DE2904186A1

DE2904186A1 - Anthracyclinantibiotika

Info

Publication number: DE2904186A1
Application number: DE19792904186
Authority: DE
Inventors: Giuseppe Cassinelli; Arpad Grein; Sergio Merli; Giovanni Rivola
Original assignee: Farmitalia Carlo Erba SRL
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1978-02-09
Filing date: 1979-02-05
Publication date: 1979-08-16
Also published as: FR2424285B1; GB2016005A; DE2904186C2; GB2016005B; FR2429770B1; BE874032A; NL7900869A; CH640246A5; FR2429770A1; JPS54115363A; US4247545A; FR2424285A1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Anthracyclinglycosidantibiotika, die im folgenden als "Glycoside A, B, C und D" bezeichnet werden, sowohl als rohe Konzentrate in verdünnter Form als auch in reiner kristalliner Form, und auf die entsprechenden Aglykone. Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf die Herstellung dieser Verbindungen durch Fermentation eines Mutantenstammes von Streptomyces peucetius var. caesius, deren Gewinnung, Konzentration, Reinigung und Salzherstellung.

Die neuen Anthracyclinglycoside zeigen Antitumor- und antibakterielle Wirksamkeit. Insbesondere sind die Glycoside A und C als Antitumormittel bei Versuchstieren verwendbar.

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus wird durch mutagene Behandlung von Streptomyces peucetius var. caesius mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin erhalten (Arcamone et al., Biotechnol.Bioengen., 1969, Xl, 1101-1110). Dem neuen Stamm wurde die Code-Nummer B211 F.I. der Farmitalia Collection of Microorganisms gegeben und er wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen unter der Nummer Ή 90 DSM, bei der American Type Culture Collection unter der Nummer 31366 ATCC und beim Fermentation Research Institute (Japan) unter der Nummer 4363 FRI hinterlegt. V7iebei vielen Antibiotika produzierenden Kulturen führt die Fermentation des Stammes 33211 F. I. zur Bildung einer Mischung oder eines Komplexes der Bestandteile. Vier biaktive Anthracyclinbestandteile, die Glycoside A/ B, C und D, wurden vom Komplex abgetrennt.

Es wurde festgestellt, daß die Glycoside A, B, C und " D die folgende Formel aufweisen: .

(i-iv)

909833/0655

" ⁵ ~ . 2304186

I: Glycosid A R= -CO-CH₃OH II: Glycosid BR= -CHOH-CH₃ III: Glycosid CR= -CO-CH₃ IV: Glycosid DR= -CH₂-CH₃, die 11-Deoxy-adriamycin für Glycosid A (I) H-Deoxy-13-dihydro-daunomycin für Glycosid B (II) 11-Deoxy-daunomycin für Glycosid C (III) und 1i-Deoxy-13-deoxodaunomycin für Glycosid D (IV) entsprechen. .

Daunomycin und Adriamycin sind eigene Markennamen und werden hier für Daunorubicin bzw.Doxorubicin verwendet.

Die obigen Anthracyclinglycoside enthalten alle Daunosarain (3-Amino-2,3,6-trideoxy-L-lyxo~hexose), die Aminozuckerkomponente von Daunomycin und Adriamycin (F. Arcamone, G, Cassinelli, P. Orezzi, G. Franceschi und R. Mondelli, J.Am.Chem.Soc. 86, 5335, 1964, und eigene US-PS 3 590 028). Die Strukturen wurden durch Analyse ihrer IR-, UV-?sichtbaren, Masse und NMR-Spektren bestimmt und stimmen mit den im nachstehenden angegebenen chemischen und physikalischen Daten überein.

Der neue Anthracyclinglycosidkompiex und seine einzelnen Bestandteile bilden sowohl mit Säuren als auch mit Basen Salze und pharmazeutisch verwendbare Salze des Komplexes und seiner Bestandteilen' fallen unter den Rahmen der-vorliegenden Erfindung. Beispiele derartiger pharmazeutisch verwendbarer Salze sind Salze mit Säuren, wie Salz-, Schwefel-, Stickstoff- und Phosphorsäure, und mit Me.tallkationen, z.B. Alkalimetalloder Erdalkalimetallkationen, wie Natrium, Kalium, Kal.2ium und Magnesium, und auch mit anderen Kationen, wie dreiwertigen Eisenka-tionen.

Der Mikroorganismus: · · .

Mikroskopische Eigenschaften des Stammes B 211 F.I.

Sporen weisen folgende Größe auf: 0,9 - 1,1 χ 1,1 - 1,6 Jim. Sie werden einzeln oder sehr häufig als-Paare gebildet, selten als Büscheln, endständig auf kurzen Sporophoren, die monopodial als Äste an langen, willkürlich gebildeten Hyphen mit einer Dicke von 0,5 bis 0,9 μΐη entstehen. Selten werden sessile

. 909833/0655

Sporen beobachtet. Es werden keine polyraorphen Formen gebildet.

Luftmycel ist nicht vorhanden.

Makroskopische Eigenschaften des Stammes·B 211 F.I.

Die Kultureigenschaften des Stammes B 211 F.I. sind in Tabelle I angegeben» Das Wachstum ist im allgemeinen auf organischen Medien gut und auf-synthetischen Medien weniger gut; auf ersteren ist es im allgemeinen erhaben und gefurcht und im Aussehen feucht, aber nicht schleimig.

Die Sporulationsschicht ändert das orange-terrakotta farbene vegetative Mycel beim Altern auf braun bis fast schwarz, Im allgemeinen wird kein lösliches Pigment gebildet. Bei Temperaturen über 40⁰C wird kein Wachstum festgestellt. Die" physiologischen und biochemischen Eigenschaften des Stammes B 211 F.I. sind in Tabelle II angegeben. Identifizierung und Klassifizierung des Stammes B 211 F.I.

Der Stamm B 211 F.I. ist klar auf den Genus Micromonospora 0rskov (0rskov J. "Investigations into the Morphology of the Ray Fungi", Levin und Maunksgaard, Kopenhagen, 1923, S. 171) der Reihe Actinomycetales zurückzufuhren, u.zw. auf Grund seiner morphologischen und Kultureigenschaften. Jedoch ermöglichte eine sorgfältige vergleichende Prüfung der von Waksman S.A. ("The Actinomycetes" Bd. 2, 1961, Williams und Wilkins Co., Baltimore, und "The Actinomycetes a Summary of Current Knowledge" 1967, Ronald Press Co.), Luedemann^vund Brodsky (1963) und Luedemann G. ("Micromonospora Taxonomy" Advances in Applied Microbiology", 1970, 1J_, 101-133) für bekannte Arten, die diesem Genus angehören, beschriebenen -und angegebenen Eigenschaften mit jenen, die der Stamm B 211 F.I» zeigt, keine Identifizierung dieses Stammes mit irgendeiner der genannten Species, die für den obgenannten Genus angeführt sind. Wegen seiner speziellen Carbohydratverwertung und im Hinblick auf die Tatsache, daß er neue Anthracycline produziert, -kann geschlossen werden, daß der Stamm B 211 F.T. sich von allen bisher beschriebenen Species dieses Genus unterscheidet und eine neue Species ist. Der Name Micromonospora peucetica sp. nova wurde diesem Stamm gegeben.

909833/0655

Tabelle

Kultureigenschaften des Stammes B 211 F.I. auf verschiedenen Medien gemäß Waksman, 1961, supra, wenn nicht anders angegeben.

O CO 00 CO

Medium Reaktion

Bennett's-Agar Emerson's-Agar

Glucose-Asparagin-Agar

1% NZ-Amin Typ A, 1 % Glucose+Agar (Luedemann G.M. et al. Antimicrobial Agents,;1963, S.116-124)

Glucose-Hefeextraktagar.

Stärke-Caseinagar

Gelatineagar

Tyrosinagar (Gordon R. D. und Smith M.L., J.Bacteriol. 69, 1955, S. 147-150)

Hefeextrakt-L-Tyrosinagar

Pepton-Eisenagar (Tresner H.D. und Danga F., J.Bacteriol. 76, 1958, S. 239-244)

Kartoffel-Glucoseagar Czapeck¹s-Agar · Wachstum gut, erhöht und gefurcht; orange bis terrakotta oder korallen-. rot, wird bei Altern schwarz <

Wachstum schön, erhöht und gefurcht; durchgehend hell-terrakotta, wird beim Altern braun

Wachstum gut, flach; durchgehend hell-terrakotta

Wachstum gut, erhöht und gefurcht; orange-terrakotta bis hellrot, wird beim Altern braun bis schwarz

Wachstum schlecht, erhöht und gefurcht? durchgehend hell-terrakotta, Wachstum gut, flach? durchgehend terrakotta

Wachstum schlecht, erhöht und gefurcht; terrakotta bis hellrot

Wachstum gut, erhöht und gefurcht; zuerst hell-terrakotta, dunkel-rötlich, wird beim Altern kupferbraun bis fast schwarz. Ein dunkelbraunes lösliches Pigment wird gebildet

Wachstum ziemlich flach; braun; ein dunkelrötliches bis kaffeebraunes lösliches Pigment wird gebildet

Wachstum gut, erhöht und gefurcht; durchgehend hell-terrakotta

Wachstum mäßig, erhöht und gefurcht; terrakotta bis braun, wird bei Altern fast schwarz ' ,

Wachstum gering, flach; hell-terrakotta, wird bei Altern schwarz.

Fortsetzung der Tabelle

Glycerin—Glycinagar

Anorganische Salze-Stärkeagar (Pridham T.C. et al., Antibiotics Annual .1956/1957, S. 947-953) '

Glycerijn-Asparaginagar

SA-Agar (bezüglich Zusammensetzung siehe Aufrechterhaltungsmedium in Beispiel 1) Wachstum mäßig, flach; zuerst farblos, wird bei Altern olivgrün bis dunkelgrün

Wachstum schön, flach; rosa bis terrakotta, wird bei Altern orangebraun

Wachstum gering, flach; hell-terrakotta, wird bei Altern fast schwarz

Wachstum gut, erhöht und gefurcht; zuerst cremefarben bis honigfarben, wird später terrakotta und bei Altern leicht bräunlich. Manchmal wird ein gelbes lösliches Pigment festgestellt, das bei Altern hellbraun wird

CD (O OO

_ 9 —

* ■ 2SÖ4188

Tabelle II

Physiologische und biochemische Eigenschaften des Stammes B 211 F.I. *)

Verwertung von: Glucose . " +

¹¹ Saccharose ■ +

¹¹ ■ ' D-Xylose . +

¹¹ M-Mannit + "

¹¹ M-Ihosit +

¹¹ L-Arabinose . ' + ·

" D-Fructose +

" Adonit +

¹¹ Lactose ' +

¹¹ d( + )-Mannose +

" Maltose +

¹¹ · Raffinose +

. " L-Rhamnose +

¹¹ α-α-Trehalose +

¹¹ A'sculin +

¹¹ Glycerin +

" Na-Citrat +

¹¹ ΝΗ,,-Succinat " _ · +

" . Na-Acetat ' + '

¹¹ ' NH₄ -Tar tr at + ' - -

¹¹ Glycogen

" . Paraffin -

Negative Kontrolle: ' . - . ·

Verflüssigung von Gelatine . · "·-.+.

Tyrosinzersetzung -+.

Malaninbildung ■ "·»·.'

Stärkehydrolyse . +

H₂S-Bildung · . -

Nitratreduktion ' +

Milch (Pepton und Koag.j ' - . . gebildete Antibiotika: neue Anthracycline .

' + _ =s positive Reaktion " - = negative Reaktion

*) das Medium für den Carbohydratverwertungstest wurde von R.D, Gordon und M.L. Smith, supra, beschrieben?

die für die anderen physiologischen Reaktionen verwendeten Medien sind von S.A. Waksman, 1961, supra, angegeben.

909833/065S .

■ · - ίο -

2304186

Fermentierungsverfahren

Die Produktion wird durch übliche, wohlbekannte Methoden durchgeführt und besteht im Kultivieren des Mikroorganismus in einem vorher sterilisierten flüssigen Kulturmedium unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 25 bis 37⁰C (vorzugsweise bei 28⁰C) während 5 bis 30 Tagen (vorzugsweise 15 Tagen) und bei einem pH-Wert von zunächst 6,5 bis 7,0 und am Ende der Fermentation von 6,5 bis 8/0.

Das Kulturmedium besteht aus einer Kohlenstoff- und einer Stickstoffquelle sowie aus Mineralsalzen. Die Kohlenstoffquelle kann beispielsweise Stärke, Dextrin, Glucose, Glycerin, Mannit _f Maltose, Getreideweiche, Trebern, Sojabohnenöl _ . oder Sojabohnenmehl sein. Die Stickstoffquelle kann außer den oberwähnten komplexen Substanzen, die Stickstoff enthalten, beispielsweise Trockenhefe, Fleischpepton oder Casein sein. Gute Ergebnisse werden sogar durch Verwendung von Ammoniumsalzen, wie Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfaten, Diammoniumphosphaten, erhalten. Die Mineralsalze variieren entsprechend dem verwendeten Medium. In einem Medium, das komplexe Substanzen, wie verschiedene Mehle und Fermentatxonsrückstände, enthält, hat sich der Zusatz von Kaliumcarbonat und Natrium- oder Kaliumphosphaten als zweckmäßig erwiesen. In Medien, die Glucose oder Ammoniumsalze enthalten, sind wesentlich höhere Mengen an Mineralsalzen, wie Kalium-, Natrium- oder Kalziumsalzen, und Zusätze von Spurenelementen, wie Eisen, Zink, Kupfer, Magnesium und Mangan, notwendig. Die Fermentation kann in Erlenmeyer-Kolben oder in Laboratoriums- oder Industriefermentern mit verschiedenem Fassungsvermögen durchgeführt werden. . ** :'■'*: Analytische Methoden - ' '

Proben der Fermentati.onsbrühen und der rohen Zubereitungen werden unter Verwendung von Whatman Nr. 1-Papier, gepuffert mit ■ M/15 Phosphatpuffer auf pH 5,4, Papierchromatographie unterworfen, wobei als Eluierungsmittel eine Mischung von n-Propanol: Äthylacetat:Wasser .(7:1:2) verwendet wird. Die Papierstreifen werden einer Bioautographie gegen Bacillus subtilis unterworfen und es wurde gefunden, daß vier antibiotische Substanzen auftreten. Diese werden als Glycosid A (Rf 0,30), B (Rf 0,50),

9 09833/0655

. - 11 -

C (Rf 0_ff55) und D (Rf 0,65) bezeichnet. ■

Rohe Zubereitungen werden unter Verwendung von vorher überzogenen TLC-Platten aus Silikagel 60-F-254 (Merck) Dünnschichtchromatographie (TLC) unterworfen, wobei als Eluierungsmittel eine Mischung aus Chloroform ; Methanol : Essigsäure ; Wasser (80:20:14:6) verwendet wird. Es treten vier gelbe Verbindungen auf, die Glycosid A (Rf 0,50), B (Rf 0,55), C -(Rf 0,65) bzw. D (Rf 0,70) entsprechen.

Eine quantitative Bestimmung der gesamten, in den Fermentationsbrühen vorhandenen gelben Bestandteile kann wie folgt durchgeführt werden. Zu einer Probe der Brühe, auf pH 8,6 eingestellt, werden zwei Volumina Chloroform:Methanol (9:1) zugesetzt. Die erhaltene Mischung wird 1 min bei R.T. beschallt. An einer Probe der organischen Phase, die mit saurem Methanol verdünnt ist, kann der Gesamtgehalt, der gelben Anthracycline und deren Äglycone spektrophotometrisch bei 418 nm bestimmt werden. An einer Probe der organischen Phase, die unter vermindertem Druck konzentriert wurde, kann die quantitative Bestimmung der einzelnen Glycosids durch präparative" TLC unter Verwendung des oben angegebenen Systems erhalten werden. Die verschiedenen gelben Zonen werden abgekratzt und mit Methanol eluiert. Jeder Bestandteil wird spektrophotometrisch bei 418 nm bestimmt« Glycosid A ist in den Fermentationsbrühen gewöhnlich der,Hauptbestandteil. Isolierverfahren ·

Nach der Fermentation sind die aktiven Verbindungen in den Mycelen und in der Fermentationsflüssigkeit enthalten. Der antibiotische Anthracyclinkomplex kann bei pH 8,5 bis 9,0 in Form freier Basen aus der Kulturbrühe "insgesamt" mit einem mit Wasser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Butanol, Methylisobu ty !keton, Chloroform', Methylendichlorid oder Jithylacetat, extrahiert werden. Vorzugsweise werden die tiycele und die Fermentationsflüssigkeit durch Filtrieren bei pH 4 mit Hilfe von Diatomeenerde getrennt und dann getrennt extrahiert. · "

Der Filtrationskuchen wird mit einer Mischung eines in Wasser löslichen Lösungsmittels, wie Aceton, Methanol oder einem anderen mied.Alkohol, und einer wässerigen 0,1N Lösung einer anorganischen oder organischen Säure, wie Salzsäure, Schwefel-

9Θ9833/0655 ;■ - -

2904188

wird eine

säure oder Essigsäure, extrahiert. Im allgemeinen Mischung aus Aceton ι 0/1N Salzsäure im Verhältnis 4:1, bezogen auf das Volumen/ verwendet. Die Mycelextrakte werden gesammelt, auf einen pH-Wert von 4 eingestellt und dann unter vermindertem Druck eingeengt. Das wässerige Konzentrat wird mit der filtrierten Brühe vereinigt, auf einen pH-Wert von 8,5 bis 9,0 eingestellt und dann mit einem mit Wasser nicht-mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform oder n-Butanol, extrahiert. Die Extrakte werden unter vermindertem Druck eingeengt und der Anthracyclinkomplex wird durch Zusetzen von 5 Volumina n-Hexan ausgefällt. Die Bestandteile des rohen Komplexes werden dann fraktioniert und durch Säulenchromatographie gereinigt. Reinigungsverfahren

Die weitere Reinigung des antibiotischen Komplexes und dessen Trennung in die vier Bestandteile kann durch Säulen— Chromatographie mit Silikagel bewirkt werden. Das rohe orangebraune Pulver wird in Chloroform gelöst und die Lösung/ gemischt mit 1 Äquivalent methanolischem Chlorwasserstoff, auf Silikagel mit Mischungen aus Chloroform, Methanol und Wasser chromato- · .. graphiert. Die Bestandteile D und C werden zuerst mit einer 94,8:5,0:0,2 Mischung eluiert« Die Glycoside B und A folgen mit einer 89,5:10:0,5 Mischung. Die Komponenten werden gewöhnlich getrennt, wie durch Papier- und Dünnschichtchromatographie gezeigt, und die vier Bestandteile werden als Hydrochloride in kristalliner Form erhalten. ·

Chemische und physikalische Eigenschaften

Die neuen Antibiotika der vorliegenden Erfindung besitzen einige gemeinsame Eigenschaften, doch können sie .auf Grund ihrer chemischen und physikalischen Merkmale unterschieden werden. Alle neuen Anthracycline besitzen eine-vergleichbare Löslichkeit; als freie Basen sind sie in Chloroform, Methylendichlorid, Aceton, Methanol, Äthanol, wässerigen Alkoholen, saurem Wasser, Dioxan und Pyridin löslich, aber wenig löslich oder unlöslich in Diäthyläther, η-Hexan, Cyclohexan und Petroläther; als Hydrochloride sind sie in Wasser, Methanol, Äthanol und wässerigen Alkoholen löslich, aber unlöslich in Aceton, Benzol,. Chloroform, Diäthyläther und Petroläther. Sie können als Indikatoren, die in neutralen und sauren Lösungen orange-gelb sind

909833/06S5

und in welchen sie auch unter UV-Licht orange-rote Fluoreszenz zeigen, verwendet werden. Ihre alkalischen Lösungen sind rotbraun und, wenn sie mit alkoholischem Magnesiumacetat behandelt werden, ergeben sie rote Lösungen.

All diese Eigenschaften und die Absorptionsspektra in den UV- und sichtbaren Zonen zeigen, daß diese neuen Verbindungen zu der Gruppe der Anthracyclinantibiotika gehören. Die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Glycoside A, B, C und D, als Hydrochloride isoliert, sind in Tabelle III angegeben.

Tabelle

III

EIGENSCHAFT	GLYCOSIE	UV- und sicht	228,260_ä	•	1180	GLYCOSID	B.HC1	1180	GLYCOSIE	) CHCl	1115	GLYCOSIE	1180
Fp.	171-173°	bare Spektren	645,42Oi	3700-2400 1200	1115	163-164	⁰C (Zers.)	1115	175-176^c	C(Zers.)	1085	140-150°	1110
Ki₀ (c^ 0,2 in Metha		JkMeOII max	235,262,	1725	1085			1050			1010		1040
nol)	1-111°	1cm	600,406,	1670	1055	+107°		1010	^+139ί	>	985	+122°	1010
j,pH7-Puffer	) A.HC1	1625	1015			985			835		980
^E1cm	C (Zers.)	1585	985			940			815		830
-s 0,01N NaOH Λ KtgX		1490	940	228,260,	418nm	840	228,260	,418nm	795	228,260,	750
ρ 1% ^L 1cm		1470	875	640,410,	179	820	713,450	,199	750	610,395,	430
IR-Spektrum		1450	840	235,262,	246nm ·	750	235,262,	,426nm	435	235,262,
(KBrJ: cm"		1420	820	605,400,	160	435	617,424	,166 .		) D.BC1
	418 nm	1385 ·	795	510nir	ι		510nm		C (Zers
	193	1330	755	118			-128
	426nm	1300	440
	161	1290	3700-2400 1195
	510nm	1/40	1665
	120	1625	3700-2300 1195	_r418nm
		1585	1710	,171
		1485	1670	_r426nm
•	1470	1625	580, 400,160
	1445 ·	1585	510nm
	1420	1490	- ..110
	1385	1470
	1325	1445
1290	1420
1235	1385	3700-2400 1190
	1325	1665
	1295	1625
1235	1585
	1485
1465
1445
1420
1385
1325
1295
1255
1235

909B33/0655

Fortsetzung der Tabelle -.

empirische Formel	C^NO^.iiCl	C₂₇H₃₁No₉:hci	C₂₇H₂₉NO₉.HCl	C₂₇H₃₁NO₈.HCl
Molgewicht	564	550'	548	' 534· '

Diese neuen Anthracyclinantibiotxka zeigen auch charakteristische NMR-Spektren. Das Spektrum von Glycosid A, als Hydrochlorid in DMSO-d_ß, zeigte charakteristische Signale bei 1₍,14i" (d, CH₃-C-5'), 3,39 <f(s, CH₃O), 4 , 60 (f (breites s, C-14-H₂), 4,89 <T (breites s, C-7-H) , 5,27 Γ (breites s, C-V-H), 7,23T(S, C-11-H), 7,4 - 7,9 ί* (m, C-1-H, C-2-N und C-3-H) und 13,61 <T (s, C-6-OH) Das Glycosid, als Hydrochlorid in DMSO-d,, zeigte Signale bei 1,15 (T (d, CH₃-C-5')/ 2,26 <f (s, CH₃CO), 3,92 ^ (s, CH₃O), 4,9θ/ (breites s, C-7-H), 5,26 (T (breites s, C-T-H), 7,31 f (s, C-11-H), 7,4-7,9 ί (m, C-1-H, C-2-H und C-3-H) und 13,65 <Γ (s, C-6-OH). Felddesorptionsmassespektroskopie der freien Basen von Glycosid A, B, C und D bestätigten die zugeschriebenen Molekularformeln, wie in Tabelle IV gezeigt.

Tabelle IV

Verbindung	Molekularformel	Molgewicht	gef.	m/e
		ber.	527	(M⁺)
Glycosid A	^C27^H29^NO10	527	• 514	,.(MH⁺)
Glycosid "B	C₂₇H₃₁NO₉	513	512	(MH⁺)
Glycosid C	- ^C27^H29^NO9	511	- 498-	(MH⁺)
Glycosid D	C₂₇H₃₁NO₈ ........	-497-

■ Wässerige Säurehydrolyse der Glycoside A, B_r C unQ D " ergab vier verschiedene wasserunlösliche gelbe Aglycone der Formeln V bis VIII. Die v/ässerigen löslichen Fraktionen ent- " hielten denselben reduzierenden Aminozucker, der als Daunosämin (3-Ämino-2,3,6-trideoxy-L-lyxohexose) identifiziert wurde, die Aminozuckerkomponente von Daunomycin und Adriamycin.

9098 3 3/06 55

2304186

OCH

■ (V - VIII)

V: Algycon A, R = COCH₂OH · ·

VI: Aglycon B, R = CHOH-CH₃ ■

VII: Aglycon C, R = COCH₃-

VIII: Aglycon D, R = CH₂CH₃

Die Aglycone A, B, C und D sind neue Anthracyclinone,

die 11-Deoxy-adriämycinon für Aglycon A (V), 1i-Deoxy-13-dihydro-daunomacinon für Aglycon B (VI), 11-Deoxy-daunomycinon für Aglycon C (VII) bzw. 11-Deoxy-13-deoxo-daunomycinon für Aglycon D (VIII)

entsprechen.

Die Strukturen der Aglycone wurden durch Analyse ihrer

IR-, UV-/ sichtbaren, Masse- und magnetischen Respnanzspektren bestimmt. Ihre chemischen und physikalischen Eigenschaften gehen aus Tabelle V hervor.

Tabelle V.

Eigenschaft	Aglycon A	Aglycon B	Aglycon C	Aglycon D
Fp. ⁰C	220	175-180 (Zers.)	213-215	175-180 {Zers
[α]*³" (c=_0/1)	+161° (Dioxan)		+144° (Methanol)	+164° (Methanol)
UV-u. sichtbare Spektral VMsOH max _1% . - ^E1cm	227,259,418nm 395,640,268	227,258,418nm	227,258,418 nm 930,660,317	227,258,4i8nn 990,640,280
empirische Formel .	^C21^H18°8	^C21^H20°7	^C21^H18°7	^C21^H20°6
Molgewicht berechnet gefunden m/e	398 . 398 (M)	384 384 (M )	382 382 (M )	368 368 (M)

909833/0655

COPY ORIGINAL INSPECTED

2904188

Biologische aktive Daten ·

a) Antibakterielle Wirksamkeit

Die "in vitro" minimalen Hemmungskonzentrationen (MIC) der Glycoside A/ B, C und D wurden für bestimmte Mikroorganismen unter Anwendung des Standardrohrverdünnungsverfahrens bestimmt und sind in Tabelle VI angegeben.

Tabelle VI

Testorganismus	I Glycosid A (I)	HC in ug/ B (II)	ml C (III)	D (IV)
Staphylococcus aureus 209 P	. 125	1000	62	250
Staphylococcus aureus 153	500	1000	250	1000
Sarcina lutea ATCC 9341	100	100	12,5	25
Bacillus subtilis ATCC 6633	100	100*	50	100
Escherichia coli B	50	100	25	50

b) Antitumorwirksamkeit

Die neuen Verbindungen wurden gegen HeLa-ZeIlen in vitro (Zeit der Einwirkung der Heilmittel 24 h) und auf. L1210- und P 388-Leukämie an Mäusen im Vergleich mit Daunorubicin getestet. Die Ergebnisse der in vitro-Versuche gehen aus Tabelle VII hervor. Es kann festgestellt werden,. daE alle Verbindungen die Zellenentwicklungsfähigkeit von HeLa-Zellen in vitro hemmten, ' wobei die ID₁-Q für Glycosid C 0,05 μg/ml, für Glycosid A 0,1 μg/ml, für Glycosid D 0,22 μg/ml und für Glycosid B 0,44. ng/ml beträgt. ' '

Die in vivo-Daten, die bei Mäusen erhalten wurden, sind in Tabelle VIII angegeben. Glycosid A war gegen P 388-Leukämie in einer Dosis von 66 mg/kg wirksam und bei der Dosis von 100 mg/kg toxisch; bei der tolerierten .Dosis war die Antitumorwirksamkeit höher als jene von Daunorubicin.

909833/06 55

Tabelle

E4186

Wirkung auf die Entwicklungsfähigkeit von HeLa-Zellen in vitro

Verbindung	Dosis* (ng/ml)	6 25 12	Anzahl von Kolonien** %■	15 66 80	^ID50 (nq/ml)
Daunorubicin (Daunomycin)	12, 6, 3,		35 - ■ 48 - 71 -		6-7
Glycosid A (I)	200 100 50 25		1 63 73 74		105
Glycosid C (III)	200 100 50		3 44 54		54
Glycosid D (IV)	400 200 100		0 53 109		220
Glycosid B (II)	1600 800 400	0 20 66	440

*) HeLa-Zellen wurden den Heilmitteln 24 h lang ausgesetzt und dann plattiert. Die Kolonienanzahl wurde 5 Tage später festgestellt.

**) % gegenüber unbehandelten Kontrollen.

909833/0655

- 18 - ' Tabelle

VIII

Wirkung gegen P 388- und L 1210-Leukamie bei Mäusen

Verbindung	Dosis* (mg/kg)	T/C % L1210 P388	toxische Todesfälle**
Daunorubicin	2,9 4,4 6,6	■ 133-133 199 140-133 200 111-133 223	14/26
Glycosid A (I)	2,9 6,6 10 66 100	111 128 122 245 254	1/10
Glycosid C (III)	2,9 6,6 15 100 150	100 117 122 .181 45	3/8 3/19
Glycosid D (IV)	2,9 6,6 15 125 250	100 100 111 18 0 . 9	5/5 5/5
Glycosid B (II)	2,9 6,6 15 500	100 122 122 9	2/2

*) Mäuse wurden intraperitoneal einen Tag nach der Tumorzellen-

animpfung behandelt. _v . -

**) Die Bewertung erfolgte auf Grundlage der makroskopischen Autopsieuntersuchungen. *

Die·folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung näher erläutern, ohne daß diese jedoch hierauf beschränkt sein soll. . ;'

Beispiel 1: Eine Kultur von Micromonospora peucetica, Stamm B 211 F.I., wurde 25 Tage lang bei 28⁰C auf Schrägagar mit dem Aufrechterhaltungsmedium SA gezüchtet. Das Medium SA hatte die folgende Zusammensetzung:

Glucose 3 %,	3	%
Brauerei-Trockenhefe	1,	2 %
Natriumchlorid	0,	1 %
Kaliumdihydrogen- orthophosphat	0,	05 %
	909	833/0655

2904136

Kaliumcarbonat 0,1 %

Magnesiumsulfat 0,005 %

Ferrosulfatheptahydrat 0,0005 %

Zinksulfatheptahydrat 0,0005 %

Cuprisulfatpentahydrat 0,0005 %

Agar 2 %

Leitungswasser bis zu 100 %. ·

Die Sterilisierung wurde durch Erhitzen in einem Autoklaven

bei 120⁰C während 20 min bewirkt.

Die Mycelmatte der so erhaltenen Kultur wurde abgekratzt und in 3 ml sterilem destillierten Wasser suspendiert. Die Suspension wurde in 300 ral-Erlenmeyerkolben mit einem Gehalt von 60 ml des folgenden flüssigen Wachstumsmediums angeimpft:

Brauerei-Trockenhefe 0,3 %

Pepton 0,5 % -

Kalsiumnitrattetrahydrat 0,05 % .

Leitungswasser bis zu 100 %.

■ Die Sterilisierung wurde durch Erhitzen in einem Autoklaven bei 120⁰C während 20 min bewirkt. Der pH-Wert des Mediums betrug nach der Sterilisierung 6,8 bis 7,0.

Die angeimpften Kolben wurden 8 Tage lang-bei einer Temperatur von 28⁰C auf einem Drehschüttler bei 250 UpM, der einen Kreis mit einem Durchmesser von 7 cm umschrieb, geschüttelt 5 ml der wie oben gezüchteten Kultur wurden in einen 300 ml-Erlenmayerkolben-mit einem Gehalt an 50 ml des folgenden Produktion smediums eingeimpft: ' ._v Glucose 6 % . -'...„.

Brauerei-Trockenhefe 3 % · - '

Natriumchlorid 0,2 % . . .

Kaliumdihydrogenorthophosphat 0_f.T %

Kalziumcarbonat ' ' 0,2 %

Magnesiumsulfat - · 0,01 % .· · ·

Ferrosulfatheptahydrat 0,001 %

Zinksulfatheptahydrat 0,001 % :

Cuprisulfatpentahydrat 0,001 %

Leitungswasser bis zu 100 %.

. 909833/0655

Das Sterilisieren wurde durch Erhitzen im Autoklaven bei 115°C während 20 min bewirkt.

Die Kolben wurden 25 Tage lang bei 28⁰C unter Bedingungen bebrütet die mit jenen für die Animpfphase identisch sind. Die maximale Konzentration der aktiven Verbindungen wurde zwischen dem 18. und 22. Tag der Fermentation mit einer Produktion von 90 mcg/ml erzielt.

Beispiel 2: Eine Kultur des Stammes B .211 F.I. wurde 14 Tage lang, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet und die Mycelmatte, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, gesammelt wurde, wurde in 300 ml-Erlenmeyerkolben mit einem Gehalt an 50 ml

des folgenden flüssigen Wachstumsmediums eingeimpft:

lösliche Stärke 4 %

Sojabohnenmehl 1,5 %

Brauerei-Trockenhefe 0,5 %

Getreideweiche 0,8 %

Kaliumcarbonat 0,3 %

Kaliummonohydrogenorthophosphat 0,05 %

Magnesiumsulfat 0,025 %

Kaliumchlorid . - 0,025 % ■

Leitungswasser bis zu 100 %.' . · .

Der pH-Wert von 5,7 wurde vor der Sterilisierung mit Natriumhydroxyd auf '7,5 erhöht. Die Sterilisierung wurde bei 120⁰C während 20 min bewirkt. . · *

Nach 4 Tagen Bebrütung unter den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen wurden 5 ml der so gezüchteten Kultur in 300 ml-Erlenmeyerkolben mit einem Gehalt an 50 ml des oben be- - schriebenen Mediums eingeimpft.

Dann wurden die Kolben unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben»10 Tage lang bebrütet. Die maximalen Konzentrationen der aktiven Verbindungen wurden zwischen dem 8. und 9. Tag der Fermentation mit einer Produktion von 15 mcg/ml erzielt. . ·

Beispiel 3: Das gesamte Bier (20 1) aus einer gemäß Beispiel 1 erhaltenen Fermentation wurde mit Salzsäure auf

909833/0 655

2904188

einen pH-Wert von etwa 4 eingestellt und unter Verwendung von 3 % Diatomeenerde als Filterhilfe filtriert, wobei ein Kuchen und ein Filtrat erhalten wurden, die getrennt extrahiert wurden. Der naße Filterkuchen wurde mit etwa 4 1 einer Mischung aus Aceton und 0,1N wässeriger Salzsäure (80:20) behandelt. Nach Filtration gewährleistete eine zweite Behandlung mit weiteren

3 1 angesäuertem wässerigen Aceton die vollständige Extraktion der aktiven Verbindungen. Die kombinierten wässerigen Acetonextrakte wurden mit Ammoniumhydroxyd auf einen pH-Wert vqn etwa

4 eingestellt, unter vermindertem Druck auf etwa 1 1 eingeengt und mit der filtrierten Brühe vereinigt. Die erhaltene Mischung wurde auf einen pH-Wert von etwa 8,5 bis 9,0 eingestellt und dann zweimal mit einem halben Volumen einer Chloroform-Methanol (9:1)-Mischung extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 200 ml eingeengt. Durch Zusetzen 1 1 η-Hexans fiel der rohe Komplex als gelbbraunes Pulver (7 g) aus.

Beispiel 4: Eine Chloroformlösung des rohen Komplexes als freie Base (6 g in 200 ml) wurde nach Behandlung mit 10 ml 1N methanolischen Chlorwasserstoffs auf eine Kieselsäuresäule (hergestellt in Chloroform) aufgebracht. Die Säule·wurde mit Chloroform gewaschen, worauf mit einer Mischung aus Chloroform, Methanol, Wasser (94,8 : 5 : 0,2) eluiert wurde. Die erste gelbe Fraktion enthielt einige Aglycorie, die nächsten zwei gelbe Banden enthielten das Glycosid D bzw. C. Die Eluierung wurde mit einer Mischung aus Chloroform, Methanol, Wasser (89,5 j 10 : 0,5) fortgesetzt, bis zwei andere gelbe Banden,' " entsprechend den Glycosiden B und A, eluiert wurden. Die Fraktionen, die diese vier Banden enthielten, wurden getrennt unter vermindertem Druck konzentriert, wobei die praktisch reinen Hydrochloride von Glycosid D (0,2 g), Glycosid C (0,4 g) , Glycosid B (0,2 g) und Glycosid A (0,6 g) als mikrokristalline Pulver erhalten wurden. Durch Umkristallisieren der Glycoside Ä und C aus Methanol:n-Butanol wurden die entsprechenden reinen Hydrochloride als gelborangefarbene Kristalle erhalten, Fp. 171-173°C mit Zersetzung für Glycosid A, Fp. 163-164°C mit

909833/0655

Zersetzung für Glycosid B, Fp. 175-176°C mit Zersei Glycosid C und Fp. 140-150⁰C mit Zersetzung für Glycosid D.

Beispiel 4: Eine 250 mg-Probe von Glycosid A wurde in 10 ml 0,2N wässeriger Salzsäure gelöst und die Lösung wurde 1h auf 95°C erhitzt. Ein kristalliner gelborangefarbener Niederschlag wurde nach Kühlen durch Filtration gesammelt/ mit Wasser gewaschen und über Phosphorpentoxyd über Nacht unter Vakuum getrocknet. Es wurden 170 mg AgIycon A in reiner Form erhalten, Fp. 220°C, m/e: 398 (M⁺). Nach der Ausfällung des Aglycons wurde die fast farblose wässerige saure Lösung mit einem Anionenaustauscherharz auf pH 5 eingestellt und dann gefriergetrocknet. Der Rückstand (60 mg), aus Methanol:Aceton kristallisiert, ergab eine kristalline Verbindung, Fp. 166°C (Zers.), die durch direkten Vergleich mit einer authentischen Probe als Daunosamin identifiziert wurde.

9 09833/06 55

Claims

PATENTANSPRÜCHE

Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung eines antibiotischen Komplexes, der mit Anthracyclinglycosiden verwandt ist, dadurch gekennzeichnet, dass man einen neuen Mutantenstamm von Streptomyces peucetius var. caesius unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Kulturmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, kultiviert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als neuen Mutantenstamm, der durch mutagene Behandlung von Streptomyces peucetius var. caesxias mit ü-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin erhalten wurde, den

909833/0655

Stamm B 211 F.I. der mikrobiologischen Sammlung der Farmitalia, der auch als Micromonospora peucetica sp. nova klassifiziert wurde, einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass man bei einer Temperatur von 25 bis 37°C 5 bis 30 Tage lang und bei einem pH-Wert von zuerst 6,5 bis 7,0 und am Ende der Fermentation von 6,5 bis 8,O arbeitet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , dass man den antibiotischen Komplex aus der Fermentationsmasse, dem abgetrennten Mycel oder der filtrierten Brühe extrahiert.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , dass man den erhaltenen antibiotischen Komplex durch Säulenchromatografie auf Silikagel in dessen vier Anthracyclinglycosidkomponenten, nämlich die Glycoside A, B, C und D, trennt.
6. Antibiotischer Komplex, hergestellt gemäss dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
7. Die antibiotische Substanz Glycosid A der Formel (I), nämlich 11-Deoxyadriamycin.
8. Die antibiotische Substanz Glycosid B der Formel (II). nämlich H-Deoxy-13-dihydro-daunomycin.
9. Die antibiotische Substanz Glycosid C der Formel (III), nämlich H-Deoxydaunomycin.
10. Die antibiotische Substanz Glycosid D der Formel (IV), nämlich H-Deoxy-13-deoxodaunomycin.

909833/0655
11. Das Aglycon der Formel (V), erhalten durch milde wässrige Säurehydrolyse von Glycosid A, nämlich 11-Deoxyadriamycinon.
12. Das Aglycon der Formel (VI), erhalten durch milde_f wässrige Säurehydrolyse von Glycosid B, nämlich 11-Deoxy-13~ dihydro-daunomycinon.
13. Das Aglycon der Formel (VII), erhalten durch milde wässrige Säurehydrolyse von Glycosid C, nämlich 11-Deoxydaunomycinon,
14. Das Aglycon der Formel (VIII), erhalten durch milde wässrige Säurehydrolyse von Glycosid D, nämlich 11-Deoxy~13-deoxo-daunomycinon.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet , dass sie eine oder mehrere antibiotische Substanzen gemäss einem der Ansprüche 6 bis 10 in Mischung mit einem pharmazeutisch verwendbaren Träger enthält.
16. Nicht-toxisches, pharmazeutisch verwendbares Säureadditionssalz der Antibiotika nach einem der Ansprüche 6 bis 10.

909833/0655