DD140672B1 - Verfahren zur herstellung eines anthracyclin-antibioticums sowie seines aglykons - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung einer antibiotisch wirksamen Substanz sowie deren Derivate, die bei der Chemotherapie von Tumor-, Virus-und durch Bakterien hervorgerufenen Erkrankungen bei Mensch und Nutztier von potentiellem Nutzen sind. Insbesondere betrifft die Erfindung die Gewinnung eines Anthracyclin-Antibioticums, das als Iremycin bezeichnet wird, seiner Salze, seines Aglykons sowie seiner hydrolytischen Abbauprodukte unter Verwendung eines neuen Mikroorganismus.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Anthracyclin-Glykoside stellen antibiotisch wirksame Verbindungen dar, deren chromophorer Molekülteil ein 7,8,9,10-tetrahydrotetracenchinon (5,12) darstellt, das mit Zuckern, bevorzugt Aminozuckern, verbunden ist (Brockmann, H. 1963. Fortschr. Chem. organ. Natstoffe, 21,121). Je nach Stellung der peri-ständigen OH-Gruppen am Aglykon werden verschiedene Anthracyclinone unterschieden, die als Glykoside die Bezeichnung Anthracycline tragen und nur in dieser Form biologisch aktiv sind. Mehr als 50 Anthracyclin-Antibiotica sind bereits beschrieben, wovon die Mehrzahl Gemische von schwer voneinander trennbaren Einzelkomponenten darstellen. 2 Anthracyclin-Antibiotica (Doxorubicin-US-Patent 3590028; Daunorubicin-GB-Patent 1003383) sind auf Grund ihrer chemotherapeutischen Wirksamkeit gegen akute Leukämien und solide Tumoren des Menschen bereits klinisch eingesetzt. Ein wesentliches Problem bei der krebschemotherapeutischen Anwendung von Anthracyclin-Antibiotica resultiert aus deren allgemeiner, hämatologischer, digestiver und kardialer Toxizität, die eine umfassendere Anwendung in der Tumorchemotherapie einschränkt und z. B. bei Herzkranken zur Kontraindikation führt. Da sich die Herztoxizität der Anthracycline als besonders störend erwiesen hat, werden ständig neue Derivate bereits bekannter Verbindungen hergestellt und hinsichtlich einer verringerten Toxizität untersucht. Ein Nachteil ist, daß zur Gewinnung chemisch modifizierter Anthracyclin-Antibiotica zwar chemische Methoden wie Total- und Halbsynthese sowie biochemische Methoden zur enzymatischen Konversion verfügbar sind, deren Anwendung jedoch zu einer unzureichenden Ökonomie der Produktherstellung führt, die eine großtechnische Herstellung dieser Derivate nicht gestattet. Bei den bisher bekannten mikrobiologischen Herstellungsverfahren für Anthracyclin-Antibiotica werden bevorzugt Gemische chemisch ähnlicher Anthracycline gewonnen, die aus den Mono-, Di-, Tri- oder Polysacchariden unterschiedlicher und bisher unter großtechnischen Bedingungen praktisch nicht trennbarer Aglykone (Anthracyclinone) bestehen. Das bringt Standardisierungsprobleme für das Endprodukt mit sich, wenn in Abhängigkeit vom Fermentationsverlauf Verschiebungen qualitativer und quantitativer Art im Vielkomponenten-Gemisch auftreten. Anthracyclinon-Glykoside, deren Aglykone dem Gamma-Rhodomycinon zugeordnet werden können, sind bisher lediglich mit Hilfe der Arten Streptomyces purpurascens und Streptomyces bobiliae auf fermentativem Wege als Minorkomponenten mit unbekannter chemotherapeutischer Aktivität erhalten worden (Brockmann und Waehnelt, 1961. Natwiss. 48,716; Biedermann und Bräuniger, 1972. Pharmazie 27,782). Die Gamma-Rhodomycinon-Glykoside, die bisher beschrieben wurden, sind im Zusammenhang mit der Gewinnung und Strukturaufklärung des biologisch inaktiven Gamma-Rhodomycinons in sehr geringen Mengen isoliert worden. Genaue Angaben zu den physikochemischen Eigenschaften der Gamma-Rhodomycinon-Glykoside sowie zu ihren biologischen Wirkungen (wie antimikrobielle, antivirale, cytostatische und cancerostatische bzw. toxische) liegen bisher nicht vor. Das im vorliegenden Herstellungsverfahren gewonnene Aglykon sowie die hydrolytischen Abbauprodukte des Iremycin sind als Ausgangssubstrate für die Mutasynthese und Halbsynthese von neuen Anthracyclin-Antibiotica bisher nicht verfügbar.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung dient der Herstellung eines neuen Anthracyclin-Antibioticums sowie seines Aglykons wie auch der Salze und hydrolytischen Abbauprodukte des Antibioticums, um die aufgeführten Nachteile bisher bekannter Verfahren zu vermeiden und

die Palette potentiell cancerostatisch, virostatisch und antimikrobiell wirksamer Anthracycline durch einen Vertreter mit verringerten Toxizität zu erweitern, der zudem eine Einzelkomponente darstellt, sowie um die hydrolytischen Abbauprodukte als Ausgangssubstrate für die Mutasynthese und Halbsynthese neuer Anthracyclin-Antibiotica verwenden zu können.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein technologisch einfaches Verfahren anzugeben, das es gestattet, das neue Anthracyclin-Antibioticum Iremycin mit Hilfe eines neuen Mikroorganismus aus leicht zugänglichen und billigen Einsatzstoffen in guten Ausbeuten herzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß unter aeroben und sterilen Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff-, Stickstoff-Quellen und Mineralsalzen ein neuer Mikroorganismus oder seine Varianten gezüchtet werden. Der neue Mikroorganismus, der in diesem Verfahren Anwendung findet, wurde durch interspezifische Hybridisierung von genetisch markierten und im Sekundärstoffwechsel geblockten Mutanten des Violamycin-Bildners, Streptomyces violaceus. Stamm IMET JA 6844 (beschrieben in der DDR-Patentschrift 100494) und des Turimycin-Bildners, Streptomyces hygroscopicus. Stamm IMET JA 6599 (beschrieben in der DDR-Patentschrift 84450) gewonnen und in der Stammsammlung des Zentralinstituts für Mikrobiologie und experimentelle Therapie (IMET), die die Dokumentationsnummer 217 des „World Survey of Collections of Microorganisms" trägt, unter der Nummer IMET 43615 deponiert. In seinen morphologischen Eigenschaften entspricht der Iremycin-Bildner IMET 43615 weitgehend dem Stamm IMET JA 6844, der im DDR-Patent 100494 beschrieben ist, 1958 aus einer Erdprobe von der Schwellenburg bei Elxleben (Erfurt) isoliert wurde und das Anthracyclin-Antibioticum Violamycin zu synthetisieren vermag. Danach gehört der Iremycin-Bildner IMET 43615 zur Gattung Streptomyces und entspricht der Diagnose von Streptomyces violaceus (Rossi-Doris 1891, Krassiinikov 1941, Waksman 1953) wie sie nach Untersuchung des Neo-Type-Stammes ISP 5082 (= INMI-1, RIA 656, ATCC 15888) im „International Streptomyces Project" von Shirling and Gottlieb (Int. J. syst. Bact, 19:497 [1969]) gegeben wird. Da der Iremycin-Bildner in seinen biochemischen und physiologischen Eigenschaften, insbesondere in seinem Sekundärstoffwechsel, vom Violamycin-Bildner, Streptomyces violaceus, abweicht, wird der Iremycin-Bildner Streptomyces violaceus, subspecies iremyceticus benannt (Fleck und Schlegel, 1979. Z. AIIg. Mikrobiol.).

Die Kultivierung des Stammes IMET 43615 sowie seiner Mutanten und Varianten erfolgt unter aeroben Bedingungen. An Erde lyophil getrocknetes Sporenmateriai bzw. Mycelfragmente werden in geeignete Agarnährböden und nachfolgend in flüssige, vorher sterilisierte Nährmedien geimpft und das entstehende Mycel wird in an sich bekannter Weise bei einer Temperatur zwischen 25 und 37°C (vorzugsweise 28°C) über einen Zeitraum von 2 bis 6 Tagen (vorzugsweise 4 Tagen) bei einer Acidität kultiviert, die zu Beginn des Fermentationsprozesses zwischen pH 6,2 und pH 7,0 und am Ende des Prozesses zwischen pH 7,5 und pH 8,3 liegt. Das Nährmedium besteht aus Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, sowie aus anorganischen Salzen. Als Kohlenstoffquellen können Stärke, Glucose, Glycerin, Mannit, Dextrin, Saccharose, Sojaöl und Sojamehl verwendet werden. Als Stickstoffquellen kommen außer den oben erwähnten stickstoffhaltigen Substanzen auch Trockenhefe, Fleischpepton und Casein in Frage.

Gute Ergebnisse können bei Zusatz von Mineralsalzen erzielt werden. Letztere begünstigen den Verlauf der Fermentation in Abhängigkeit vom eingesetzten Nährmedium. In komplexen Medien, die verschiedene Mehle enthalten, haben sich Zusätze von Kalziumkarbonat, Na-Phosphat bzw. Kalium-Phosphat als vorteilhaft erwiesen. Die Fermentation des Bildners kann in Steilbrustflaschen und Rundkolben verschiedenen Inhalts, im Glasfermenter sowie in V2A-Tanks durchgeführt werden. Die Isolierung des Iremycin wird in der Weise durchgeführt, daß das Antibioticum aus dem Kulturfiltrat mit organischen, mit Wasser nicht oder nur wenig mischbaren, und aus dem Mycel mit organischen, mit Wasser mischbaren Lösungsmitteln extrahiert, nach Konzentrieren der Extrakte in die wäßrige Phase überführt, aus der wäßrigen Phase bei pH 7 bis pH 9 (vorzugsweise bei pH 7,5) mit organischen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln erneut extrahiert und aus den Extraktkonzentraten durch Versetzen mit Petroläther unter Rühren ausgefällt, vom Lösungsmittel durch Filtration befreit, mit Petroläther gewaschen, nachfolgend in niederen Alkoholen gelöst, vom unlöslichen Rückstand abfiltriert, konzentriert, in Wasser aufgenommen, mit Methylenchlorid ausgeschüttelt und säulenchromatographisch gereinigt wird. Iremycin ist eine amorphe, rotbraune Substanz, die sich gut in niederen Alkoholen und Chloroform, dagegen nur mäßig in Wasser, Petroläther und Cyclohexan löst. Das Antibioticum besitzt Indikatoreigenschaften und ist in sauren Lösungen rotgelb, in alkalischen blauviolett. Iremycin bildet bei der Acetylierung mit Acetanhydrid in Pyridin ein gelbes Tetraacetat C₃₆H₄-INOi₃: Gefunden: m/e 695 (M)⁺; 636,2362 (M-CH₃COO)⁺(Massenspektrum). Aus dem hochaufgelösten Massenspektrum des Iremycintetraacetates erhält man für das Iremycin die Summenformel: C₂SH₃₃NO₉; MG 527.

Hierdurch wird die aus der Bausteinanalyse angenommene Struktur des Iremycin als Rhodosaminyl-gamma-rhodomycinon bestätigt und ist in der elementaren Zusammensetzung mit dem in der Literatur beschriebenen Gamma-Rhodomycin I (Brockmann und Waehneldt, 1961. Natwiss. 48,717) identisch.

Das durch Säurehydrolyse aus dem Antibioticum Iremycin gewonnene Iremycinon ist eine amorphe, braunrote Substanz, die sich gut in Pyridin, mäßig in niederen Alkoholen, Chloroform, Eisessig, Aceton, Benzol und sehr wenig in Cyclohexari löst. Das Aglykon des Iremycin löst sich in konz. Schwefelsäure und Alkalilauge mit der für 1,4,5-Trihydroxyanthrachinon typischen Violettfärbung (H. Brockmann, 1963. Fortschr. Chem. organ. Naturstoffe, 21,121).

Iremycinon kristallisiert aus Chloroform/Petroläther in Form roter, nadeiförmiger Kristalle vom Fp.235°C bis 245°C. C₂₀H₁₈O₇(MG: Gef.: 370,1081; Ber.:370,1052; Massenspektrum). Das Aglykon stimmt nach Schmelzpunkt und elementarer Zusammensetzung, Elektronenspektrum (nm) λ max Cyclohexan 466; 484; 494; 517; 528 mit dem in der Literatur beschriebenen Gamma-Rhodomycinon überein. (H. Brockmann et al. 1963. Chem. Ber. 96,1356). Auch durch das hochaufgelöste Massenspektrum mit der charakteristischen Fragmentierung m/e 370 (M)⁺; 352; 334; 298; 295; 270 wurde die Identität mit Gamma-Rhodomycinon bestätigt. (H.Brockmann Jr. et al. 1965. Chem. Ber. 98,1260).

Im Iremycin-Hydrolysat konnte durch vergleichende dünnschichtchromatographische Untersuchungen als Zuckerkomponente des Iremycins lediglich Rhodosamin nachgewiesen werden, so daß es sich bei dem erfindungsgemäß hergestellten Iremycin um ein Rhodosaminyl-gamma-rhodomycinon handelt.

Sowohl frische Fermentationslösungen des Iremycin-Bildners IMET 43615 als auch das aus ihnen isolierte Iremycin besitzen antibiotische Aktivität. Bevorzugt werden Vertreter grampositiver Bakterien und Mycobakterien in ihrem Wachstum gehemmt. Dagegen entfaltet Iremycin, ähnlich wie andere Anthracyclin-Antibiotica, gegen Hefen und Pilze keine wachstumshemmende Aktivität. Im Vergleich zu dem cytostatisch und cancerostatisch wirksamen Violamycin A (Rhodosaminyl-Derivat des Aglykongemisches Violamycinon, DDR-Patent 100494) zeigt Iremycin qualitativ vegleichbare Wirkungen bezüglich der Wechselwirkung mit der DNAin vitro und dem DNA-Stoffwechsel in der Zelle, die für die cytostatische Wirkung der Anthracyclin-Antibiotica an Mikroorganismen und Säugerzellen sowie für die cancerostatische Wirkung im Tierexperiment verantwortlich gemacht werden. Iremycin unterdrückt zudem in selektiver Weise die Vermehrung von DNA-Viren in gramnegativen Bakterien (z.B. von temperenten Lambda-Phagen in Zellen von Escherichia coli C600) bei Konzentrationen, die nicht gleichzeitig den Stoffwechsel und die Vermehrung der Wirtszellen beeinträchtigen. Iremycin bildet wie andere Anthracycline mit Kalbsthymus-DNA Komplexe in vitro, was darauf schließen läßt, daß mit der im Iremycin vorliegenden Strukturveränderung (Aminozucker am C-10 anstatt am C-7 gebunden) nicht gleichzeitig auch das Komplexbildungsvermögen mit der DNA verlorgen gegangen ist. Um so überraschender ist der Befund, wonach Iremycin im Vergleich zu anderen Anthracyclinen (z. B. Violamycine, Carminomycine) eine mehr als 7fach geringere, akute Toxizität (LDs₀) bei der Maus verursacht. Es kann angenommen werden, daß die verringerte Toxizität des Iremycin mit seiner besonderen Struktur zusammenhängt. Iremycin kann daher als ein bisher nicht verfügbares Anthracyclin-Antibioticum angesehen werden, dessen biologische Wirkung, insbesondere verringerte Toxizität, eine potentielle Anwendung als Chemotherapeuticum gegen Tumor-, Virus- und durch Bakterien hervorgerufene Erkrankungen bei Mensch und Nutztier ermöglichen

Die folgenden Beispiele dienen dazu, die Erfindung zu erläutern, ohne sie hierauf zu beschränken.

Ausführungsbeispiele

1. Zwei 500-ml-Steilbrustflaschen enthalten je 80ml des folgenden Vorzuchtmediums:

Glucose 1,5%

Sojamehl 1,5%

Na-Chlorid 0,5%

Ca-Karbonat 0,1 %

primäres K-Phosphat 0,03 %

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min. bei 110⁰C. Acidität nach Sterilisation liegt bei pH 6,3. Jede Steilbrustflasche wird mit einer Sporen- oder Mycelsuspension des Iremycin-Bildners IMET 43615 beimpft, welche mit steriler, isotonischer Kochsalzlösung von einer im Reagenzglas auf folgendem Anzucht-Nährboden gezüchteten, 10 bis 14 Tage alten Kultur des Iremycin-Bildners hergestellt wird:

Hafermehl 1,0%

Haferflocken, gemahlen 1,0%

Agar-Agar 2,0%

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min. bei 120X, natursauer.

Die beimpften Vorzuchtkulturen werden 48 Std. bei 28°C auf einem Schüttelgerät mit einer Frequenz von 180 U/min bebrütet. 8 ml einer so bebrüteten Vorzuchtkultur dienen zur Beimpfung von 500-ml-Steilbrustflaschen, die je 80 ml des folgenden Produktionsmediums enthalten:

Glucose 2,0%

Sojamehl 2,0%

Na-Chlorid 0,5%

Ca-Karbonat 0,3%

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min. bei 115°C. Die Acidität beträgt nach Sterilisation pH 6,3. Die Temperatur während der Fermentation liegt bei 28⁰C und die Schüttelfrequenz bei 180U/min.

Nach 96stündiger Fermentation wird der höchste Gehalt an Rohprodukt A 43615 in der Kulturlösung erreicht (150 Mg/ml). Die Aktivitätsbestimmung erfolgt mit Hilfe bekannter mikrobiologischer Agardiffusions-Testverfahren (BIP-Testverfahren: Fleck, W., 1968. Z. AIIg. Mikrobiol., 8,139).

2. Man verfährt wie im Beispiel 1 mit dem Unterschied, daß das Produktionsmedium folgende Zusammensetzung hat:

Glukose 3%

Sojamehl 3%

Na-Chlorid 0,3%

Ca-Karbonat 0,3%

in Leitungswasser

Sterilisation: 35 Min. bei 115°C. Die Acidität liegt nach dem Sterilisieren bei pH 6,2. Der höchste Gehalt an Iremycin (Reinprodukt) wird nach 96stündiger Fermentation erreicht (43g/m³).

3. Mit einer Kultur des Iremycin-Bildners von einem festen Nährboden wie in Beispiel 1 beschrieben, beimpft man 80 ml des in Beispiel 1 angeführten flüssigen Vorzucht-Mediums, welches in einer 500 ml-Steilbrustflasche enthalten ist. Man bebrütet 48Std. bei 28°C auf einem Schüttelgerät mit einer Schüttelfrequenz von 180U/Min. 12 ml der so erhaltenen Kulturbrühe dienen zur Beimpfung von 400 ml des gleichen Vorzucht-Mediums, welches in einem 2-l-Glaskolben enthalten ist. Man bebrütet weitere 24Std. bei 28⁰C bei einer Schüttelfrequenz von 180U/Min., ehe die so erhaltenen 400 ml Kulturbrühe zur Beimpfung von 2Ol des im Beispiel 1 beschriebenen Produktions-Mediums dienen. Letzteres ist in einem 32-l-Glasfermenter enthalten. Während der Fermentation, die mit einer Rührgeschwindigkeit von 400 U/Min, und mit einer Luftzufuhr von 151/Min. ausgeführt wird, kann die Schaumbildung durch Zusatz kleiner Mengen von Sonnenblumenöl oder anderer, silikonhaltiger Schaumschutzmittel kontrolliert werden. 601 auf diese Weise gewonnene Kulturlösung werden mit Salzsäure

auf pH 4,0 eingestellt und nach Separieren des Mycels werden 5,7 kg Mycel und 451 Kulturfiltrat erhalten. Danach werden die 451 Kulturfiltrat mit Natronlauge auf pH 7,5 eingestellt und mit 3Ol Butanol ausgerührt. Der so erhaltene Butanolextraktwird anschließend bis zum Farbumschlag mit Salzsäure angesäuert und im Vakuum auf V» des Ausgangsvolumens eingeengt. Aus dem Endkonzentrat läßt sich unter Zufügen des 3fachen Volumens an Petroläther das Rohprodukt A 43 615 ausfällen, mit Petroläther waschen und unter vermindertem Druck im Exsikkator über konz. Schwefelsäure trocknen. Die Ausbeute an Rohprodukt A 43615 beträgt 125g.

Von 5,7 kg Mycel werden mit 201 Methanol ein erster und zweiter Extrakt hergestellt, wobei vor der 2. Extraktion dem Methanol 300 ml Salzsäure (1:1 mit Wasser verdünnt) zugesetzt werden. Die erhaltenen Methanolextrakte werden filtriert, mit Natronlauge auf pH 6,0 eingestellt, vereinigt und im Vakuum eingeengt. Das wäßrige Methanolextrakt-Konzentrat des Mycels wird bei pH 7 bis pH 9 mit Butanol erschöpfend extrahiert, wobei für 51 des Mycelextrakt-Konzentrates 51 Wasser und 51 Butanol eingesetzt werden. Nach Abtrennen der die Pigmente enthaltenden Butanol-Phase wird letztere mit Salzsäure wieder angesäuert, nachfolgend wird konzentriert, mit Petroläther ausgefällt, gewaschen und im Vakuum über konz. Schwefelsäure getrocknet. Die Ausbeute an Rohprodukt A 43615 beträgt 4,5g.

4. 10g Rohprodukt A 43615 werden in 100ml Methanol suspendiert und nach Istündigem Rühren wird die Lösung vom unlöslichen Rückstand abfiltriert. Das Filtrat wird im Vakuum bis fast zur Trockne eingeengt, nachfolgend in 100 ml Wasser gelöst, mit Natriumbikarbonat auf pH 8)0 eingestellt und die wäßrige Phase mit Methylenchlorid erschöpfend extrahiert. Danach wird die Methylenchlorid-Phase mit Wasser ausgeschüttelt, über Natriumsulfat (wasserfrei) getrocknet, abfiltriert und unter vermindertem Druck bei 2O⁰C zur Trockne eingeengt. Man erhält 350 mg Iremycin-Rohprodukt. Zur Reinigung des Iremycin-Rohproduktes wird letzteres in Methylenchlorid aufgenommen und durch wiederholte Chromatographie mit Chloroform/Methanol/Essigsäure/Wasser (35:15:2:1) an Kieselgel (0,2 bis 0,5mm; Merck Darmstadt, BRD) von noch vorhandenen Begleitkomponenten getrennt und aus Chloroform/Petroläther in reiner Ferm isoliert. Die Ausbeute beträgt 190 mg Iremycin. Das entspricht einer Ausbeute von 43g reines Iremycin/m³ Fermentationsflüssigkeit.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung eines Anthracyclin-Antibioticums sowie seines Aglykons durch Fermentation unter aeroben und sterilen Bedingungen in flüssigen Nährmedien, die eine Kohlenstoff- und Stickstoffquelle sowie Mineralsalze enthalten und Isolierung der Zielsubstanz sowohl aus dem Mycel als auch dem Kulturfiltrat mit üblichen Methoden, gekennzeichnet dadurch, daß man

- den neuen Mikroorganismus Streptomyces violaceus subsp. iremyceticus IMET 43615 bei einer Temperatur zwischen 25°C und 37°C während eines Zeitraumes von 2 bis 6 Tagen kultiviert sowie

- das gebildete Antibioticum Iremycin bei einer Acidität zwischen pH 3 und pH 9 extrahiert, konzentriert sowie ausfällt und chromatographisch reinigt oder durch anorganische bzw. organische Säuren in seine Salze überführt und/oder durch Säurehydrolyse in sein Aglykon umwandelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man

- bei einer Temperatur von 28°C während eines Zeitraumes von 4 Tagen kultiviert sowie

- bei einer Acidität von pH 5,0 extrahiert und konzentriert.