DE2408666B2

DE2408666B2 - Antibiotische verbindungen, deren nicht-toxische, pharmakologisch vertraegliche salze und hydrate und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2408666B2
Application number: DE19742408666
Authority: DE
Inventors: Takayuki; Nakagawa Susumu; Abe Yoshio; Tokio Naito
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1973-02-23
Filing date: 1974-02-22
Publication date: 1978-02-16
Also published as: DK140259C; NL7402456A; FR2218879A2; CH599243A5; DK140259B; SE417972B; AU6587574A; JPS553360B2; CA1046513A; DE2408666C3; FR2218879B2; JPS504043A; GB1467401A; DE2408666A1

Description

HO-

4' 6'

HO

CH₂-NH₂

(IV)

NH-R

rin R¹ die Bedeutung OH oder NH₂ besitzt und R die deutungen L-( —)-j3-Amino-ot-hydroxypropionyl oder —)-d-Amino-a-hydroxyvaleryl bedeutet, und deren httoxische, pharmakologisch verträgliche Säureaddinssalze und Hydrate sowie Verfahren zu deren Herstellung. Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben die Bezeichnungen l-[L-( — )-/?-Amino-«-hydroxypropionyl]-kanamycin A, l-[L-(—)-/?-Amino-a-hydroxypropionyl]-kanamycin B, l-[L-( — )-ö-Amino-<x-hydroxyvalerylj-kanamycin A und l-[L-(—)-ö-Amino-a-hy-

droxyvalerylj-kanamycin B.

Die Kanamycine sind bekannte Antibiotika und im Merck Index, 8. Aufl., auf Seiten 597 bis 598 beschrieben.

Die mit l-[L-( — )-y-Amino-a-hydroxybutyryl]-kanamycin A [BB-K8] bezeichnete Verbindung ist in Journal of Antibiotics, 25 (12), Seiten 695-711 (Dezember 1972) bzw. in der DT-OS 22 34 315 beschrieben.

Die bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung verwendete Bezeichnung »nichttoxisches, pharm^kologisch verträgliches Säureadditionssalz« bedeutet ein Mono-, Di-, Tri-, Tetra- oder .'entasaiz, gebildet durch Reaktion eines Moleküls der Verbindung IV mit 1 bis 5 Mol einer nichttoxischen, pharmakologisch verträglichen Säure. Zu diesen Säuren gehören Essigsäure, Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Bromwassersioffsäurc. Ascorbinsäure, Apfelsäure und Zitronensäure und Säuren, die üblicherweise zur Herstellung von Salzen Aminogruppen enthaltender Pharmazeutik« verwendet werden.

Bevorzugte Ausführungsformen sind die Mono- und Disulfate und die Mono- und folyhydrate der Verbindungen der allgemeinen Formel IV.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel IV ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine Verbindung der Formel

HO

H,N

worin R¹ die oben angegebene Bedeutung besitzt, mit dem N-Hydroxysuccinimidester von L-( — )-/i-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxypropionsäure bzw. L-( — J-ß-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxyvaleriansäure der Formeln

OH

CH₂-O-CO-NH-CH₂-Ch-CO-O-N^

M-)

OH

CH₇-O-CO-NH-CH₂-CH₂-CH₂-Ch-CO-O-N

in einem Verhältnis von etwa 0,5 bis clwa 1.4 Mol Acylierungsmittel pro Mol Verbindung Il in einem Lösungsmittel acylicrt.

b) ;ius der erhaltenen Verbindung der lormel

CH₁-NH-O-C-O-CH₁

HO

H₁N-

worin η die Bedeutung I oder 3 besitzt und R¹ die oben angegebene Bedeutung besitzt,
in an sich bekannter Weise die .Schutzgruppen durch Hydrieren in Gegenwart eines Palladium-Aktivkohlc-Katalysators in einem mit Wasser r mischbaren Lösungsmittel bei Atmosphärendruck und normaler Temperatur entfernt und gegebenenfalls das erhaltene Produkt anschließend in an sich bekannter Weise in ein nichttoxisches, pharmakologisch verträgliches Säureadditionssalz oder Hydratüberführt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist aus folgendem Schema ersichtlich:

HO-

V. CH₁-NH-C-O-CH₁-C₁₁H,

VM ς

HO--¹

HO

- NH₁

CH₁OH

IkN

HO

C ;

N-I lulrowsi

'stiT win I -I !-,.-lien/

(!Mein Nun l-,iinin< >-

N-Hydroxysuccinimidcsler von L-(—)-/i-Bcnzyl-

oxyearbonyl-amino-
«-hydroxy propionsäure

HO-

CH₂-NH-C-O-CH₂-C₀H₅

CH₂-NH-C-O-CH₂-C₆H

HO

CH₂-NH₂

(IV-I)

HO

H,N

In Stufe a) verwendet man das Acylierungsmittc! in einem Verhältnis von etwa 0,5 bis etwa 1,4 Mol, vorzugsweise etwa 0,8 bis etwa 1,1 Mol Acylicrungsmittel je Mol Verbindung der allgemeinen Formel II. Als Lösungsmittel werden bevorzugt Mischungen von Wasser und Äthylcnglykoidimethylüther, Dioxan, Dimcthylacctamid, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran oder Propylenglykoldimcthylüthcr verwendet, insbesondere jedoch Wasser-Tetrahydrofuran oder Wasscr-1,2-Dimelhoxyäthan.

In Stufe b) wird ein aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bestehenden Lösungsniittelsystem, vorzugsweise Wasser und Dioxan, Tctrahydro-

bi furan, Äthylenglykoldimethylüihcr oder Propylengly koldimethylälher, bevorzugt Wasser — Dioxan I : (vorzugsweise in Gegenwart einer katalytischen Meng Eisessig) oder Wasser — Tetrahydrofuran 1 : 1 verwendet.

Die als Ausgangsmatcrial verwendeten b'-Carbo benzoxykanamycine Λ bzw. B erhält man in der in de DT-OS 22 34 315 beschriebenen Weise.

I-[L-( — )-/j-Amino-rv-hydroxypropionyl]-kanamycin A, Verbindung IVa-I (UB-K 101), l-[L-(-)-/i-Amino-i\ hydroxypropionyl]-kanamyein B, Verbindung IVb-(BB-K 122), l-[L-(-)-'/>-Amino-(\-hydroxyvaleryl]-ka namycin A, Verbindung IVa-2(BB-K 23)und I-[!.-(-)-«/>

mino-ft-hydroxyvaleryl]-kanamycin B, Verbindung 'b-2 (BB-K 33) besitzen ausgezeichnete antibakterielle ktivität, die gegenüber bestimmten krankheitscrrcinden Mikroorganismen verglichen mit Kanamycin A Ier B oder der Verbindung BB-K 8 überlegen wirksam

Die nachstehenden zwei Tabellen zeigen die Mindestmmkonzentrationen (MHK) von Kanamycin A,

verglichen mit den Verbindungen IVa-I (BB-K 101) und IVa-2 (BB-K 23), und Kanamycin B, verglichen mit Verbindungen IVb-I (BB-K 122) und lVb-2 (BB-K 33) gegenüber einer Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Bakterien, erhalten mit Steers Agar-Verdünnungsmethode. Bei den Versuchen in beiden Tabellen wurde Mueller-Hinton-Agar-Medium verwendet.

Tabelle I (MHK y/ml)

Mikroorganismus	KM-R	K-12	P. vulgaris	A15119	KM-R	i	BB-KIOl	BB-K 23	Kanamycin	0,8
		" KM-R		A15169	KM, SM-R	" riinac	(IVa-I)	(IVa-2)	A	1,6
E. coli NIHJ	KM-R	" KM-R	P. mirabilis	A20363	1,6	1,6	1,6
Juhl	" W677		A9844	1,6	1,6	>100
	JR/W677	P. morganii	A20365	1,6	1,6	0,8
K. pneumoniae D-11			1,6	1,6	100
" Type 22 # 3038	S. aureus Smith	A20664	0,8	1,6	0,8
S. marcescens	" 209P SM-R	A20665	0,4	0,4	6,3
P. aeruginosa D-15	KM-R	A20684	1,6	1,6	100
H9 D-113	Mycobactcrium 607	A20683	1,6	6,3	0,8
			0,8	0,8	>100
		A20680	1,6	1,6	0,2
	pille	A20019	1,6	3,1	>100
			0,4	0,8	1,6
GM-R		KM-R	1,6	3,1	12,5
GM-R		A9923	1,6	3,1	>100
A9930	3,1	6,3	50
A15150	6,3	25,0	12,5
A15194	6,3	6,3	100
A20717	0,4	0,8	25
A20718	6,3	12,5	50
A9436	3,1	6,3	50
A9526	6,3	12,5	0,4
A9554	6,3'	12,5	0,4
A9900	0,4	0,4	0,8
A9553	0,4	0,8	0,8
A20031	0,8	1,6	0,8
	0,8	1,6	0,8
	0,8	0,8	0,4
A2O239	0.8	0,8	1,6
	0,4	0,4	100
1,6	3,1	0,4
1,6	3,1	> 100
0,8	1,6	>IOO
> 100	>100	0,4
>10()	>10()	0,4
0,4	1,6
0,8	1,6

KM-K bedeutet kanamycinresisleiil
GM-K bedeutet genlamyeinresistcnt
SM-K bedeutet slrcpUmiyeinrcsistenl

13

Tabelle II (MHK y/ml)

14

Mikroorganismus

BB-K 122

(IVb-I)

BB-K .13

(IVb-2)

Kanamycin B

E. coli NIHJ
Juhl

	KM-R	KM-R	A15119
			A15169
		KM-R
	KM-R		A20363
		W677	A9844
	K-12
	JR/W677	A20365

	pneumoniae D-11
	Typ 22 3038	A20664

	marcescens	A20665

	aeruginosa D-15	A20684
	H9 D-113
	KM-R	A20683
K.

	A20680
S.
	A20019
P.

P. aeruginosa

Gm-R
GM-R

P. vulgaris

>. miriibilis

P. morpanii

S. iiurcus Smith

2091' SM-R
KM-R

A9923

A9930

A1515O

A15195

Λ2Ο717

A20718

A9436

Λ9526

Λ9554

Λ9900

Λ9553

Λ2ΟΟ31

0,8 0,8 0,8 0,8 0,8

0,2 0,4

0,4 0,2 0,4

1,6 0,2

1,6

0,8

12,5 3,1 0,4 3,1 1,6 3,1

3,1 0,2

0,4 0,8 0,8 0,8

0,8 0,2 0,8

1,6	0,4
1,6	0,8
1,6	0,8
3,1	100
1,6	0,4
0,4	50
1,6	0,4
6,3	0,8
0,8	25
1,6	0,8
12,5	100
0,4	0,1

>100

12,5	0,8
3,1	6,3
100	>1ÜO
6,3	25
1,6	6,3
12,5	25
12,5	12,5
12,5	50
12,5	25
1,6	0,2
1,6	0,2
3,1	0.4
1,6	0.8
3.1	O.S
3,1	0,8
0.4	0,1
3.1	0,8

Fortsetzurm

Mikroorganismus

BB-K 122
(IVb-I)

BB-K 33
(IVb-2)

Kanamycin
B

A20239

Mycobacterium 607
KM-R

KM, SM-R

phlei
ranae

0,8	3,1	50
0,8	1,6	1,6
100	>100	100
100	>100	100
0,8	0,4	1,6
0,8	1,6	1,6

Tabelle H!

Mindesthemmkonzentration (MIlK) (y/nil)

Mikroorganismus	A15119	BB-KIOI	BB-K 23	BB-K 122	BB-K33	BB-K 8
1) E. coli Juhl	A20363	1,6	1,6	0,8	1,6	4
2) E. coli Juhl	A20365	1,6	1,6	0,8	3,1	2
3) H. coli Juhl	A20664	0,4	0,4	0,2	0,4	1
4) H. coli Juhl	A20665	1.6	6,3	0,4	6,3	4
5) E. coli Juhl	A2O684	0.8	0,8	0,2	0,8	I
6) E. coli Juhl	A2O683	1,6	1,6	0,4	1,6	2
7) E. coli Juhl	A20680	1,6	3,1	1,6	12,5	8
S) K. pneumoniae	A200I9	1,6	3,1	1,6	25	4
9) S. maraseens	A 94 3 6	1,6	3,1	1,6	12,5	4
10) i\ vulguris	A9900	0,4	0,4	0,2	1,6	2
1!) P. mirabilis	A20239	0,8	1,6	0,8	1,6	2
12) S. aureus	1,6	3,1	0,8	3,1	4

Die vorstehenden Daten zeigen, daß die Verbindungen IVa-I. lVa-2. IVb-I und IVb-2 gegenüber einer bedeutenden Anzahl Testorganismen weitaus aktiver sind, insbesondere gegen Pseudomonas und andere kanamycinresistente Organismen.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel IV sind wertvoll als antibakterielle Mittel, als Beifuttermittel bei Tierfutter, als therapeutische Mittel bei Geflügel und T'eren sowie beim Menschen und sind insbesondere wertvoll bei der Behandlung von Infektionskrankheiten, die durch grampositive und gramnegative Bakterien verursacht sind.

Bei oraler Verabreichung sind die Verbindungen der allgemeinen Formel IV zusätzlich bei der präoperativen Sterilisation des Darms brauchbar. Sowohl aerobe als auch anaerobe Flora, die gegenüber diesen Verbindungen empfindlich sind, werden im Dickdarm reduziert. Zusammen mit geeigneter mechanischer Reinigung sind sie bei der Vorbereitung für Darmchirurgie wertvoll.

Die Verbindungen der allgemeinen Formel IV sind wirksam bei der Behandlung von systemischen bakteriellen Infektionen beim Menschen, wenn sie parenteral in einem Dosierungsbereich von etwa 250 mg bis etwa 3000 mg pro Tag in geteilten Dosen, drei- oder viermal täglich, verabreicht werden. Im allgemeinen sind die Verbindungen wirksam, wenn sie a!!c 12 Stunden in einem Dosierungsbereich von etwa 5,0 bis 7,5 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden.

Beispiel 1

1-[L-( — )-ß-Ainino-«-hydroxypropionyl]-kanamyrin A (IVa-I₁BB-KlOl)

a) Zu einer gerührten Lösung von 1,48 g (2,4 mMol) 6'-Carbobenzoxykanamycin A (II, R¹ = OH) in 25 ml Wasser-Tetrahydrofuran (4:1) gibt man tropfenweise bei 5^CC die Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von L-jfJ-Benzyloxycarbonylamino-oc-hydroxypropionsäure. Man rührt die Mischung zwei Stunden bei Raumtemperatur und filtriert dann ab, um eine geringe Menge unlösliches Material zu entfernen. Das b) Filtrat hydriert man über Nacht mit 300 mg eines 10% Palladium auf Aktivkohle enthaltenden Katalysators bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck und filtriert dann ab, um den Katalysator zu entfernen. Man engt das Filtrat im Vakuum ein, um den größten Teil des organischen Lösungsmittels zu entfernen. Die sich ergebende wäßrige Lösung stellt man mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 7 ein und gibt sie über eine Kolonne »Amberlite CG-50« (NH₄ ¹, 80 ml) [»Amberlite CG-50« ist ein chromatographisch reines schwach saures Kalioncnaustauscherharz vom Carbon-

809 507/310

säurepolymethacrylsäuretyp], die man mit 200 ml Wasser wäscht und dann mit 400 ml 0,1 n-, 870 ml 0,2 n-, und 430 ml 0,5n-NH₄OH eluiert. Das Eluat wird in 10-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 95 bis 106, die Aktivität gegenüber Pseudomonas aeruginosa A 9843 zeigen und bei Dünnschicht-Chromatographie auf Kieselsäuregelplatte (Ninhydrin) [DC: Kieselsäuregelplatte, CHCIj-MeOH-28%iges NH₄OH-H₂O (1:4:2:1)] Rf-Werte bei 0,25 und 0,41 aufweisen (gewünschtes Produkt), werden vereinigt, im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet, wobei sich 170 mg rohe Verbindung IVa-I ergeben.

Die rohe Verbindung IVa-I (162 mg) adsorbiert man auf einer Kolonne mit »Amberlite CG-50« (15 ml, Cuproammoniumform, wie folgt hergestellt: Zu einer gerührten Suspension von CG-50 (NH₄ ⁺ )Jn Wasser gibt man 10%ige Kupfer(ll)-sulfatlösung, wobei sich das Kupfersalz von »Amberlite CG-50« ergibt, das man abfiltriert. Man wäscht das Harz mehrmals mit Wasser, behandelt dann unter Rühren mit I n-NH₄OH, filtriert und wäscht mehrmals mil Wasser, wobei man die dunkelblaue Cupro-Ammonium-Form von »Amberlite CG-50« erhält, die man mit 50 ml Wasser wäscht und mit 1 Liter 0,2 n-, 700 ml 0,5 n- und schließlich 400 ml 1,On-NH₄OH eluiert. Das Eluat sammelt man in 7-ml-Fraktionen. Die Fraktionen 269 bis 282, die einen einzigen Fleck bei Rf 0,41 zeigen, werden vereinigt, im Vakuum eingedampft und lyophilisiert, wobei sich 79 mg Kupferkomplex von Verbindung IVa ergeben. Das Kupfer wird durch Säulenchromatographie über »Amberlite CG-50« (NH₄ ⁺, 5 ml) unter Verwendung von 0,2 n-NH₄OH als Eluierungsmittel entfernt. Das Eluat wird in 10-ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 2 bis 10 werden vereinigt, im Vakuum eingedampft und lyophilisierl, wobei sich 26 mg Verbindung IVa-I ergeben (2%, bezogen auf Vl-1), F. 200 bis 205⁰C.

IR(KBr): 1640,1540cm '.

AnalyscC₂iH₄|N',O,, ■ 2 H₂COj · 3 H₂O:

Ber.: C 36,84, H 6,84, N 9,34%; gef.: C 36,93. H 6,00, N 9,62%.

c) Man löst 1 Mol 1-[L-( — )-ß-Amino-<x-hydroxypropionyl]-kanamycin A in 1 bis 3 Liter Wasser. Man filtriert die Lösung, um jegliche nicht gelöster, Feststoffe zu entfernen. Zu der abgekühlten und gerührten Lösung gibt man 1 Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser. Man rührt die Mischung 30 Minuten, gibt dann kaltes Äthanol zu der Mischung bis Ausfällung eintritt. Die

Feststoffe werden durch Filtrieren gesammelt und al das gewünschte Monosulhl identifizieri.

Löst man 35 g l-[L-(—)-/}-Amino-ix-hydroxypropio nyl]-kanamycin A (in Form des Monobicarbonatlrihy drats) in 125 ml entionisiertem Wasser, stellt der pH-Wert mit 50% VoIVVoI. Schwefelsäure auf 7 bis 7,f ein, gibt 8,5 g Aktivkohle zu, schlämmt die Mischung 0,i Stunden bei Umgebungstemperatur auf, entfernt die Aktivkohle durch geeignetes Abfiltrieren, wäscht mi 35 m! entionisiertem Wasser, gibt Wasser zu den Filtrat, vereinigt das Filtrat und die Waschflüssigkeit mi 50% VoIVVoI. Schwefelsäure und stellt das Gemisch au einen pH-Wert vor; 1 bis 1,3 ein, gibt die Lösung untei raschem Rühren innerhalb von 10 Minuten zu 600 bi; 800 ml Methanol (3 bis 4 Volumina Methanol), rührt die Mischung 5 Minuten beim pH-Wert von 1 bis 1,3, gibt sie durch ein 100 Maschen-Sieb (0,148 mm), rührt sie Ί Minuten, läßt sie 5 Minuten absetzen, dekantiert der größten Teil der überstehenden Flüssigkeit, filtriert die verbleibende Aufschlämmung, wäscht sie mit 200 m Methanol und trocknet sie bei 50°C 24 Stunden in: Vakuum, so erhält man das Disulfat.

Beispiel 2

l-[L-( —)-j3-Amino-a-hydroxypropionyl]-kanamycin B [BB-KI22(IVb-l)]

a) Zu einer gerührten Lösung von 1,23 g (2,0 mMol) 6'-Carbobenzoxykanamycin B in 20 ml Wasser gibt man tropfenweise eine Lösung des N-Hydroxysuccinimidesters von L-^-Benzyloxycarbonylamino-Ä-hydroxypropionsäure. Man rührt die Mischung über Nacht und hydriert dann über Nacht in Gegenwart eines b) 300 mg 10% Palladium auf Aktivkohie-Katalysators bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck. Die hydrierte Mischung filtriert man und engt das Filtrat im Vakuum ein, um den größten Teil des organischen Lösungsmittels zu entfernen. Die sich ergebende wäßrige Lösung stelli man mit 1 n-Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 7 ein und adsorbiert sie aus einer Kolonne von »Amberlite CG-50« (NH₄ ⁺ , 40 ml), die man mit 80 ml Wasser wäscht und dann mit 900 ml 0,1 n- und 1,2 Liter 0,2 n-NH₄OH eluiert. Das Eluat wird in 10-ml-Fraktionen gesammelt, mit Ninhydrin-Fleck-Test, Dünnschichtchromatographie (Kieselsäuregelplatte) und Scheibeniest unter Verwendung von Pseudomonas aeruginosa A 9843 überwacht und in die folgenden geeigneten Fraktionen aufgeteilt. Jede Fraktion wird im Vakuum eingedampft und gefriergetrocknet.

Fraktion

Gläser Nr.

NH₄OH (n)

Gewicht (mg) Bezeichnung

1	91	-113	0,2	420	Kanamycin B
2	121	-143	0,2	253	BB-K 122 (IVb-I)+ Neben
					produkt + Kanamycin B

Fraktion 2 (250 mg) in 30 ml Wasser wird mit I n-Chlorwasserstoffsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und durch eine Kolonne von »Ambcrliie CG-50« (Cupro-Ammonium-Form, 14 ml) gegeben, die mit 50 ml Wasser gewaschen und mit 2,5 Liter 1,On-NH₄OH und 1,5 Liier 1,Sn-NH₄OH eluiert wird. Das Eluat wird in 10-ml-Fraktionen gesammelt und basierend auf den Rf-Werten, der Dünnschichtchroniatographie und der Aktivität gegenüber Pseudomonas aeruginosa in die geeigneten Fraktionen geteilt.

S-'raktion Glaser Nr. NII₄OIIIn) Gewicht

(mg) Bezeichnung

Γ 191-240 1,0

2' 331-360 1,5

3' 361-385 1,5

Kupferkomplex des Neben

produktes

Kupferkomplex von dem

gewünschten BB-K122

Kupferkomplex von

Kanamycin B

I R-Absorptionsspektrum (K Br) 1635,1570 cm - '

Chromatographie von Fraktion 2' (80 mg), um Kupfer zu entfernen,ergibt35 mg(3%)BB-K 122(IVb-I).

Die physikalisch-chemischen Daten der Verbindung |-, AnalyseC23H45N5O1J · H2O: aus Fraktion 2' sind in der nachstehenden Tabelle Ber.: C 43,57, H 7,16, N 10,59%;

angegeben: gef.: C 43,25, H 7,12, N 9,33%.

BB-K	IR	F	Rf
Nr.
	(cm"')	( C)	(Kieselsäuregel
			platte, Ninhydrin)

122 1640,1570 192 bis 196 0,41

Analyse C₂IH₄₂N₆Oi₂ · 2 H₂CO₁:
Ber.: C 39,77, H 6,67, N 12,10%;
gef.: C 39,84, H 6,23, N 11,66%.

Durch Hydrolyse mit 0,5n-NaOH bei 100°C innerhalb von 1 Stunde erhält man lsoserin und Kanamycin B. Das Mono- und Disulfat kann man in der in Beispiel Ic) beschriebenen Weise herstellen.

Beispiel 3

l-[L-( — )-(5-Amino-«-hydroxyvaleryl]-kanamycin A
[BB-K 23, IVa-2]

a) Zu einer gerührten Lösung von 1,24 g (2,0 mMol) der Verbindung l!a-l (R = OH) in 12 ml Wasser und 60 ml 1,2-Dimethoxyäthan gibt man tropfenweise 780 mg (2,0 mMol) des N-Hydroxysuccinimidesters von L-<5-Benzyloxycarbonyl-it-hydroxyvaleriansäure in 10 ml 1,2-Dimethoxyäthan. Man rührt die Mischung über Nacht und dampft dann im Vakuum zur Trockene ein. Den Rückstand behandelt man mit 20 ml Wasser und schüttelt ihn mit zwei 30-ml-Anteilen von mit Wasser gesättigtem Butanol. Die vereinigte Butanolschicht b) wird im Vakuum eingedampft, wobei sich 1,36 g (b) eines .Feststoffs ergeben, der in 10 ml Wasser, 10 ml Dioxan und 1 ml Essigsäure gelöst und mit 200 mg 10% Palladium auf Aktivkohle bei Atmosphärendruck und Umgebungstemperatur über Nacht hydriert wird. Die hydrierte Mischung wird filtriert und das Filtrat wird im Vakuum zur Trockene eingedampft. Den Rückstand löst man in 20 ml Wasser. Man gibt die Lösung auf eine Kolonne von »Amberlite CG 50« (NH₄ ⁺, 15 ml), die man mit 80 ml Wasser wäscht und dann mit 760 ml 0,1 n- und 880 ml 0,2 n-NH₄OH eluiert. Das Eluat wird in 10-ml-Fraktionen gesammelt. Die Gläser 109 bis 172, die bei der Dünnschichtchromatographie [Kieselsäuregelplatte, CHCIrMethanol-28%iges NH₄OH-H₂O (1 :4 : 2 : I)] (Kieselsäuregelplatte, Ninhydrin) einen Rl'-Wert 0,18 ergeben, werden vereinigt, im Vakuum eingedampft und gefriergetrocknet, wobei sich 330 mg (28%) der Verbindung IVa-2 ergeben, F. l85°C(Zers.),

c) Man löst 1 Mol l-[L-( — )-(5-Amino-a-hydroxyvale-

_>o ryl]-kanamycin A in 1 bis 3 Liter Wasser. Man filtriert die Lösung, um irgendwelche unlöslichen Feststoffe zu entfernen. Zu der gekühlten und gerührten Lösung gibt man I Mol Schwefelsäure, gelöst in 500 ml Wasser. Man rührt die Mischung 30 Minuten, wonach man kaltes

2j Äthanol zugibt, bis Ausfällung eintritt. Man sammelt die Feststoffe durch Abfiltrieren und erhält das gewünschte Monosulfat.

35 g 1-[L-( —)-(5-Amino-«-hydroxyvaleryl]-kanamycin A (in Form des Monobicarbonattrihydrats) löst man in

jo 125 ml entionisiertem Wasser.

Man stellt den pH-Wert mit 50% Vol./Vol. Schwefelsäure auf 7 bis 7,5 ein. Man gibt 8,5 g Aktivkohle und schlämmt die Mischung 0,5 Stunden bei Raumtemperatur auf. Durch Abfiltrieren wird die Aktivkohle entfernt

j-, und mit 40 ml Wasser gewaschen. Die Waschflüssigkeit wird zu dem Filtrat gegeben.

Das Filtrat und die Waschflüssigkeit, die vereinigt sind, werden mit 50% Vol./Vol. Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 bis 2,6 eingestellt. Es entwickelt sich eine große Menge Kohlendioxid. Man legt an die Lösung unter Rühren 20 Minuten Vakuum an, um weiteres Kohlendioxid zu entfernen.

Zu der entgasten Lösung gibt man 8,5 g Aktivkohle. Man schlämmt die Mischung 0,5 Stunden bei Raumtemperatur auf. Die Aktivkohle wird durch Abfiltrieren entfernt und mit 35 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Das Wasser wird zu dem Filtrat gegeben.

Das mit der Waschflüssigkeit vereinigte Filtrat wird mit 50% Vol./Vol. Schwefelsäure auf einen pH-Wert

3D von 1 bis 1,3 eingestellt. Diese Lösung gibt man unter raschem Rühren innerhalb von 10 Minuten zu 600 bis 800 ml Methanol (3 bis 4 Volumina Methanol). Man rührt die Mischung 5 Min. beim pH-Wert von 1 bis 1,3, gibt sie durch ein 100 Maschensieb (0,148 mm), rührt sie 2 Min. und läßt sie 5 Min. absetzen. Der größte Teil der überstehenden Flüssigkeit wird abdekantiert. Die zurückbleibende Aufschlämmung wird filtriert, mit 200 ml Methanol gewaschen und bei 50⁰C 24 Stunden im Vakuum getrocknet, wobei man das gewünschte

bo Disulfat erhält.

Beispiel 4

l-[L-( — )-(5-Amino-«-hydroxyvaleryl]-kanamycin B
h-, [BB-K33(IVb-2)]

a) Zu einer gerührten Lösung von 618 mg (I mMol) der Verbindung Il (R = NH₂) in 30 ml Wasser/1,2-Di-

methoxyäthan (1 : 2) gibt man 364mg (I niMol) des N-Hydroxysuccinimidesters von L-o-Benzyloxyearbonyl-«-hydroxyvaleriansäure in 10 ml trockenem 1,2-Dimelhoxyälhan auf einmal. Man rührt die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur und dampft im Vakuum ein. Das wäßrige Konzentral extrahiert man mit zwei 20-ml-Anieilen mit Wasser gesättigtem n-Butanol. Man dampft die Butanolextrakte zur Trockene ein, wobei sich 530 mg Feststoff ergeben, der in 40 ml Wasser/1,2-b) Dimethoxyäthan (1 :1) gelöst und über Nacht bei Almospaärendruck und Raur.temperatur mit 150 mg Palladium auf Aktivkohle hydriert wird. Der Katalysator wird durch Abfiltrieren entfernt. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, um den größten Teil des organischen Lösungsmittels zu entfernen. Die wäßrige Lösung gibt man auf eine Kolonne von »Amberlite CG-50« (NH₄ ⁺ , 14 ml), die man mit 140 ml Wasser wäscht und dann mit 410 ml 0,1 n-, 760 ml 0,2 n-, 650 ml 0,5 n- und 510 ml 1,0 n-NH₄OH eluiert. Das Eluat wird in 10 ml-Fraktionen gesammelt. Die Gläser Nr. 127 bis 141, die bei Dünnschichtchromatographie auf Kieselsäurcgelplatte (Ninhydrin) einen Rf-Wert 0,22 haben, werden vereinigt, im Vakuum eingedampft und lyophilisiert. wobei sich 103 mg (17%) der Verbindung BB-K 33 ergeben, F. 185 bis 190°C (Zers.).

IR-Absorptionsspektrum(KBr):i'c _tO 1635cm '.
Analyse C_2iH4bN_bOi2 · 2 H₂CO₁:

Bcr.: C 41,55, H 6,97. N 11,63%;

gef.: C 41,44, H 7,09, N 11.75%.

Das Mono- und Disulfat erhält man in der in Beispiel 3c) beschriebenen Weise.

Die als Ausgangsmaterial verwendeten N-Hydroxysuccinimidester von L-jS-Benzyloxycarbonylamino-ahydroxypropionsäure bzw. -valeriansäure erhält man entsprechend den Angaben in der DT-OS 22 34 315 in folgenderWeise:

N-Hydroxysuccinimidester von L-ß-Benzyloxycarbonylamino-«-hydroxypropionsäure

Zu einer gekühlten und gerührten Lösung von 478 mg (2 mMol) L-ß-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxypropionsäure (Vl-I) und 230 mg (2 mMol) N-Hydroxysuc cinimid in 10 ml Tetrahydrofuran gibt man 412 mg (2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt die Mischung 1 Std. bei Null bis 5°C, 2 Std. bei Raumtemperatur und filtriert dann ab, um den Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Das Filtrat, das die obige Verbindung enthält, wird ohne weitere Abtrennung für die nächste Umsetzung verwendet.

Die L-jS-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxypropionsäure (VI-I) stellt man wie folgt her:

8,2 g (0,078 Mol) L-/?-Amino-«-hydroxypropionsäurc (K. Freude nberg.Ber. 47, 2027 [1914]) löst man in einer Lösung von 6,56 g (0,0164 Mol) Natriumhydroxid und in 60 ml Wasser. Zu der gerührten Lösung gibt man tropfenweise 14,7 g (0,086 Mol) Carbobenzoxychlorid unterhalb 5°C. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei Raumtemperatur, wäscht mit 60 ml Äther und stellt mit verdünnter HCI auf einen pH-Wert von 2 ein. Der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt, mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet, wobei sich 9,65 g (52%) L-/3-Benzyloxycarbonylamino-,-vhydroxypropionsaurc (Vl-I) ergeben. Das Filtrat extrahiert man mit fünf 100-ml-Anteilcn Äther. Die ätherische Lösung wäscht man mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft in, Vakuum zur Trockene ein, wobei man weitere 2,0 g (11%) L-/i-Benzyloxycarbonylamino-ivhydroxypropionsäurc (Vl-1) erhält. Insgesamt 11,65g Verbindung Vl-I kristallisiert ■-, man aus 500 ml Benzol-Äthylacetat (4:1). wobei sich 9,36 g (50%) reine Verbindung L-ß-Benzyloxyearbonylamino-ivhydroxypropionsäure (Vl-I) ergeben, F. 128,5 bis 129,5° C.

IR-Absorptionsspektrum(KBr))»( ,, 1745,1690 cm ';
[α];¹ = +2,9° (c·= 5,0, Methanol).

NMR-Spektrum(Dimethylsulfoxyd D_h):
ό (in ppm) 3,05- 3,45 (2H, m, CH ,N).
4,05(1 H.d-d, -0-CH-CO-),5,03(2 H.s.CH.Ar) i-, 7,18(1 H, breit, NH), 7,36(5 H.s.Ring H).

Analyse Ci ι HhNO-,:

Bcr.: C 55,23, H 5,48, N 5,86%;
gef.: C 55,34, H 5,49, N 5,87%.

N-Hydroxysuccinimidester von L-rt-Benzyloxycarbonyl-ivhydroxyvaleriansäurc

:■-, Zu einer gerührten und gekühlten Lösung von 535 mg (2,0 mMol) L-tf-Benzyloxycarbonylamino-ft-hydroxyvaleriansäure und 230 mg (2,0 mMol) N-Hydroxysuceinimid in 55 ml Äthylacetat gibt man 412 mg (2,0 mMol) Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid. Man rührt die Mischung

jo 3 Stunden bei Raumtemperatur und filtriert ab, um ausgefällten Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen. Das Filtrat wird im Vakuum eingedampft, wobei man 780 mg (100%) eines viskosen Sirups aus N-Hydroxysuccinimidesters von L-o-Benzyloxycarbonyl-oc-hydro-

j-, xyvaleriansäure erhält.

IR-Absorptionsspektrum (klar):
1725 cm-'.

■i'c -. 11

1810, 1785,

-in Die L-(i-Benzyloxycarbonylamino-(\-hydroxyvaleriansäure stellt man wie folgt her:

Zu einer gerührten Lösung von 400 mg (3,0 mMol) L-o-Amino-a-hydroxyvaleriansäure (S. Ohshiro et al., Yakugaku Zasshi, 87, 1184 [1967]) und 250 mg

■n (6,5 mMol) Natriumhydroxyd in 25 ml Wasser gibt man tropfenweise 580 mg (3,3 mMol) Carbobenzoxychlorid innerhalb von 30 Minuten bei Null bis 5°C. Man rührt die Mischung 1 Stunde bei 5 bis 15^CC, wäscht mit 25 ml Äther, stellt mit Chlorwasserstoffsäure auf einen

,ο pH-Wert von 2 ein und extrahiert mit drei 30-ml-Anteilen Äther. Die vereinigte ätherische Lösung schüttelt man mit 10 ml gesättigter Natriumchloridlösung, trocknet über wasserfreiem Natriumsulfat und dampft im Vakuum ein, wobei sich Kristalle ergeben, die aus

)-, Benzol umkristallisiert werden; man erhält 631 mg (78%) L-O- Benzyloxycarbonylamino-rx-hydroxy valeriansäure, F. 110bis lirC.

IR-Absorptionsspektrum (KBr): 3460.3350,1725.
1685,1535,1280,730.690 cm '.

NMR-Spektrum (Aceton-Db): Λ (in ppm) 1,70(4 H, m),
4,14(2 H, q, I = 4, 5 Hz), 4,19(1 H,m),
4,82(2 H. s), 6.2 (3 H. breit), 7,25 (5 ll.s).

[λ]:·¹ = +1.6(C= 10. Methanol).

Analyse ChHi₇NO-,:

Ber.: C 58.42, H 6,41, N 5,24%;
gef.: C 58.36. H 6.50. N 5,27»/».

Claims

Patentansprüche:

1. Verbindungen der Formel
HO

CH₁-NH,

NH-R

H,N

worin R L-( — )-jtf-Amino-«-hydroxypropionyl oder L-(-)-<5-Amino-«-hydroxyvaleryl und R¹ OH oder NH₂ bedeuten, und deren nicht-toxische, pharmazeutisch verträgliche Salze und Hydrate.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,daß

a) eine Verbindung der Formel

HO

H, N

CH₁-NH-O-CO-CH

worin R¹ die oben angegebene Bedeutung besitzt, mit dem N-Hydroxysuccinimidester von L-( — )-/;-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxypropionsäure bzw. L-( — )-//-Benzyloxycarbonylamino-a-hydroxyvaleriansäure der Formeln

OH O

CH,-O—CO—NH-CH,-CH-CO-O—N I

OH

CH₂-O-CO-NH-CH₂-CH₂-CH₁-Ch-CO-O-N

in einem Verhältnis von etwa 0,5 bis etwa 1.4 Moi Aeylierungsmittel pro Mol Verbindung Il in einem Lösungsmittel acyliert.

b) aus der erhaltenen Verbindung der Formel

HO

CH₂-NH-O-CO-CH₂-

L-(-)CO — O—CH₂

worin π die Bedeutung 1 oder 3 besitzt und R¹ die obenangegebene Bedeutung besitzt, in an sich bekannter Weise die Schutzgruppen durch Hydrieren in Gegenwart eines Palladium-Aktivkohle-Katalysators in einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel bei Atmosphärendruck und normaler Temperatur entfernt und gegebenenfalls das erhaltene Produkt anschließend in an sich bekannter Weise in ein nichttoxisches, pharmakologisch verträgliches Säureadditionssalz oder Hydrat überführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) und b) als Lösungsmittel eine Mischung aus Wasser und Tetrahydrofuran oder 1,2-Dimethoxyäthan verwendet.

Die vorliegende Erfindung betrifft halbsynthetische Verbindungen der allgemeinen Formel