; CH599243A5; DK140259B; SE417972B; AU6587574A; JPS553360B2; CA1046513A; FR2218879B2; JPS504043A; GB1467401A; DE2408666A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft halbsynthetische Verbindungen der allgemeinen Formel

HO-

4· 6-

HO

CH₂-NH₂

(IV)

4 h

~K CH₂OH

NH-R

H.N \'

worin R¹ die Bedeutung OH oder NIb besitzt und R die Bedeutungen L-(—)-/i-Aniino-<\-hyclr()xypropionyl oder L-( — )-<5-Amino-ix-hydroxyvalcryl bedeutet, und deren nichttoxische, pharnuikulogisch verträgliche Säureadclitionssul/c und Hydrate sowie Verfuhren /u deren Herstellung. Die erfiMdungsgeniäßcn Verbindungen haben die tlezcichnungen l-[L-( — )-/J-Amino-uchydroxypropionyl]*kanamycin A, I [L-( —)-/J-Amino-ix-hydroxypropionylj-kanamyein B, I-[!_,-(— )-(5-Amino-<x-hydroxyvaleryl]-kanamycin A und I fL ( —)-(VAmiiu) \ hy-

droxyvaleryl]-kanamycin B.

Die Kanamycine sind bekannte Antibiotika und im Merck Index, 8. Aufl., auf Seiten 597 bis 598 beschrieben.

Die mit l-[U-( — )-)'-Amino-tt-hydroxybutyryl]-kanamycin A [BB-K8] bezeichnete Verbindung ist in Journal of Antibiotics, 25(12), Seiten 695—731 (Dezember 1972) bzw. in der DT-OS 22 34 315 beschrieben.

Die bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendete Bezeichnung »nichtioxisches, pharmakologisch verträgliches Säureadditionssalz« bedeutet ein Mono-, Di-, Tri-, Tetra- oder Penlasalz, gebildet durch Reaktion eines Moleküls der Verbindung IV mit 1 bis 5 Mol einer nichttoxischen, pharmakologisch verträglichen Saure. Zu diesen Säuren gehören Essigsäure, Chlonvasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure, Ascorbinsäure, Apfelsäure und Zitronensäure und Säuren, die üblicherweise zur Herstellung von Salzen Aminogruppen enthaltender Pharmazeutika verwendet werden.

Bevorzugte Ausffihrungsformen sind die Mono- und Disulfale und die Mono- und Polyhydrate der Verbindungen der allgemeinen Formel IV.

Das erfindungsgemäßc Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel IV ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Verbindung der Formel

CH₂-NH-O-CO-CH

HO

worin R¹ die oben angegebene Bedeutung besitzt, mil dem N-Hydroxysuccinimidcstcr von L-( — )-/i-Bcnzyloxycarbonylamino-a-hydroxypropionsäurc bzw. L-( — )-/i-BcnzyIoxycarbonylamino-a-hydroxyvalcriansäurc der Formeln

OH

CH₅-O-CO-NH-CHj-CH-CO-O-N

OH

I /

CH₂-U-CO-NH-CH₂-CH₂-CH₂-CH-Cu-U-N^

in einem Verhältnis Von etwa 0,5 bis clwii 1,4 Mol Acylicrungsmiltcl pro Mol Verbindung Il in einem Lösungsmittel iicyli'crU

b) eins der crhiillcnen Vcrbintlunii der l'ornicl

HO-

ll,- NII-O -CO-CII

H₂N

(iii)

worin η die Bedeutung I oder 3 besitzt und R¹ die falls das erhaltene Produkt anschließend in an sich

oben angegebene Bedeutung besitzt, bekannter Weise in ein nichttoxisches, phafmako-

in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen logisch verträgliches Säureadditionssalz oder Hy-

durch Hydrieren in Gegenwart eines Palladium- drat überführt.

Aktivkohle-Katalysators in einem mit Wasser j> Das erfindungsgemäße Verfahren ist aus folgendem

mischbaren Lösungsmittel bei Atmosphärendruek Schema ersichtlich:

und normaler Temperatur entfernt und gegebencn-

HO-

HO

CH₂-NH-C-O-CH₂-Q₁H₅

HO

H₇N

NH,

(II)

N-Hydroxysuccinimidcster von L-{ — }-/i-Bcnzy!-

oxycarbonyl-aminois-hydroxypropionsäure

809 542/272

N-Hydroxysiiecinimideslcr von L-(-)-//-13cir/yI-

oxycarbonyl-iiminu-
\-hydioxypropionsaiirc

10

HO-

C)

CH, — N H - - C — O - CH, — C₁, H₅

CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅

H₂/Pd/C HO^ CH₇-NH₁

(IV-I)

H₇N

HO

In Stufe a) verwendet man das Acylierungsmittel in einem Verhältnis von etwa 0,5 bis etwa 1,4 Mol, vorzugsweise etwa 0,8 bis etwa 1,1 Mol Acylierungsmittel je MoI Verbindung der allgemeinen Formel II. Als Lösungsmittel werden bevorzugt Mischungen von Wasser und Äthylenglykoldimethyläther, Dioxan, Dimethylacetamid. Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder Propylenglykoldimethyläther verwendet, insbesondere jedoch Wasser-Tetrahydrofuran oder Wasser-1,2-Dimeihoxyäthan.

In Stufe b) wird ein aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bestehenden Lösungsmittelsystem, vorzugsweise Wasser und Dioxan, Tetrahydrofuran, Äthylenglykoldimethyläther oder Propylenglykoldimethyläther, bevorzugt Wasser — Dioxan 1 : I (vorzugsweise in Gegenwart einer katalytischen Menge Eisessig) oder Wasser — Tetrahydrofuran 1:1, verwendet.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten 6'-Carbobenzoxykanamycine A bzw. B erhält man in der in der DT-OS 22 34 315 beschriebenen Weise.

l-[L-(—)-/?-Amino-a-hydroxypropionyl]-kanamycin

A, verbindung iVa-I (BB-K 101), i [L-(-)-j?-Ämino-ixhydroxypropionylj-kanamycin B, Verbindung IVb-I (BB-K 122), l-[L-(—)-<ß-Amino-Ä-hydroxyvaleryl]-kanamycin A, Verbindung I Va-2(BB-K 2 3) und 1 -[[.-(—)-Φ-

Il

A in ino-rt-hydroxy valcry I]- kanamycin B, Verbindung IVb-2 (BB-K 3i) besitzen ausgezeichnete antibakterielle Aktivität, die gegenüber bestimmten krankheitserregenden Mikroorganismen verglichen mil Kanamycin Λ oder B oder der Verbindung BB-K 8 überlegen wirksam ist.

Die nachstehenden zwei Tabellen /eigen die Minclcsthcmmkonzcntraliuricn (MlIK) von Kanamycin A.

verglichen mit den Verbindungen IVn-I (BB-K 101) und iVa-2 (BB-K 23), und Kanamycin B, verglichen mit Verbindungen IVb-ί (BB-K 122) und IVb-2 (BB-K H) gegenüber einer Vielzahl von granipositivcn und gramnegativen Bakterien, erhallen mit Steers Agar-Vcrdünnungsmclhodc. Bei den Versuchen in beiden Tabellen wurde Mueller-Hinton-Agar-Medium verwendet.

tabelle I (MIlK y/ml)

Mikroorganismus	KM-R	Ψ. vulgaris	A15II9	" KM-R	SM-R	IiB-K 101	BiJ-K 23	kanamycin	0.8
			A15I69	" KM,		fl Va-I)	(iVii-2)	Λ	1,6
I. coli NIlIJ	* KM-R	Ψ. mirabilis	A20363	phlei		1.6	1.6	1,6
Juhl	* K-12	-	Λ9844	ninae	1,6	1,6	>IOO
	" " KM-R	Ψ. niorganii	A20365	1,6	1,6	0,8
" KM-R			1,6	1,6	100
" W677	S. üurcus'-Smilfr	A20664	0,8	1,6	0,8
" JR/W677	" 209P SM-R	A20665	0,4	0,4	6,3
R. pneumoniae D-11	KM-R	A20684	1,6	1,6	100
* Type 22 #3038	Mycobacterium 607	A20683	1,6	6,3	0,8
B. marcescens			0,8	0,8	>100
#. aeruginosa D-15		A20680	1,6	1,6	0,2
" H9 D-113		A20019	1,6	3,1	>100
*		0,4	0,8	1,6
	KM-R	1,6	3,1	12,5
	A9923	1,6	3,1	>ioo
f	A9930	3,1	6,3	50
" GM-R	A15150	6,3	25,0	12,5
GM-R	AI5194	6,3	6,3	100
A207I7	0,4	0,8	25
A207I8	6,3	12,5	50
A9436	3,1	6,3	50
A9526	6,3	12,5	0,4
A9554	6,3	12,5	0,4
Λ9900	0,4	0,4	0,8
A9553	0,4	0,8	0,8
Λ20031	0,8	1,6	0,8
	0,8	1,6	0,8
	0,8	0,8	0,4 ■
Λ20239	0,8	0,8	1,6
	0,4 -	• 0,4	100
1,6	3,1	0,4
1,6	3,1	>I00
0,8	1,6	>100
>I0()	>1()()	0,4
>100	> 100	0,4
0,4	1,6
0,8	1,6

KM-R bedeutet kanamycinrcsistcnt
CiM-R bedeutet gent;imycinresislent
SM-R bedeutet slreptnmycinresistcnt

13

Tabelle II (MIiK v/ml)

14

Mikroorganismus

E. coli NIIIJ
Juhl

KM 4

	KM-R	KM-R
m	K-12	KM-R
m	W677
m	JR/W677
m
m

t·. pneumoniae D-Ί I
" Typ 22 3038

1. marcescens

Ψ-. aeruginosa D-15

" 119 D-113

KM-R

9. aeruginosa

" Gm-R
" GM-R
Ψ. vulgaris

P. mirabilis
P. morganii

S. aureus Smith

209P SM-R
KM-R

A15119

Λ15Ι69

Λ20363

Λ9844

A20365

Λ20664 Λ20665 A20684 A20683

Ä20680 A20019

A9923

A9930

A15150

A15195

A20717

A207I8

A9436

A9526

A9554

A9900

A9553

A20031

UU-K 122	M3-K33	Kanamycin	0,4
(IVl)-I)	(IVh-2)	I!	0,8
0,8	1,6	0,8
0,8	1,6	H)O
0,8	1,6	0,4
0,8	3,1	50
0,8	1,6	0,4
0,2	0,4	0,8
0,4	1,6	25
0,4	6,3	0,8
0,2	0,8	100
0,4	1,6	0,1
1,6	12,5
0,2	0,4

1,6

1,6 0,8 12,5 3,1 0,4 3,1 1,6 3,1 3,1 0,2 0,4 0,8 0,8 0,8

0,8 0,2 0,8

25

>100

12,5	0,8
3,1	6,3
100	>I00
6,3	25
1,6	6,3
12,5	25
12,5	12,5
12,5	50
12,5	25
1,6	0,2
1,6	0,2
3,1	0,4
1,6	0,8
3,1	0,8
3,1	0,8
0,4	0,1
3,1	0,8

Fortsetzung

Mikroorganismus	Tabelle III	A20239	BB-K 122	BB-K 33	Kanamycin	50
	Mindcsthemmkonzentration		(IVb-I)	(IVb-2)	B	1,6
	Mikroorganismus		0,8	3,1	100
Mycobacterium 607			0,8	1,6
KM-R			100	>100	100
it r»				1,6
KM, SM-R		100	>100	1,6
phlei		0,8	0,4
ranae	(MHK) (y/ml)	0,3	1,6
BB-K ;0I			BB-K 33 BB-K 8

BB-K 23	BB-K122

1) I coli Juhl A15119 1,6 1,6

2) I coli Juhl A20363 1,6 1,6

3) Ii. coli Juhl A20365 0,4 0,4

4) Ii. coli Juhl Λ20664 1,6 6,3

5) i^;. coli Juhl A20665 0,8 0,8

6) Ii. coli Juhl A20684 1,6 1,6

7) [-:. coli Juhl A20683 1,6 3,1

8) K. pncumoniae A20680 1,6 3,1

9) S. marasccns A20019 1,6 3,1

10) P vulgaris A9436 0,4 0,4

11) P. mirabilis A9900 0,8 1,6

12) S. aurcus A20239 1,6 3,1

Die vorstehenden Daten /eigen, daß die Verbindungen IVa-I. IVa 2. IVb-I und IVb-2 gegenüber einer-45 bedeutenden Anzahl Testorganismen weitaus aktiver sind, insbesondere gegen Pscudomonas und andere kanamycinrcsistcnlc Organismen.

Die Verbindungen der allgemeinen 1 ormel IV sind wertvoll als antibakteriell Mittel, als Bcifuttermillcl bei so Tierfutter, als therapeutische Mittel bei Geflügel und Tieren sowie beim Menschen und sind insbesondere wertvoll bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, die durch gramposilive und gramnegative Bakterien verursacht sind.

Bei oraler Verabreichung sind die Verbindungen der allgemeinen Formel IV zusätzlich bei der präoperativen Sterilisation des Darms brauchbar. Sowohl aerobe als auch anaerobe Flora, die gegenüber diesen Verbindungen empfindlich sind, werden im Dickdarm reduziert, μ Zusammen mil geeigneter mechanischer Reinigung sind sie bei der Vorbereitung für DarmchirUfgic Wertvoll.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel IV sind wirksam bei der lichandlung von systemischen bakteriellen Infektionen beim Menschen, wenn sie parenteral in einem Dosicrungsbcrcich von etwa 250 mg bis etwa 3000 mg pro Tag in geteilten Dosen, drei- oder viermal täglich, verabreicht werden. Im allgemeinen sind die Verbindungen wirksam, wenn sie alle 12 Stunden in 0,8
0,8
0,2
0,4
0,2
0,4
1,6
1,6
1,6
0,2
0,8
0,8

1,6
3,1
0,4
6,3
0,8
1,6

12,5

12,5
1,6
1,6
3,1

einem Dosierungsbercich von etwa 5,0 bis 73 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden.

Beispiel I

1 -{L-{—)-/J-Amino-a-hydroxypropionyl]-kanamycin A (IVa-I, BB-KlOI)

a) Zu einer gerührten Lösung von 1,48 g (2,4 mMol) ö'-Carbobcnzoxykanamycin A (H, R¹ = OH) in 25 ml Wasscr-Tetrahydrofuran (4:1) gibt man tropfenweise bei 5°C die Lösung des N-Hydroxysuccinimidcstcrs von L-ß-Bcnzyloxycarbonylamino-a-hydroxypropionsäure. Man rührt die Mischung zwei Stunden bei Raumtemperatur und filtriert dann ab, um eine geringe Menge unlösliches Material zu entfernen. Das;b) Filtrat hydriert man über Nacht mit 300 mg eines 10% Palladium auf Aktivkohle enthaltenden Katalysators bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck und filtriert dann ab, um den Katalysator zu entfernen. Man engt das Filtrat im Vakuum ein, um den größten Teil des organischen Lösungsmittels zu entfernen. Die sich ergebende wäBrige Lösung stellt man mit verdünnter Chlorwasscrstoffsäure auf einen pH-Wert von 7 ein und gibt sie über eine Kolonne »Amberlite CG-50« (NH₄ ⁴. 80 (til) [»AmberÜte CG-50« ist ein chromatographisch reines schwach saures Kationenaustauscherharz vom Carbon-

809 642/272

saurepolymethacrylsäuretypl die man mit 200 ml Wasser wäscht und dann mit 400 ml 0,1 n-, 870 ml 0,2 n-, und 430 ml 0,5 n-NH₄OH eluiert Das Eluat wird in 10-ml-Fraktionen gesammelt Die Fraktionen 95 bis 106, die Aktivität gegenüber Pseudomonas aeruginosa A 9843 zeigen und bei Dünnschicht-Chromaiographie auf Kieselsäuregelplatte (Ninhydrin) [DC: Kieselsäuregelplatte, CHCl₃-MeOH-28%iges NH₄OH-H₃O (1:4:2:1)] Rf-Werte bei 0,25 und 0,41 aufweisen (gewünschtes Produkt), werden vereinigt im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei sich 170 mg rohe Verbindung IVa-I ergeben.

Die rohe Verbindung IVa-I (162 mg) adsorbiert man auf einer Kolonne mit »Amberlite CG-50« (15 ml, Cuproammoniumform, wie folgt hergestellt: Zu einer π gerührten Suspension von CG-50 (NH₄ ⁺ ) in Wasser gibt man 10%ige Kupfer(ll)-sulfatlösung, wobei sich das Kupfersalz von »Amberlite CG-50« ergibt, das man abfiltriert. Man wäscht das Harz mehrmals mit Wasser, behandelt dann unter Rühren mit 1 n-NH₄OH, filtriert und wäscht mehrmals mit wasser, wobei man die dunkelblaue Cupro-Ammonium-Form von »Amberlite CG-50« erhält, die man mit 50 ml Wasser wäscht und mit 1 Liter 0,2 n-, 700 ml 0,5 n- und schließlich 400 ml I₁On-NH₄OH eluiert Das Eluat sammelt man in 2^r· 7-mI- Fraktionen. Die Fraktionen 269 bis 282, die einen einzigen Fleck bei Rf 0,41 zeigen, werden vereinigt, im Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wobei sich 79 mg Kupferkomplex von Verbindung IVa ergeben. Dfcs Kupfer wird durch Säulenchromatographie über so »Amberlite CG-50« (NH₄*, 5 ml) unter Verwendung von 0,2 n-NH₄OH als Eluierungsmittel entfernt Das Eluat wird in 10-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 2 bis 10 werden vereinigt im Vakuum eingedampft und lyophilisiert wobei sich 26 mg r> Verbindung IVa-I ergeben (2%, bezogen auf Vl-I), F. 200 bis 205" C.

IR(KBr): 1640.1540 cm '.

Analyse C₂₁H₄₁NsOu · 2 H₂COj · 3 H₂O:

Ben: C 36,84, H 6,84, N 9,34%;
gef.: C 36,93, H 6,00, N 9,62%.

c) Man löst 1 Mol l-[L-(—)-/?-Amino-<x-hydroxypro- Vi pionyl]-kanamycin A in 1 bis 3 Liter Wasser. Man filtriert die Lösung, um jegliche nicht gelösten Feststoffe zu entfernen. Zu der abgekühlten und gerührten Lösung gibt man 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml V/asser. Man rührt die Mischung 30 Minuten, gibt dann kaltes to Äthanol zu der Mischung bis Ausfällung eintritt. Die Feststoffe werden durch Filtrieren gesammelt und als das gewünschte Monosulfai identifiziert

Löst man 35 g 1-[L-(—)-/J-Amino-a-hydroxypropionyl]-kanamycin A (in Form des Monobicarbonattrihydrats) in 125 ml entionisiertem Wasser, stellt den pH-Wert mit 50% VoL/Vol. Schwefelsäure auf 7 bis 7,5 ein, gibt 8,5 g Aktivkohle zu, schlämmt die Mischung 03 Stunden bei Umgebungstemperatur auf, entfernt die Aktivkohle durch geeignetes Abfiltrieren, wäscht mit 35 ml entionisiertem Wasser, gibt Wasser zu dem Filtrat, vereinigt das Filtrat und die Waschflüssigkeit mit 50% VoUVoI. Schwefelsäure und stellt das Gemisch auf einen pH-Wert von 1 bis 1,3 ein, gibt die Lösung unter raschem Rühren innerhalb von 10 Minuten zu 600 bis 800 ml Methanol (3 bis 4 Volumina Methanol), rührt die Mischung 5 Minuten beim pH-Wert von 1 bis 1Λ gibt sie durch ein 100 Maschen-Sieb (0,148 mm), rüh-t sie 2 Minuten, läßt sie 5 Minuten absetzen, dekantiert den größten Teil der überstehenden Flüssigkeit, filtriert die verbleibende Aufschlämmung, wäscht sie mit 200 ml Methanol und trocknet sie bei 50^aC 24 Stunden im Vakuum, so erhält man das Disulfat.

B e i s ρ i e I 2

1-[L-( — )-ß-Amino-<x-hydroxypropionyl]-kanamycin B [BB-K122(IVb-l)]

a) Zu einer gerührten Lösung von 1,23 g (2,OmMoI) 6'-Carbobenzoxykanamycin B in 20 ml Wasser gibt man tropfenweise eine Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von L-^-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxypropionsäure. Man rührt die Mischung über Nacht und hydriert dann über Nacht in Gegenwart eines b) 300 mg 10% Palladium auf Aktivkohle-Katalysators bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck. Die hydrierte Mischung filtriert man und engt das Filtrat im Vakuum ein, um den größten Teil des organischen Lösungsmittels zu entfernen. Die sich ergebende wäßrige Lösung stellt man mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 7 ein und adsorbiert sie aus einer Kolonne von »Amberlite CG-50« (NH₄*, 40ml), die man mit 80 ml Wasser wäscht und dann mit 900 ml 0,1 n- und 1,2 Liter 0,2 n-NH₄OH eluiert. Das Eluat wird in 10-mi-Fraktionen gesammelt, mit Ninhydrin-Fleck-Test, Dünnschichtchromatographie (Kieselsäuregelplatte) und Scheibentest unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa A 9843 überwacht und in die folgenden geeigneten Fraktionen aufgeteilt. Jede Fraktion wird im Vakuum eingedampft und gefriergetrocknet.

F raklinn

Gläser Nr.

NII₄OIi (n)

Gewicht (mg)

121

113
143

0,2
0,2

420 253

Fraktion 2 (250 mg) in 30 ml Wasser wird mit 1 h-Chlörwassersioffsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und durch eine Kolonne von »Ambcrlite CG-50« (Cupro-Ammonium-Form, 14 ml) gegeben, die mit 50 ml Wasser gewaschen und mit 2,5 Liter Bezeichnung

Kanamycin H

BB-K 122 (IVh-I) + Nebenprodukt + Kanamycin Ii

1,On-NHiOH und 1,5 Liier 1,5 n-NlliOII oluiurl wird. (,-> Das Eluat Wird in lO-inl-Fniklioheii gesammelt und basierend tiuf den Rf-Werten, der Diinnseliiehtchroinaiographie Und der Aktivität gegenüber Pseudonionäs aeruginosa in die geeigneten Fraktionen geteilt.

Fraktion Glaser Nr. NII^OII (η) Gewicht Bezeichnung

1' 191-240 1,0

2' 331-360 1,5

3' 361-385 1,5

Chromatographie von Fraktion 2' (80 mg), um Kupfer zu entfernen, ergibt 35 mg(3%) BB-K 122 (IVb-I).

Die physikalisch-chemischen Daten der Verbindung aus Fraktion 2' sind in der nachstehenden Tabelle angegeben:

Kuplerkomplex des Neben

produktes

Kupferkomplex von dem

gewünschten BB-K122

Kupferkomplex von

Kanamycin B

IR-Absorptionsspektrum(KBr) 1635,1570 cm

,- Anal·,seC₂₁H^N₅On · H₃O:

Ber.: C 43,57, H 7,16, N 10,59%;
gef.: C 43,25, H 7,12, N 9,83%.

IR

(cnT

RT

(Kieselsäurege!-
platte, Ninhydrin)

122 1640, 1570 192 bis 196 0,41

AnalyseC2iH«N_bOi> ■ 2

Ber.: C 39,77, H 6,67, N 12,10%;
gef.: C 39,84, H 6,23, N 11,66%.

Durch Hydrolyse -it 0,5 n-NaOH bei 100°C innerhalb von 1 Stunde erhält man Isnserin i'"d Kanamycin B. Das Mono- und Disulfat kann man in der in Beispiel Ic) beschriebenen Weise herstellen.

Beispiel 3

1 -[L-( — )-<5-Amino-a-hydiOxyvaleryl]-kanamycin A
[BB-K 23. IVa-2]

a) Zu einer gerührten Lösung von 1,24 g (2,0 mMol) der Verbindung IIa-1 (R = OH) in 12 ml Wasser und 60 ml 1,2-Dimethoxyäthan gibt man tropfenweise 780 mg (2,0 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters von L-o-Benzyloxycarbonyl-a-hydroxyvaleriansäure in 10 ml 1,2-Dimethoxyäthan. Man rührt die Mischung über Nacht und dampft dann im Vakuum zur Trockene ein. Den Rückstand behandelt man mit 20 ml Wasser und schüttelt ihn mit zwei 30-ml-Anteilen von mit Wasser gesättigtem Butanol. Die vereinigte Butanolschicht b) wird im Vakuum eingedampft, wobei sich 1,36 g (b) eines Feststoffs ergeben, der in 10 ml Wasser, 10 ml Dioxan und 1 ml Essigsäure gelöst und mit 200 mg 10% Palladium auf Aktivkohle bei Atmosphärendruck und Umgebungstemperatur über Nacht hydriert wird. Die hydrierte Mischung wird filtriert und das Filtrat wird im Vakuum zur Trockene eingedampft. Den Rückstand löst man in 20 ml Wasser. Man gibt die Losung auf eine Kolonne von »Ambcrlile CG 50« (NHj', 15 ml). die man mit 80 ml Wasser wäscht und dann mit 760 ml Q₁I η und 880 ml 0,2 n-NIUOH eluicri. Das Eluat wird in lÖ-ml-Fraklionen gesammelt. Die Gläser 109 bis 172, die bei der Dünnschichtchromatographie fKicselsäurcgclplattc, CHCIi-Mcthanol-28%igcs NfIiOlI-H₂O (I :4 :2: I)] (Kiesclsäurcgclplattc, Ninhydrin) einen Rf-Wert 0,18 ergeben, werden Vereinigt, im Vakuum eingedampft und gefriergetrocknet, wobei sich 330 mg (28%) der Verbindung IVa-2 ergeben, F. 185⁰C(ZCi-S.),

c) Man löst 1 Mol l-[L-( — )-n-Amino-<x-hydroxyvaleryl]-kanamycin A in 1 bis 3 Liter Wasser. Man filtriert die Lösung, um irgendwelche unlöslichen Feststoffe zu entfernen. Zu der gekühlten und gerührten Lösung gibt man 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser. Man rührt die Mischung 30 Minuten, wonach man kaltes

2-, Äthanol zugibt, bis Ausfällung eintritt. Man sammelt die Feststoffe durch Abfiltrieren und erhält das g .-wünschte Monosulfat.

35 g l-[L-( —)-(5-Amino-\-hydroxyvalcryl]-kanamycin A (in Form des Monobicarbonattrihydrats) löst man in

so 125 ml entionisiertem Wnsser.

Man stellt den pH-Wert mit 50% VoIVVoI. Schwefelsäure auf 7 bis 7,5 ein. Man gibt 8,5 g Aktivkohle und schlämmt die Mischung 0,5 Stunden bei Raumtemperatur auf. Durch Abfiltrieren wird die Aktivkohle entfernt

j5 und mit 40 ml Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeit wird zu dem Filtrat gegeben.

Das Filtrat und die Waschflüssigkeit, die vereinig; sind, werden mit 50% VoIVVoI. Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 bis 2,6 eingestellt. Es entw.jkelt sich eine große Menge Kohlendioxid. Man legt an die Lösung unter Rühren 20 Minuten Vakuum an, um weiteres Kohlendioxid zu entfernen.

Zu der entgasten Lösung gibt man 8,5 g Aktivkohle. Man schlämmt die Mischung 0,5 Stunden bei Raumtemperatur auf. Die Aktivkohle wird durch Abfiltrieren entfernt und mit 35 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Das Wasser wird zu dem Filtrat gegeben.

Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat wird mit 50% VoIVVoI. Schwefelsäure auf einen pH-Wert

.-,o von 1 bis 1,3 eingestellt. Diese Lösung gibt man unter raschem Rühren innerhalb von IO Minuten zu 600 bis 800 ml Methanol (3 bis 4 Volumina Methanol). Man rührt die Mischung 5 Min. beim pH-Wert von 1 bis 1,3. gibt sie durch ein 100 Maschensieb (0,148 mm), rührt sie

5--, 2 Mm. und läßt sie 5 Mm. absetzen. Der größte Teil der überstehenden Flüssigkeit wird abdekantiert. Die zurückbleibende Aufschlämmung wird filtrier!, mit 200 ml Methanol gewaschen und bei 50"C 24 Stunden im Vakuum getrocknet, wobei man das gewünschte Disiilfiit erhall

Beispiel 4

'■[!—( — H-Amino-fx-liydroxyvalerylj-kanauiycin I)
[BB-K33(IVb-2)]

ii) Zu einer gerührten Lösung voii 618 mg (I iiiMol) der Verbindung Il (R = NII;) in 30 ml Wasser/1,2 Di-

nieihoxyüthan (I :2) gibt man 364 mg (1 mMol) des, N-Mydroxysuccinimidesters von L-n-Bcnzyloxycarbonyl-ft-hydroxyvaleriansäure in 10 ml trockenem 1,2-Dimethoxyäthan auf einmal. Man rührt die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur und dampft im Vakuum ein. Pas wäßrige Konzentrat extrahiert man mit /wci 20-ml-Anlei!en mit Wasser gesättigtem n-Bulanol. Man dampft die Butanolextrükte zur Trockene ein, wobei sich 530 mg Feststoff ergeben, der in 40 ml Wasser/1,2-b) Dimcthoxyäthan (1 :l) gelöst und über Nacht bei Atmosphärendruck und Raumtemperatur mit 150 mg Palladium auf Aktivkohle hydriert wird. Der Katalysator wird durch Abfiltrieren entfernt. Das Fillrai wird im Vakuum eingedampft, um den größten Teil des organischen Lösungsmittels zu entfernen. Die wäßrige Lösung gibt man auf eine Kolonne von »Ambcrlitc CG-50« (NH₄*, HmI), die man mit 140 ml Wasser wäscht und dann mit 410 ml 0,1 n-, 760 ml 0,2 n-, 650 ml 0,5 n- und 510 ml 1.0 n-NH₄OH eluicrl. Das Eluat wird in 10 ml-Fraktioncn gesammelt. Die Gläser Nr. 127 bis 141, die bei Dünnschichlchromatographie auf Kieselsäuregclpiatte (Ninhydrin) einen Rf-Wert 0,22 !-.aben, werden vereinigt, im Vakuum eingedampft und lyophilisierl. wobei sich 103 mg (17%) der Verbindung BB-K 33 crgebcn.F. 185bis 190 C(7.ers.).

IR-AbsorptionsspcklrumiKBr):)'! ₍, 1635 cm '.
AnalyseC,,H^N_h(),> ■ 2 H-CO₁:

Ben: C 41.55. H 6.97. N 11,63%:

gcf.: C" 41,44, H 7,09, N 11,75%.

Das Mono· und Disulfat erhält man in der in Beispiel 3c) beschriebenen Weise.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten N-Hydroxysuccinimidester von L-jS-Benzyloxycarbonylamino-«- hydroxypropionsäure bzw. -valeriansäurc erhält man entsprechend den Angaben in der DT-OS 22 34 315 in folgender Weise:

N-I 'ydroxysuccinimidester von L-ß-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxypropionsäure

Zu einer gekühlten und gerührten Lösung von 478 mg (2 mMol) L-jJ-Benzyloxycarbonylamino-fX-hydroxypropionsäurc (VIl) und 230 mg (2 mMol) N-Hydroxysuccinimid in 10 ml Tetrahydrofuran gibt man 412 mg (2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt die Mischung 1 Sld. bei Null bis 5°C, 2 Sld. bei Raumtemperatur und filtriert dann ab, um den N.N'-DicycIohexylhd-nstoff zu entfernen. Das Filtral. das die obige Verbindung enthält, wird ohne weitere Abtrennung für die nächste Umsetzung verwendet.

Die L-^-Benzyloxycarbonylamino-nt-hydroxypropionsäure (Vl-I) stellt man wie folgt her:

8.2 g (0,078 Mol) L-/?-Amino-«-hydroxypropionsäurc (K. Freudenberg, Ber. 47, 2027 [1914]) löst man in einer Lösung von 6,56 g (0,0164 Mol) Natriumhydroxid und in 60 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung gibt man tropfenweise 14,7 g (0,086 Mol) Carbobcnzoxychlorid unterhalb 5"C. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur, wäscht mit 60 ifll Äther und stellt mit verdünnter HCl auf einen* pH-Wert von 2 ein. Der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei sich 9,65 g (52%) L-^-Bcnzyloxycarbonylamino-a^hydroxypropionsäurc (VI-I) ergeben, Das FHtral extrahiert man mit fünf ioo-ml-Anteilcn Äther. Die ätherische Lösung wäscht man mit Wasser, trocknet

über Natriumsulfat und dampft im Vakuum zur Trockene ein, wobei man weitere 2,0 g (1!%) U-ß-Benzyloxycarbonylamino-ix-hydroxypropionsäure (VI-I) erhält. Insgesamt 11,65 g Verbindung VI-I kristallisiert man aus 500 ml Benzol-Äihylaceiai (4:1), wobei sich 9,36 g (50%) reine Verbindung L-/i-Benzy|oxyearbonylamino-a-hydroxypropionsäure (Vl-I) ergeben, F. 128,5 bis 129,5° C.

IR-Absorptionsspektrum(KBr)i'( =₍₎ 1745,1690cm '; [α]Γ = +2,9"(C= 5,0, Methanol).

NMR-Spcktrum(DimelhylsulfoxydD_b): (5 (in ppm) 3,05- 3,45 (2 H, m, CH_aN), 4,05(1 H,d-d, -O-CH-CO-),5,03(2 H,S₁CH₂Ar) 7,18(1 H,breit, NH),7,36(5 H,s. Ring H).

Analyse C_nH_nNOi:

Ber.: C 55,23, H 5,48, N 5,86%; gef.: C 55.34. H 5.49. N 5.87%.

N-Hydroxysuceinimidcstcr von L-o-Ben/yloxycarbonyl-ft-hydroxyvaleriansäure

Zu einer gerührten und gekühlten Lösung von 535 mg (2,0 mMol) L-ä-Bcn/yloxycarbonylamino-rt-hydroxyvaleriansäure und 230 mg (2.0 mMol) N-I lydroxysuccinimid in 55 ml Äthylacetat gibt man 412 mg (2.0 mMol) N.N'·Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt die Mischung

jo 3 Stunden bei Raumtemperatur und filtriert ab, um ausgefällten Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Das I'iltrat wird im Vakuum eingedampft, wobei man 780 mg (100%) eines viskosen Sirups aus N-Ilydroxy succinimidesters von L-o-Bcnzyloxycarbonyl-ft-hydro

j-, xyvaleriansäure erhält.

IR-Absorptionsspcklrum (klar): 1725 cm '.

(, 1810. 1785.

α» Die L-o-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxyvalcriansäurc stellt man wie folgt her:

Zu einer gerührten Lösung von 400 mg (3,0 mMol) L-o-Amino-rt-hydroxyvalcriansäurc (S. Ohshiro el al.. Yakugaku Zasshi, 87, 1184 [1967]) und 250 mg

4-, (6,5 mMol) Natriumhydroxyd in 25 ml Wasser gibt man tropfenweise 580 mg (3,3 mMol) Carbobcnzoxychlorid innerhalb von 30 Minuten bei Null bis 5°C. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei 5 bis 15°C, wäscht mit 25 ml Äther, stellt mit Chlorwasserstoffsäurc auf einen pH-Wert von 2 ein und extrahiert mit drei 30-ml-Antciicn Äther. Die vereinigte ätherische Lösung schüttelt man mit 10 ml gesättigter Natriumchloridlösung, iiOcknet über wasserfreiem Natriumsulfat und dampft im \akuum ein, wobei sich Krislalle ergeben, die aus Benzol umkristallisicrt werden: man erhält 631 mg (78%) L-tf-Bcnzyloxycarbonylamino-rt-hydroxyvalcriansäurc, F. 110 bis 111"C.

IR-Absorptinnsspektrum (KBr): 3460.3350,1725. 1685.1535.'.280.730,690 cm '.

NMR-SpektrumiAccton-Da): Λ (in ppm) 1,70(4 H.ffi), 4,14(2 H.q.J = 4,5 Hz),4,19(1 H.ir), 4,82(2 H. s), 6,2 (3 H. breit), 7,25 (5 H,s).

[α]?? = +1,6(c·= 10, Methanol).
Analyse C13H17NO'-,:

Ber.: C 58,42, H 6,41, N 5,24%; gcf.: C 58,36, H 6,50, N 5,27%,

Claims

Patentansprüche:

Verbindungen der Formel HOCH,—NH₁

HO

NH-R

worin R L-( — )-/)-Amino-a-hydroxypropionyI oder L-{ — )-i5-Amino-«-hydroxyvaIeryl und R¹ OH oder NH₂ bedeuten, und deren nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Salze und Hydrate.
2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch I, dadurch gekennzeichnet,daß

a) eine Verbindung der Formel

HO

CH₂-NH-O-CO-CH₂

HO

H₇N

worin R¹ die oben angegebene Bedeutung besitzt, mil dem N-Hydroxysuccinimidcstcr von L-( — )-//-BenzyI-oxycarbonylamino-a-hydroxypropionsäure bzw. L-( - i^-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxyvalcriansäurc der Formeln

OH »

<? >-CHj O-CO-- NH-CH₂-CH- CO - O n'

I.-I - I

b/w.

C)II

^V-CiI₂-O-CO-NfI-CfI,-CfI₂-CH,- CH-CO-O- N I

L-I-)

in einem Verhältnis von olwa 0,5 bis etwa 1,4 Mol Acylierungsmillel pro Mol Verbindung Π in einem Lösungsmittel aeyliert.

b) aus der erhaltenen Verbindung der Formel

CH₁-NH-O-CO-CH₁

L-(-)CO — O — CH,-<f

HO

H₁N

worin π die Bedeutung 1 oder 3 besitzt und R^! die obenangegebene Bedeutung besitzt,
in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen durch Hydrieren in Gegenwart eCnes Pa.^;-,adium-Aktivkoh-Ie-Katalysators in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bei Atmosphärendru; \ und normaler Temperatur entfernt und gegebenenfalls das erhaltene Produkt anschließend in an sich bekannter Weise in ein nichttoxisches, pharmakologisch verträgliches Säureadditionssalz oder Hydrat überführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) und b) als Lösungsmittel eine Mischung aus Wasser und Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyäthan verwendet.