DD220046A1 - Verfahren zur herstellung von beta-rhodomycin ii sowie seines aglykons - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Anthracyclin-Antibiotikums sowie seines Aglykons, die fuer die Chemotherapie von Tumor-, Virus- und durch Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind. Insbesonders betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des bisher nicht verfuegbaren Antibiotikums Beta-Rhodomycin II, seiner Salze sowie seiner hydrolytischen Abbauprodukte unter Verwendung eines neuen Mikroorganismus, der nach interspezifischer Rekombination erhalten und als Streptomyces violaceus subsp. iremyceticus, Stamm ZIMET 43 687, bezeichnet wurde. Ziel der Erfindung ist die Gewinnung eines Anthracyclin-Antibiotikums mit potentiell cancerostatischen Eigenschaften sowie seiner hydrolytischen Abbauprodukte als Ausgangssubstrate fuer Mutasynthese und Halbsynthese, um die Palette derartiger Pharmaka zu erweitern. Die Aufgabe wird dadurch geloest, dass durch aerobe Submersfermentation des neuen Mikroorganismus ZIMET 43 687 in Medien mit geeigneten C-, N-Quellen und Mineralsalzen Beta-Rhodomycin II gebildet, mit geeigneten Methoden aus Mycel und Kulturfiltrat isoliert und nachfolgend gereinigt und gegebenenfalls hydrolysiert wird.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer antibiotisch wirksamenSubstanz sowie deren Derivate, die bei der Chemotherapie von Tumor-, Virus-und durch Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die Gewinnung eines neuen Anthracyclin-Antibiotikums, das als Beta-Rhodomycin Il bezeichnet wird, seiner Salze, sowie seines Aglykons.

Charakteristik der bekannten technischen Lösung ,

Anthracycline, die ein,oder mehrere Zuckerreste enthaltenden Glykoside der Anthracyclinone, stellen antibiotisch wirksame Verbindungen dar. Die biologisch inaktiven Aglykone der Anthracyclin-Antibiotika (= Anthracyciinone), die man ihrem Kohlenstoffgerüst nach als Derivate'des 7,8,9,10-Tetrahydro-5,12-naphthacenchinons und ihrem chromophoren Molekülteil nach als Hydroxyanthrachinone ansehen kann, werden je nach Zahl und Stellung der «-Hydroxylgruppen am Anthrachinonringsystem in verschiedene Gruppen mit charakteristischen Elektronenabsorptionsspektren unterteilt (Brockmann, H., 1963. Fortschr. Chem. Org. Naturstoffe, 21,121). Mehr als 100 Anthracycline sind bisher bekannt, wovon die Mehrzahl Gemische von schwer voneinander trennbaren Einzelkomponenten darstellen. .

Zwei Anthracyclin-Antibiotika (Doxorubicin — US-Patent 3590028; Daunorubicin— GB-Patent 1003383) sind auf Grund ihrer chemotherapeutischen Wirksamkeit gegen akute Leukämien und solide Tumoren des Menschen in klinischer Anwendung. Ein wesentliches Problem bei der krebschemotherapeutischen Anwendung von Anthracyclin-Antibiotika resultiert aus deren allgemeiner, hämatologischer, digestiver und kardialer Toxizität, die eine umfassendere Anwendung in der Tumorchemotherapie einschränkt und z. B. bei Herzkranken zur Kontraindikation führt. Da sich die Herztoxizität der Anthracycline als besonders störend erwiesen hat, werden ständig neue Derivate bereits bekannter Verbindungen hergestellt und hinsichtlich einer verringerten Toxizität untersucht. Ein Nachteil ist hierbei, daß zur Gewinnung chemisch rriodifizierter Anthracyclin-Antibiotika zwar chemische Methoden wie Total- und Partialsynthese sowie biochemische Methoden zur enzymatischen Konversion verfügbar sind, deren Anwendung jedoch zu einer unzureichenden Ökonomie der Produktherstellung führt, die eine großtechnische Gewinnung dieser Derivate nicht gestattet. Bei den bisher bekannten mikrobiologischen Herstellungsverfahren für Anthracyclin-Antibiotika werden bevorzugt Gemische chemisch ähnlicher Anthracycline gewonnen, die aus den Mono-, Di-, Tri-oder Polysacchariden unterschiedlicher und unter industriellen Bedingungen praktisch nicht trennbarer Anthracyclinone bestehen. Das bringt Standardisierungsprobleme für das Endprodukt mit sich, wenn in Abhängigkeit vom Fermentatiönsverfauf Verschiebungen qualitativer und quantitativer Art im Vielkomponenten-Gemisch auftreten. Anthracycline, deren Aglykone dem Beta-Rhodomycinon zugeordnet werden können, sind bisher mit Hilfe der Arten Streptomyces purpurascens(Brockmann, Waehneldt und Niemeyer, 1969. Tetrahedron Lett., (6), 415; Brockmann, Scheffer und Stein, 1973. Tetrahedron Lett., (38), 3699; Brockmann und Greve, 1975. Tetrahedron Lett., (11), 831), Streptomvces bobiliae (Biedermann und Bräuninger, 1972. Pharmazie, 27,782), Streptomyces griseoruber4620 (Podojil, Blumauerovä, Prikrylova, Vanek, Gauze und Maksimova, 1980. Folia Microbio!., 25,464), Streptomyces violaceus(Fleck, Strauß, Koch, Kramer und Prauser, 1974. Z. AIIg. Mikrobiol., 14, 551), Streptomvces roseovilaceusA 529 (IFO 13081 Matsuzawa, Yoshimoto; Oki, Inui, Takeuchi und Umezawa, 1979. J. Antib., 32,420) auf fermentativem Wege sowie durch Biosynthese und Glykosidierung von Beta-Rhodomycinon mittels einer Aclacinomycin-Mangelmutante (Oki, Yoshimoto und Matsuzawa, 1980. J. Antib., 33,1331) als Gemische oder als Minorkomponenten in sehr geringen Mengen mit unbekannter chemotherapeutischer Aktivität erhalten worden. Detaillierte Angaben zu den physikochemischen Eigenschaften der Beta-Rhodomycine sowie zu deren biologischer Wirkung wie antimikrobielle, antivirale, cytostatische und antitumorwirksame Aktivität liegen bisher nur vom Beta-Rhodomycin I vor. Dieses Beta-Rhodomycinon-Monoglykosid wurde auf fermentativem Wege als HaUbtkomponente aus einer Mutante des Streptomyces violaceus subsp. iremyceticusZlMET 43678 (Ihn, Schlegel, Fleck, Tresselt, Gutsche, Sedmera und Vokoun, 1983. Pharmazie, im Druck) erhalten und als reine Einzelkomponehte isoliert. .

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der Hersteilung eines neuen Anthracyciin-Antibiotikums sowie seines Aglykons wie auch der Salze des Antibiotikums, um die aufgeführten Nachteile bisher bekannter Verfahren zu vermeiden und die Palette potentiell cancerostatisch, virostatisch und antimikrobiell wirksamer Anthracycline durch einen Vertreter, der eine Einzelkomponente darstellt,zu erweitern, sowie um die hydrolytischen Abbauprodukte als Ausgangssubstrat für die Mutasynthese und Halbsynthese neuer Anthracyclin-Antibiotika verwenden zu können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches Verfahren anzugeben, das es gestattet, das Anthracyclin-Antibiotikum Beta-Rhodomycin Il mit Hilfe eines Mikroorganismus aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guten Ausbeuten als Einzelkomponente herzusteilen. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit:entsprechenden Kohlenstoff-,,Stickstoff-Quellen und Mineralsalzen ein neuer Mikroorganismus oder seine;Varianten gezüchtet werden. Der neue Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Anwendung findet, wurde durch interspezifische Hybridisierung von genetisch markierten und im Sekundärstoffwechsel geblockten Mutanten des Violamycirc-Bildners, Streptomyces violaceus.Stamm IMET JA 6844 (beschrieben in der DDR-Patentschrift 100494) und des Turimycin-Bildners, Streptomyces hygroscopicus, Stamm IMET

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-*

Jena-DDR, unter der Nummer ZIMET 43687 deponiert. In seinen morphologischen Eigenschaften entspricht der Beta-Rhodomycin Il-Bildner ZIMET 43687 dem Stamm ZIMET 43615, der in der DDR-Patentschrift 140672 sowie von Schlegelund Fleck 1980 (Z. AiIg. Mikrobiol., 20, 527-530) als Streptomyces violaceus sufasp. iremyceticusbeschrieben wurde. Danach gehört der Beta-Rhodomycin Il-Bildner ZIMET 43687 zur Gattung Streptomycesund entspricht der Diagnose von Streptomyces violaceus(Rossi-Doria 189.1, Krassilnikov 1941, Waksmart 1953), wie sie nach Untersuchung des Neo-Type-Stammes ISP 5082 ·(= INMI-1, RIA 656, ATCC 15888) im „International Streptomyces Project" von Shiriing and Gottlieb (Int. J. syst. Bact., 19,497/ 1969) gegeben wird. Der Beta-Rhodomycin Il-Bildner ZlMET 43687 ist durch Selektionsprozesse aus einer Population der interspezifischen Rekombinante ZIMET 43615 hervorgegangen und unterscheidet sich von der Ausgangsrekombinante dadurch, daß andere Anthracyclin-Antibiotika gebildet werden. Während die Ausgangsrekombinante ZlMET 43 615 das Anthracyclin-Antibiotikum Iremycin ([10-a-L-modosaminyl]-y-rhodomycinon; vgl. Patentschrift DD 140672) bildet, wird durch die Mutänte ZlMET 43687 das neue Anthracyclin-Antibiotikum Beta-Rhodomycin Il synthetisiert. Die Kultivierung des Stammes ZIMET 43687 sowie seiner Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen. An Erde lyophil getrocknetes Sporenmaterial bzw. Mycelfragmente werden in geeignete Agamährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25°C und 37⁰C, vorzugsweise 28°C, über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen, vorzugsweise 4 Tagen, bei einer Äcidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,2 und pH 7,0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,3 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie aus anorganischen Salzen. Als _Λ.

Kohlenstoffquellen können Stärke, Glukose, Glyzerin, Mannit, Dextrin, Saccharose, Sojaöl und Sojamehl verwendet werden. Als Stickstoffquellen kommen außer den oben erwähnten stickstoffhaltigen Substraten auch Trockenhefe, Fleischpepton und Casein in Frage. Gute Ergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt werden. Letztere begünstigen den Verlauf der Fermentation in Abhängigkeit vom eingesetzten Nährmedium. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, Natriqm-Phosphat bzw. Kalium-Phosphat als vorteilhaft erwiesen. Die Fermentation des Bildners ZIMET 43687 kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, im Glasfermenter sowie in V2 A-Stahltanks durchgeführt werden. Die isolierung des Beta-Rhodomycin Il wird in der Weise durchgeführt, daß das Antibiotikum aus dem Kulturfiltrat mit organischen, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren, und aus dem Mycsl mit organischen, mit Wasser mischbaren und anschließend mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren Lösungsmitteln extrahiert, nach Konzentrieren der Extrakte mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel reextrahiert', über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, vom Lösungsmittel durch Destillieren im Vakuum befreit, durch Versetzen mit Petroläther unter Rühren ausgefällt, vom*Lösungsmittel durch Filtration befreit, mit Petroläther gewaschen, nachfolgend getrocknet, anschließend in niederen Alkoholen gelöst filtriert, vom Lösungsmittel durch Destillieren im Vakuum befreit, der getrocknete Rückstand mit Wasser versetzt und bei pH 8,0 mit Chloroform extrahiert, die Chloroformphase abgetrennt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum zur Trockene gebracht und auf yblichem Wege säulenchromatographrsch an Kieselgel gereinigt wird.

Beta-Rhodomycin Il kristallisiert aus Chloroform/Methanol in rotbraunen Kristallen, die sich gut in Chloroform, mäßig in niederen Alkoholen und fast nicht in Wasser und Petroläther lösen. Das basische Antibiotikum besitzt Indikatoreigenschaften und ist in sauren Lösungen rotgelb, in alkalischen blauviolett. Beta-;Rhodomycin Il bildet bei der Umsetzung mit der äquivalenten Menge methanolischer Salzsäure in Äther ein rotes Hydrochiorid vom Schmelzpunkt 190/193°C. Das Hydrochlorid ist im Gegensatz zum basischen Antibiotikum gut löslich in Wasser und niederen Alkoholen, dagegen nahezu unlöslich in Chloroform und Äther. Sowohl die freie Base als auch das AnthracyclinHydrochlorid stellen entsprechend ihres dünnschichtchromatographischen Verhaltens auf Kieselgel-Platten in verschiedenen Fließsystemen und bei unterschiedlichen pH-Werten definierte, chemisch reine Einzelkomponenten dar.

Beta-Rhodornycin Il bildet bei der Acetylierung mit Acetanhydrid in Pyridin ein gelbes Pentaacetat C₄₆H₅₈Oi₇N₂ (M⁺ 910, Massenspektrum). Bei Hydrolyse mit verdünnter Säure in der Wärme liefert das Anthracyclin ein Mol Beta-Rhodomycinon und zwei Mol Rhodosamin. Die Identifizierung des Aglykone als Beta-Rhodomycinon (Brockmann und Franck, 1955. Chem. Ber., 88, 1792) und die der Zuckerkomponente als L-Rhodosamin (Brockmann, Spohler und Waehneldt, 1963. Chem. Ber., 96, 2925) wurde durch vergleichende dünnschichtchromatographische und verschiedene spektroskopische (MS-, UV/VIS-, IR- und ¹H-NMR-) Untersuchungen gesichert. .

Die pr.äparative elektrochemische Reduktion des Beta-Rhodomycins Il an einer großflächigen Quecksilberelektrode führt unter reduktiver Spaltung der Glykosidbindung am C-7 Atom zum Anthracyclin-Antibiotikum Iremycin (Ihn, Schlegel, Fleck und Sedmera, 1980. J. Antibiotics, 33,1457). , .

Die in Abb. 1 dargestellte Struktur des Antibiotikums Beta-Rhodomycin Il wurde durch die chemische Abbau- und Derivatisierüngsreaktionen sowie durch umfassende spektroskopische Untersuchungen am intakten Antibiotikum-Molekül ermittelt. Beta-Rhodomycin Il ist unseres Erachtens mit dem in der Literatur beschriebenen Rhodomycin A (Brockmann und Patt, 1955. Chem. Ber., 88,1455) identisch, obwohl die für Rhodomycin A aus der Elementaränalyse errechnete Summenformel fehlerhaft ist und physikochemische Daten nur unvollständig vorliegen. Wichtige physiköchemische Parameter des Beta-Rhodomycin Il sind: ' . ' ' ; UV/VIS λ max (Hydrochlorid in Methanol) nm: 235, 253, 294, 494

^IRmax^Cm"^{1: 1595} i^H-^C0 :.

MS m/z (Acetat): M⁺ 910,476 (Bisanhydroaglykon-Triacetat), 434 (Bisanhydroaglykon-Diacetat), 392 (Bisanhydroagiykon-

Monoacetat), 350 (Bisanhydroaglykon, Basispeak) 200 (Zuckeracetat-OH), 158 (Zucker-OH) ¹H-NMR {Pyridin-D_s): ^:

1-H: . 7,86 Q , J₁₂ = 7,5 Hz

2-H: : - 7,65T J₁^₃ =1,2 Hz

3-H: - 7,36Q '

7-H: .'.. /_ _ _5,22u(X) 8a-H:) . ^ ca."2^3Ö - 2,60 (A) 8b-H:) . , (B)"

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10-H:

CH₃VOnC₂H₆:

CH₂VOnC₂H₅:

2'-CH₂; 2"-CH₂: 3'-H;3"-H: 3'-N(CH₃J₂; 3"-N(CH₃);,: 4'-H;4"-H: 5'-H;5"-H: 5'-CH₃; 5"-CH₃:

Abkürzungen: S = Singulett, T = Triplett, Q = Quartett, Μ = Multiple«, u = Signal unaufgelöst.

Sowohl frische Fermentationslösungen des Beta-Rhodomycin H-Bildners, 2IMET 43687, als auch das aus ihnen isolierte Beta-Rhodomycin Il besitzen antibiotische Aktivität. Beta-Rhodomycin Il hemmt bevorzugt das Wachstum vom grampositiven Bakterien und Mycobakterien. Gegen Vertreter gramnegativer Bakterien, der Hefen oder filamentösen Pilze entfaltet Beta-Rhodomycin Il dagegen keine wachstumshemmende Aktivität, Bei der Bestimmung der antibakteriellen Wirksamkeit von Beta-Rhodomycin Il im Vergleich zur entsprechenden Wirksamkeit des klinisch als Krebschemotherapeutikum eingesetzten Anthracyclin-Antibiotikums Doxorubicin und der bekannten Anthracyclin-Antibiotika Iremycin und Beta-Rhodomycin I ergaben sich unter standardisierten Bedingungen gegen den Sporenbildner Bacillus subtilis SG 119 folgende Aktivitätsunterschiede: Anthracyclin-Antibiotika Aktivität (%)

5,49 S	UCH3-CH2 = 7,0 HZ	J5-H,5-CH3 = 6'5 HZ
1,35T		Js-hü-ch, — 6/5 Hz
ca.2,15M	Σ J ca. 8 Hz
5,77 u	(Signalüberlagerung
	von 1'-H und 1-"-H)
ca. 2,0-2,60 M
3,26 M
3,40 M '
2,58 S
2,71 S
4,22 ca. S(u)	ι»
4,37 ca. S (u)
4,26 ca. Q
4,59 ca. Q
1,55 D
1,62D

Iremycin	100
Beta-Rhodomycin Il	766
Beta-Rhodomycin I	322
Doxorubicin	738

Interessant ist- die, offenbar durch den am Aglykon gebundenen zweiten Rhodösaminylrest hervorgerufene, bedeutende antimikrobielle Aktivitätssteigerung des erfindungsgemäß hergestellten Beta-Rhodomycin'Il gegenüber der entsprechenden Wirksamkeit des bekannten Beta-Rhodomycin I.

Im Vergleich zu den cytostatisch und cancerostatisch wirksamen Anthracyclin-Antibiotika Daunorubicin und Doxorubicin zeigt Beta-Rhodomycin Il-Hydrochlorid qualitativ vergleichbare Wirkungen bezüglich der Wechselwirkung mit der DNA in vitro und dem DNA-Stoffwechsel in der Zelle, die u.a. für die cytostatische Wirkung der Anthracyclin-Antibiotika in Mikroorganismen und Säugerzellen sowie für die Antitumorwirksamkeit im Tierversuch verantwortlich gemacht werden. Beta-Rhodomycin Il unterdrückt zudem in selektiver Weise die Vermehrung von DNA-Viren in gram'negativen Bakterien (z.B. von temperenten Lambda-Phagen in Escherichia coli C 600) bei Konzentrationen, die nicht gleichzeitig den Stoffwechsel und die Vermehrung der Wirtszellen beeinträchtigen.

Beta-Rhodomycin Il kann als ein bisher nicht verfügbares Anthracyclin-Antibiotikum angesehen werden, dessen biologische Wirkung eine potentielle Anwendung als Chemotherapeutikum gegen Tumor-, Virus- und durch Bakterien hervorgerufene Erkrankungen bei Mensch und Nutztier ermöglicht.

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu erläutern, ohne sie hierauf zu beschränken. ' .

1. Zwei 500-ml-Steilbrustflaschen enthalten je 80ml des folgenden Vorzuchtmediums:

Glucose ' 1,5%

Sojamehl 1,5%

Na-Chlorid . ' 0,5% . .

Ca-Karbonat .0,1%

primäres K-Phosphat 0,03% ,

in Leitungswasser

Sterilisation: 35Min. bei 1T0°C. Acidität nach Sterilisation liegt bei pH 6,3. Jede Steilbrustflasche wird mit einer Sporen- oder Mycelsuspension des Beta-Rhodomycin Il-Bildners ZIMET 43687 beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-Nährboden gezüchteten, 10 bis 14Tage alten Kultur des Beta-Rhodomycin Ü-Bildners hergestellt wird: . ,' '

Hafermehl 1,0%

Haferflocken, gemahlen 1,0%

Agar-Agar 2,0%

in Leitungswasser -

Sterilisation: 35Min. bei 120°C, natursauer. ' . , .

Die beimpften Vorzuchtkulturen werden 48Std. bei 28°C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/min bebrütet. 8ml einer so bebrüteten Vorzuchtkultur dienen zur Beimpfung von öOOVnl-Steiibrustflaschen, die je 80ml des folgenden Produktionsmediums enthalten: .

Glucose 3,0% :

Sojamehl 1,0% ·

Na-Chlorid - . 0,5%

Ca-Karbonat 0,3% ." ,

in Leitungswasser

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2. Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß das Produktionsmedium folgende Zusammensetzung hat:

Glucose 3,0%

Sojamehl 3,0% · . ' , ,

Na-Chlorid ' ' 0,3%

Ca-Karbonat 0,3% ,

in Leitungswasser Sterilisation: 35Min. bei 115⁰C. Die Acidität liegt nach dem Sterilisieren bei pH 6,2. . :

3. Mit einer Kultur des Beta-Rhodomycin Il-Bildners von einem festen Nährboden, wie in Beispiel 1 beschrieben, beimpft man 80ml des in Beispiel.1 angeführten flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einer SOQ-ml-Steilbrustflasche enthalten ist. Man bebrütet 48Std. bei 28°C auf einem Schüttelgerät mit einer Schüttelfrequenz von 180U/min. 12ml der so erhaltenen Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 400 ml des gleichen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2-l-Glaskoiben enthalten ist. Man bebrütet weitere 24Std. bei 28°C bei einer Schüttelfrequenz von 180 U/min, ehe die so erhaltenen 400ml Kulturbrühe zur Beimpfung von 20I des im Beispiel 1 beschriebenen Produktions-Mediums dienen. Letzteres ist in einem 32-l-Glasfermenter enthalten. Während der 96stündigen Fermentation, die mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/min und mit einer Luftzufuhr von 15l/min ausgeführt wird, kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer, siiikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden. 200I auf diese Weise gewonnene Kulturlösung werden mit Salzsäure auf pH 4,0 eingestellt und nach Separieren des Mycels werden 19,0 kg Mycel und 150 IKülturfiltrat. erhalten. Danach werden die 1501 Kulturfiltrat mit Natronlauge auf pH 7)5 eingestellt und mit 1001 Butanol ausgerührt. Der so erhaltene Butanolextrakt wird anschließend bis zum farbumschlag mit Salzsäure angesäuert und im Vakuum auf V25 des Ausgangsvolumens

eingeengt. . ,

Von 19,0kg Mycel werden mit 7Ol Methanol ein erster und zweiter Extrakt hergestellt, wobei vor der 2.Extraktion dem Methanol 300 ml Salzsäure (1:1 mit Wasser verdünnt) zugesetzt werden. Die erhaltenen Methanolextrakte werden filtriert, mit Natronlauge auf pH 6,0 eingestellt, vereinigt und im Vakuum eingeengt. Das wäßrige Methanolextrakt-Kohzentrat des Mycels wird bei pH 7 bis pH 9 mit Butanol erschöpfend extrahiert, wobei für 51 des Mycelextrakt-Konzentrates 51 Wasser und 51 Butanol eingesetzt werden. Nach Abtrennen der die Pigmente enthaltenden Butanol-Phase wird letztere mit Salzsäure wieder angesäuert, nachfolgend wird konzentriert, mit dem Konzentrat des Butanolextrakts des Kulturfiltrats vereinigt, mit Petroläther ausgefällt, gewaschen und im Vakuumüber konz. Schwefelsäure getrocknet. Die Ausbeute an Rohprodukt beträgt

50g. . ..'.'. i ; - ._

4. 10g Rohprodukt werden in 50 ml Methanol aufgenommen, mit 11 Wasser versetzt, mit NaHCO₃ aufpH 7,9 eingestellt und erschöpfend (3mal) mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformphase wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und unter vermindertem Druck bei 20⁰C zur Trockne eingeengt. Man erhält 2,4g Anthracyciin-Rohprodukt. Zur Abtrennung des Beta-Rhodomycin Il wird das Rohprodukt in Chloroform aufgenommen und 2mai an Kieselgel (NaHCO₃-gepuffert — 0,05-43,2 mm) mit CHCI₃-CHCl₃/Aceton = 80:20 CHCVAcetoniMethanol = 80:20:6 und anschließend an Kieselgel (0,05-0,2) mit CHCI₃:Methanol:H₂O = 70:20:2/ chromatografiert und aus Chloroform/Petrdläther in reiner Form isoliert. Die Ausbeute beträgt 205mg Beta-Rhodomycin IL Das entspricht einer Ausbeute von 5,1 g reines Beta-Rhodomycin Il pro m³ Fermentationsflüssigkeit.

5. 100mg Beta-Rhodomycin Il werden in 10ml 0.1 η Salzsäure gelöst und 70 Minuten auf 95°C erwärmt. Das sich hierbei ausscheidende Beta-Rhodomycinon wird abfiltriert, mit Wasser mehrmals gewaschen und aus Eisessig umkristallisiert. Ausbeute: 40mg rote Nadeln vom Schmelzpunkt 223-226°C.

Claims (1)

1. -1_T 255 894 5

   Erfindungsanspruch: , ;

   Verfahren zur Herstellung von Beta-Rhodornycin Il sowie seines Aglykone, gekennzeichnet dadurch, daß ein neuer Mikroorganismus, Streptomyces violaceus subsp. iremyceticus, Stamm ZIMET 43687, unter aeroben Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten, bei einer Temperatur zwischen 25⁰C und 37⁰C während eines Zeitraumes von 2 Tagen bis 6 Tagen kultiviert wird und das gebildete Anthracyclin-Antibiotikum Beta-Rhodomycin Il sowohl aus dem Mycel als auch aus dem Kulturfiltrat bei einer Acidität zwischen pH 3 und pH 9 mittels üblicher Lösungsmittel extrahiert, nachfolgend mit an sich bekannten Methoden konzentriert, ausgefällt und chromätografisch gereinigt oder mit anorganischen bzw. organischen Säuren in seine Salze übergeführt oder durch Säurehydrolyse in sein Aglykön umgewandelt wird. ' * '

   Hierzu 1 Seite Abbildung