DD205696A1 - Verfahren zur herstellung eines anthracyclin-antibioticums sowie seines aglykons - Google Patents

Abstract

DIE ERFINDUNG BEZIEHT SICH AUF VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG EINES ANTHRACYCLIN-ANTIBIOCUMS SOWIE AGLYKONS, DIE FUER DIE CHEMOTHERAPIE VON TUMOR-, VIRUS- UND DURCH BAKTERIENHERVORGERUFENEN ERKRANKUNGEN BEI MENSCH UND NUTZTIER VON POTENTIELLEM NUTZEN SIND. INSBESONDERE BETRIFFT DIE ERFINDUNG EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG DES BISHER NICHT VERFUEGBAREN ANTIBIOTICUMS BETA-RHODOMYCIN L, SEINER SALZE SOWIE SEINER HYDROLYTISCHEN ABBAUPRODUKTE UNTER VERWENDUNG EINES NEUEN MIKROORGANISMUS, DER NACH INTERSPEZIFISCHER REKOMBINATION ERHALTEN UND ALS STREPTOMYCES VIOLACEUS SUBSP. IREMYCETICUS, STAMM ZIMET 43678, BEZEICHNET WURDE. ZIEL DER ERFINDUNG IST DIE GEWINNUNG EINES ANTHRACYCLIN-ANTIBIOTICUMS MIT POTENTIELL CANCEROSTATISCHEN EIGENSCHAFTEN SOWIE SEINER HYDROLYTISCHEN ABBAUPRODUKTE ALS AUSGANGSSUBSTRATE FUER MUTASYNTHESE UND HALBSYNTHESE, UM DIE PALETTE DERARTIGER PHARMAKA ZU ERWEITERN. DIE AUFGABE WIRD DADURCH GELOEST, DASS DURCH AEROBE SUPMERSFERMENTATION DES NEUEN MIKROORGANISMUS ZIMET 43678 IN MEDIEN MIT GEEIGNETEN C-, N-QUELLEN UND MINERALSALZEN BETA-RHODOMYCIN L GEBILDET, MIT GEEIGNETEN METHODEN AUS MYCEL UND KULTURFILTRAT ISOLIERT UND NACHFOLGEND GEREINIGT UND GEGEBENENFALLS HYDROLISIERT WIRD.

Description

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Titel der Erfindung

Verfahren zur Herstellung eines Anthracyclin-Antibioticums sowie seines Aglykons

Anwendungsgebiet -der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer antibiotisch wirksamen Substanz sowie deren Derivate, die bei der Chemotherapie von Tumor-, Virus- und durch Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind· Insbesondere betrifft die Erfindung die Gewinnung eines neuen Anthracyclin-Antibioticums, das als Beta-Ehodomycin 1 bezeichnet wird, seiner Salze, sowie seines Aglykone·

Charakteristik der bekannten technischen Lösung

Anthracyclinon-Glykoside stellen antibiotisch wirksame Verbindungen dar, deren chromophorer Molekülteil ein 7»8,9,10-tetrahydrotetracenchinon (5*12) darstellt, das mit Zuckern, bevorzugt Aminozuckern, verbunden ist (Brockmann, H., 1963* lortschr. Ohem. Organ, Naturstoffe, 21, 121). Je nach Stellung der peri-ständigen OH-Gruppen am Aglykon werden verschiedene Anthracyclinone unterschieden, die als Glykoside die Bezeichnung Anthracycline tragen und nur in dieser 3?orm biologisch aktiv sind» Mehr als 50 Anthracyclin-Antibiotica sind bisher beschrieben, wovon die Mehrzahl Gemische von schwer voneinander trennbaren Einzelkomponenten darstellen· 2 Anthracyclin-Antibiotica (Doxorubicin-US Patent 3 590 028; Daunorubicin-GB-Patent 1 003 383) sind auf Grund ihrer chemotherapeutischen ?fi.rksamkeit gegen akute Leukämien und solide Tumoren des Menschen bereits klinisch eingesetzt* Ein

uaa . 8 -a-

wesentliches Problem bei der krebschemotherapeutischen Anwendung von Anthracyclin-Antibiotica resultiert aus deren allgemeiner, hämatologischer, digestiver und kardialer Toxizität, die eine umfassendere Anwendung in der Tumorchemotherapie einschränkt und z, B· bei Herzkranken zur Kontraindikation führt» Da sich die Herztoxizität der Anthracycline als besonders störend erwiesen hat, werden ständig neue Derivate bereits bekannter Verbindungen hergestellt und hinsichtlich einer verringerten Toxizität untersucht· Ein Nachteil ist, daß zur Gewinnung chemisch modifizierter Anthräcyclin-Antibiotica zwar chemische Methoden wie Total- und Partialsynthese sowie biochemische Methoden zur enzymatischen Konversion verfügbar sind, deren Anwendung jedoch zu einer unzureichenden Ökonomie der Produktherstellung führt, die eine großtechnische Herstellung dieser Derivate nicht gestattet· Bei den bisher bekannten mikrobiologischen Herstellungsverfahren für Anthräcyclin-Antibiotica werden bevorzugt Gemische chemisch ähnlicher Anthracycline gewonnen, die aus den Mono-, Di-, Tri- oder Polysacchariden unterschiedlicher und bisher unter großtechnischen Bedingungen praktisch nicht trennbarer Aglykone (Anthracyclinone) bestehen·. Das bringt Standardisierungsprobleme für das Bndprodukt mit sich, wenn in Abhängigkeit vom Fermentationsver-' lauf Verschiebungen qualitativer und quantitativer Art im Vielkomponenten-Gemisch auftreten·

Anthracyclinon-Glykoside, deren Aglykone dem beta-Rhodomycinon zugeordnet werden können, sind bisher lediglich mit Hilfe der Arten Streptomyces purpurascens (Brockmann, Waehneldt und ITiemeyer, 1969. Tetrahedr« Lett·, (6), 4-15; Brockmann, Scheffer-und Stein, 1973· Tetrahedr. Lett,, (38), 3699; Brockmann und Greve, 1975. Tetrahedr.'Lett., (11), " 831), Streptomyces bobiliae (Biedermann und Bräuninger, 1972. Pharmazie, 22, 782), Streptomyces griseoruber 4620 (Podojil, Blumauerova, Prikrylova, Vanek, Gauze und Maksimova, 1980. Polia Microbio l'i, 2£_t 464), Streptomyces violaceus (Fleck^ Strauß, Koch, Kramer und Prauser, 1974· Z· AlIg. Mikrobiol., 14, 551), Streptomyces roseoviolaceus A 529 (IK) 13O8I) COtL₁ loshimoto und Matsuzawa, 1980. J. Antibv, 22t 1331)

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auf fermentativem Wege sowie durch Biosynthese und Glykosidierung von beta-Bhodomycinon mittels einer Aclacinomycin-Mangelmutante als Gemische oder als Minorkomponenten mit unbekannter chemotherapeutischer Aktivität erhalten worden. Die beta-Shodomycinon-Glykoside, die bisher beschrieben wurden, sind im Zusammenhang mit der Gewinnung und Strukturaufklärung des biologisch inaktiven be ta-Hhodomycino ns in sehr geringen Mengen isoliert, worden. Angaben zu den physikochemischen Eigenschaften der beta-Rhodomycinon-Glykoside sind nicht oder nur unvollständig vorhanden*- Angaben zur biologischen Wirkung der Einzelkomponenten wie antimikrobielle, antivirale, cytostatische und cancerostatische bzw. toxische liegen bisher nicht vor«

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung eines neuen Anthracyclin-Antibioticums sowie seines Aglykons wie auch der Salze des Antibioticums, um die aufgeführten Nachteile bisher bekannter Verfahren zu vermeiden und die Palette potentiell cancerostatisch, virostatisch u.ad antimikrobiell wirksamer Anthracycline durch einen Vertreter, der eine Einzelkomponente darstellt, zu erweitern, sowie um'die hydrolytischen Abbauprodukte als Ausgangssubstrat für die Mutasynthese und Halbsynthese neuer Anthracyclin-Antibiotica verwenden zu können·

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches Verfahren anzugeben, das es gestattet, das neue Anthracyclin-Antibioticum Beta-Hhodomycin I mit Hilfe eines Mikroorganismus aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoff en in guten Ausbeuten herzustellen»

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoff-Quellen und Mineralsalzen ein neuer Mikroorganismus oder seine Varianten gezüchtet werden* Der neue MkroOrganismus,

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der in diesem Verfahren Anwendung findet, wurde durch interspezifische Hybridisierung von genetisch markierten und im Sekundärstoffwechsel geblockten Mutanten des Violamycin-Bildners, Streptomyces violaceus, Stamm IMET JA 6844 (beschrieben in der DDR-Patentschrift 100 494) und des Turimycin-Bildners, Streptomyces hygroscopicus,. Stamm IMBT JA 6599 ("beschrieben der DDR-Patentschrift 84 450) gewonnen und in der ZIMET-Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen, Jena-DDR, unter der Nummer ZIMST 43 678 deponiert» In seinen morphologischen Eigenschaf ten entspricht der Beta-Rhodomycin I-Bildner ZIMBT 43 dem Stamm ZIMET 43 615, äer in äer DDR-Patentschrift 140 672 sowie von Schlegel und fleck 198O (Z. AlIg· Mikrobiol*, 2O₃ 527 bis 53O) als Streptomyces violaceus subsp« iremyceticus beschrieben wurde·.

Danach gehört der Beta-Rhodomycin I-Bildner ZIMET 43 678 zur Gattung Streptomyces und entspricht der Diagnose von Stre-ptomyces violaceus (Rossi-Doria 1891, Krassilnikov 1941, Waksman 1953) wie sie nach Untersuchung des Neo-Type-Stammes ISP 5082 (= INMI-1, RIA 656, ATCC 15 888) im "International Streptomyces Project" von Shirling and Gottlieb (Int· J, syst, Bact,_? 19« 497/1969) gegeben wird. Der Beta-Rhodomycin I-Bildner ZIMST 43 678 ist durch Selektionsprozesse aus einer Population der interspezifischen Rekombinante ZIMST 43 615 hervorgegangen und unterscheidet sich von der Ausgangsrekombinate in der Bildung von Anthracyclin-Antibiotica. Während die Ausgangsrekombinante ZIMBT 43 615 das Anthracyclin-Antibioticum Iremycin (= 10-<*^-rhodosaminyl)-y-rhodoHycinon (DDR-Patentschrift ~140 672) bildet, wird durch die selektierte Mutante ZIMET 43 678 das Anthracyclin-Antibioticum Beta-Rhodomycin I synthetisiert·

Die Kultivierung des Stammes ZIMET 43 678 sowie seiner Mutanten und Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen. An Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial bzw. Mycelfragmente werden in geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher,, sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37 ^C (vorzugsweise 28 ⁰C) über einen Zeit-

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raum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn, des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,2 und pH 7*0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7j5 urid pH 8,3 liegt* Das Nahrmediuia besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen* Als Kohlenstoffquellen können Stärke, Glukose, Glyzerin, Mannit, Dextrin, Saccharose, Sojaöl und Sojamehl verwendet werden. Als Stickstoffquellen kommen außer den oben erwähnten stickstoffhaltigen Substraten auch .Trockenhefe, Fleischpepton und Oasein in Präge· Gute Ergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt werden· Letztere begünstigen den Verlauf der Fermentation in Abhängigkeit vom eingesetzten Nährmedium· In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, Na-Phosphat bzw. Kalium-Phosphat als vorteilhaft erwiesen* Die Fermentation des Bildners ZIMBT 43 678 kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts,, im Glasfermenter sowie in V2A-Stahltanks durchgeführt werden«

Die Isolierung des Beta-Rhodomycin-I wird in der Weise durchgeführt,, daß das Antibioticum aus dem KuIturfiltrat mit organischen, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren, und aus dem Mycel mit organischen, mit Wasser mischbaren und anschließend mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lo.*- sungsmitteln extrahiert, nach Konzentrieren der Extrakte mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel reextrahiert, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, vom Lösungsmittel durch Destillieren im Vakuum befreit, durch Versetzen mit Petroläther unter Rühren ausgefällt, vom Lösungsmittel durch Filtration befreit, mit Petroläther gewaschen, nachfolgend getrocknet, anschließend in niederen Alkoholen gelöst,, der getrocknete Rückstand mit Wasser versetzt und bei pH 8,0 mit Chloroform extrahiert, die Chloroformphase- abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum zur Trockne gebracht und auf üblichem lege säulenchromatographisch an Kieselgel gereinigt wird*

Beta-Rhodomycin I ist eine rotbraune, aus Chloroform/Petroläther auskristallisierende Substanz, die sich gut in nie«

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deren Alkoholen und Chloroform, dagegen nur mäßig in Wasser und Petroläther löst. Das basische Antibioticum besitzt Indikatoreigenschaften und ist in sauren Lösungen rotgelb, in alkalischen blauviolett. Aus dem hochaufgelösten Massenspektrum erhält man für das Molekülion !U⁺JmZz 543,2124 und damit die Summenformel ^σ2^33¹¹⁰IO C^theorei3isch: 543,2104). Beta-Rhodomycin I bildet bei der Umsetzung mit einer äquivalenten Menge methanolischer Salzsäure in Chloroform/Äther^ ein kristallines Hydrochlorid mit der Summenformel G^gH-,JTO/jq^HCI und einem 3Pp*. von 179 "bis 181 *C* Das Hydrochlorid ist im Gegensatz zum basischen Antibioticum gut löslich in Wasser, dagegen nahezu unlöslich in Chloroform und Äther« Sowohl das basische Antibioticum als auch sein Hydrochlorid stellen entsprechend ihres dünnschichtchromatographischen Yerhaltens auf Kieselgel-Platten in verschiedenen Fließsystemen und bei unterschiedlichen pH-Werten definierte, chemisch reine Sinzelkomponenten dar·'

Bei Hydrolyse mit verdünnter Säure in der Wärme liefert das Anthracyclin-Antibioticum ein wasserunlösliches Aglykon und eine wasserlösliche Zuckerkomponente· Durch vergleichende dünnschichtchromatographische und verschiedene spektroskopische Untersuchungen (UY/YIS-, IR-, MS-, "¹H-, ^G-NMB-Spektroskopie) konnte das Aglykon als Beta-Rhodomycinon (Brockmann und Franck, 1955· Chenu Ber», 88, 1792) und die Zuckerkomponente als L-Hhodosamin (Brockmann, Spohler und Waehneldty 1963. Chern, Ber., ^6, 2925) identifiziert werden, so daß es sich bei dem hergestellten Beta-Rhodomycin I um ein Rhodosaminyl-beta-rhodomycinon handelt*

Die in Abb. 1 dargestellte Struktur des Antibioticums Beta-Shodomycin I wurde durch säurehydrolytischen Abbau und Identifizierung der Abbauprodukte sowie durch umfassende spektroskopische Untersuchungen am intakten Antibioticum-Molekül als 7-(et -L-Rhodosaminyl)-beta-rhodomycinon gesichert und ist möglicherweise mit dem in der Literatur beschriebenen Rhodomycin B (Beta-Rhodomycin I) (Brockmann und Patt, 1955. Chem· Ber·, 88 ^ 1455) identisch· Spektros«-

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kopische Daten zum Bhodomycin B liegen bisher in der Literatur nicht vor. .

Wichtige physicocheinische Parameter des Beta-P-hodomycin I sowie seines Aglycons sind:

(Gyolohexan/Gnloroforiii) mn: 234,255,294,471,483,

500,516,534

~¹

IH ^³* cm~¹i 3450(0H) ;2770,2817(H(GH₃)₂) j 1597 (H. .....00

^max Ghinon)

MS m/a : Mt 543 (G₂₈H₃₃ITO₁₀); 386t (Aglyfcon, G₂₀H₁₃O₈)

175* (Zucker, O₈H₁₇NO,,) 158* (Zucfcer

¹H-HMR (GDGl₃ <f): 7,90 dd (Je?,3 und 1,8 Hz,H-i); 7,70 t

(J=7,3 Hz,H-2) 7,31 dd (J=7,3 und 1,8 Hz,H-3); 4,91 s

(H-IO)₅ 5,17 int (W 7 Hz,H-7); 1,40 d (J=6,1 Hz,3H,

6' "Me ) ; 2,23 s (6H,3¹-Hme)₅ 5,51 mt (W-6 Hz, H-1«);

¹J_{0 H} = 171,9 Hz₁H₅G-I¹ (oC-Glykos.) ¹³G (ODOIo):

GWLtom-iTr. Ghem_eVerschiebung (ppm) G-Atom-Nr. Ohem.Yersch_< (vvm)

1 119,7

2 137,1

3 125,1

4 162,7

5 190,9 .6 156,7

7 70,8

8 30,4

9 71,9

10 65,9

11 157,2

12 186,4

4a	115,4
5a	112,5
6a	135,0
10a	138,5
11a	111,5
12a	133,3
1f	101,4
2*	28,7
31	59,5
4J	66,7
51	66,7
6J	17,0

241 03 9 8 -^β-

G-Atom-Nr· Ghem.Verschiebung (ppm) G-Atom-Nr· Ghem.Versch·

(ppm)

13 32,9 NMe₂ 42,0

14 6,5

Sowohl, frische Fermentationslösungen des 3eta-Rhodomycin I-Bildners, ZIMET 43 678, als auch das aus ihnen isolierte Beta-Ehodomycin I besitzen antibiotische Aktivität· Wie typisch für die bisher bekannten Anthracyclin-Antibiotica, wird auch vom Beta-Shodomycin I bevorzugt das Wachstum.von grampositiven Bakterien und Mycobakterien gehemmt ·. Gegen Vertreter der Hefen und filamentösen Pilze läßt sich demgegenüber keine wachstumshemmende Aktivität feststellen··

Bei der Bestimmung der antibakteriellen Wirksamkeit von Beta-Ehodomycin I im Vergleich zur entsprechenden Wirksamkeit der klinisch als Krebschemotherapeutica eingesetzten Anthracyclin-Antibiotica' Daunorubicin und Doxorubicin ergab sich, daß die. in Wasser löslichen Hydrochloride unter standardisierten Bedingungen gegen Bacillus, subtilis ASGG 66.33 folgende Aktivitätsunterschiede aufweisen:.

Anthracyclin-Antibiotica Aktivität in Prozent

Iremycin 100

Beta-Ehodomycin I 2SO

Doxorubicin 57Q

Daunorubicin 798

Im Vergleich zu dem cytostatisch und cancerostatisch wirksamen Violamycin A (Ehodosaminyl-Derivat des Aglykongemisches Violamycinon, DDE-Patent 100 494) zeigt Beta Hhodomycin I qualitativ vergleichbare Wirkungen bezüglich der Wechselwirkung mit der DIIA in vitro und dem DHA«Stoffwechsel in der Zelle, der für die cytostatische Wirkung der Anthracyclin-rAntibiotica an Mikroorganismen und Säugerzellen sowie für die cancerostatische Wirkung im 'Tierexperiment verantwortlich gemacht werden* Beta-Hhodomycin I unter-drückt

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zudem in selektiver Weise die Vermehrung von DNA-Viren in gras*· negativen Bakterien (z.B.. von temperenten Lambda-Phagen in Bscherichia coli O 600) bei Konzentrationen, die nicht gleichzeitig den Stoffwechsel und die Vermehrung der Wirtszellen beeinträchtigen.

Beta-Rhodomycin I erwies sich am P 388-Modell als antileukämisch wirksam* Die maximale Wirkung "beträgt 4-5,4- % Verlängerung der Überiebenszeit bei einer Dosis von 2 mg/kg (9 Applikationen)»,

6 Die Leukämie wurde bei diesen Untersuchungen mit 10 Zellen aus dem Ascites leukämischer Mäuse am 7· 'lag nach der vorangehenden Transplantation übertragen* Die Haltung der P 388« Zeil-Linie erfolgte auf Musen des InzuchtStammes DBA/2 Jena, die experimentelle Prüfung dagegen auf ABD2I?^-Hybriden beiderlei Geschlechts* Beta-Hhodomycin I wurde täglich einmal vom 1e bis 4·· und vom 7· bis 11. Tag nach der Tumorübertragung intraperitoneal appliziert« Lösungen von Beta-Bhodo« mycin I-Hy&rochlorid wurden je einmal für die ersten 4- und die folgenden 5 Injektionen hergestellt und über die entsprechenden Zeiträume bei 4 ⁰O im Dunkein aufbewahrt« De- ' taillierte Angaben zu den Testbedingungen sind von Gutsche et al· beschrieben (Arch, f· Geschwulstforschg·, ^t₃ 5 (1981), 394-404; Folia haematologica, 108, 5 (1981), 647-651; Pharmazie (1982), 00, 000-000 (im Druck)·

Beta-Hhodomycin I kann als' ein bisher nicht verfügbares Anthracyclin-Antibioticum angesehen werden, dessen "biologische Wirkung eine potentielle Anwendung als Ghemotherapeuticum gegen Tumor-, Virus- und durch Bakterien hervorgerufene Erkrankungen bei Mensch und Hutztier ermöglichen.

Ausführungsbeispiele

1· Zwei 500-ml-Steilbrustflaschen enthalten je 80 ml des folgenden Vorzuchtmediums:

Glucose 1,5 % Sojamehl 1,5 % Na-ChIorid 0,5 %

24103 9 8 -«>-

Ga-Karbonat 0,1 %

-. primäres ..

K-Phosphat 0,03 %

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min. bei 110 ⁰O. Acidität nach Sterilisation liegt bei pH 6,3· Jede Steilbrustflasche wird mit einer Sporen- oder Mycelsuspension des Beta-Shodomycin I-Bildners 43 673 beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-Nahrboden gezüchteten, 10 bis 14 Tage alten Kultur des Beta-Hhodomycin I-Bildners hergestellt wird:

Hafermehl 1,0 %

Haferflocken

gemahlen 1,0 %

Agar-Agar 2*0 %

in Leitungswasser Sterilisation: 35 Min· bei 120 ⁰C, natursauer* Die beimpften Vorzuchtkultüren werden 48 Std. bei 28 ⁰C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/min bebrütet« 8 ml einer so bebrüteten Vorzuchtkultur dienen zur Beimpfung von 500 ml-Steilbrustflaschen, die je 80 ml des folgenden Produktionsmediums enthalten:

Glucose 3,0 %

Sojamehl 1,0 %

ITa-GhIorid . 0,,5 %

Ga-Karbonat 0,3 %

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min. bei 115 ⁰O* Die Acidität beträgt nach Sterilisation pH 6,3·- Die (Temperatur während der fermentation liegt bei 28 ⁰G und die Schüttelfrequenz bei 180 TJ/min«

Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß das Produktionsmedium folgende Zusammensetzung hat:

Glukose 3,0 %

Sojamehl 3,0 %

ITa-ChIorid 0,3 %

Ca-Karbonat 0_t3 %

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in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min· "bei 115 ⁰Ci" Die Acidität liegt nach dem Sterilisieren bei pH 6,2»

Mit einer Kultur des Beta-Rhodomycin I-Bildners von einem festen Nährboden wie in Beispiel 1 beschrieben, beimpft man 80 ml. des in Beispiel 1 angeführten flüssigen Vbrzucht-Mediums.» welches in einer 500 ml-Steilbrustflasche enthalten ist. Man bebrütet 4-8 Std· bei 28 ⁰G auf einem Schüttelgerät mit einer Schüttelfrequenz von 180 U/min* 12 ml der so erhaltenen Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 400 ml des gleichen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2 1-Glaskolben enthalten ist,. Man bebrütet weitere 24- Std.,· bei 28 ⁰G bei einer Schüttelfrequenz von 180 U/min», ehe die so erhaltenen 400 ml Kulturbrühe zur Beimpfung von 20 1 des im Beispiel 1 beschriebenen Produktions-Mediums dienen* Letzteres ist in einem 32 1-Glasfermenter enthalten. Während der Fermentation, die mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min* und mit einer Luftzufuhr von 15 l/min* ausgeführt wird, kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer^ silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden« 210 1. auf diese Weise gewonnene Kulturlösung werden mit Salzsäure auf pH 4,0 eingestellt und nach Separieren des Mycels werden 19»8 kg Mycel und 155 1 Kulturfiltrat erhalten« Danach werden die 155 1 Kulturfiltrat mit Natronlauge auf pH 7j5 eingestellt und mit 100 1 Butanol ausgerührt., Der so erhaltene Butanolestrakt wird anschließend bis zum Farbumschlag mit Salzsäure angesäuert und im Vakuum auf 1/25 des Ausgangsvolumens eingeengt,. Aus dem Bndkonzentrat läßt sich unter Zufügen des 3-fachen Volumens an Petroläther das Rohprodukt A 43 678 ausfällen, mit Petroläther waschen und unter vermindertem Druck im Exsikkator über konz. Schwefelsäure trocknen* .

Von 19*8 kg Mycel werden mit 70 1 Methanol ein erster und zweiter Extrakt hergestellt, wobei vor der 2« Extraktion dem Methanol 300 ml Salzsäure (1:1 mit Wasser

verdünnt) zugesetzt werden* Die erhaltenen Methanolextrakte werden filtriert, mit Natronlauge auf pH 6,0 eingestellt, vereinigt und im Vakuum eingeengt· Das wässrige Methanolextrakt-Konzentrat des Mycels wird bei pH 7 bis pH 9 mit Butanol erschöpfend extrahiert, wobei für 5 1 des Mycelextrakt-Eonzentrates 5 1 Wasser und 5 1 Butanol eingesetzt werden· Nach Abtrennen der die Pigmente enthaltenden Butanol-Phase wird letztere mit Salzsäure wieder angesäuert, nachfolgend wird konzentriert, mit Petroläther ausgefällt, gewaschen und im Vakuum über konz. Schwefelsäure getrocknet. Die Ausbeute an Rohprodukt A 4-3 678 beträgt 55 g·

10 g Rohprodukt A 43 -678 werden in 50 ml Methanol aufgenommen, mit 1 1 Wasser versetzt, mit NaHCOo auf pH 7j9 eingestellt und erschöpfend (3 mal) mit Chloroform extrahiert· Die .Chloroformphase wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und unter vermindertem Druck bei 20 ⁰O zur Trockne eingeengt· Man erhält 3,1 g Anthracyclin-Rohprodukt _r Zur Abtrennung des Beta-Rhodomycin I wird das Rohprodukt in Chloroform aufgenommen und 2 mal an Kieselgel (NaHCO^,-gepuffert - 0,05 bis 0,2 mm) mit CHCl₃-CHCWAceton=:80;20 -CHClosAceton:Methanol=80i20:6 und anschließend an Kieselgel (0,05 bis 0,2) mit"CHCl₃:Methanol:H₂0=70i2€i:2 chromatografiert; und aus Chloroförm/Petroläther in reiner Porm isoliert·" Die Ausbeute beträgt 130 mg Beta-Rhodomycin_el· Das entspricht einer Ausbeute von 3>5 g reines Beta-Hhodo— mycin I pro mr Permentationsflüssigkeit*

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Claims (1)

1. U 3 a 8 -¹³-

   Srfindungsanspruch

   Verfahren zur Herstellung eines Anthracyclin-Antibioticums sowie seines Aglycons, dadurch gekennzeichnet, daß ein neuer Mikroorganismus-, Streptomyces violaceus subsp. iremyceticus, Stamm ΖΙΜΞΤ 43 678, unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur zwischen 25 und 37 ⁰C während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen kultiviert wird und das gebildete Anthracyclin-Antibioticum Beta-Hhodomycin I sowohl aus dem Mycel als auch aus dem Eulturfiltrat bei einer Acidität zwischen pH 3 und. pH 9 mittels üblicher Lösungsmittel extrahiert, nachfolgend mit üblichen Methoden konzentriert, ausgefällt und chromatogfafisch gereinigt oder mit anorganischen bzw· organischen Sauren in seine Salze übergeführt oder durch SäurehydroIyse in sein Aglykon umgewandelt wird«

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