DE2408227A1

DE2408227A1 - Neue antibiotika und verfahren zu ihrer gewinnung

Info

Publication number: DE2408227A1
Application number: DE19742408227
Authority: DE
Inventors: Alan K Mallams; Richard W Tkach; Gerald H Wagman; Marvin J Weinstein
Original assignee: Scherico Ltd
Current assignee: Scherico Ltd
Priority date: 1973-02-23
Filing date: 1974-02-21
Publication date: 1974-08-29
Also published as: BE811370A; ZA741149B; AU6584674A; US3880828A; FR2218876B1; FR2218876A1; GB1464599A

Description

2GH-FTG-1

Pebruar-5-197^

CG-re

Patentanwälte

Dr.-lng. Schönwob¹ Dr.-ing. lh. λΑο/er Dr. Fues DJpl.-Chsm. Abk ve:: '.:<· H.x 'uVil-CV^m. /Vc=; :!kovvski-Keller Dr.-lng. G. Kid^xl·, Dipl. \ /j. G. Salting ^ Köln 1, Deichmannhaus

SCIIERICO LIMITED

in Luzern, Schweiz

NEUE ANTIBIOTIKA UND VERFAHREN SU IHKSR GEWINNUNG

-1-

409835/1078

Die Erfindung bezieht sich auf neue Antibiotika, die durch Micromonospora inyoensis hergestellt werden können, auf eine Methode zur Isolierung der Verbindungen und auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Antibiotika enthalten.

Im Britischen Patent Nr. 1,27^*518 wird ein neuer Aktinomycete beschrieben, der fähig ist, antibiotisch aktives Material herzustellen. Dieser Aktinomycete wird dort Micromonospora inyoensis genannt. Es wurde angenommen, dass die antibiotische Aktivität alleine auf ein Antibiotikum zurückzuführen ist, das Antibiotikum 66-4o (auch Sisomicin) genannt wird und den Hauptbestandteil der Fermentation darstellt. Methoden zur Isolierung urd Reinigung von Sisomicin wurden beschrieben, diese Methoden waren jedoch nicht geeignet, die Gegenwart weiterer biologisch aktiver Verbindungen aufzuzeigen. Ferner wurden im Journal of Antibiotics (Japan) Band XXIII, No. 11, S. 551-55¹I- (1970) weitere Ergebnisse publiziert, die sich auf die Sisomicin-Fermentation und deren Produkte beziehen. Es wurde nun gefunden, dass durch Anwendung anderer Methoden zur Isolierung und Reinigung von Sisomicin als der, die in dem Britischen Patent oder der obengenannten Veröffentlichung

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beschrieben sind, neue Antibiotika erhalten werden können. Die neuen Antibiotika werden Antibiotikum 66-4OB und Antibiotikum 66-4OD genannt.

Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-¹J-OD sind epimere

Pseudotrisaccharide des Aminocyclitol-Aminoglycosid-Typs. Die beiden Antibiotika sind weisse,amorphe Feststoffe und geben positive Ergebnisse im Ninhydrin und Elson-Morgan-Test. Sie zeigen negative Resultate im Maltol, Furfiral und Sakaguchi Test.

Im folgenden werden einige physiko-chemische Eigenschaften der Antibiotika angegeben:

Antibiotikum 66-40B Antibiotikum 66-40D

(a) Molekulargewicht

(Massenspektroskopie) 433.2540 433-2565

(b) Empirische Formel C^H 3 0„ ^cl8^H35^N5°7

(c) Elementaranalyse des

Monohydrates C^oH^j-Np-O^.HpO

Berechnet C=47.88# Η=8.2β# N=15.51#

Gefunden 0=4γ.89# C=47.82#

H= 7-73$ H= 8.15$

J H=156

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(d) [α] ²^ (C=O.3# in +152.8° +147-3°

H₂O)

(e) Pp. des Monohydrates 91° - 102°C 92° - 1OJ⁰C

(f) I.R. (KCl) 33¹W, I69O , 3330, 168O ,

IO5O, 1000cm. IO75, 1000 cm.

(g) Zirkulardichroismus

1. Tetraaminkupfersulfatlösung
(TACU) [£90+2,530 [θ]₂₉₀-8,590

2. Cuprammonium A

(Cupra A) ^O⁺¹'⁹⁵⁵ [9)^-6,270

(h) Kernresonanzspektroskopie (NMR) in D_0 - Die folgenden

Peaks und strukturellen Zuordnungen werden als massgebend betrachtet [ £-Werte in p.p.m J

Antibiotikum 66-40B Antibiotikum 66-40D

3H, S, 3"-NCH,) IH, M, EJ) ^D IH, D, J=4Hz, H") IH, D, J=2.5Hz, H₁")

2.49 (3Η, S, 3"-NCH,) 2.19

4.8θ (IH, M, H₁,¹) ^D 4.66

4.96 (IH, D, J=4Hz, H ") 5.00

5.27 (IH, D, J=2.5Hz,¹H ') 5.26

Antibiotikum 66-4OB zeigt ein charakteristisches Multiplettim NMR-Spektrum, welches auf das 4"-Proton in Axialstellung zurückzuführen ist, während Antibiotikum 66-40D das Multiplett bei niedrtgamWerten aufweist, was für die äquatoriale Stellung des 4"-Protons charakteristisch ist.

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Die obigen physiko-chemischen Daten und der stufenweise Abbau der Antibiotika zu Aminoglycosiden und Aminocyclitol erlauben die Festlegung auf eine stereochemische Strukturformel der erfindungsgemässen Antibiotika.

Die Erfindung bezieht sich daher auf Antibiotikum 66-4OB und Antibiotikum 66-höD mit der allgemeinen Formel

worin, für Antibiotikum 66-4OB, Ring A die Formel

und, für Antibiotikum 66-4o D, Ring A die Formel

OH 409835/1078

aufweist.

Gemäss der Erfindung kann Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-40D in Abwesenheit eines Ueberschusses von Sisomicin vorliegen oder im Wesentlichen frei von Garamin sein. Sisomicin in starkem Ueberschuss, Garamin und die neuen Antibiotika sind Bestandteile eines Gemisches, dessen Herstellungsverfahren in der oben erwähnten Literatur beschrieben wird. Garamin , ein Pseudodisaccharid mit mittlerer antibakterieller Aktivität, ist 0-j5~Deoxy-4-C-methyl-;5-(N-methylamino) -ß-L-arabinopyranosyl- (l-v6) -2-d'eoxy-D-streptamin. Gemäss der Erfindung können die Antibotika auch in im Wesentlichen reiner Form vorliegen. Dies ist dann der Fall, wenn Verunreinigungen bis zu 15 Gew.$ vorhanden sind. Gemäss der Erfindung können Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-kOD auch in einem Zustand vorliegen, der durch die Abwesenheit von Substanzen gekennzeichnet ist, die ebenfalls bei der Fermentation gebildet werden.

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Werden die Antibiotika durch Fermentation hergestellt, die im Britischen Patent Nr. 1,274,518 beschrieben ist, sind Sisomicin und Garamjn solche Substanzen. Gemäss der Erfindung kann sich Antibiotikum 66-40B auch in einem Zustand der Reinheit

of?
befinden, der durch (1) einen M^ von + 152.8° (± 7#) (c=O,3# in HpO), (2) einen Schmelzpunkt des Monohydrates von 91 - 102 C,

(3) einen Zirkulardichroismus [^]nan ^{von + 2}^ 530 (-5$) in Tetraaminkupfersulfatlösung und (4) einen Zirkulardichroismus [θ]ρη₀ von + 1,935 (-5$) in Cupraammonium A gekennzeichnet ist, und Antibiotikum 66-40D kann sich in einem Zustand der Reinheit befinden, der durch (1) einen [a]^ von +147,3° fi-Tf) (c=0,3# in HpO), Tf2) einen Schmelzpunkt des Monohydrates von 92°-103°C,

(3) einen Zirkulardichroismus [Q]₀Q₀ von -8,590 (-5#) in Tetraaminkupfersulfatlösung und (4) einen Zirkulardichroismus [θ]PQ₀ von -6,270(-5$) in Cupraammonium A gekennzeichnet ist.

Antibiotikum 66-40B der Formel I, wie oben definiert, kann auch als Feststoff mit den folgenden Charakteristika definiert werden:

(a) ein Molekulargewicht von 433.2540 gemäss massenspektromettischer Bestimmungen;

(b) einer empirischen Formel C,gH ,-Nj₅O₇;

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(c) einem [α]^ von + 152.8° (c = 0,3# in H₂O)

(d) einem antibakteriellen Spektrum, wie im Wesentlichen in Tabelle I angegeben;

(e) einem Kernresonanzspektrum in Deuteriumoxyd mit Peaks bei 2.49, 4.80, 4.96 und 5.27 p.p.m.;

(f) einem Schmelzpunkt des Monohydrates von 91 -102 C;

%) einem Zirkulardichroismus [θ]_οηη von +2,530 in Tetra-

dyu

aminkupfersulfatlösung; und
(h) einem Zirkulardichroismus [θ]ροο ^von +1*935 in Cüpraammonium A;

wobei das Antibiotikum frei von Substanzen ist, die bei der Fermentation ebenfalls hergestellt werden. Antibiotikum 66-4OD der Formel I, wie oben definiert, kann als Feststoff mit den folgenden Gharakteristika definiert werden:

(a) ein Molekulargewicht von 433.2565 gemäss massenspektrometrischer Bestimmungen;

(b) einer empirischen Formel CUoH^j-N-O ·

(c) einem [α]ξ νοη+ΐ4γ.3° (C=O, J?o. in H₃O)

(e) einem Kernresonanzspektrum in Deuteriumoxyd mit Peaks bei 2.I9, 4.66, 5.OO und 5.26 p.p.m;

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(f) einem Schmelzpunkt des Monohydrates von 92° - 103°C;

(g) einem Zirkulardichroismus [OLg₀ von -8,590 in Tetraaminkupfersulfatlösung; und

(h) einem Zirkulardichroismus [QIq₀ von -6,270 in Cupra-

ammonium A;

wobei das Antibiotikum frei von Substanzen ist, die bei der Fermentation ebenfalls hergestellt werden.

Die Erfindung bezieht sich auch auf die pharmazeutisch annehmbaren Derivate der neuen Antibiotika. Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-40D bilden Säureadditionssalze mit allgemein verwendbaren Säuren, wie Mineralsäuren und Karbonsäure. Beispiele sind Chlorwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Bernstein-, V/ein-, Malein-, Pumar- und Glutarsäure. Die Antibiotika bilden auch Schiffsche Base-Oxazolidinderivate mit Aldehyden. Weiters bilden sie Solvate mit üblichen organischen Lösungsmitteln und besonders mit polaren organischen Lösungsmitteln. Mit Wasser bilden die Antibiotika stabile Hydrate. Im Allgemeinen weisen die Säureadditionssalze, die Schiffsche Base-Oxazolidinderivate, die Solvate und Hydrate dasselbe antibakterielle Spektrum auf wie die freien Basen, es bestehen jedoch geringe Unterschiede im Grad der Aktivität. Bakterien, die für die eine Form

-Q-

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der Antibiotika empfänglich sind, sind auch für die anderen Formen empfänglich.

Die Erfindung bezieht sich auch auf antibiotisch aktive Zusammensetzungen, die zumindest zwei der Antibiotika Sisomicin, Antibiotikum 66-4OB und Antibiotikum 66-40D oder pharmazeutisch annehmbare Derivate von zumindest zwei der Antibiotika Sisomicin, Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-40D enthalten, wobei Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-40D die oben definierte Formel I haben, und wobei Garamin im Wesentlichen von der Zusammensetzung abwesend ist.

Die Erfindung-bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Gewinnung der oben definierten Antibiotika und deren Derivate. Das Verfahren besteht darin, dass eine Zusammensetzung, die eines der neuen Antibiotika zusammen mit dem anderen neuen Antibiotikum und/oder mit einer oder mehreren strukturell ähnlichen Verbindungen enthält, auf einem nicht-ionischen Adsorbens chromatographiert wird, und dass aus einer so erhaltenen Fraktion das Antibiotikum als solches oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Derivates isoliert wird.

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Strukturell ähnliche Verbindungen sind Pseudotrisaccharide wie Sisomicin, oder Pseudodisaccharide, wie Garamin. Die Chromatographie wird vorzugsweise auf einer Säule durchgeführt, und ein bevorzugtes nicht-ionisches Adsorbens ist Silikagel. Andere Beispiele für nicht-ionische Adsorbenten sind Zellulose oder Chromosorb W. Der Ausdruck "Nicht-ionische Adsorbenten"

schliesst Ionenaustauscherharze, wie Dowex 1x2, aus.

Das bevorzugte Lösungsmittel für die Chromatographie besteht aus Chloroform, Methanol, und 15$ Ammoniumhydroxid im Volumsverhältnis 3:5Ο* wenn ein Gemisch, das Antibiotikum 66-4OB, Antibiotikum 66-4OD, Garamin und eventuell Sisomicin enthält, auf. Silikagel chromatographiert wird.

Das Verfahren kann durchgeführt werden, indem man das Produkt von Beispiel 2 des Britischen Patentes No. 1,274,518 als Ausgangsmaterial verwendet, da dieses alle antibakteriell aktiven Stoffe, die bei der Fermentation gebildet werden, enthält und als Feststoff vorliegt. Das Produkt wird auf Silikagel chromatographiert, wobei die untere Phase eines Lösungsmittels, das aus Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxid im Volumsverhältnis 1:1:1 besteht, verwendet wird. Hierbei wird der Hauptanteil an Sisomicin entfernt.

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Die restlichen Komponenten verlassen die Säule als Gemisch, das zur Trockene verdampft wird. Wiederholte Chromatographie auf Silikagel mit Chloroform, Methanol und 15$ Ammoniumhydroxid führt sodann zur Trennung der Komponenten. Restliches Sisomicin verlässt die Säule zuerst, dann folgt Garamin, dann Antibiotikum 66-4OB und zuletzt Antibiotikum 66-40D. Da sich die Verbindungen nicht leicht scharf trennen lassen, wird bevorzugt, die einzelnen Verbindungen wiederholt zu chromatographieren, um die letzten Reste der anderen Komponenten zu entfernen. "

Das Verfahren der Erfindung kann auch definiert werden als Trennung von Antibiotikum 66-4OB, Antibiotikum 66-40D und Garamin aus einem Gemisch, das diese Verbindungen enthält, wobei (a) das Gemisch in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform, Methanol und 15% Ammoniumhydroxid im Volumsverhältnis 3:5 O aufgelöst wird, (b) die entstehende Lösung auf Silikagel adsorbiert wird, (c) die Komponenten von Silikagel mit dem obigen Lösungsmittel selektiv desorbiert werden, (d) die Komponenten aus der Lösung isoliert werden und (e) die Produkte aus Stufe (d) wiederholt chromatographiert werden, um die Verbindungen frei von Substanzen, die bei der Fermentation ebenfalls gebildet werden, zu erhalten.

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Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung.

Beispiel 1

Isolierung von Garamin, Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-4OD

A. Auf eine Chromatographiesäule von etwa 305 cm Länge und mit einem Durchmesser von etwa 10 cm, die Silikagel beinhaltet, werden 225 g Antibiotikakomplex, der in der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxid im Volumsverhältnis 1:1:1 gelöst ist, aufgegeben. Der Antibiotikakomplex ist das Produkt von Beispiel 2 des Britischen Patentes No. 1,274,518. Die Säule wird mit dem oben beschriebenen Lösungsmittelgemisch eluiert, wobei eine Geschwindigkeit von etwa j50 bis 35 ml/Minute eingehalten wird. Fraktionen von etwa l600 ml v/erden gesammelt und Jede Fraktion wird dünnschichtchromatographisch auf Silikagelplatten mit dem obigen Lösungsmittelsystem überprüft. Die Fraktionen, die getnäss der dünnschichtchromatographischen Bestimmungen Substanzen mit gleicher Mobilität enthalten, v/erden vereint und die zwei entstehenden Fraktionen zur Trockene verdampft. Die erste, weniger polare Fraktion enthält im Wesentlichen reines Sisomicin*und die zweite, stärker polare Fraktion enthält restliches Sisomicin, Garamin, Antibiotikum 66-4OB und

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-Π*

und Antibiotikum 66-4OD.

B. Auf eine Chromatographiesäule von etwa 170 cm Länge und etwa 7,5 cm Durchmesser, die Silikagel beinhaltet, werden 8.3 g des Antibiotikakomplexes, der aus restlichem Sisomicin, Garamin, Antibiotikum 66-4OB und Antibiotikum 66-4OD besteht und welcher in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform-Methanol-15# Ammoniumhydroxid im Volumsverhältnis 3:5:3 aufgelöst ist, aufgegeben. Die Säule wird mit dem obigen Lösungsmittelgemisch eluiert, wobei eine Geschwindigkeit von etwa 2 bis 3 ml/Minute eingehalten wird. Es werden Fraktionen von etwa 20 ml gesammelt und jede Fraktion dünnschichtehromatographisch auf Silikagelplatten überprüft, wobei dasselbe Lösungsmittelsystem Anwendung findet, das in der Säule verwendet wurde. Die Fraktionen mit Substanzen der gleichen Mobilität werden vereint und zur Trockene verdampft, um Feststoffe zu erhalten, die an einem einzigen Produkt · arigereichert sind, jedoch noch Spuren der anderen Komponenten enthalten. Die erste, weniger polare Fraktion der Eluierung besteht aus restlichem Sisomicin, dann folgt Garamin, dann Antibiotikum 66-40B und zuletzt Antibiotikum 66-40D. Die angereicherten Fraktionen werden auf separaten Silikagelsäulen nochmals chromatographiert, wobei dasselbe Lösungsmittelsystem verwendet wird. Danach wird eingedampft und man erhält die Verbindungen der Erfindung frei von Substanzen, die ebenfalls bei der Fermentation hergestellt wurden.

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C. Jede der Verbindungen wird in deionisiertem Wasser aufgelöst und die Lösungen werden auf separaten Säulen, die das Ionenaustauscherharz Amberlite IRA-4O1S (Rohm und Haas, Philadelphia, Pennsylvania) enthalten, aufgegeben. Die Säulen werden mit deionisiertem Wasser eluiert, die Eluate im Vakuum auf etwa 100 ml eingeengt und gefriergetrocknet. Man erhält: (i) 1.0 g., Garamin;
(ii) 1.6 g., Antibiotikum 66-40B Monohydrat,

m.p.91°-102°C, [α]^2β = +152.8° (C=O.J>% H₀O);

D ^d

(iii) 0.8 g., Antibiotikum 66-4OD Monohydrat,

m.p. 92°-103°C, [a]p = + 147-3° (C=O.^ H₀O). Beispiel 2

Antibiotikum 66-40D Sulfat

Antibiotikum 66-40D (100 mg.) wird in Wasser (10 ml) gelöst und verdünnte Schwefelsäure zugegeben, bis die Lösung neutral (pH7) ist. Die Lösung wird gefriergetrocknet und man erhält das Sulfat als farblosen, amorphen Peststoff mit der empirischen Formel

Um das Sulfat von Antibiotikum 66-4OB zu erhalten, wird die freie Base Antibiotikum 66-40B denselben Bedingungen unterworfen, wie oben für Antibiotikum 66-40D beschrieben.

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Biologische Eigenschaften der neuen Antibiotika

Obwohl die Antibiotika der Erfindung Epimere und daher strukturell sehr ähnlich sind, unterscheiden sie sich untereinander und von Sisomicin in Bezug auf ihre biologische Wirksamkeit. So ergibt im Bioassay mit Bacillus subtilis und bezogen auf Sisomicin das Antibiotikum 66-kOB einen Wert von 60 mcg/mg und Antibiotikum 66-40D einen Wert von 324 mcg/mg. Im selben Biotest ergibt sich für Sisomicin 1000 meg/ mg.

Antibakterielie Aktivität in vitro

In Tabelle 1 wird die antibakterielle. Aktivität von Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-40D als minimale Hemmkonzentration der freien Basen gegen eine Vielzahl von gram positiven und gram negativen Mikroorganismen angegeben. Die Tests wurden unter Standardbedingungen in einem Mueller-Hinton Medium welches auf pH 7*4 gepuffert war, durchgeführt.

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Tabelle 1

Minimale Heimkonzentration	Organismus	(MIC)	66-40D
	Staphylococcus aureus	MIC (mcc?/ml)	.0.08-0.3
•	Streptococcus pyoi?enes C	Antibiotikum Antibiotikum	7.5
Bacillus subtilis	66-UOB	<0.01
Escherichia coli	3.0	0.75 '
Escherichia coli, 589	>25
und Baker 2	3.0	3.0
Escherichia coli,	3.0
Swindinsky		7.5
Escherichia coli, JR9 0	>25
Und JR88		3.0
Escherichia coli, W677/R55	>25	>25
Pseudomonas aerupinosa		>25 0.3 - 0.75
Pseudomonas aeruginosa,	>25
Travers	>25 '	>25
Pseudomonas aeruginosa,	3.0 -
Stones		3.0
Klebsiella pneumoniae,	>25
Adler		0.08 - 0.3
Klebsiella t>neumoniae,	>25
Providence		>2 5
Klebsiella pneumoniae	7.5
Georgetown		17.5
Proteus mirabilis	>25	3.0
Serratia marcescens		0.8
	>25
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-17-	17.5
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Antibakterielle Aktivität in vivo

Die Aktivität der Antibiotika der Erfindung wird bestimmt, indem man die Antibiotika eine Stunde nach intraperitonealer Infektion mit einer tödlichen Dosis von Stapiiä-ococcus aureus (Gray) subkutan verabfolgt und 48 Stunden nach Infektion die Zahl der überlebenden Tiere feststellt. Unbehandelte, infizierte Tiere (CP-I Mäuse, Carworth Farms) sterben normalerweise 18-24 Stunden nach der Infektion. Der PD^₀ (mg/kg) wird nach Standardmethoden der Statistik bestimmt. Tabelle 2 gibt die Schutzaktivitäten der Antibiotika der Erfindung wider.

Tabelle 2 Antibiotikum 66-4OB Antibiotikum 66-4OD

2?mg./kg. 2.2.mg/kg.

Toxizität

Die akute intravenöse Toxizität der Antibiotika der Erfindung,bestimmt an CP-I Mäusen nach Staidardmethoden, wird als I Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3 Antibiotikum 66-4QB Antibiotikum 66-4QD

(I.V.) LD₅₀ (I.V.)

70 mg./kg. 83 mg./kg.

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Weiteres ist Antibiotikum 66-40D auf Gewebekulturen aktiv gegen den Influenza-Virus. Antibiotikum 66-40B zeigt keine besondere Aktivität bei im Wesentlichen gleichen Testbedingungen.

Die Antibiotika der Erfindung weisen eine bedeutende antibakterielle Aktivität gegen eine Vielzahl von gram positiven und gram negativen Mikroorganismen auf. Die Erfindung bezieht sich daher auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die zumindest eines der Antibiotika 66-4OB und 66-4OD der obigen Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Derivat von zumindest einem dieser Antibiotika und einen geeigneten pharmazeutischen Trägerstoff enthalten. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden durch Mischen von zumindest einem der Antibiotika in feier Form oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Derivates mit einem geeigneten pharmazeutischen Trägerstoff hergestellt.

Die Antibiotika der Erfindung können in Formulierungen für topische und/oder parenterale Verabreichung eingearbeit werden. Diese Formulierungen enthalten zusätzlich noch die üblichen Trägerstoffe. Die Formulierungen können auch noch andere •verträgliche Wirkstoffe enthalten, wie Mittel gegen Angstzustände, Antipyretika und Antiphlogistika. Im allgemeinen enthalten topische Zusammensetzungen etwa 0,1$ bis etwa

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des Antibiotikums. Die Zusammensetzungen (Salben, Cremen, Lotionen) werden üblicherweise 2 bis 5 mal am Tag auf der infizierten Stelle appliziert.

Bei parenteraler Verabreichung können die Antibiotika im Allgemeinen in 2 bis 4 gleichen Dosen appliziert werden, wobei die Gesamtmenge etwa 10 bis 20 mg/kg/ Tag beträgt. Die genaue Verabreichungsdosis hängt vom Zustand und der Schwere der Infektion ab, von der Empfänglichkeit der infizierender Organismen und dem individuellen Zustand des zu Behandelnden.

Die Antibiotika können auch verwendet v/erden, um empfängliche Mikroorganismen in Spitälern und besonders in Badezimmern und auf Objekten, die gegen bakterielle Verunreinigungen besonders anfällig sind, unwirksam zu machen. Die Wirksamkeit der Antibiotika ist besonders gut, wenn diese in Seifenlösungen oder Reinigungsmitte In vorhanden sind.

Die Erfindung umfasst daher auch ein Verfahren zur Bekämpfung von Infektionen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einem infizierten Tier eine therapeutisch effektive Dosis von Antibiotikum 66-40B oder Antibiotikum 66-4OD oder einem pharmazeutisch annehmbaren Derivat dieser Antibiotika verabreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wir antibakterielle Wirkung in einem Tier dadurch hervorgerufen, indem man eine therapeutisch effektive Dosis von Antibiotikum 66-40B, Antibiotikum 66-40D,nicht giftigen Säureadditionssalzen, Schiffsche Base-Oxazolidinderivaten oder Solvaten dieser Antibiotika verabreicht.

-20-.

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Claims

Patentansprüche

ί./ Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-40D

NH,

der allgmeinen Formel

worin, für Antibiotikum 66-4OB_fRing A die Formel

und, für Antibiotikum 66-4OD,RiigA die Formel

aufweist.
2. · Antibiotikum 66-40B der Formel I nach Anspruch in Abwesenheit eines Ueberschusses von Sisomicin.

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3· Antibiotikum 66-4OD der Formel I nach Anspruch 1 in Abwesenheit eines Ueberschusses von Sisomicin.
4. Antibiotikum 66-4OB der Formel I nach Anspruch 1 in im Wesentlichen reiner Form.
5. Antibiotikum 66-köD der Formel I nach Anspruch 1 in im Wesentlichen reiner Form.

6. Antibiotikum ββ-ΛθΒ der Formel I nach Anspruch 1, im Wesentlichen frei von Garamin.

7. Antibiotikum 66-40D der Formel I nach Anspruch 1, im Wesentlichen frei von Garamin.

8. Antibiotikum 66-4GB und Antibiotikum 66-4OD, wobei jedes der Antibiotika frei von Substanzen ist, die bei der Fermentation ebenfalls gebildet werden.

9. Antibiotikum 66-40B in einem Zustand der Reinheit _s der durch (I) einen [α]_β von + 152.8° (± 1%) (c=O,3$ in H₂O)^(Il) einen Schmelzpunkt des Monohydrates von 91° -102°C, (ill) einen Zirkulardichroismus [©Joga ^{von +} 2,530 (- 5$) in Tetraaminkupfersulfatlösung und (IV) einen Zirkulardichroismus

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[ θ] 2^₀ von + 1,935 (- 5%) in Cuprammonium A gekennzeichnet ..ist.

10. Antibiotikum,66-40D in einem Zustand der Reinheit,

der durch (i) einen [a]^ von + 147,3° C- 7/0 (c = 0,3# in H₂O), (II) einen Schmelzpunkt des Monohydrates von 92° - 103°C, (III) einen Zirkulardichroismus [Q]₂Q₀ von -8,590 (- 5$) in Tetraaminkupfersulfatlösung und φι') einen Zirkulardichroismus von -6,270 (·*5%) in Cupraamitnium A gekennzeichnet ist.

11. Antibiotikum 66-40B der Formel I nach Anspruch 1, das als Feststoff charakterisiert ist durch

(a) ein Molekulargewicht von 433.25^0 gemäss massenspektromeiiischer Bestimmungen;

(b) eine empirische . Formel C^H^N^O^;

(c) einen [_a]^⁶ von + 152.8° (c = 0,3/^ in H₃O)

(d) ein antibakterielles. Späctrum, wie im Wesentlichen in Tabelle I angegeben/

(e) ein Kernresonanzspektrum in Deuteriumoxyd mit Peaks bei

2.49, 4.80, 4.96 und 5.27 p.p.m.;

ο ο

(f) eine»· Schmelzpunkt des Monohydrates von 91 -102 C;

%) einem Zirkulardichroismus [Q]₂₉₀ von +2,530 in Tetraaminkupfersulfatlösung; und

(h) einen Zirkulardichroismus [Q]₂₉₀ von +1,935 in Cuprammonium A;

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und wobei das Antibiotikum im Wesentliehen frei von Substanzen ist, die bei der Fermentation ebenfalls gebildet vrerden.

12. Antibiotikum 66-40D der Formel I nach Anspruch 1, das als Peststoff charakterisiert ist durch

(a) ein Molekulargewicht von 433-2565 gemäss massenspektrometrischer Bestimmungen;

(b) eine empirische Formel Ο-,οΗ-,^Ν-Ο ;

(c) einen [a]^ von+147.3° (e=0,3& in H₃O)

(d) ein antibakterielles Spektrum, wie im Wesentlichen in Tabelle I angegeben;

(e) ein ^ Kernresonanzspektrum in Deuteriumoxyd mit Peaks bei . 2.I9, 4.66, 5.OO und 5.26 p.p.m;

(f) einen Schmelzpunkt des Monohydrates von 92 - 103 C;

(g) einen Zirkulardichroxsmus [Q^q₀ von -8,590 in Tetraaminkupfersulfatlösung; und

(h) einen Zirkulardichroismus [Q^q₀ von -6,270 in Cupraatnmonium A;

und wobei das Antibiotikum im Wesentlichen frei von Substanzen ist, die bei der Fermentation ebenfalls gebildet werden.

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13· Pharmazeutisch .annehmbare Derivate der Antibiotika aus den vorhergehenden Ansprüchen.

14. Nichttoxische Säureadditionssalze als Derivate nach Anspruch 13·

15. Salze nach Anspruch 14, die mit Chlorwasserstoff, Schwefel-, Phosphor, Bernstein-, Wein-,.Malein-, Fumar- und Glutarsäure gebildet sind.

16. Solvate als Derivate nach Anspruch I3. YJ. Hydrate als Derivate nach Anspruch I3.

18. Schiffsche Base-Oxazolidinderivate als Derivate nach Anspruch 13·

19· Antibiotisch aktive Zusammensetzung, die zumindest zwei der Antibiotika Sisomicin, Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-4OD enthält, wobei Antibiotikum 66-4.0B und Antibiotikum 66-40D die Formel I gemäss Anspruch 1 haben, und wobei Garamin im Wesentlichen nicht in der Zusammensetzung enthalten ist.

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20. Antibiotisch aktive Zusammensetzung, die ein pharmazeutisch annehmbares Derivat von zumindest zwei der Antibiotika Sisomicin, Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-40D enthält, wobei Antibiotikum 66-40B und Antibiotikum 66-40D die Formel I gemäss Anspruch 1 haben, und wobei Garamin im Wesentlichen nicht in der Zusammensetzung enthalten ist.

21. Verfahren zur Gewinnung eines Antibiotikums gemäss den Ansprüchen 1 und 9 bis 12 oder von dessen pharmazeutisch annehmbaren Derivaten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Zusammensetzung, die eines der Antibiotika zusammen mit dem anderen Antibiotikum und/oder mit einer oder mehreren strukturell ähnlichen Verbindungen enthält, einer chromatographischen Trennung auf einem nicht-ionischen Adsorbens unterworfen und das Antibiotikum -aus einer Fraktion der chromatographischen Trennung als solches oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Derivates isoliert wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die strukturell ähnlichen Verbindungen Pseudotrisaccharide oder Pseudodisaccharide sind.

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2j5. Verfahren nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, worin die strukturell ähnliche Verbindung Garamin ist.

24. Verfahren nach Anspruch 21 oder Anspruch 22, worin die strukturell ähnliche Verbindung Sisomicin ist.

25· Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 2^}\, worin die Chromatographie auf einer Säule durchgeführt wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 25, worin die chromatographische Trennung auf Silikagel als Adsorbens durchgeführt wird.

27· Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 26, worin die Zusammensetzung Antibiotikum 66-4OB, Antibiotikum 66-höD und Garamin enthält.

28. Verfahren nach Anspruch 27, worin die Zusammensetzung noch zusätzlich Sisomicin enthält.

29. Verfahren nach Anspruch 27 oder Anspruch 28, worin die chromatographische Trennung mit einem Lösungsmittelsystem _t das aus Ghloroform, Methanol und 15$ Ammoniumhydroxid im Volumsverhältnis 5:5:5 besteht, durchgeführt wird.

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30. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass Antibiotikum 66—40B, Antibiotikum 66-4OD und Garamin aus einem Gemisch, das diese Verbindungen enthält, durch (a) Lösen des Gemisches in einem Lösungsmittelsystem aus Chloroform, Methanol und 15$ Ammoniumhydroxid im Volumsverhältnis 3:5:3,(b) Adsorbieren der Lösung auf Silikagel, (c) selektives Desorbieren der Verbindungen mit demselben Lösungsmittel, (d) Isolieren der Verbindungen aus den Lösungen und (e) weiteres Chromatographieren der Produkte aus Stufe (d), um die Verbindungen frei von bei der Fermentation ebenfalls gebildeten Substanzen zu erhalten, aufgetrennt wird.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 bis 30, worin Antibiotikum 66-40B und/oder Antibiotikum 66-40D als Säureadditionssalze, Solvate, Hydrate oder Schiffsche Base-Oxazolidinderivate isoliert v/erden.

32. Ein Antibiotikum nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder dessen Derivat nach Anspruch 13, hergestellt nach dem Verfahren gemäss den Ansprüchen 21 bis 31·

33. Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend zumindest eines der Antibiotika 66-4OB und 66-4OD der Formel I nach Anspruch 1 und geeignete pharmazeutische Trägerstoffe.

Pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend ein pharmazeutisch annehmbares Derivat von zumindest einem der Antibiotika 66-40B und 66-4OD der- Formel I nach Anspruch 1 und geeignete pharmazeutische Trägerstoffe.

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35. - Zusammensetzung nach Anspruch 33 oder Anspruch y\ als Dosiseinheit.

36. Zusammensetzung nach Anspruch 33 oder Anspruch J>k_} geeignet zur topischen Verabreichung.

37· Zusammensetzung nach Anspruch..35* worin die Dosiseinheit ein Behälter für Injektionslösungen mit der darin befindlichen Lösung ist.

38. Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest eines der Antibiotika 66-4OB und 66-höD der Formel I nach Anspruch 1 in feier Form oder in Form der pharmazeutisch annehmbaren Derivate mit einem geeigneten pharmazeutischen Trägerstoff gemischt wird.

39· Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, dass ein Antibiotikum nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und 32, ein pharmazeutisch annehmbares Derivat nach einem der Ansprüche I3 bis l8 und 32, oder eine antibiotisch aktive Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder Anspruch 20 mit einem geeigneten pharmazeutischen Trägerstoff vermischt wird.

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4o. Antibiotisch aktive Zusammensetzung enthaltend Antibiotikum 66-40B der Formel I nach Anspruch 1 oder dessen pharmazeutisch annehmbare Derivate als einzige Aktivsubstanz.

kl. Antibiotisch aktive Zusammensetzung enthaltend Antibiotikum 66-40D der Formel I nach Anspruch 1 oder dessen pharmazeutisch annehmbare Derivate als einzige Aktivsubstanz.

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