DE2234315B2

DE2234315B2 - L-(-)-gamma-amino-alpha-hydroxybutyrylderivate des kanamycins a und b, deren nicht-toxische saeureadditionssalze und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2234315B2
Application number: DE19722234315
Authority: DE
Inventors: Hiroshi; Naito Takayuki; Nakagawa Susumu; Tokio Kawaguchi
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1971-07-13
Filing date: 1972-07-12
Publication date: 1977-03-17
Also published as: SG20778G; AU462657B2; PH9589A; CY953A; AR201265A1; FI56388C; CA966831A; EG10889A; FR2145649A1; YU181872A; KE2850A; DK136251B; DD98927A5; IE36539L; NL7209617A; IL39872A; IL39872A0; IE36539B1; FR2145649B1; FI56388B

Description

~K CH₂-NH-O

\\^— o

-O- CO -CH₂

HO

worin R³ die oben angegebene Bedeutung besitzt, in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen durch Hydrieren in Gegenwart eines Palladium-Aktivkohle-Katalysators in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bei Atmosphärendruck und normaler Temperatur entfernt und gegebenenfalls das erhaltene Produkt anschließend in an sich bekannter Weise in ein nichttoxisches Säureadditionssalz überfuhrt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß

in Stufe a) als Lösungsmittel Dimethylformamid bzw. 1,2-Dimethoxyäthan und
in Stufe b) als Lösungsmittel eine Mischung aus Wasser und Äthylenglykoldimethyläther und

in Stufe c) wäßriges Dioxan (1 : 1) in Gegenwart einer katalytischen Menge Eisessig verwendet werden.

Die Erfindung betrifft halbsynthetische, in 1-Stellung substituierte Derivate von Kanamycin A und B. Diese Verbindungen werden durch Acylieren der 1-Aminofunktion von Kanamycin A oder B mit dem y-Amino-«-hydroxybutyrylrest hergestellt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in ihrer antibakteriellen Wirkung dem Kanamycin A und Kanamycin B überlegen.

Für das Derivat des Kanamycins A wird die Codenummer BB-K 8 und für das des Kanamycins B BB-K 26 verwendet. BB-K 8 hat die allgemeine Bezeichnung Amikacin erhalten.

Die Kanamycine sind bekannte Antibiotika, die im Merck Index, 8ih Edition, auf den Seiten 597 und 598 beschrieben ,sind. Kanamycin A ist eine Verbindung der Formel Ia

HO

NH,

Kanamycin B ist eine Verbindung der Formel Ib

HO

~K CH₂NH₂ \^-—o

Den Verbindungen der Erfindung kommt die allgemeine Formel

HO-

HO

(IV)

NH-R

zu, worin R³ eine Hydroxyl- oder Aminogruppe und R den L-( — )-;<-Amino-&-hydroxybutyrylrest bedeutet. In die Erfindung sind auch die nichttoxischen Säureadditionssalze eingeschlossen.

Die Bezeichnung »nichttoxisches Säureadditionssalz« bedeutet ein Mono-, Di-, Tri- oder Tetrasalz, das durch die Reaktion eines Mols der Verbindung IV mit 1 bis 4 Mol einer nichttoxischen Säure gebildet wird.

Zu diesen Säuren gehören Essigsäure. Chlorwasser-

a) 1 Mol Kanamycin B mit etwa 1 Mol

stoffsäure, Schwefelsäure, Mandelsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Bromwasserstoffsäure, Ascorbinsäure, Apfelsäure und Zitronensäure und die anderen Säuren, die üblicherweise zur Herstellung von Salzen Aminogruppen enthaltender Pharmazeutika verwendet werden.

Bevorzugt sind das Mono- und Disulfat der Verbindungen nach der Erfindung.

Das Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach der Erfindung besteht darin, daß man

r O-C-O—

in einem Lösungsmittel bei einer Temperatur unterhalb etwa 50⁰C umsetzt, b) die erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel

HO-^

CH₂-NH-OCO-CH₂-

NH,

^HO~

worin R₃ die oben angegeben·' Bedeutung besim. mit dem N-Hydroxysuccnümidcsier von M - V;-Bcn/yloxy-

709511/35?

ίο

OH O CH-O-CO —SH-CH;-CH--CH-C —O—N

in einem Verhältnis *on miBdesiero 0-5 bis et*a 3.4 Mol Aeylierungsmiuel pro Mol Verbindung H in einem Lösungsmittel acyfien.

cj aus der erhaltenen Verbindung der Formel

CHj-NH-O-CO-CH₂

HO —

*■*

HO--

CH₂OH

NH₂

HO

	-CH;-CH,	-NH
■ ο		CO
--ΝΉ—C-CH-		O
OH	M-V	CH
		\
		Y

worin R³ die oben angegebene Bedeutung besitzt, in an sich bekannter Weise die Schutzgrtippen durch Hydrieren in Gegenwart eines Paltadiem-Akttvkohle-Katafysators in emem mit Wasser mischbaren Lobei Atmosphärendruck und aormaler

gn^smittel bei Atmospfeärendriick und nwmaler Tenmerator eolfemt und gegebenenfaBs das erhaltene V>föfkÄ\ anschheeend in an sich bekannter Weise in ein nkhttoxisches Säureadditionssalz überfuhrt.

Gemäß einer vorteilhaften Ausbildung des Verlafarens «erden

m Stufe al ab Lösungsmittel Dimethylformamid bzw I J-Dimethoiyathan und in Stufe b) als Lösungsmittel eine Mischung aus Wasser und Athylengfykoldiniethyläther and in Stufe c| wäßriges Dioxaa (1:1) in Gegenwart katalyttseben Menge Eisess^ verwendet. Außer den für dk Stufe at genannten Lösungsnut rehi können ebenfe lh verwendet wjden Diraethv I acetamid. Tetrahydrofuran, Dioxan. Methanol. Alba

ss noil Wasser. Aceton. Pyridin. N-Nwdrigalkylpipen din« oder deren Mischungen, wobei vorzugsweisi unterhalb 25 C gearbeitet wird.

Außer den für Stufe b) genannten Lösungsmitteb aus eaier Mischung von Wasser und Äth)1engrykol

to dmethylätber können auch Mischungen von Wasse

¹^' E^°^xain· CNmethytacetanud. Dimethylformamki

Tetrahydrofuran. Propylenglykoidimethyttther ver

wendet werden.

Für die Stufe c) kann außer in wtBrigetn Dioxan π

*>< eäiem Losungsmittelsystem aus Wasser und Tetra h>drofuran. Ath>kngfykoldhnethyUther oder Propy fenglykokfaniethyläther gearbeitet werden

11

η*

12

Zum besseren Verständnis seien nachstehend die Reaküonsschemata der einzelnen Stufen des Verfahrens nach der Erfindung dargestellt:

a) Kanamycin A (Ia) oder
Kanamycin B (Ib)

N-(Benzyloxycarbonyloxy) .._.

HU Succinimid

HO

Il

CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ O

(o'-Monobenzyloxycarbonylkanamycin A oder B)

HO

H₂N NH,

NH₂

b) Verbindung II

HO

CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H₅ O

HO-

N-Hydroxysucrinimidester von L-(-)-y-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxybmtersäure

^HO~K CH₂OH \ NH,

\ W

HO

C=O HO-CH

CH₂

i Il

CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆Hs M-)-

c) Verbindung ΠΙ

14

HO

H₂/Pd/C

HO

NH

Bei der Herstellung des Kanamycins mit der geschützten Aminogruppe in 6'-Stellung in Sufe a) des Verfahrens der Erfindung verwendet man solche Molverhältnisse der Reaktionsteilnehmer, daß etwa ein Mol Acylierungsmittel pro Mol Kanamycin verwendet wird. Würde man die Menge des Acylierungsmittels erhöhen, so erhält man geringere Ausbeuten an gewünschtem Zwischenprodukt, und zwar deshalb, weil konkurrierende Nebenreaktionen zunehmen, die zu Verunreinigungen durch Polyacylderivate führen.

Ähnliches gilt für die Einhaltung der Temperatur. Arbeitet man z. B. in Stufe a) oberhalb 50° C, so führen Nebenreaktionen in größerem Ausmaß zu verminderten Ausbeuten.

In Versuchen wurden die Verbindungen nach der Erfindung in ihrer antibakteriellen Wirksamkeit mit Kanamycin A verglichen. Hierbei wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen überlegen mrksam sind. Dies geht aus den Werten der folgenden Tabellen hervor.

Tabelle 1 enthäl' die Werte für die Mindesthemmkonzentration (MlC) gegenüber einer Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Bakterien, die bei Steers Aga!"verdünnungsmethode erhalten werden. Die Werte nach der Tabelle II wurden bei der zweifachen Verdünnungsmethode erhalten.

Bei den in Tabelle 1 aufgeführten Versuchen wird Mueller-Hinton-Agar-Mediutn und bei den Versuchen in Tabelle II wird Heart-Infusion-Brühe verwendet.

Tabelle 1 (MIC y/ml)

Organismus

1. Alk. faecalis A-9423

2. Alk. faecalis A-20648

3. Ent. cloacae A-9656

4. Ent. species A-20

5. Ent. hamiae 1A-20674

6. E. coli A^0636

7. E. coli A-20 664

8. E. coli A-20 665

9. E. coh A-20 507

10. E. coli A-20 520

11. E. coli A-20 365

12. E. coli A-20 684

13. E. coli A-20 682

14. E. coli A-20 683 !5. E. coli A-20681

16. E. coli A-15 119

17. K. pneumoniae A-9867

Kanamy	Ver	8
cin A	bindung	> 125
(6-8198)	IVa	4
	[BB-K 8]	2
	Probe	1
	Nr. 4	1
16	4
> 125	1
4	2
>125	4
1	1
2	2
16	2
> 125	8
32	2
> 125	4
>125	4
2
>125
> 125
>125
4
4

Fortsetzung

Tabelle Il (MIC γΐπύ)

Organismus

Kanamy- Verein A bindung (6-8198) IVa

[BB-K 8] Probe Nr. 4

18. K. species A-20 328 > 125

Ϊ9. K. species A-20 330 32

20. K. species A-20 634 > 125

21. K. pneuraoniae A-20 680 > 125

22. K. pneumoniae A-9977 1

23. Pr..mirabilisA-9900 2

24. Pr. morganii A-15153 2

25. Pr. vulgaris A-9555 2 I

26. Pr. rettgeri A-9636 0,25 0,25

27. Pr. rairabilis A-20645 4 4

28. Pr. mirabilis A-20 454 2 2

29. Providencia stuartii A-20 615 2 1

30. Providencia alkalifaciens 2 1 A-20 676

31. Ps. aeruginosa A-20 229 32 2

32. Ps. aeruginosa A-9843A 125 16

33. Ps. aeruginosa A-20 653 > 125 32

34. Ps. species A-20 601 125, 63 16

35. Ps. species A-20 621 > 125 > 125

36. Ps. maltophiJia A-20 620 32 > 125

37. SaI. enteritidis A-9531 1 0,5

38. Sal. derby A-20 087 > 125 1

39. Ser. marcescens A-20 019 2 4

40. Ser. marcescens A-9933 4 8

41. Ser. marcescens A-20 460 > 125 4,2

42. Ser. marcescens A-20 459 4 16

43. Shig. flexneri A-9684 4 4

44. Aeromonas sp. A-20 670 2 2

45. Arizona sp. A-20 671 2 1

46. Citrobactersp. A-20673 4 4

47. Edwardsieila sp. A-20 678 4 4

48. Staph. aureus A-9606 1 1

49. Staph. aureus A-4749 0,5 1

50. Staph. aureus A-9537 2 1

51. Staph. aureus A-20 610 > 125 2

52. Staph. aureus A-20 240 > 125 8

53. Staph. aureus A-15 197 1 2

Mueller-Hinton-Medium +4% Schafblut

54. Str. faecalis A-9854

55. Str. faecalis A-9575

56. Str. pyogenes A-20 200

57. Str. pyogenes A-9604

58. Str. pyogenes A-15 040

59. Str. pyogenes A-20065

60. D. pneumoniae A-9585
fil D nneumoniae A-20 159

63 63

125 >125

32, 16 32 125 125 125

63, 32 125

125

63

>125

Organismus	Kanamy	Ver
	cin A	bindung
	(6-8196)	IVa
		[BB-K 8]
		Probe
		Nr. 4
1. D. pneumoniae +5%	63	63
Serum A-9585
2. Str. pyrogenes	125	125
±5% Serum A-9604
3. Staph. aureus Smith	0,5	0,5
A-9537
4. Staph. aureus A-9497	0,5	0,5
5. Staph. aureus A-20 239	>125	4
6. Staph. aureus A-20 240	> 125	4
7. Enter, cloacae A-0656	2	2
8. Enter, species A-20 364	>125	2
9. K. pneumoniae A- ^867	2	4
10. E.coliK-12	2	4
ML 1410 A-20 361
11. E. coli K-12	> 125	2
ML 1630 A-20 363
12. E. COÜK-12A-9632	2	1
13. E. coli A-20 664	32	8
14. E. coli A-20 6ό5	> 125	8
15. Pr. mirabilis A-9900	2	16
16. Pr. morganii A-15 153	4	16
17. Pr. vulgaris A-9436	1	2
18. Ps. aeruginosa A-20 227	4	1
19. Ps. species A-20 499	63	4
20. Ps. aeruginosa A-20 653	> 125	4
21. Ps. species A-20 621	> 125 >	■125
22. Ser. marcescens A-20 019	2	4
23. Ser. marcescens A-20 141	16	16

Die oben angegebenen Mindesthemmkonzentrationen zeigen, daß die Verbindung IVa (BB-K8) Kanamycin A an Wirksamkeit, insbesondere gegen Kanamycin A resistente Organismen, überlegen ist.

Die Daten für die Mindesthemimkonzentrationen

stehen auch in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die in vivo erhalten wurden.

Verbindung IVa und Kanamycin A sind bei Infektionen bei Mäusen, die durch Kanamycin A-empfindliche Stämme von E. coli A 15119 und Staph. aureus A 9537 verursacht werden, gleich wirksam. Obgleich die CD₅₀ Werte (heilende Dosis bei 50% tödlich infizierter Mäuse) für Staph. aureus A 9537 zeigen, daß Verbindung IVa geringfügig weniger wirksam ist als Kanamycin A. ist dieser kleine Unterschied kaum von Bedeutung, da die Dosierungen sehr verschieden waren (5malige Verdünnung).

Gegen den kanamycinresistenten Stamm E. coli A 20 520 war Kanamycin A in vivo erwartungsgemäß nicht wirksam, während Verbindung IVa eine ausgeprägte Schutzwirkung zeigt. Verbindung IVa war

ds gegenüber diesem Stamm von E. coli nahezu lOmal wirksamer, wenn sie in einem Behandlungsplan mit 4 Behandlungen verabreicht wurde: als bei einem Behandlungsplan mil 2 Behandlungen

Tabelle III

Vergleich von In-vitro- und In-vivo-Wirksamkeiten von Verbindung IVa und Kanamycin A

Verbindungen	Versuchs zahl	Staphylococcus sureus A9537	*CD₅₀)**	Escherichia A15I19	coii	2	Escherichia A20520	coii	2	2
		MIC	2,0 χ 2	MlC	CD₅₀		MIC	CD₅₀		4
Verbindung IVa	1	1	—	2	2 X	2	2	66 χ
	2	-Ί	0,5 χ 2	-	—		—	5x4
Kanamycin A	1	2		4	4 χ	125	200 χ
	2			—	—	200 χ

") MlC= Mindesthemmkonzentration (y/ml). Die Versuche werden durchgeführt wie von C h r i s h ο 1 m u. a. (Anumicrob. agents and Chemotherapie-1969, S. 244, 1970) beschrieben unter Verwendung von Mueller-Hinten-Agar als Testmedium.

*) CD₅₀ = Heilende Dosis, 50% (mg/kg/behandelt χ Anzahl der Behandlungen). Mäuse werden subkutan 1 und 4 Stunden nach Infektion bei 2 Behandlungen und 0, 2, 4 und 6 Stunden nach Infektion bei 4 Behandlungen behandelt Im übrigen wurde der Versuch durchgeführt wie von Price u.a. (J. of Antibiotics 22, 1, 1969) beschrieben. *) = Nicht getestet.

1-[M-H . . .._

von Kana-

(MIC) von 25

MIC-Werte sind durch ί

3°

Bristol Resi- MIC (y/ml)

35

Kanamy

Organismus

Bristol

Resi-

MIC <;·

ml)

Kanamv-

- Amino - α - hydroxy butyryl] - kanamy-

mycin A überlegen zeigt. Die nachstehende Tabelle IV

und Verbindung IVb (BB-K 26) gegen-

steers Aear-

Code Nr. stent

cin A

C OQc IN Γ.

stcnt
gegen

BBK-26

ein A

ein B (I V b) besitzt gleichfalls eine ausgezeichnete anti

zeigt die Mindesthemmkonzentrationen

über einer Vielzahl grampositiver und gramnegativer

Verdünnungsmethode (Tabelle IV) auf Nähragarme-

gegen BBK-26

bakterielle Wirksamkeit, die sich der

Kanamycin A

Bakterien. Die

dium erhalten.

°'⁸ 40

50

0,8 ⁴

Pc a^n ι—

A 20479

KM

1,6

Tabelle IV

0,4

1,6

JTa. ad u
ginosa D 113

A15119 1,6

50

Ps. aeru-

25

Organismus

A 15 169 1,6

0,8

ginosa D 113

A 20616

KM

3,1

A 20363 KM 0,8

>50 ⁴⁵

Ps. aeru-

50

A 9844 0,8

0,4

ginosa D 113

A 20 653

KM

25

A 20365 KM 0.4

3,1

Ps. aeru-

12,5

0,8

50

ginosa D 113

A 9843

1,6

E. coii NlHJ

A 20664 KM 0,8

0,2 50

Pseudo-

6,3

E. coii Juhl

A 20 665 KM 0,8

0,8

monas sp.

A 20355

1,6

E. coii Juhl

0,2

Pseudo-

12,5

E. coii Juhl

A 9678 0,8

1.6 «

monas sp.

A 20 358

KM

3,1

E. coii Juhl

' 55
12,5

Pseudo-

25

E. coii Juhl

A 20019 1,6

monas sp.

A 20 368

GM

50

E. coii K-12

3,1

>50

Pseudo-

25

E. coii K-12

monas sp

A 20 598

GM

6,3

E. coii K-12

KM 50

25 ^6o

Pseudo-

12,5

K. pneu-
moniae D 11

monas sp.

A 20 600

GM

3,1

K. pneu-

A 9923 1,6

6,3

Pseudo-

>50

moniae D 11

monas sp.

A 20 603

GM

6,3

S. marcescens

A 9930 0,8

25 ₆₅

Pseudo-

50

Ps. aeru-

monas sp.
Pr. vulgaris

A 20618

GM

50

0,8

ginosa D 15

A 15150 6,3

12,5

Pr. vulgaris

A 9436

1,6

0,8

Ps. aeru-

Pr. mirabilis

A 9526

0,8

1,6

ginosa D 113

A 15 194 1,6

Pr. mirabilis

A 9554

1,6

Ps. aeru-

Pr. morganii

A 9900

1,6

ginosa D 113

Pr. morganii

A 9553

1.6

3,1

Ps. aeru-

Pr. rettgeri

A 20031

6,3

0,8

ginosa D 113

S. aureus 209 P

A 15167

0,8

Ps. aeru-

S. aureus

1,6

0,4

ginosa D 113

Smith

0,8

Ps. aeru-

S. aureus

0,8

ginosa D 113

209 P

1,6

S. aureus

25

209 P

A 20 239

KM

1,6

S.lutea

3,1

PCl-1001

1,6

Fortsetzung

Organismus

Bristol
Code Nr.

Resistent

MIC <-, BBK-26

Kanamycin A

IO

20

M flavus 0,4 0,8

B. subtilis 0,1 0,1

PCl-219

St pyogenes 25 25

St pyogenes 1,6 i,6

St pyogenes A 9604 12,5 25

Digonnet

St pyogenes A 20065 25 25

Digonnet

D. pneu- 50 25

ffloniae

Mycobac- 6,3 0,8

terium 607

Mycobac-

terium 607

Mycobac-

terium 607

Mycobac- 1,6 1,6

tertum phlei

Mycobac- 6,3 1,6

terium ranae

Mycobac- 0,8 0,4

terium H₃₇Rv*)

*) Bestimmt durch Reihenverdünnungsmethode. KM bedeutet Kanamycin, GM bedeutet Gentamycin.

Die vorstehenden MIC-Werte zeigen, daß Verbindung IV b (BB-K 26) Kanamycin A an Wirksamkeit überlegen ist, insbesondere gegen Kanamycin-A-resistente Organismen.

Es wird eine in-vivo-Untersuchung der Verbindung IV b gegen sowohl Kanamycin-B-empfindliche als auch resistente Stämme von E. coli und Ps. aeruginosa durchgeführt.

Die Organismen werden wie folgt bezeichnet:

KM > 100 >100

Code Nr.

Kanamycin-Empfindlichkcit

E. coli Juhl
E. coli ML-1630

A 15119 A 20 363

Ps. aeruginosa D 15 —
Ps. aeruginosa D-113 -

Tabelle VI

empfindlich resistent (Phosphorylierung) mäßig resistent hoch resistent (Phosphorylierung)

Verbindung IV b (BB-K 26) und Kanamycin B sind bei Mäusen in einer Dosierung von 63 mg/kg gegen E. coli Juhl A 15119 gleich wirksam. Verbindung IV b ist am wirksamsten gegen Kanamycin B resistente E. coli ML-1630 bei einer Dosis von 6,3 mg/kg, verglichen mit 100 bis 400 mg/kg Kanamycin B.

Verbindung IV b zeigt eine leicht bessere Aktivität gegen mäßig resistente Ps. aeruginosa D 15 als Kanamycin B. Verbindung IVb zeigt eine wesentlich bessere Aktivität gegen hoch resistente Ps. aeruginosa D-113 als Kanamycin B (siehe folgende Tabelle).

Tabelle V

Dosis (se) E. coli JuM A15119 E. coli ML-1630

BB-K 26 KM-B*) BB-K 26 KM-B

400 mg/kg
100 mg/kg
25 mg/kg
6,3 mg/kg
1,6 mg/kg
CD₅₀ (mg/kg)

5/5
5/5
5/5
0/5
3,1

5/5 5/5 5/5 2/b 1,8

2/5 2/5 0/5 0/5

ca. 300

Dosis (se)

Ps. aeruginosa D1S BB-K 26 KM-B

100 mg/kg	5/5	5/5
25 mg/kg	1/5	0/5
6,3 mg/kg	1/5	0/5
1,6 mg/kg	0/5	0/5
CD₅₀ (mg/kg)	38	50

Dosis (se)

Ps. aeruginosa D-11 BB-K 26 KM-B

400 mg/kg
200 mg/kg
50 mg/kg
12,5 mg/kg
3,1 mg/kg
CD₅₀ (mg/kg)

0/5

3/5 1/5 0/5 0/5 145

>400

*) KM-B bedeutet Kanamycin B.

Die Zahlen 0/5,1/5,5/5 etc. geben die Aazahl überlebender Tiere pro 5 getesteter Tiere an, beispielsweise bedeutet 5/5, daß bei Behandlung mit Kanamycin B oder BB-K 26 von 5 Tieren 5 die tödliche Dosis des Testorganismus überlebten.

Nachstehend werden die erfindungsgemäßen Verbindungen noch mit anderen bekannten Aminoglycosiden verglichen. In Tabelle VI sind die Mindesthemmkonzenirationen (y/ml) aufgeführt.

BB-K8 BB-K 26

Kanamycin B Gentamicin Tobramycin

Ent. cloacae A 9656
Ent. cloacae A 20650
Ent. cloacae A 20957

0,63

1,3

0,63

5
8

0,63

21

22

Fortsetzung

!■

BB-K 8	BB-K 26	Kanamycin B	Gentamicin	Tobramycir
0,63	0,63	>160	8	8
2,5	0,32	80	40	80
>160	>160	160	40	160
0,63	1,3	1,3	0,63	0,32
VTjV-' 160	>160	>160	80	40
0,63	0,08	0,63	0,32	0,16
2,5	0,63	80	0,63	8
0,63	0,08	5	0,32	5
	1,3	>160	20	20
2,5	10	>160	40	40
0,04	0,02	032	0,16	0,16
1,3	1,3	>160	20	40
10	8	20	8	8
0,32	0,08	20	20	20
0,63	1,3	>160	1,3	8
0,63	0,32	1,3	40	0,63
40	40	40	20	20
0,32	0,08	0,63	0,32	0,16
0,63		>160	20	20
0,63		>160	20	20
0,63		>160	20	20
1,3		>160	20	20
1,3		>160	20	40
0,63	,3	2,5	0,32	0,63
0,63	,3	5	8	8
0,32	,3	0,63	0,16	0,16
1,3	.3	8	20	8
0,63	,3	>160	40	20
1,3	0,63	20	20	8
2,5	5	20	20	20
1,3	0,04	8	20	5
1,3	5	40	40	40
0,63	5	>160	>160	160
0,32	5	>160	>160	80
0,63	5	>160	20	20
2,5	5	8	2,5	2,5
2,5	8	>160	20	20
0,32	8	2,5	1.3	2,5
0,16	8	8	8	20
0,63	2,5	>160	20	20
0,32	1,3	>160	20	20
5	8	80	80	80
1,3	0,32	8	20	8
1,3	0,63	20	20	20
1.3	2,5	40	80	20
o,32	2,5	8	8	8
0,63	40	40	5	0,32
2,5	5	160	5	0,63
1,3	5	160	160	8
8
1,3
1,3
2,5
;
15

Ent cloacae A 20960 Ent cloacae A 20 953 Ent cloacae A 21136 Pseud, aerug. A 20971 Pseud, aerug. A 21234 E. coli A 9632 E. coli A 21218 E. coli A 20 664 E. coli A 20681 E. coli A 20683 E. coli A 20 360 E. coli A 21 225 E. coli A 21175 E. coli A 20 732 E. coli A 20766 E. coli A 20895 E. coli A 20 898 K. pneumoniae A 9977 K. pneumoniae A 21 228-1 K. pneumoniae A 21 236-1 K. pneumoniae A 20 636 K. pneumoniae A 20639 K. pneumoniae A 20680 Pr. mirabilis A 9900 Pr. mirabilis A 21222 Pr. rettgeri A 9637 Pr. rettgeri A 20645 Pr. rettgeri A 20915 Pr. rettgeri A 20920 Pr. rettgeri A 20921 Pr. rettgeri A 21182 Pr. rettgeri A 21 207 Pr. rettgeri A 21 241 Pr. rettgeri A 21 268 Pr. rettgeri A 21 269 Pr. vulgaris A 21 201 Pr. vulgaris A 21 240 Prov. stuartii A 21 210 Prov. stuartii A 20 734 Prov. stuartii A 20 746 Prov. stuartii A 20 747 Prov. stuartii A 20 894 Prov. stuartii A 21 213 Prov. stuartii A 21 073 Prov. stuartii A 20912 Prov. stuartii A 21 059 Ps. aeruginosa A 20 553 Ps. aeruginosa A 9843 A Ps. aeruginosa A 21 229

Die Verbindungen nach der Erfindung sind wert- <ss wertvoll bei der Behandlung von Infektions

voll als antibakterielle Mittel, Beifuttermittel zu Tier- heiten, die durch grampositive und gramm

futter, als therapeutische Mittel bei Geflügel und Bakterien verursacht werden.

Tieren und auch beim Menschen und sind besonders Sie sind bei oraler Verabreichung brauchl

zusätzliche Behandlung zur voroperativen Slerilisierung des Darmes. Sowohl aerobe als auch anaerobe Flora, die auf diese Mittel anspricht, wird im Dickdarm reduziert. In Verbindung mit mechanischer Reinigung sind sie bei den Vorbereitungen für Dickdarmchirurgie brauchbar.

Weiter sind sie wirksam bei der Behandlung von systemischen bakteriellen Infektionen, wenn sie parenteral in einem Dosierungsbereich von etwa 250 bis etwa 3000 mg pro Tag in geteilten Dosen drei-oder viermal täglich verabreicht werden. Im allgemeinen sind die Verbindungen wirksam, wenn sie in einer Dosierung von etwa 5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht alle 12 Stunden verabreicht werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung:

Beispiel 1
aj 6'-Carbobenzoxykanamycin A (II)

Eine Lösung von 42,5 g (90 mMol) Kanamycin A freie Base in 450 ml Wasser und 500 ml Dimethylformamid wird unterhalb OC gekühlt und heftig gerührt. Zu der Lösung gibt man tropfenweise innerhalb von etwa 2 Stunden eine Lösung von 22,4 g (90 mMol) N-iBenzyloxycarbonyloxyJ-succinimid in 500 ml Dimethylformamid. Die Mischung wird bei —10 bis 0 C über Nacht und dann einen Tag lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wird bei verringertem Druck unterhalb etwa 50 C eingedampft. Den öligen Rückstand löst man in einer Mischung von 500 ml Wasser und 500 ml Butanol, filtriert die Mischung, um unlösliches Material zu entfernen und in zwei Schichten zu trennen. Die Butanol- und wäßrigen Schichten werden mit mit Butanol gesättigtem Wasser (500 ml χ 2) bzw. mit mit Wasser gesättigtem Butanol (500 ml χ 2) behandelt, wobei man ein Verfahren ähnlich der Gegenstromverteilung verwendet. Die drei wäßrigen Schichten werden vereinigt und bei verringertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei sich ein öliger Rückstand ergibt, wovon ein Teil bei Stehen bei Raumtemperatur kristallisiert. Zu dem Rückstand einschließlich der Kristalle gibt man etwa 100 ml Methanol, das das Ol löst und es von den Kristallen trennt. Nach Zugabe von etwa 300 ml Äthanol wird die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht stehengelassen, wobei sich eine kristalline Masse ergibt, die durch Filtrieren gesammelt wird. Sie wiegt 44 g. Das Produkt enthält eine kleine Menge Kanamycin A, wie durch Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von n-Propanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser(15: 10:3:12) als Lösungsmittelsystem und Ninhydrin als Sprühreagens festgestellt wird.

Das rohe Produkt wird in 300 ml Wasser gelöst und auf einer Säule (30 mm Durchmesser) lonenaustauscherhar? (NHJ-Typ. 500 ml) Chromatographien. Die Säule wird mit 0.1 n-Ammoniumhydroxydlösung gespült, und das Fluat 'vird in 10-ml-Fraktionen gesammelt. Das gewünschte Produkt ist in den Fraktionen !0 bis 100 enthalten, während Kanamycin A aus sich langsamer bewegenden Fraktionen gewonnen wird und die Stellungs-lsomeren des Produkts in den sich rascher bewegenden Fraktionen enthalten zu sein scheinen. Die Fraktionen !0 bis HO werden vereinigt und unter verringertem Druck rar Trockne eingedampft, wobei sich 24.6 g (45%) eines farblosen Produkts. 6-Carbobenzoxykanamycin A (H) [6'-Cb?- kanamycin A] ergeben, das bei 204 C zu schmelzen

und sich zu färben beginnt und sich bei 21T C unter Gasentwicklung zersetzt.
[*]„ + 106° ic = 2, H₂O).

S Dünnschichl-	IO	n-PrOH-Pyridin-	Rf-Werl	,O	fl,33 0,15	Kana
chromatographie	AcOH-H₂O			lieringer	my
Silikagcl F₂₅₄,	(15:10:3:12)		CHjCOOMe-n-PrOH-		cin A
Ninhydrin)	ι s Ace.ton-		kon? NH₄OH	0,24
Lösungsmittelsystem	CH₃COOH-H₂O	6'-Cbz-Kanamycin A	(45:105:60)		0,04
(20:6: 74)		*) Festgestellt durch
CHCl₃-MeOH-			0,76
kon?. NH₄OH-H₂				0,14
20 (1:4:2:1)	0,42
(Haupt		0,22*)
menge)			0,50

	Anthron-Schwcl elsäurc.
		0,04*)

Durch Dünnschichtchromatcigraphie mit einem der getesteten Lösungsmittelsysteme wird festgestellt, daß das Endprodukt zwei Komponenten in geringfügigem Ausmaß enthält. Das Endprodukt wird jedoch ohne weitere Reinigung für die Herstellung von BB-K 8 verwendet.

b) l-[L-( - !-,-Benzyloxycarbonylamino-n-hydroxybutyryl]-6'-carbobenzoxy-kanamycin A (111 a)

Eine Lösung von 1,6 g (4,6 raMo!) des N-Hydroxysuccinimidesters der L-( — i-^-Benzyloxycarbonylamino-oi-hydroxybuUersäure (VIl) in 40 ml Äuiylenglykoldimethyläther gibt man tropfenweise zu einer

4c gerührten Lösung von 2,6 g. (4,2 mMol) 6'-Monobenzyloxycarbonylkanamycin A (II) in 40 ml 50%igem wäßrigem Äthylenglykoldime thy lather und rührt die Mischung über Nacht. Man dampft die Reaktionsmischung bei verringertem Druck ein, wobei sich ein brauner Rückstand der Verbindung 111 a ergibt, der ohne weitere Reinigung für die nächste Umsetzung verwendet wird.

c) 1 -[ L-( - )-,-Amino-t-hydroxybutyry1]-kanamycin A (IV a) BB-K 8 (Amikacin)

Das rohe Produkt 111 a der Stufe b) wird in 40 ml 50%igem wäßrigem Dioxan gelöst, und eine kleine Menge unlösliches Material wird durch Abfiltrieren entfernt. Zu dem Filtrat gibt man 0.8 ml Eisessig und 1 g 10%-Palladium-auf-Akiivkohle und hydriert die Mischung bei Raumtempetatur 24 Stunden in einer Parr-Hydriervorrichtung. Man filtriert die Reaktionsmischung ab. um den Palladium-Katalysator zu entfernen und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird in 30 ml Wasser gelöst und auf einer ionenaustauscherharesäule (NH₄*-Typ. 50 cm χ 1.8 cm) Chromatographien.

Man wäscht die Säule mit 200 ml Wasser und ehiiert dann mit 800 ni 0.1 n-NH^OH. 500 ml 0.2H-NH₄OH und schließlich mit SOOmlO.Sn - NH₄OH 10-ml-Fraktionen werden gesammelt, und Fraktionen 146 bis 154 enthalte! 552 mg (22%. ausgehend von Carnobcnzoxykanaiwcin A. H) an Produkt IVa.

709 SU/357

das als BB-K 8, Probe 2, bezeichnet wird. F. = 187 (Zers.). Relative Wirksamkeit gegen B. subtilis (Agarplatte) = 560)'/mg (Standard: Kanamycin A freie Base).

Eine Lösung von 250 mg BB-K 8, Probe 2, in 10 ml Wasser wird auf einer Säule (NH₄ ⁺-TyP, 30 cm χ 0,9 cm) Chromatographien. Die Säule wird mit 50 ml Wasser gewaschen und dann mit0,2 n-NH^OH eluiert. 10-ml-Fraktionen werden gesammelt. Die Fraktionen 50 bis 63 werden vereinigt und bei verringertem Druck zur Trockne eingedampft, wobei sich 98 mg des reinen Produkts. BB-K 8. Probe 2-1, ergeben. F. = 194" (Zers.),[<*]? + 85 (c = 2, H₂O). Relative Wirksamkeit gegen B. subtilis (Agarplatte) = 960 y/mg (Standard: Kanamycin A freie Base).

Analyse für C₂₂H₄₃N₅O₁₃ · 2 H₂CO₃: Berechnet ... C 40,62, H 6,68. N 9.87%: gefunden .... C 40.21, H 6,96. N 9,37%; C 39,79, H 6,87. N 9,49%.

Beispiel 2 a) ö'-Carbobenzoxykanamycin B (11)

Zu einer abgekühlten Lösung von 8,1 g (0.0168 Mol) Kanamycin B in 120 ml Wasser und 80 ml 1,2-Dimethoxyäthan gibt man tropfenweise unter Rühren eine Lösung von 4,2 g (0,0168 Mol) N-(Benzyloxycarbonyloxyj-succinimid in 40 ml 1,2-Dimethoxyäthan. Man rührt die Reaktionsmischung über Nacht und dampft bei verringertem Druck ein. Der Rückstand wird in 100 ml Wasser gelöst und zweimal mit 50ml mit Wasser gesättigtem n-Butanol geschüttelt. Die wäßrige Schicht wird abgetrennt und auf einer Säule von 100 ml (NH^-Typ) absorbiert. Die Säule wird mit 200 ml Wasser gewaschen und mit 0,05 n-NH^OH eluiert. Das Eluat wird in 10-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 121 bis 180 werden gesammelt, eingedampft und gefriergetrocknet, wobei sich 1,58 g (15%) des gewünschten Produkts ergeben. Die Fraktionen 1 bis 120 werden eingedampft und erneut über einer Säule (NH⁺-TyP) Chromatographien, wobei sich 1,21 g(12%) Produkt ergeben. F. = 151 bis 152°C (Zers.).

[*]? +104^: (C. 2,5, H₂O). ;_{c = o} 1710 cm¹.

Analyse für C₂₆H₄₃N₄O₁₂:

Berechnet ... C 50,56, H 7,02, N 11.34%: gefunden .... C 50,71, H 7,38, N 11,48%.

Dünnschichtchromatographie (Silikagel F 254). RfO,O3 in 11-C₃H^OH-CH₃COOH-H₂O(15 10:3:12». Rf 0,16 in Aceton-AcOH-HjO (20:6:74).

b) 1 -[L-( - H-Benzyloxycarbonylamino-t-hydroxybutyryl]-6'-carbobenzoxy-kanamycin B (III b)

Zu ein«· gerührten Lösung von 1,85 g (3,0 mMol) 6-Carbobenzoxykanamjcin B in 40 ml H₂O und 50 ml 1.2-Dime'hoxyäthan werden auf einmal bei 5'C 1,1g (3,i inMoi) N-jL-y-Carbobenzoxyamino- «-hydroxybutyryloxyhsuccmiinid gegeben. Die Reaktionsmischung wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und einer Hydrogenolyse unterworfen, ohne daß das Carbobenzoxyderivat (III b) entfernt wird.

Dünnschichtchromatographie (Silikagel F 254). Rf 0,06 (Ausgangsmaterial), 0.41,0,57 (H-C₃H-OH-Pyridin-CH,COOH-H₂O = 15: 10:3:12). Rf 0.11 (Ausgangsmaterial) 0,21, 0,34, 0,46 (Aceton-AcOH-H₂O = 20 :6: 74).

c) l-[L-( — )-;-Amino-*-hydroxybutyryl]-kanamycin B (IV b) BB-K 26

Zu der gemäß Beispiel 2 b) erhaltenen Lösung gibt man 0,2 g 10%igen Palladium-auf-Aktivkohle-Katalysator. Nachdem die Mischung bei Atmosphärendruck 5 Stunden hydriert worden ist, gibt man weitere

ίο 0,1 g 10%igen Palladium-auf-Kohlenstoff-Katalysator und 10 ml Wasser zu. Die Hydrierung wird über Nacht fortgesetzt. Man filtriert die Reaktionsmischung ab, dampft das Filtrat unter verringertem Druck ein, löst den Rückstand in 50 ml Wasser und chromatographiert auf einer Säule (NH₄ ⁺-TyP 1,2 cm χ 50 cm). Die Säule wird mit 200 ml Wasser gewaschen und dann mit 500 ml 0,1 n-NH^OH, 500 ml 0,2 n-NHUOH, 900 ml 0.5 ^NH₄OH und 500 ml I ^NH₄OH eluiert. Die Abströme werden in 10-ml-Fraktionen gesammelt.

Kanamycin B wird aus Fraktionen 60 bis 76 in einer Ausbeute von 32% gewonnen (459 mg). Die Fraktionen 128 bis 138 werden gesammelt, unter verringertem Druck eingedampft und gefriergetrocknet, wobei sie 318 mg (17%, basierend auf Carbobenzoxykanamycin B) an BB-K 26 (IVb) ergeben. F. = 186 bis 187 C (Zers.).
[*]? +78 (C. 1.15. H₂O). y_{c = o} 1640 cm"¹.

Analyse Tür C₂₂H₄₄N₆O₁₂ · H₂CO₃:
Berechnet ... C 42,72, H 7,17, N 13,00%;
gefunden .... C 42,23. H 7,19, N 12.37%.

Dünnschichtchromatographie (Silikagel F 254,

Ninhydrin). Rf 0.11 in Aceton-AcOH-H₂O (20:6: 74),

Rf 0,19 in CHCl₃-MeOH- konz. NH₄OH-H₂O

(1:4:2:1).

Beispiel 3

Monosulfate von l-[L-(-)-_:-Amino-K-hydroxybutyryl]-kanamycin A (IVa) oder B (IVb)

1 Mol l-[L-(-)-;-Amino-^-hydroxybutyryl]-kanamycin A oder B wird in ! bis 3 Liter Wasser gelöst. Die Lösung wird abfiltriert, um jegliche ungelösten

Feststoffe zu entfernen. Zu der abgekühlten und gerührten Lösung gibt man 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser. Man rührt die Mischung 30 Minuten, danach wird kaltes Äthanol zu der Mischung gegeben, bis ein Niederschlag entsteht. Die

Feststoffe werden durch Filtrieren gesammelt und als das gewünschte Monosulfatsalz bestimmt.

Beispiel 4

Disulfat von l-[L-(-)-_rAmino->-hydroxybutyryll-kanamyctn A (IVa) (BB-K 8 2H₂SO₄)

35 g l[L-(-|-_:-Amino-3i-hydroxybutyryl]-kanamycin A (in Form des Monobicarbonattrihydrats)

to werden in 125 ml entionisiertem Wasser gelöst. Man mißt einen pH-Wert von etwa 9,0. Der pH-Wert wird mit 50% Vol./Vol. Schwefelsäure auf 7 bis 7,5 gesenkt. 8,5 g Darco G-60 (Entfärbuagskohfc) werden zugegeben, und die Mischung wird bei Raum-Umge-

*5 bung^temperatitr (^Standen aufgeschlämmt. Die Kohle wird durch geeignetes Abfiltrieren entfernt und nut 40 ml Wasser gewaschen. Das Waschwasser wird zu dem Filtrat gegeben.

Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten, wie oben erwähnt, werden mit 50%iger VoL/Vol. Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 bis 2,6 eingestellt. Es entwickelt sich eine große Menge Kohlendioxyd. Die Lösung wird 20 Minuten lang im Vakuum unter Rühren belassen, um weiteres Kohlendioxyd zu entfernen.

Zu der entgasten Lösung gibt man 8,5 g Aktivkohle. Die Mischung wird 0,5 Stunden bei Raumtemperatur aufgeschlämmt. Die Kohle wird durch geeignetes Abfiltrieren entfernt und mit 35 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Das Wasser wird zum Filtrat gegeben.

Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mit 50%iger Vol./Vol. Schwefelsäure auf einem pH-Wert von 1 bis 1,3 eingestellt. Diese Lösung wird innerhalb von 10 Minuten unter raschem Rühren zu 600 bis 800 ml Methanol (3 bis 4 Volumen Methanol) gegeben. Man rührt die Mischung 5 Minuten beim pH-Wert 1 bis 1,3, gibt sie durch ein Sieb mit 100 Maschen (0,148 mm Maschenweite), dann wird 2 Minuten gerührt und 5 Minuten absetzen gelassen. Der größte Teil des überstehenden wird dekantiert. Die zurückbleibende Aufschlämmung wird geeignet abfiltriert, mit 200 ml Methanol gewaschen und bei 50C 24 Stunden im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an amorphem BB-K 8 (Dihydrogensulfat)₂ beträgt 32 bis 34 g.
M? H₂O = +74,75, Zersetzung bei 220 bis 23O°C.

Elementaranalyse [auf Trocken basis*)]:
CNS Asche

Null

Die Herstellung des Ausgangsmaterials erfolgt in folgender Weise:

I. N-( BenzyloxycarbonyloxyJ-succinimid

N-Hydroxysuccinimid (G. W. A η d e r s ο η u. a., J. Am. Chem. Soc. 86, 1839 [1964]) (23 g, 0,2 Mol) werden in einer Lösung von 9 g (0,22 Mol) Natriumhydroxyd in 200 ml Wasser gelöst. Zu der gerührten Lösung gibt man tropfenweise 34 g (0,2 Mol) Carbobenzoxychlorid, wobei man mit Wasser kühlt, dann wird die Mischung bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, um das Carbobenzoxyderivat abzutrennen, das durch Abfiltrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet wird. Die Ausbeute beträgt 41.1 g (82%). Umkristallisation aus Benzol n-Hexan (10:1) ergibt farblose Prismen mit einem F. 78 bis 79 C.

H. 1) L-( - H-Amino-ft-hydroxybuttersäure

a) aus Ambutyrosin A oder B

oder deren Mischungen

5.0 g Ambutyrosin A (US-Patentschrift 35 41 078) werden mit 160 ml 0,5 n-Natriumhydroxyd 1 Stande zum Rückfluß erhitzt. Das Hydrolysat wird mit 6 n-HCl neutralisiert und auf einer Säule (NH₄ ⁺-TyP) Chromatographien.

•!Wassergehalt bestimmt nach Karl Fisber: 233. 1.79, 2,87% (Theorie IBr Monohydrat ist 2^5% Wasser). Dieses Salz ist hygroskopisch aber nicht zerfließend Nach Lagerung einer aliquoten Teils an Luft bei Raumtemperatur innerhalb von 18 Standen erhöht sich der Wassergehalt auf 9.55. 9.89% (Theorie far Pmtahvdrat ist IO33% Wasser).

Berechnet ...	33,5	8,97	8.2
gefunden ....	32,7	8,78	8,75
	33,5	8,7	8,9
	32,5	8,2	7,8
		8,8	8,85

Die gewünschte L-( — )-y-Amino-a-hydroxybuttersäure wird isoliert, indem man die Säule mit Wasser entwickelt und das Wasser durch Gefriertrocknen entfernt. Die L-( — )-y-Amino-a-hydroxybuttersäure ist gekennzeichnet als kristallines Material mit einem F. 212,5 bis 214,5⁰C (US-Patentschrift 35 41078, Spalte 2, Zeilen 31 bis 38).

b) aus DL-a-hydroxy-y-phthalimidobuttersäure

A. Dehydroabietylammonium-L-51-hydroxyy-phthalimidobutyrat

Zu einer Lösung von 25 g (0,1 Mol) 2-Hydroxyy-phthalimidobuttersäure (Y. S a i t ο u. a., Tetrahedron Letters, 1970, 4863) in 200 ml Äthanol gibt man eine Lösung von 29 g (0,1 Mol) Dehydroabietylamin in 130 ml Äthanol. Man schüttet die Lösung 1 Minute lang heftig, dann läßt man sie bei Raumtemperatur 5 Stunden stehen. Währenddessen kristallisieren feine Nadeln aus. Die Kristalle werden durch Filtrieren gesammelt, mit 50 ml Äthanol gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei man 30,1 g (56%) eines Diastereomeren des Dehydroabietylaminsalzes erhält. F. = 93 bis 94°C. [*]? +15° (C. 2,5, MeOH). Umkristallisation aus 300 ml Äthanol ergibt 23,2 g (43%) des reinen Produkts. F. = 94 bis 95 C, [*] i' +10,8° (C. = 2,5, CH₃OH). Weitere Umkristallisation ändert den Schmelzpunkt und die spezifische Rotation nicht.

Analyse für C₃₂H₄₂N₂O₅ · H₂O:

Berechnet ... C 69,54, H 8.02, N 5,07%;
gefunden .... C 69,58. H 8,08, N 5,07%.

B. L-( - )-;-Amino-k-hydroxybuttersäure

Zu einer Lösung aus 1,5 g (0,014 Mol) Natriumcarbonat in 40 ml Wasser gibi man 5,3 g (0,01 Mol) Dehydroabietylammonium - L -«- hydroxy - >- phthalimidobutyrat und 60 ml Äther. Die Mischung wird heftig geschüttelt, bis sich der ganze Feststoff gelöst hat. Die Ätherschicht wird abgetrennt. Die wäßrige Lösung wird zweimal mit 20-ml-Anteilen Äther gewaschen und auf 15 ml unter verringertem Druck eingedampft. Zu dem Konzentrat gibt man 10 ml konz. Chlorwasserstoffsäure und erhitzt die Mischung 10 Stunden zum Rückfluß. Nach Abkühlen wird abgetrennte Phthalsäure durch Abfiltrieren entfernt. Das Filtrat wird unter verringertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst, und die Lösung wird zur Trockne eingedampft. Dies wird zweimal wiederholt, um überschüssige Chlorwasserstoffsäure zu entfernen. Der zurückbleibende Sirup wird in 10 ml Wasser gelöst und abfiltriert, um eine kleine Menge unlöslicher Phthalsäure zu ent fernen. Das Filtrat wird auf einer Säule (H ⁺-Typ, 1 cm χ 35 cm) absorbiert, die Säule wird mit 300 ml Wasser gewaschen und mit 1 n-Ammoniumhydroxydlösung eluiert. Das Eluat wird in 15-ml-Fraktionen gesammelt. Die ninhydrinpositiven Fraktionen 10 bis 16 werden vereinigt und unter verringertem Druck eingedampft, wobei sich ein Sirup ergibt, der allmählich kristallisiert. Die Kristalle werden mit Äthanol verrieben, filtriert und in einem Vakuumexsikkator getrocknet, wobei sich 0,78 g (66%) M — )-y-Ami-

6s no-i-hydroxybuttersaure ergeben. F. = 206 bis 207 C. [»] ? -29 (C. 2,5, H₂O). Das IR-Spektrum ist identisch mit dem der aus Ambutyrosin erhaltenen authentischen Probe.

III. L-( — )-y-Benzyloxycarbonylamino-α-hydroxybuttersäure (VI)

7,4 g (0,062 MoI) L-(—)-y-Amino-a-hydroxybuttersäure werden zu einer Lösung von 5,2 g (0,13 Mol) Natriumhydroxyd in 50 ml Wasser gegeben. Zu der gerührten Lösung gibt man tropfenweise bei 0 bis 5 C innerhalb von 0,5 Stunden 11,7 g (0,068 Mol) Carbobenzoxychlorid und rührt die Mischung 1 Stunde bei der gleichen Temperatur weiter. Dann wäscht man die Reaktions-Mischung mit 50 m! Äther, stellt den pH-Wert mit verdünnter ChlorwasserstofTsäure auf den pH-Wert 2 ein und extrahiert mit vier 80-ml-Anteilen Äther. Man vereinigt die ätherischen Extrakte, wäscht sie mit einer kleinen Menge gesättigter Natriumchloridlösung, trocknet sie mit wasserfreiem Natriumsulfat und filtriert ab. Man dampft das Filtrat im Vakuum ein und kristallisiert den sich ergebenden Rückstand aus Benzol um, wobei man 11,6 g (74%) farblose Plättchen erhält. F. = 78.5 bis 79,5° C, M ο = 4,5° (c = 2, CH₃OH).

IR-Spektrum [KBr)]:IR(KBr) _rc=o 1740,1690 crrT'.

NMR-Spektrum (Aceton-D₆) (in ppm aus TMS)*) 2,0 (2H, m), 3.29 (2H, d-d, J = 6, 7 und 12 Hz). 4.16 (IH, d-d, J = 4,5 und 8 Hz), 4,99 (2N.s). 6.2 (2H. breit) 7,21 (5 H. s).

Analyse für C₁₂H₁₅NO₅:

Berechnet ... C 56,91, H 5,97, N 5,53%:
gefunden .... C 56,66, H 5,97, N 5,47%.

*) TMS = Tetramethylsulfoxyd.

IV. N-Hydroxysuccinimidester der L-( - l-;-Benzyloxycarbonylamino-*-hydroxybuuersäure (VIl)

Man kühlt eine Lösung von 10.6 g (0.042 Mol) L-( — )--'-Benzyloxycarbonylamino-.A-hydroxybuttersäure und 4,8 g (0,042 Mol) N-Hydroxysuccinimid¹) in 200 ml Äthylacetat auf 0 C und gibt dann 8.6 g (0,042 Mol) Dicyclohexylcarbodiimid zu. Man läßt die Mischung über Nacht in einem Kühlschrank. Der DicyclohexyihamstofT, der sich abgetrennt hat, wird abfiltriert, und das Filtrat wird bei verringertem Druck auf etwa 50 ml reduziert, wobei sich farblose Kristalle der Verbindung VIl ergeben, die durch Abfiltrieren gesammelt werden. Die Ausbeute betrt^:et 6.4 g. F. = 121 bis 122,5°C. Man dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockne ein und wäscht den kristallinen Rückstand mit 20 ml einer Mischung von Benzol-n-Hexan. wobei sich eine zusätzliche Menge Verbindune VIl ergibt. Die Gesamtausbeute beträat 13.4 e (92%). [»] _D 1.5 (c = 2, CHCl₃).

lR-Spektrum(KBr)yc=o 1810,1755,1740.1680cm"¹.

NMR-Spektrum (Aceton-DJ Λ (in ppm aus TMS) 2.0 (2H.m). 2.83 (4H.s). 3.37 (2H, d-d. J = 6.5 und 12.5Hz). 4.56(1 H, m). 4,99 (2 H. s), 6.3 (2 H. breit). 7.23 (5 H. s).

Analyse Tür C_lhH,_gN₂O₇:

Berechnet ... C 54.85. H 5.18. N 8.00%:

gefunden C 54.79. H 5.21. N 8.14%;

C 54.70. H 5,20. N 8,12%.

') G. W. Aderson u. a.. J. Am. Chcm. Soc.. Sh. 1S39

Claims

Patentansprüche:

L Verbindungen der uillgemeinen Formel HO

_NH _ CO—CH — CH₂- CH₂- NH₂

OH W-)-

worin R³ OH oder NH₂ bedeutet und deren nichttoxische Säureadditionssalze.
2. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) 1 Mol Kanamycin A oder Kanamycin B mit etwa 1 Mol

O ρ \- rn.—n—r—η—

CH₂-O-C-O-N

in einem Lösungsmittel bei einer Temperatur unterhalb etwa 50⁰C umsetzt, b) die erhaltene Verbindung der allgemeinen Foimel

CH₂- NH -OCO -CH,

worin R₃ die oben angegebene Bedeutung besitzt, mit dem N-Hydroxysuccinimidester von L-(-)-y-Benzyl-

oxycarbonylamüio-ioc-hydroxybuttersäure der Formel

OH O 3^CH₂O-CO-NH-Ch₂-CH₂-CH-C-O-N

in einem Verhältnis von mindestens 0,5 bis etwa 1,4 Mol Acylierungsmittel pro Mol Verbindung II in einem Lösungsmittel acyliert,

c) aus der erhaltenen Verbindung der Forme}