DE2900315A1 - Aminoglykosid-antibiotika, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung - Google Patents

Aminoglykosid-antibiotika, verfahren zu ihrer herstellung sowie ihre verwendung

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DE2900315A1 DE19792900315 DE2900315A DE2900315A1 DE 2900315 A1 DE2900315 A1 DE 2900315A1 DE 19792900315 DE19792900315 DE 19792900315 DE 2900315 A DE2900315 A DE 2900315A DE 2900315 A1 DE2900315 A1 DE 2900315A1
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Description

Aminoglykosid-Antibiotika, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung
Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd., Nr. 5 - 1, Nihonbashi-Honcho 2-chome, Chuo-ku, Tokyo (Japan)
Zaidan Hojin Biseibutsu Kagaku Kenkyu Kai, Nr. 14 - 23,
Kamiosaki 3-chome, Shinagawa-ku, Tokyo (Japan)
Diese Erfindung bezieht sich auf Aminoglykosid-Antibiotika, die aus Kanamycin A oder Kanamycin B durch biochemische Umwandlung erhalten werden, und genauer bezeichnet handelt es sich um
Aminoglykosid-Antibiotika der Formel I
NH9 (I)
worin R1 ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe darstellt und R2 eine Aminogruppe oder eine Hydroxylgruppe bedeutet, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie ihre Verwendung.
Die Verbindungen der Formel I sind neue Verbindungen mit chemischen Strukturen, in denen Kanamycin A und B in ihren beiden
9098 29/06 6 0 ·
3'- und ^-'-Positionen deoxyliert, in der 4"-Position C-methyliert und ihre Aminogruppe in der 3"-Position methyliert worden ist und gegebenenfalls ihre Aminogruppe in der 6-Position methyliert worden ist.
Bisher sind verschiedene Aminoglykosid-Antibiotika bekannt geworden, die durch eine Vielzahl von Mikroorganismen hergestellt werden. Es ist auch "bekannt, Aminoglykoside zu erhalten, die zugefügte Substanzen in ihr Molekül eingebaut enthalten durch die Verwendung von Mutanten dieser Mikroorganismen und durch die Zufügung von Zwischenprodukten, die diese Mutanten nicht herstellen können wie z.B. Deoxystrepamin, Neamin, oder ihre Analogen. [Proc. Nat. Acad. Sei., U.S.A., 63: 198 - 204 (1969), J. Antibiol;, 26: 784 - 786 (1973), GB - PS 1 480 374, J. Antibiot. 29: 532 535 (1976)].
Weiterhin ist es durch das Studium des biosynthetischen Weges der Aminoglykoside bekannt, daß natürlich vorkommende Zwischenprodukte in die Aminoglykoside überführt werden können, wenn das Zwischenprodukt zu der Kultur des Aminoglykosid-herstellenden Organismus hinzugefügt wird. [j. Antibiot., 28: 573 - 579 (1975), J. Antibiot., 29: HO - 146 (1976)J.
Jedoch ist es bisher noch nicht bekannt geworden, daß neue und nützliche Aminoglykoside durch Modifizierung der hauptsächlichen chemischen Struktur von natürlichen Aminoglykosiden erhalten werden können durch die Anwendung des biosynthetischen Weges von Mikroorganismen, um eine biochemische Transformation zu bewirken, wie die 3f,4'-Dideoxylierung und C-MethyIierung an ihren Monosaccharidbestandteilen, die bisher nur durch chemische synthetische Arbeitsverfahren durchgeführt werden konnten.
Unter diesen Umständen haben die Erfinder dieser Erfindung gefunden, daß die Züchtung von Gentamycin-erzeugenden Stämmen von Micromonospora-Spezies oder ihren Mutanten in einem Medium, das als bekannte Aminoglykosid-Antibiotika Kanamycin A oder Kanamycin B enthält, neue Verbindungen mit einer chemischen Struktur der vorstehend erläuterten Formel I liefert, in denen Kanamycin A
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ORIGINAL INSPECTED
oder Kanamycin B in den 3'- und 4'-Positionen deoxyliert, in der 4"-Position C-methyliert und ihre Aminogruppe in der 3"-Position methyliert worden ist und gegebenenfalls ihre Aminogruppe in der 6-Position methyliert worden ist«, Ferner wurde auch gefunden, daß diese neuen Verbindungen überlegene antibiotische Eigenschaften im Vergleich zu denen von Kanamycin A oder B besitzen»
Demgemäß ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, neue und nützliche Aminoglykosid-Antibiotika mit der allgemeinen Formel I zur Verfugung zu stellen·
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Aminoglykosid-Antibiotika der allgemeinen Formel I oder ihren pharmakologisch zulässigen Säureadditionssalzen zur Verfügung zu stellen, welche dadurch gelöst wird, daß Gentamycin-erzeugende Stämme von Micromonospora-Spezies oder ihren Mutanten in Gegenwart von Kanamycin A oder Kanamycin B gezüchtet werden»
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I können weiterhin in ihre Säureadditionssalze mit pharmakologisch zulässigen nicht» toxischen anorganischen oder organischen Säuren, wie z#B« Salzsäure , Schwefelsäure, Phosphorige-Säure, Essigsäure, Propionsäure , Stearinsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure und dergleichen, übergeführt werden. Diese Salze können durch Gefriertrocknung ihrer wässerigen Lösung oder Kristallisation aus einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel erhalten werden,, Wenn diese aseptisch hergestellt Vierden, können sie für Injektionen verwendet werden.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel I besitzen breite antibakterielle Spektrenj, so können sie für verschiedene Zwecke sowohl in ViVO5 als auch in vitro verwendet werden© Für in Vitro-Anwendungen können sie zur Sterilisienang Tand Desinfektion von liaboratoriumseinrichtungen und medizinischen Instrumenten und für in Vivo-Anwendraigen kö:aa@B. sie wirksam bei der Behandlung und zur Verhütung verschiedener bakterieller Infektionen bei Mensch rad Tier eingesetzt werdeno
29 003ΤΓ"
Die Dosierung der Verbindungen der allgemeinen Formel I kann gemäß der Art der Erkrankungen, des Alters und des allgemeinen Zustandes der infizierten Menschen oder Tiere sowie der Dosierungsform der Zubereitung angepaßt werden. Beispielsweise sollte in der Humanmedizin die Dosis bei 0,04 bis 1,0 g pro Tag betragen. Die Verbindungen werden in Form von Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulaten, Sirup, Trockensirup, Aerosol, Suppositorien und vorzugsweise injizierbaren Zubereitungen verabreicht.
Die antibakteriellen Aktivitäten der Verbindungen der allgemeinen Formel I als sogenannte minimale Hemmkonsentration MHK, in ug/ml angegeben, (auch als MIC (Minimal Inhibitory Concentration bezeichnet) , werden in der folgenden Tabelle I im Vergleich mit Kanamycin A (nachfolgend als KIi-A bezeichnet), Kanamycin B (nachfolgend als KM-B bezeichnet), Dibekacin (nachfolgend als DKB bezeichnet), welches ein chemisches Derivat von Kanamycin B ist, und Gentamycin-C-Komplex (nachfolgend als GM-C bezeichnet), angegeben, die ähnliche chemische Strukturen wie die Verbindungen der allgemeinen Formel I aufweisen.
Tabelle I
Minimale Hemmkonzentration (ug/ml)
1,56 0,78 0,78 3,13 1,56
Salmonella enteri- 0s78 0,39 1,56 0,78 0,78 3,13 1,56 tidis 1891
Shigella sonnel II o«78 0,78 3,13 0.78 1,56 3,13 1,56 37148
Eroteus vulgaris 0,78 0,78 3,13 0,78 1,56 6,25 6,25 OXK US
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BAD ORIGINAL
Mikroorgarn smus 1-B1 ,39 I-32 ,39 1-A2 C-M-C ,39 DKB KM-A
Micrococcus flavus
ATCC 10240		 0 ,39 0 ,39 0,78 0 ,39 3,13 6,25
Sarcina lutea
ATCC 9341		 0 ,39 0 ,39 0,78 0 ,39 1,56 3,13
Staphylococcus
aureus Smith		 0 ,78 0 ,39 3,13 0 ,78 0,78 3,13
Mycobacterium
phlei		 0 ,78 0 ,78 1,56 0 ,78 1,56 1,56
Ischerichia coli
NIHJ"		 0 0 1,56 0 0,78 3,13
Pseudomonas aeru- 3,13 3,13 6,25 3,13 1,56 >1OO 100 ginosa ATCC 8689
Pseudomonas mela- 1,56 1,56 6«,25 1,56 1,56 >1OO 50 nogenum IAM 1655
Staphylococcus 0,19 0,19 3,13 0,19 0,19 1,56 0,78 aureus Onuma (PC-.
SM-,Mac-resistent)
Staphylococcus 0,19 0,19 6„25 0,19 0f19 >1OO 50 aureus(PC-,SM-,
TC-, EM-.Mac-resistent)
Escherichla coli 1,56 1,56 3,13 1,56 1„56 >1OO >1OO K-12 ML-1629
Escherichia coli 1,56 25 >100 1,56 100 >100 >1OO K-12 R-5
Pseudomonas aeru- 3,13 6,25 12,5 >1OO 1„56 100 50 ginosa 99
Pseudomonas aeru- 1,56 50 >100 6,25 100 >100 100 ginosa GiT-315
(I-B.. : Verbindung τοη Beispiel 1, 1-B2? Verbindung von Beispiel 3, I-ApS Verbindung von Beispiel 5)
Aus der Tabelle I ist deutlich zu ersehen, daß die Verbindungen der allgemeinen Formel I breite und stark antibakterielle Aktivitäten gegen verschiedene grampositive und gramnegative Bakterien besitzen. Ferner weisen sie eine viel stärkere Aktivität auf als jene von Kanamycin A oder B, die die Ausgangsmaterialien darstellen. Sie besitzen ferner wirksame antibakterielle Aktivitäten gegen Kanamycin A- und B-resistente Escherichia coli K-12 ML-1629, welches Aminoglykoside mit einer Phosphotransferase inaktiviert, gegen Kanamycin A-, B- und Dibekacin-resistente Escherichia coli K-12 R-5, welches Aminoglykoside mit einer Acetyltransferase inaktiviert, und gegen Gentamycin-resistente Pseudomonas aeruginosa 99, welches Aminoglykoside mit einer Acety!transferase inaktiviert. Demgemäß besitzen die Verbindungen der allgemeinen Formel I gleichzeitig die Vorteile von Dibekacin und Gentamycin. Im akuten Toxizitätstest,, unter Verwendung der Verbindung (1-B2) gemäß Beispiel 3» wurde festgestellt, daß Mäuse eine Dosis von 125 mg/kg bei intravenöser Verabreichung tolerieren,, also eine Dosisf die bei Verwendung von Dibekacin und Gentamycin alle getesteten Mäuse tötete·
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ORiGlNAL INSPECTED
1100315
NACHQERi - 8 -
In Bezug auf die vorstehenden Ausführungen über die Verbindungen der allgemeinen Formel I ist festzustellen, daß diese Gentamycin und Debekacin überlegen sind, sehr nützliche Antibiotika und als Medikamente verwendbar sind.
Bei dieser Erfindung werden die Verbindungen der allgemeinen Formel I durch Züchten Gentamycin-erzeugender Stämme von Micromonospora-Spezies oder ihren Mutanten in der Gegenwart von Kanamycin A oder Kanamycin B erhalten.
diese Zwecke kann jeder Stamm verwendet werden, wenn er die 3'- und 4'-Positionen von KM-A oder KM-B deoxylieren kann, die Aminogruppe in der 3"-Position methyliert, in der 4"-Position C-methyliert und falls gewünscht, die Aminogruppe in der 6-Position methyliert. Als solche Stämme können bekannte Gentamycinherstellende Organismen, wie z.B. Micromonospora echinospora NRRI 2985 (ΙΙΌ-13149) und Micromonospora purpurea NRRl 2953 (IFO-13150) verwendet werden, auch Micromonospora sp. K-6993 3^LSt geeignet, das zu einer neuen Micromonospora Spezies gehört, durch die Erfinder dieser Erfindung aus einer Bodenprobe auf der Insel Ishigaki der Okinawa Präfektur in Japan isoliert und. gezüchtet, dessen Gentamycin-erzeugende Eigenschaft bestätigt wurde. x(AICC 31 348)
Mutanten können durch Behandeln Gentamyoin-erzeugender Stämme mit herkömmlichen künstlichen routagenen üteohniken erhalten werden wie z.B. mittels ultravioletter oder Röntgenstrahlen-Bestrahlung, Cobalt 60-Bestrahlung, durch Verwendung mutagener Mittel, z,B, Nitrosoverbindungen, Acridinpigmenten, Nuoleinsäurebasisanalogen etc. Solche Mutanten, die geringe oder keine Gentamyoinherpteilung bewirken, und KM-A und KM-B deoxylieren und methylieren können, werden bevorzugt. Als Beispiele solcher Mutanten werden Mutaj^en-Stämme mit der Bezeichnung Miororaonospora sp, K-6993-Y-41 und Mioromonoapora eohinospora NRRL 2985 (110-13149)-N-6, die durch die Erfinder dieser Erfindung geschaffen wurden,
XX XXX
genannt werden, (acpoc 31 349) (aiöö 31 350) Die ideologischen Eigenschaften von Miororaono spora sp· K-6993, seinen Mutanten Mioromonospora sp, K-6993-Y-41 und Mioromono-
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spora ecMnospora NRRL 2985 (Xi1OI3149)-ϊΤ<=·6 werden, wie folgend angegeben, festgehalten:
Diese Stämme sind in der American Type Culture Collection unter den ATCC-Hinterlegungsnummern 31348, 31349 "bzw* 31350 hinterlegt worden. Ferner sind diese Stämme auch in dem Institute of MicroMal Industry, Agency of Industrial Science and Technology , Ministry of International Trade and Industry, Japan unter den Hinterlegungsnummern J1ERM-P 4304 j, PERIi-P 4305 bzw. PERM-P 4303 hinterlegt worden«,
Die vorstehend genannten drei Stämme weisen ein ähnliches morphologisches Erscheinungsbild auf«, Sie bilden verzweigte Substratmycelienf 0„5 bis 1,O Mikron im Durchmesser, weisen Jedoch keine Luftmycelien auf. Axt. der Spitze einer jeden Sporenträgerabzweigung am Substratmycel wird eine einzige Spore· angeordnet, in sphärischer oder ovaler Gestaltung,, Diese Stämme wachsen gut auf Ozapek-Agar und Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar., Die Oberflächenfärbung des vegetativen Wachstums ist gewöhnlich purpur auf Eier-Albtunin-Agar. Micromonospora sp„ 1-6993 und Mieromonospora echinospora NRRL 2985 (ΐΙΌ-13149)-ΪΓ-6 weisen ähnliche morphologische Charakteristiken im Vergleich zu Mieromonospora echinospora NRRL 2985 (IFO=I3149) auf. Mieromonospora sp« K-6993-Y-41 weist eine geringere Sporenbildung und helleres vegetatives Wachstum im Vergleich zu den beiden anderen Stämmen auf.
Tabelle IX
Kultur - Charakteristiken (bei 29° C)
Mieromonospora Micromoaospora Mieromonospora sp. K-6993 ■ sp. Κ-6993-Ϊ-41 echinospora
HURL 2985-K-6
C!sapek=Agar Wachstum: gut, Wachstum:gut, Wachstumsgut
p-urpurrot schwach orange helles gelblichorange bis tief braun bis bräunteänlich schwarz lieh schwarz kein lösliches kein lösliches kein lösliches Pigment Pigment Pigment
Glucose-Aspara- Wachstums schwach Wachstums schwach Wachstums gin-Agar schwach bräun- achwach bräun- schwach
lich-gelb lich-gelb ocker kein, lösliches kein lösliches kein lösliches Pigment Pigment Pigment
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GIyc erin-Asparagin-Agar
Stärke-Agar
Wachstum: kein Wachstum :kein Wachs turn: kein
Tyrosin-Agar
Nähr-Agar
Hefe-Extrakt-Malz-Extrakt-Agar
Hafermehl-Agar
Bennett-Agar
N-Z-Amin (1:1)-Agar
Emmerson-Agar
Ei-Albumin-Agar
Wachs tum:mäßig schwach gelblich-orange kein lösliches Pigment
Wachstum:
schwach
hell terra
cotta
kein lösliches
Pigment
Wachs tum:mäßi g helles beige kein lösliches Pigment
Wachstum:gut
hellorange bis
dunkel rötlich
orange
kein lösliches
Pigment
Wachstum:kein
Wachstum:mäßi g hellbraun Wachstum:mäßig
orange
kein lösliches
Pigment
Wachstum:
schwach
helles graugelb bis braun
kein lösliches
Pigment
Wachstum:mäßig
helles beige
kein lösliches
Pigment
Wachstum:gut
orange bis
dnnkelorange
kein lösliches
Pigment
Wachstum:kein
Wachstum:mäßig
hellbraun
purpur , purpur
kein lösliches kein lösliches
Pigment Pigment
Wachstum:gut
"· hell-bräunlich
purpur
kein lösliches
Pigment
Wachstum:gut
dunkel-rötlich
orange
kein lösliches
Pigment
Wachs tum:mäßig
schwach braun
purpur
kein lösliches
Pigment
Wachstum:gut
dunkel-orange
kein lösliches
Pigment
Wachstum:gut
hellbraun
kein lösliches
Pigment
Wachstum:mäßig
schwach braun
purpur
kein lösliches
Pigment
Wachstum:mäßig ocker
kein lösliches Pigment
Wachstum: schwach
helles graugelb bis braun kein lösliches Pigment
Wach3tum:mäßi g helles beige kein lösliches Pigment
Wachstum:gut dunkelorange
kein lösliches Pigment
Wachstum:kein
Wachstum:mäßig
hellbraun
purpur'
kein lösliches
Pigment
Wachstum:gut
schwach orange
purpur
kein lösliches
Pigment
Wachstum:gut schwach braun
kein lösliches Pigment
Wachstum: mäßi g
schwach braun
purpur
kein lösliches
Pigment
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Tabelle III
Ausnutzung τοπ Kohlehydraten Die Ausnutzung von Kohlehydraten wurde im Pridham-Gottlieb-Medium geprüft. Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle
D-Glucose
D-Galactose
D-Lactose
D-Mannitol
D-XyIose
D-Pructose
D-Arabinose
L-Arabinose
D-Raffinose
L-Rhamnose
Sucrose
Stärke
Glycerin
Micromonospora sp. K-6993
Micromonospora spe K-6993-T-41
Micromonospora echinospora NRRL 2985-1-6
Tabelle IY
Physiologische Eigenschaften (Beobachtet nach zweiwöchentlicher Inkubation bei 29° C)
Micromonospora Micromonospora sp. K-6993 sp. K-6993-T-41
Micromonospora echinospora NRRL 2985-ΪΤ-6
Verflüssigung von + Gelatine
Milchkoagulation -
Milchpeptonisation"1" +
Oelluloseabbau +
Nitratreduktion +
Tyrosinasebildung _
+beobachtet nach einmonatiger Inkubation bei 37° G Micromonospora sp„ K-6993 bildet eine einzige Spore am Substratmycelf ohne 3'edoch luftmycelien au "bilden. Somit gehört es zn den
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Micromonospora Species.
Gentamycin-herstellende Stämme der Micromonospora Spezies,, die bereits beschrieben worden sind, werden nachfolgend genannt: Micromonospora purpurea NRRL 2953?
Micromonospora echinospora var. eehinospora NRRL 2985; Micromonospora eohinospora var. ferruginea NRRL 2995; Micromonospora echinospora var. Pallida NRRL 2996;
(Diese Stämme sind in Antimicrobial Agents and Chemotherapy 116-124 (1963) beschrieben und in der veröffentlichten und geprüften japanischen Patentanmeldung Nr. 21934/1969^ Micromonospora sagamiensis MK-65 (ATOO 21 826); Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK-62 (ATOO 21 803); Micromonospora sagamiensis var. flava Mm-628 (ATCO 21 827).
[Diese Stämme sind in den veröffentlichten und geprüften japanischen Patentanmeldungen Nr. 39155/1975 und Nr. 6755/1976 beschriebenn
Die Charakteristiken von Micromonospora sp, K-6993 werden mit denen der vorstehenden sieben Stämme verglichen, die Ergebnisse werden in der Tabelle V wiedergegeben.
Tabelle V
Micromonospora sp. K-6993
M. purpurea
M.echinospora
M.echinospora var. ferruginea
M.echinospora var. pallida
M.sagamiensis MK-65
M.sagamiensis var, nonreducans MK-62
M.sagamiensis var. flava Mm-628
Nitratreduktion
Verflüssigung Verflüssigung Farbe des von Gelatine ilh
von Milch
Wachstums purpur
dunkles purpur
purpur η
orange
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90031
Die erfindungsgemäß zu verwendenden Mikroorganismen sind vor dem Offenlegungstag der vorliegenden Anmeldung allen Dritten 9 einschließlich der Anmelderin zugänglich geweseng wie aus den Hinterlegungsbezeichnungen ersichtlich. ist ρ wurden die Hinter« legungen mit der Bezeichnung_JjgRIi "beim Agriculture Research Service Culture Collection Northern Regional Research !laboratory Peorias Illinois 61 604„ USAg
mit der_BezeicIin.ung^AffiGO "beim American Type Culture Collection 12 301 Parklawn Drive Rockville^ Maryland 20852 USA; und mitderBezeichnung1IO "beim Institute for Fermentation 17-85 Juso-Honmachi 2-chomej, Yodogawa~kuf Osaka 532 9 Japan^ vorgenommen.
Θ09 829/0660
Ms 29U031B
Wie aus der Tabelle Y ersichtlich ists ist Mieromonospora sp. K-6993 ein neuer Stamm, der einige Gemeinsamkeiten mit Micromonospora echinospora hat.
Um Kanamycin A oder Kanamycin B in die Verbindungen der allgemeinen Formel I zu überführen, werden die vorstehend genannten Stämme in Gegenwart von Kanamycin A oder Kanamycin B gezüchtet. Bei dieser Erfindung werden herkömmliche Züchtungsverfahren zur Herstellung von Antibiotika verwendet. Verschiedene Nährstoffe werden für die Züchtung eingesetzt. Als Kohlenstoff quellen können Dextrose, Stärke, lösliche Stärke, Dextrin, Sucrose, Melasse, einzeln oder im Gemisch, und Kohlenwasserstoffe, Alkohole, organische Säuren, öle pflanzlicher oder tierischer Herkunft in Anpassung an das Ausnutzungsvermögen der Stämme eingesetzt werden. Als Stickstoffquellen können anorganische Salze, wie z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrit und dergleichen, natürliche Stickstoffquellen, wie z.B. Sojabohnenmehl, entfettetes Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Glutenmehl, Maismehl, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maiseinweichlaugen und dergleichen, einzeln oder in Kombination, eingesetzt werden. Falls erforderlich, können Aminosäuren, Nukleinsäuren, Vitamine, anorganische Salze, z.B. Natriumchlorid, Calciumcarbonat, Phosphate, Magnesiumsulfat, Gobaltchlorid und dergleichen, verwendet werden.
Als Züchtungs- und Vermehrungsverfahren werden flüssige Kulturen, insbesondere belüftete submerse Kulturen bevorzugt. Die Temperatur bei der Züchtung liegt zwischen 25 bis 45° 0, bevorzugt 28 bis 32° C. Der bevorzugte pH-Wert liegt im etwa neutralen Bereich. Die Züchtungsbedingungen, wie die Zusammensetzung des Kulturmediums, pH-Wert des Mediums, Temperatur, Durchrühren oder Belüften und dergleichen, können gemäß dem eingesetzten Stamm oder einer zugesetzten Menge an Kanamycin angepaßt werden»
Zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel I wird das Ausgangsmaterial Kanamycin A oder Kanamycin B dem Medium zu Beginn oder innerhalb von etwa 72 Stunde^ vom Beginn der Züchtung an, dem Kulturansatz zugefügt« Die Menge an Kanamycin A
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oder B beträgt etwa O51 bis 10 g/Liter und diese Menge kann ganz als einmaliger Zusatz oder in Form von Zugabeteilportionen hinzugefügt werden 9 wobei der Zusatz als freie Base oder in Form ihrer Säureadditionssalze9 soBo Sulfats erfolgen kanno Die Züchtung wird so lange fortgesetzt5 bis die Verbindungen der allgemeinen Formel I im Medium in ausreichender Menge vorliegeno Die hierzu erforderliche Zeit beträgt üblicherweise 3 bis 7 Tage nach erfolgter Kanamyein=Zugabeo
Die in der Kulturbrühe angesammelte Menge der Verbindungen der allgemeinen Formel I wird mittels Plattendiffusionstestes unter Verwendung von Filterpapier (Disktest) unter Verwendung von Escherichia coli K-12 ML=1629 bestimmt s welches selektiv gegen die Verbindungen der allgemeinen Formel I empfindlich istP je= doch nicht gegen Kanamycin A und Bo
Zur Isolierung und Reinigung der Verbindungen der allgemeinen Formel I aus der Kulturbrühe werden für Aminoglykoside übliche Methoden verwendeto Dies sind Z0B0 Absorption mit Kationen- und/oder Anionenaustauscherharzens Absorption mit Aktivholzoder -knochenkohle sowie mittels Cellulose- und Silicagelsäulenchromatographie v einzeln oder in ihren Kombinationen,,
Zum Beispiel wird praktisch gearbeitet, indem das pH der Kulturlösung auf 2 bis 3 eingestellt 9 das Mycel abfiltriert und das pH der Filtratbrühe auf 6 bis 7 eingestellt wird. Dann wird die hergestellte Verbindung an einem Kunstharz absorbiert, welches zum Absorbieren und Desorbieren der hergestellten Verbindung geeignet ist, das Carbonsäure- oder Sulfonsäuregruppen enthält s z.B. KationenaustauschharZg wie Amberlite IRC-50 (Handelsname) (!OL+), Dowex 5Ow (Handelsname) (EEL·*5*)ο Die hergestellte Verbindung wird mit 1 normalem Ammoniumhydroxid eluiert. Die so erhaltene Lösung wird unter vermindertem Druck eingeengt ΰ und der Rückstand wird über Amberlite CG-50 (Handelsname) (KH,+) gegeben unter Verwendung einer kontinuierlichen Gradienten-Elutions-Technik und unter Verwendung von Ammoniumhydroxid« Weitere Reinigung kann durch Silicagelsäulenchromatographie und dergleichen erfolgen und - falls erforderlich - durch wiederholte Säulen=·
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Chromatographie mit einer Füllung aus Amberlite CG—50 (IiH/ ), Dowex (Handelsname) (0H~) und dergleichen»
Typische Beispiele der "Verbindungen der allgemeinen Formel I, die durch das vorstehende Verfahren erhalten wurden, sind die folgenden:
3"-N-Kethyl-4"-G-methyl-3'»4'-dideoxy-»6'-N-methylkanamycin B oder sein 4"-Epimeres (I-B..);
3»-N-Methy1-4"-C-methyl-3',4'-dideoxykanamycin B oder sein 4"-Epimeres (1-B2);
3"-N-Methyl-4"-C-methyl-3',4f -dideoxy-6' -N-methy!kanamycin A oder sein 4"-Epimeres (I-A..);
3"-N-Methyl-4"-C-methyl-3· ^'-dideoxykanamycin A oder sein 4"-Epimeres (1-A2).
BeisOiel 1
Herstellung der gewünschten Verbindung [Ϊ-βΓ| mittels des Stammes K-6993-Y-41:
In 100 ml eines flüssigen Mediums (pH 7,5), enthaltend 5% Dextrin, 3,5% entfetteten Sojabohnenschrot Esusanmito-Tokkyu (Handelsname) und 0,7% Oalciumcarbonat in einer 500 ml Flasche, wurde mit Micromonospora sp. Stamm K-6993-Y-41 "beimpft, der auf einer modifizierten Bennet's-Agar-Schrägung 2 Wochen bei 30° 0 gezüchtet war. Die Flasche wurde 48 bis 72 Stunden bei 29° C geschüttelt, um eine Beimpfungskultürlösung zu erhalten.
Separat wurden 100 ml eines Hauptkulturmediums in einer 500 ml Flasche hergestellt. Dieses Kulturmedium wurde mit 1 ml der vorstehend genannten Beimpfungskultürlösung beimpft. Die Zusammensetzung der Hauptkulturlösung, bestehend aus 3% Dextrin, 3,5% entfettetem Sojabohnenschrot Esusanmito-Tokkyu (Handelsname), O,7?o Calciumcarbonat und 0,000025% Cobaltchlorid (pH 7,5) wurde nach Sterilisation bei 120° C bei 20 Minuten verwendet. Nach 24 stündigem Kultivieren wurde Kanamycin B zu dem Kulturmedium in einer Menge von 300 meg (Potenz) pro Milliliter des Mediums hinzugefügt. Danach wurde die Kultur 120 Stunden bei 29°C geschüttelt, worauf die antimicrobielle Potenz in der Brühe mittels des Plattendiffusionstestes unter Verwendung von Filter-
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papier (Disktest) und von Escherichia coli K«12 ML-1629 (Po.lypepton^Agar-Kedium) bestimmt wurde o Hierbei wurde eine inhibierte Zone von 15,5 mm Durchmesser beobachtete Dann wurde der pH-Wert von 20 Liter der erhaltenen Kulturlösung auf pH 2,0 mit 4 nor·= maler Salzsäure eingestellt, das Kycel wurde danach abfiltriertβ Der pH-Wert der filtrierten Brühe wurde auf pH 7s0 mit 4 normaler Natriumhydroxidlösung zurückgestellte Dann wurde die filtrierte Brühe in eine Säule, gefüllt mit 1,6 Liter Amberlite IRC-=50 (NH. ) 9 gegeben^ um die gewünschte Verbindung (1-B^) zu absorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde das Produkt mit 5 Liter einer 1 normalen Ammoniumhydroxidlösung eluiertm Das Eluat \-rarde unter vermindertem Druck eingeengt und getrocknet» Es wurde 1O96 g rohes Pulver erhalten» Das rohe Pulver wurde an 900 ml Amberlite CG-50 (KH^+) in einer Säule adsorbiert» Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser wurde eine kontinuierliche Gradientenelution unter Verwendung von 3 «,5 Liter Wasser und 3*5 Liter 0j>8 normaler Ammoniumhydroxidlösung ausgeführte Dann wurde jede Fraktion (jeweils 15 ml) mittels des Plattendiffusionstestes unter Verwendung von Filterpapier (Disktest) und unter Verwendung von Escherichia coli K-12 ML-1629 als Teststamm und einer Silika- ^eldünnschichtcliroinatographieflvieselgel 60 EV,Ή ^^ 0»25 ssn Dicke (Handelsname),Herstellers Merck & Co.; entwickelt in 2 Stunden mit dem Entwicklungslösungsmittel (gemäß A in Tabelle Vl); Ninhydrin-Anfärbung Rf-Wert Of43>Jo Die hergestellte Verbindung wurde eluiert in die Fraktionen Ur. 270 bis Nr· 310«, Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt 9 vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt sowie präparativ auf einer Silicagelplatte [Kieselgel 60 PF2C^ (Handelsname) Herstellers Merck & Co
mm Dicke und 20 χ 20 cm 9 aktiviert in 5 Stunden bei 150° unter Verwendung des vorstehend genannten Ent\o.eklungslösungsmittels chromatographiert0 Nach der Entwicklung wurde die Lage der hergestellten Verbindung durch Ninhydrinanfärbung bestätigte Die hergestellte Verbindung wurde zusammen mit Silicagel abgekratzt und die Verbindung aus dem Silicagel mit dem gleichen Entwicklungslösungsmittel extrahiert. Der Extrakt wurde unter vermindertem Druck eingeengt und dann erneut einer Säulenchromatographie unter Verwendung von 10 ml Amberlite Cfr-50 (NH^, )
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unterworfen. Dann wurde eine kontinuierliche Gradienteneluierung unter Verwendung von 200 ml Wasser und 200 ml 0,8 normaler Ammoniumhydroxidlösung ausgeführt. Fach Bestätigung der aktiven Fraktionen, die mittels der vorstehenden Silicageldünnschichtchromatographie erhalten wurden, wurden die Fraktionen, die die hergestellte Verbindung enthielten, gesammelt, eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden 37 mg weißes Pulver erhalten. Nach Auflösen von 37 mg des weißen Pulvers in 5 ml Methanol wurde die erhaltene lösung durch Zugabe von 0,1 normaler Schwefelsäure in Methanol angesäuert. Die gebildeten Fiederschlage wurden durch Filtration abgetrennt und im Vakuum getrocknet. Es wurde das Sulfat der hergestellten Verbindung erhalten. Das Sulfat wurde in 0,5 ml Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde in eine Säule mit einer Füllung aus 10 ml Dowex 1x2 (OH") gefüllt. Die Säule wurde mit Wasser eluiert. Die so erhaltenen aktiven Fraktionen wurden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und in eine Säule, enthaltend 10 ml Amberlite CG-50 (NH/*"), gefüllt. Dann wurde eine kontinuierliche Gradienteneluierung unter Verwendung von 200 ml Wasser und 200 ml 0,8 normaler Ammoniumhydroxidlösung durchgeführt. Fach Bestätigung der aktiven Fraktionen durch die vorstehend beschriebene Silicageldünnschichtchromatographie wurden die Fraktionen, die die hergestellte Verbindung enthielten, gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden 24 mg weißes Pulver der reinen hergestellten Verbindung [Ϊ—B^] erhalten.
Die freie Base [i-B^ (das gefriergetrocknete Produkt) hatte die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften:
(1) Basisches weißes Pulver (Vakuum-getrocknet für 24 Stunden bei 95° C)
(2) Löslichkeit: Sehr leicht löslich in Wasser; löslich in Methanol und Äthanol; schwach löslich in Aceton; unlöslich in Chloroform, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat, Äther, η-Hexan etc.
(3) Elementaranalyse für C2^H,-zFc0Q·H2O
CHN
Berechnet: 49,30% 8,87% 13,69%
Gefunden: 49,51% 9,13% 13,52%
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(4) Schmelzpunkts 108 Ms 111° C
(5) Optische Drehungs pt] 25 + 128° (C = 1?S, in H2O)
(6) TJl traviolettabsorptions spektrums Endabsorption
(7) Infrarotabsorptionsspektrum (KBr) s Figo 1 Maximumabsorption (cm )%
1040, 1115, 1270,1340-9 1385, 1485, 157O9 1640, 2930 und 3390
(8) MI-IR-Spektrum (in D2O) ι Pigo 2
Charakteristische Peaks ι
1,3 ppm=-=— tertiäres 4!g~C=methyls Z9S ppm === ö^N-methyl, 2P7 ppm=·— S'^N-methylj, 5P12 ppm ■=«=·= 1"=anomeres Protons, 5 s 37 ppm— 1s-anomeres Pro tone
(9) Massenspektruras
Hauptionen-Peaks (m/e)s
112, 125p 143, 144, 1729 190, 330, 334S 352S 38O9 393, 494 (M+ 1)
(10) Rf-Wert durch Dünnschichtchromatographie % Tabelle Vf
Aufgrund der physikalisch^chemischen Eigenschaften-, insbesondere durch die Ergebnisse des Massenspektrums und des kernmagnetischen Resonanzspektrums (HMR) zusammen mit den Charakteristiken des Ausgangsmaterials Kanamycin B, wurde die so erhaltene Verbindung als 3"-lT-Methyl-4"-C-methyl»3ü ^"-dideoxy-ö s-methyl-kanamycin B oder ihr 4t!-Epimeres mit der folgenden Formel angesehen:
CH2OH
Weiterhin wurde durch die vorstehende Struktur der Verbindung [i-B..] das Wachstum der resistenten Bakterien inhibiert, die Kanamycin B und 3',4'-dideoxy-kanamycin durch Acetylierung der Aminogruppe in ihrer 6'-Position inaktivieren, wie dies z.B. durch Pseudomonas aeruginosa GN 315, Escherichia coli K-12 R-5 und dergleichen erfolgt.
Beispiel 2
Herstellung der gewünschten Verbindung [I-B.J durch den Stamm ΗΗΒΙι-2985-Η-6:
Durch Verwendung des gleichen Kultivierungsverfahrens, des Kulturmediums, der Zugabemenge an Kanamycin B, dessen Zugabeverfahren und dergleichen, wie im Beispiel 1 beschrieben^wurden 20 liter Kulturlösung erhalten. Die so erhaltend Lösung wurde an Amberlite IRC-50 (NH.+) absorbiert und danach desorbiert. Danach ■wurde eine Gradientensäulenchromatographie unter Verwendung von Amberlite GG-50 (NH^ ) durchgeführt. Die Fraktionen, die die hergestellte Verbindung fl-rB^J enthielten, wurden gesammelt, unter vermindertem Druck eingeengt und einer Silikageldünnschichtchromatographie, wie im Beispiel 1 beschrieben, unterworfen. Es folgte eine Gradientenchromatographie unter Verwendung von Amberlite CG-50 (NH/*"). Es wurden 13 mg der Verbindung Fl-B1J als weißes Pulver erhalten. Durch Behandeln des weißen Pulvers, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurden 7 mg weißes Pulver der reinen hergestellten Verbindung [1-B1J erhalten.
Herstellung der gewünschten Verbindung Jl-B2J durch den Stamm K-6993-Y-41:
Die im Beispiel 1 gezüchtete Impfkultur wurde zur Beimpfung und Kultivierung in ein Kulturmedium, enthaltend 1,5% lösliche Stärke, 1% Hefeextrakt, 0,3% Triptose (Handelsname, Hersteller: Difco Go.), 0,3% Magnesiumsulfat·7Η20, 0,3% Dikaliumhydrogenphosphat und 0,000025% Cobaltchlorid (pH 7,2) gegeben. Nach 24 Stunden wurde eine solche Menge Kanamycin B zugefügt, daß dessen Konzentration 300 mcg/ml betrug. Das Schütteln der Kultur wurde weiterhin 115 Stunden bei 29° C durchgeführt» Nach dem Piltrie-
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ren Ton 20 Liter Kulturlösung,, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde das Piltrat in eine Säule mit einer Füllung von 1P6 Liter Amberlite IRO-5O (NH^+) gegeben^ um die hergestellte Verbindung I-BoJ zu adsorbiereno Diese wurde dann mit 5 Liter 1 normaler wässeriger Ammoniaklösung eluiert. Durch Einengen des Eluates unter vermindertem Druck wurden 12,1 g rohes Eluatprodukt erhalten«, Das rohe Eluatprodukt wurde an 900 ml Amberlite CG-50 (KEL+) als Säulenfüllung adsorbierte Es wurde eine Gradienteneluierung unter Verwendung von 3,5 Liter !fässer und 3? 5 Liter 0s8 normaler wässeriger Ammoniaklösung durchgeführte Die Fraktionens, die die hergestellte Verbindung enthielten,, besaßen den KP-Wert 0P36 bei der Dünnschichtchromatographie und sie wurden«, wie im Beispiel 1 angegeben, gesammelte Dann wurde nach Durchführung der präparativen Silißageldünnschichtchromatographiep wie im Beispiel 1 angegeben,, der Extrakt einer Säulenchromatographie unter Verwendung'"*"' von 20 ml Amberlite CG-50 (ITIL+) und einer Gradienteneluierung unter Verwendung von 300 ml Wasser und 300 ml 0,8 normaler wässeriger Ammoniaklösung unterworfen«, Dann wurden die Fraktionenf die die hergestellte Verbindung enthielten, gesammelt und gefriergetrocknet«, Es wurden 99 mg weißes Pulver erhalten, 70 mg des erhaltenen weißen Pulvers wurden s wie im Beispiel 1 angegeben, behandelt,, Es wurden dadurch 45 mg weißes Pulver der reinen hergestellten Verbindung £I=B2] erhalten.
Die freie Base Jl-Brj (das gefriergetrocknete Produkt) hatte die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften; •—""*"—
(1) Basisches weißes Pulver (Getrocknet im Vakuum für 3 Stunden bei 95° 0)
(2) Löslichkeits Sehr leicht löslich in Wasser, löslich in Methanol£ schwer löslich in Äthanol und Acetonj unlöslich in Chloroform^ Benzol s Äthylacetats, Butylacetat, Äther, η-Hexan etc.
(3) Elementaranalyse für C20H^1N^O8°H2Os
C- H- ¥
Berechnet? 4-8,28% 8,71% 14,07#
Gefunden g 4-80O6% 8,96% 14,11#
(4) Schmelzpunkts 143 bis 146° G
(5) Optische Drehungs [^J]^5 ..+ 142° (C = 1#9 in H2O)
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(6) Ultraviolettabsorptionsspektrum; Endabsorption
(7) Infrarotabsorptionsspektrtun (KBr): Pig. 3 Maximumabsorption (cm ):
1020, 1050, 1105, 1130, 1260, 1340, 1450, 1475, 1580, 2920, 3330
(8) HMR-Spektrum (in D2O): Pig. 4
Charakteristische Peaks:
1,28 ppm tertiäres 4"-0-methyl, 2,55 ppm 3n-N-methyl,
5,09 ppm 1"-anomeres Proton, 5,26 ppm 1'-anomeres
Proton
(9) Massenspektrum:
Hauptionenpeaks (m/e):
112, 129, 144, 172, 190, 319, 334, 352, 380, 479 und 480 (M+ 1) _„-_.__
(10) Ef-Viert für Dünnschichtchromatographie: Tabelle VI
Aus den vorstehend beschriebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere den Ergebnissen des Massenspektrums und des kernmagnetischen Resonanzspektrums (HMR) wurde die erhaltene Verbindung [l-B2l als 3"-N-Methyl-4"-C-methyl-3f,4f-dideoxykanamycin B oder dessen 4"-Epimeres mit der folgenden Formel angesehen:
NHCH3 OH N, /
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Beispiel 4
Herstellung der gewünschten Verbindung [i^Bo] durch den Stamm HRRL 29S5-IT-6S
Das gleiche Züchtungsverfahren9 Kulturmedium und Zugabeverfahren von Kanamycin B und dergleichen;, wie im Beispiel 1 angegeben, wurde im vorliegenden Beispiel verwendeto Dann wurden 20 Liter der erhaltenen Kulturlösung an Amberlite IB.O50 (ITH.'5') adsorbiert und danach desorbiert. Es wurde eine Gradientensäulenchromatographie unter Verwendung von Amberlite 0G=-50 (NH* ) durchgeführt. Die aktiven Fraktionen9 die die hergestellte Verbindung JjE-B2J enthielten, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt«, Dann wurde die präparative Silicageldünnschichtchromatographie durchgeführt, wie im Beispiel 1 beschrieben,, und weiter wurden die aktiven Fraktionen bei einer Gradientenchromatographxe unter Verwendung von Amberlite CG=5O (NIL+) gesammelt» Es wurden 83**lng der hergestellten Verbindung als weißes Pulver erhalten» 80 mg des erhaltenen Pulvers wurdens wie im EeÄJS.pie3r 1 angegeben,
-Aj
behandelt«, Dadurch wurden 51 mg weißes Pulver der reinen hergestellten Verbindung Jl0BpJ erhalten»
Beispiel 5
Herstellung der gewünschten Verbindung [i-ApJ durch den Stamm K-6993-Y-41:
Es wurde nach dem gleichen Verfahren, wie im Beispiel 1 beschrieben,, unter Verwendung des gleichen Kultivierungsverfahrens, Kulturmediums , Zugabemenge und Zugabeverfahren von Kanamycin A und dergleichen gearbeitet. Es wurden 50 Liter Kultur lösung erhalten«,
Die so erhaltene Kulturlösung wurde in eine Säule mit einer Füllung von 4 Liter Amberlite IRC-50 (ML+) gegeben» Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit 20 Liter 1 normaler wässeriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet» Es wurden 25j,5 g rohes Eluatprodukt erhalten«, Das rohe Eluat wurde einer Gradienteneluierung in einer Säule mit einer Füllung aus 1,6 Liter Amberlite GG-50 (NH,'1*) unter Verwendung von 7 Liter Wasser und 7 Liter 0,7 normaler wässeriger Ammoniaklösung unterworfen.
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Dann wurde der gleiche Nachweis und die Bestimmung, wie im Beispiel 1 angegeben, durchgeführt. Die Fraktionen, die die hergestellte Verbindung [JC-A2J enthielten, wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Der gebildete Rückstand wurde einer Silicagelsäulenchromatographie (Wako Gel C-200, Handelsname, 20 mm χ 900 mm) unterworfen. Eluiert wurde mit dem Entwicklungslösungsmittel A gemäß Tabelle VI, wodurch die rohen Fraktionen der hergestellten Verbindung j_I-A2J erhalten wurden. Zur weiteren Reinigung der so erhaltenen rohen Fraktion wurde die präparative Silicageldünnschichtchromatographie, wie im Beispiel 1 angegeben, durchgeführt. Die so erhaltene rohe hergestellte Verbindung wurde einer Gradientenchromatographie in einer Säule, gefüllt mit 10 ml Amberlite OG-50 (ML·*), unter Verwendung von 100 ml Wasser und 100 ml wässeriger Ammoniaklösung, unterworfen.
Die Fraktionen, die die hergestellte Verbindung enthielten, wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden 35 mg der hergestellten Verbindung Tl-AoJ als weißes Pulver erhalten.
Durch Behandeln des Pulvers, wie im Beispiel 1 angegeben, wurden 13 mg der hergestellten reinen Verbindung [l-A2J erhalten.
Die freie Base [ΐ-Α23 (das gefriergetrocknete Produkt) hatte die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
(1) Basisches weißes Pulver (im Vakuum 24 Stunden bei 95° G getrocknet)
(2) löslichkeit: Sehr leicht löslich in Wasser; löslich in Methanol; schwer löslich in Äthanol und Aceton; und unlöslich in Chloroform, Benzol, Ithalacetat, Butylacetat, Äther, n-Hexan etc.
(3) Elementaranalys e für C20H 40N4°9"H20i • 11 N
C H 11 ,24%
Berechnet: 48,18% 8,49% ,15%
Gefunden: 48,59% 8,80%
(4) Schmelzpunkt: 129 bis 131° C
(5) Optische Drehung: (}c3 ψ + 147,5 (C = 1%, in H2O)
(6) ültraviolettabsorptionsspektrum: Endabsorption
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(7) Infrarotabsorptionsspektrum (EBr): Fig. 5 Maximumabsorption (cm ):
820, 1o25, 1050, 1090, 1145, 1260, 1330, 1365, 1455, 1475, 1580, 2925 und 3350
(8) MMR-Spektrum (in D2O): Fig. 6
Charaketristische Peaks:
1,29 —— tertiäres 4"-C-methyl, 2,56 ppm — 3"-F-methyl, 5,12 ppm — 1 »-anomeres Protonf 5^2? ppm -— 1 '-anomeres Proton,
(9) Massenspektrums
Hauptionenpeaks (m/e)s
113, 130, 172, 190, 320, 334f 352, 362, 380, 480 und 481 (M+ 1)
(10) Rf-Werte bei der DünnscMchtchromatographies Tabelle YI
Aus den vorstehenden physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere den Ergebnissen des Massenspektrums und des kernmagnetischen Resonanzspektrums (HMR) wurde die in diesem Beispiel erhaltene Verbindung [i-ApJ als das 3«-N~Methyl-4"-C-methyl-3',4'-dideoxy-kanamycin A oder dessen 4"-Epimeres mit der folgenden Formel angesehen:
Beispiel 6
Herstellung der gewünschten Verbindung ^I-ApJ durch den Stamm K-6993-Y-41
Ein Medium, enthaltend 1 „5% lösliche Starkes, 1% Hefeextrakt,
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-VS-
0,3% Triptose (Handelsname), 0,3?o Magnesiumsulfat·7H2O, 0,3?o Dikaliumhydrogenphosphat und 0, OOOO2594 Oobaltchlcrid (pH 7,5) wurde 20 Minuten bei 120° C sterilisiert. Eine Impfkultur, in gleicher Weise wie im Beispiel 1 "beschrieben, die Kanamycin-A-sulfat in einer Konzentration von 1000 meg (Potenz)/ml enthielt, wurde zur Beimpfung zu dem Medium in einer Menge von 1%, bezogen auf die Menge des zu beimpfenden Mediums, hinzugefügt. Dann wurden 20 Liter der Kulturlösung, die durch Schütteln der Kultur während 144 Stunden bei 29° C erhalten wurde, in eine Säule, wie im Beispiel 1 beschrieben, eingefüllt, die als Füllung 1,8 Liter Amberlite IRC-50 (ML+) enthielt. Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wurde die Säule mit 1 normaler wässeriger Ammoniaklösung eluiert. Das erhaltene Eluat wurde unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet. Es wurden 22,3 g rohes Eluatprodukt erhalten. Das rohe Produkt wurde einer Gradientenchromatographie unter Verwendung von 3,5 Liter Wasser und 3,5 Liter 0,7 normaler wässeriger Ammoniaklösung und unter Verwendung einer Säule mit einer Füllung aus 800 ml Amberlite CG-50 (NH/1") unterworfen. Die Fraktionen, die die hergestellte Verbindung [I-Ao] enthielten (der Nachweis erfolgte durch Dünnschichtchromatographie , wie im Beispiel 1 beschrieben), wurden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt und einer SiIicagelsäulenchromatographie (Wako Gel C-200 in einer Säule 20 mm χ 900 mm) unterworfen. Dann wurde die Säule mit dem Entwicklungslösungsmittel A gemäß Tabelle VI eluiert, wodurch die Fraktionen, die die hergestellte Verbindung [1-A2"] enthielten, erhalten wurden. Die Untersuchung der Fraktionen wurde unter Verwendung der gleichen Dünnschichtchromatographie ausgeführt, wie dies schon vorstehend angegeben wurde. Die so erhaltenen Fraktionen wurden vereinigt und erneut einer Gradientenchromatographie mit einer Säule, die als Füllung 10 ml Amberlite CG (NH,"1*) enthielt, unterworfen. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt und gefriergetrocknet. Es wurden 28 mg der hergestellten Verbindung (J-A2J erhalten. Durch Behandeln der so erhaltenen Verbindung, wie im Beispiel 1 angegeben, wurden 9 mg reine hergestellte Verbindung Tl-A2J erhalten.
hergestellt,
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Zusätzlich werden die Rf-Werte für die Dünnschichtchromatographie der hergestellten Verbindungen Tl-B.,J, [l-B2J und Fl-A2] , die in den vorstehenden Beispielen erhalten wurden, in Tabelle YI zusammen mit jenen bekannten Aminoglykosid-Antibiotika zum Vergleich angegeben.
Tabelle YI Rf-Wert A B
0,43 0,09
0,36 0,05
0,39 0,06
0,51 0,15
0,47 0,12
0,42 0,08
0,47 0,12
0,42 0,09
0,08 0
0,04 0
0,05 0
0,02 0
0,03 0
0,05 0
Gentamycin C.
Gentamycin C2
Gentamyein Cj a
Gentamycin C2b
Sagamycin
Sisomycin
Tobramycin
Kanamycin A
Kanamycin B
Neomycin B
Paromomycin
Ribostamycin
Silikageldünnschiehts Kieselgel 60F254 (Handelsname, Hersteller:
Merck) 20 χ 20 cm, 0,25 mm
Entwicklungslösungsmittels A Chloroform : Methanol s 28?oigem
wässerigem Ammoniak (20 : 15 % 8)
B Chloroform s Methanol : 28?&Lgem
wässerigem Ammoniak (2:1 s 1) untere
Phase
Beispiel 7
In 350 ml destilliertes Wasser für Injektionszwecke wurden 25 mg der Verbindung [i-B^J suspendiert. Der pH-Wert wurde auf 7 durch vorsichtige tropfenweise Zugabe von 2 normaler Schwefelsäure eingestellt. Mit weiterem destillierten Wasser für Injektionszwecke wurde auf 500 ml Gesamtlösung aufgefüllt«. Die lösung
wurde aseptisch filtriert und je 5 ml Lösung in eine Ampulle abgefüllt. Es wurde in üblicher Weise gefriergetrocknet. Dann wurde die Ampulle verschlossen.
Beispiel 8 (Tabletten)
Verbindung [l-B2J 500 g
Mikrokristalline Cellulose 37 g
Leichtes Kieselsäureanhydrid 12,5 g
Polysolbate 80 5g
Carboxymethylcellulosecalcium . 40 g
Die vorstehenden Komponenten wurden vermischt. Each Zugabe einer geeigneten Menge Wasser wurde das Gemisch geknetet und durch ein Sieb gesiebt, um ein Granulat zu bilden. Die erhaltenen Granulate wurden in 5,5 g Magnesiumstearat dispergiert, dann wurden in üblicher V/eise 2000 Tablettenkerne hergestellt. Danach wurden nach Aufbringen eines Schutzüberzuges Tabletten erhalten, die jeweils 250 mg der Verbindung [i-BpU enthielten.
Beispiel 9 (Suppositorien)
Es wurde ein geschmolzenes Gemisch aus 84 g höheren Pettsäuretriglyceriden (Witepsol, Handelsname) und 3,5 g Polyoxyäthylenlaurylather bei 45° C hergestellt. In der Schmelze wurden 12,5 g der Verbindung [i-Aoj unter Rühren dispergiert. Dann wurden jeweils 2 g der Dispersion in eine Suppositorienform gegossen. Fach dem Erstarren wurde das gebildete Suppositorium aus der Form entnommen.
Beispiel 10 (Trockensirup)
Ein in einem Mischer hergestelltes rohes Gemisch aus 78,6 g gereinigtem Rohrzuckerpulver und 20,0 g der Verbindung £l-B2J wurde in einen Mörser gefüllt. Nach Zugabe einer Bindemittellösung, hergestellt durch Auflösen von 0,4 g Methyl-p-oxybenzoat und 1,0g Hydroxypropylcellulose in 15,0 g Isopropanol, wurde das Gemisch gut in dem Mörser durchgeknetet. Das geknetete Gemisch wurde durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,853 mm passiert, um Granulate zu ergeben, die in einem Trockner getrocknet wurden.
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Pig. 1 und Pig. 2 zeigen das Infrarotabsorptionsspektrum bzw.
das kernmagnet!sehe Resonanzspektrum der hergestellten Verbindung dieser Erfindung,,
Pig. 3 und Pig. 4 stellen das Infrarotabsorptionsspektrum bzw« das kernmagnetische Resonanzspektrum der hergestellten Verbindung [jE-BpJ dieser Erfindung dar.
Pig. 5 und Pig„ 6 sind eine Wiedergabe des Infrarotabsorptionsspektrums bzw. kernmagnetischen Resonanzspektrums der hergestell ten Verbindung [l-A2] dieser Erfindung,
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Claims (9)

  1. 2^00315
    Patentansprüche t
    1.1 Aminoglykosid-Antibiotika mit der Formel I
    CH2OH
    worin R.. ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe darstellt und Rp eine Aminogruppe oder eine Hydroxylgruppe "bedeutet, oder ihre pharmakologisch zulässigen Säureadditionssalze.
  2. 2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R^ eine Methylgruppe darstellt und R2 eine Aminogruppe bedeutet.
  3. 3· Verbindung nach Anspruch 1, worin R.. ein Wasserstoff atom darstellt und Rp eine Aminogruppe bedeutet.
  4. 4· Verbindung nach Anspruch 1, worin R.. ein Wasserstoff atom darstellt und Rp eine Hydroxylgruppe bedeutet.
  5. 5. Verfahren zur Herstellung der Aminoglykosid-Antibiotika mit der Formel I nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Gentamycin-erzeugende Stämme von Micromonospora-Spezies oder ihren Mutanten in einem Medium, welches Kanamycin A oder Kanamycin B enthält, kultiviert werden, und gegebenenfalls mit pharmakologisch zulässigen Säuren in ihre Säureadditionssalze
    909829/066 0
    OBlGfNAL INSPECTED
    - 2 überführt werden.
    00031$
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Gentamycin-erzeugender Stamm der Micromonospora-Spezies der Micromonospora sp. K-6993 eingesetzt wird.
  7. 7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Mutante des Gentamycin-erzeugenden Stammes der Micromonospora-Spezies der Micromonospora sp. K-6995-Y-41 eingesetzt wird.
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß als Mutante des Gentamycin-erzeugenden Stammes der Micromonospora-Species der Micromonospora echinospora NRRL 2985-N-6 eingesetzt wird.
  9. 9. Verwendung der erfindungsgemäßen Aminoglykosid-Antibiotika mit der Formel I nach Anspruch 1 als therapeutisch wirksame Wirkstoffe zur Herstellung von Arzneimitteln für Mensch und Tier.
    909829/0660
    ORIGINAL INSPECTED
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