DE2821948C3

DE2821948C3 - Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 und ihre Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen

Info

Publication number: DE2821948C3
Application number: DE2821948A
Authority: DE
Inventors: Ryo Machida Tokyo Okachi; Kunikatsu Mashida Tokyo Shirahata
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1977-05-19
Filing date: 1978-05-19
Publication date: 1981-08-27
Also published as: US4310661A; GB1593130A; US4298690A; DE2821948A1; DE2821948B2; FR2391222A1; FR2391222B1

Description

mit folgender Bedeutung und Zuordnung der Substituenten R¹ und R²

XK-62-3
XK-62-4

R'

Wasserstoff
Methyl

Methyl
Wasserstoff

sowie deren Salze mit Säuren.

2. Verfahren zur Gewinnung der Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Micromonospora sagameinsis var. nonreducans NRRL 11101 in einem Nährmedium züchtet und die aktiven Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-3 bzw. XK-62-4 nach üblichen Verfahren aus der Kulturflüssigkeit abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einem neutralen pH-Wert 2 bis 15 Tage bei 25 bis 40°C durchführt.

4. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen.

Die Erfindung betrifft die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände.

Nach Antibiotika mit einem breiten Wirkungsspektrum gegenüber Bakterien besteht ständig ein großer Bedarf. Es ist festgestellt worden, daß bestimmte Stämme von Micromonospora bei Züchtung in einem Nährmedium verschiedene Antibiotika in der Kulturflüssigkeit bilden. So wurde das Antibiotikum XK-62-2 aus der Kulturflüssigkeit von Micromonospora sagamiensis MK-65, ATCC 21826 (FERM-P 1530) und Micromonospora sagameinsis var. nonreducans MK-62, ATCC 21803 (FERM-P 1477) isoliert; vgl. DE-OS 26 781.

Dieses Antibiotikum weist folgende Strukturformel auf. „

wähnten DE-OS erläutert

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß ein neuer Mutantenstamm von Micromonospora sagamiensis bei der Züchtung zusätzlich zu XK-62-2 zwei weitere Wirkstoffe freisetzt Aufgrund der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften dieser Wirkstoffe ergibt sich, daß es sich dabei um neue Antibiotika handelt die mit XK-62-3 und XK-62-4 bezeichnet werden.

ι ο Die Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 der im Patentanspruch 1 aufgeführten allgemeinen Formel I werden hergestellt, indem man den in Anspruch 2 genrnnten Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der zur Bildung von einem oder beiden Antibiotika in der Lage ist in einem Nährmedium züchtet bis sich in der Kulturflüssigkeit eine wesentliche antibakterielle Aktivität nachweisen läßt Nach beendeter Züchtung werden die· aktiven Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-3 bzw. XK-62-4 nach üblichen Verfahren aus der Kulturflüssigkeit abgetrennt, beispielsweise durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz.

XK-62-3 und XK-62-4 weisen ein breites antibakterielles Wirkungsspektrum auf und sind daher unter anderem zur Reinigung und Sterilisation von Glasgeraten im Laboratorium und von chirurgischen Instrumenten geeignet Ferner können sie zusammen mit Seifen, Waschmitteln und Waschflüssigkeiten für hygienische Zwecke verwendet werden. Ferner weisen diese Verbindungen wertvolle therapeutische Eigenschaften bei verschiedenen durch Bakterien verursachten Infektionen auf.

Die Erfindung betrifft auch Salze von XK-62-3 und XK-62-4 mit Säuren, insbesondere die pharmakologisch verträglichen Salze. Beispiele dafür sind Salze mit Mineralsäuren, wie Hydrochloride, Hydrobromide, Hydrojodide, Sulfate, Sulfamate und Phosphate, und Salze mit organischen Säuren, wie Maleate, Acetate, Citrate, Oxalate, Succinate, Benzoate, Tartrate, Fumarate, Malate, Mandelate und Ascorbate.

Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften der freien Base des Antibiotikums XK-62-3 zusammengestellt:

CH₂NHCH₃

NHCH₃

NH₂

Die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften dieses Antibiotikums sind in der vorer-

(1) Es handelt sich um ein weißes, basisch reagierendes Pulver.

(2) Elementaranalyse:

C = 49,77%, H = 9,02%, N = 14,26%.

(3) F. 95 bis 103° C.

(4) Das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung von XK-62-3 zeigt zwischen 220 und 360 nm keine charakteristischen Absorptionsmaxima sondern nur eine terminale Absorption.

(5) Spezifische Drehung

[(X]V = +182° (C= 0,5, H₂O).

(6) IR-Absorptionsspektrum (KBr-Preßling):

Die freie Base von XK-62-3- zeigt folgende Absorptionsmaxima:

3330, 2920, 1590, 1450, 1360, 1040 und 1020 cm-'.

(7) Farbreaktionen:

Ninhydrin-Reaktion: positiv

Kaliumpermanganat-Reaktion: positiv
lilson-Morgan's-Reaktion: negativ

Biuret-Reaktion: negativ

(8) Bei der Messung des PMR-Spektrums von XK-62-3 in Deuteriumoxidlösung (pD=10,2) unter Verwendung eines JEOL JNM-PS-100-Geräts ergeben sich folgende Werte:

δ (ppm) 1,21 (3 H, s), 0,8-1,95 (6 H, m), 1,95-3,05 (6 H, m), 2,34 (3 H, s), 2,54 (3 H, s), 3,05 bis 4,20 (7 H, m), 5,06 (IH, d, J =4), 5,20 (lH,d,J=4).

(9) Bei der Messung des CMR-Spektrums von XK-62-3 in Deuteriumoxidlösung (pD = 11,0) unter Verwendung eines JEOL-PFT-IOOA-Geräts ergeben sich folgende Werte:
ö(ppm) 102,4, 101,1, 87,4, 85,8, 75,4, 73,3, 71,7,

70,2, 68,5, 64,2, 57,9, 51,4, 50,6, 45,8, 37,8, 32m8, 32,6, 28,2, 26,8, 22,5.

(10) Das Massenspektrum von XK-62-3 zeigt das folgende M + l-Ion und die folgenden Ionenfragmente (die in Klammern angegebenen Summenformeln sind durch hochauflösende Massenspektrometrie erhalten):

m/e 464 M +1 (C₂₀H₄₂N₅O₇), 446 (C₂₀H₃₈N₄O₇)-388(C₁₇H₃₄N₅O₅), 364 (C₁₅H₃₀N₃O₇), 346(C₁₅H₂₈N₃O₆), 336 (C₁₄H₃₀N₃O₆), 333 (C₁₄H₂₉N₄Os), 318 (C₁₄H₂₈N₃O₅), 289 (Ci₃H₂₅N₂O₅), 272 (C₁₃H₂₆N₃O₃), 205 (C₈H₁₇N₂O₄), 177 (C₇H₁₇N₂O₃), 160 (C₇H₁₄NO₃), 129 (C₆H₁₃NO₂).

Aus den vorstehenden Werten läßt sich ein Molekulargewicht von 463 und die Summenformel C₂OH₄₁N₅O₇ ableiten. Aus der Summenformel lassen sich folgende Werte für die Elementaranalyse (mit 1 Mol H₂O hydratisiert) errechnen:

C=49,88%, H = 9,00%, N = 14,54%.

(11) Somit kommt dem Antibiotikum XK-62-3 die nachstehende Strukturformel zu.

CH₂NH₂

NHCH,

HO I C

O NA/OH

OH _/Λθ^/

NH₂

H₃CNH

(6) Das IR-Absorptionsspektrum (KBr-Preßling) der freien Base von XK-62-4 zeigt folgende Absorptionsmaxima:

3350, 2920, 1570, 1460, 1340, 1050 und 1020 cm-'.

(7) Farbreaktionen:

Ninhydrin-Reaktion: positiv

Kaliumpermanganat-Reaktion: positiv Elson-Morgan's-Reaktion: negativ

Biuret-Reaktion: negativ

(8) Bei der Messung des PMR-Spektrums von XK-62-4 in Deuteriumoxidlösung (pD = 10,3) unter Verwendung eines JEOL-JUM-PS-100-Geräts ergeben sich folgende Werte:

δ (ppm) Ul (3 H,s),0,8-2,10(6 H,m),2,24(6 H,s), 2,35-2,68 (3 H, m), 2,34 (3 H, s), 2,68 bis 3,05 (3 H, m), 3,05-4,20 (7 H, m), 5,07 (1 H, d, J=4), 5,17 (IH, d, J=4).

(9) Bei der Messung des CMR-Spektrums von XK-62-4 in Deuteriumoxidlösung (pD=10,5) unter Verwendung eines JEOL-PET-lOOA-Geräts ergeben sich folgende Werte:

δ (ppm) 101,2, 101,2, 87,6, 87,4, 75,1, 73,2, 70,1, 68,5,

67.6, 64,2, 63,8, 51,6, 50,6, 50,4, 45,7, 45,7,

37.7, 36,4, 29,3, 26,5, 22,4.

(10) Das Massenspektrum von XK-62-4 zeigt das folgende Molekülion und die folgenden Ionenfragmente (die in Klammern angegebenen Summenformeln sind durch hochauflösende Massenspektromutrie erhalten):

m/e 477 M (C₂₁H₄₃N₅O₇), 460 (C₂₁H₄₀N₄O₇), 360 (C₁₆H₃₂N₄O₅), 350 (C₁₄H₂₈N₃O₇), 347 (C₁₅H₃₁N₄O₅), 322 (C₁₃H₂₈N₃O₆), 304 (C₁₃H₂₆N₃O₅), 286 (C₁₄H₂₈N₃O₃), 160 (C₇H₁₄NO₃), 157 (C₈H₁₇N₂O).

Aus den vorstehenden Werten ergibt sich ein Molekulargewicht von 477 und die Summenformel C₂₁H₄₃N₅O₇. Die berechneten Werte für die Elementaranalyse (hydratisiert mit Ui Mol H₂O) sind

40

45 C=51,83%, H =

= 14,39%.

(12) Die freie Base von XK-62-3 ist in Wasser stark löslich, löslich in Methanol und geringfügig löslich in Ethanol und Aceton und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Essigsäureethylester, Essigsäurebutylester, Diethylether, Butanol, Petrolether und n-Hexan.

Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften der freien Base des Antibiotikums XK-62-4 angegeben:

(1) Es handelt sich um ein weißes, basisch reagierendes Pulver.

(2) Elementaranalyse: C=51,61%, H =9,28%, N = 14,18%.

(3) F. 101 bis 112°C.

(4) Das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung von XK-62-4 zeigt zwischen 220 und 360 nm keine charakteristischen Absorptionsmaxi- 1,5 ma, sondern nur eine terminale Absorption.

(5) Spezifische Drehung:
[λ]?,⁵ = 143° (C= 0,5; H₂O).

(11) Aufgrund der vorstehenden physikochemischen Eigenschaften kommt dem Antibiotikum XK-62-4 folgende Strukturformel zu.

CH₂N(CHj)₂ NHCH₃

HO I CH₃

YVoh oh Ao'

NH,

Η,Ν

NH,

(12) Die freie Base von XK-62-4 ist stark löslich in Wasser, löslich in Methanol und geringfügig löslich in Ethanol und Aceton und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Essigsäureethylester, Essigsäurebutylester, Diethylether, Butanol, Petrolether und n-Hexan.

Die Rf-Werte von XK-62-3 und XK-62-4 bei Papier- und Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von verschiedenen Laufmitteln sind in den Tabellen I b III zusammengestellt. Zu Vergleichszwecken sind die Rf-Werte von mit XK-62-3 und XK-62-4 verwandten Antibiotika angegeben.

	Tabelle r	28 2	bei	Rf-Wert	und Methanol (1:1	1	948	6	Tabelle III·	Verwendung der Chloroform, Me--	bei Raumtempe-
5	R_f-Werte von XK-62-3 und XK-62-4						thanol und 1 Wo (Gew7Ge\*.} wäßrigem Ammoniak (2 : i rl Volumteile) als Laufmittel und Whatman Nr.
Papierchromatographie (bei 28° C)		0,67			t-Papier (nach 1-Zstündiger Laufzeit	Rf Wert
LaufmMtef Rf-Wert	bei aufsteigender	0;7t			ratur)	0,02
ΧΚ.-62-j		0,74	5	Rf-Werte von verschiedenen Antibiotika bei aufstei	Antibiotikum:	ODO
	Rr-Wert Lauf zeit,	0,80		gender Papierchromatographie unter unteren Phase eines Gemisches- aus	Streptomycin A	osn
	XlC-62-4 Std.	σ,75		Streptomycin R	ο,οσ
2S9fe Ammoniumchforitf QM-		0,74		BlueBsomycin	OiW
Mit Wasser gesäugtes OjDft η Rtttannl		078	Hl	Ribostamycin	0,02
Il'DUlallUl	0.96 3"	0,71		Lividomycin Α	0,45
n-ButanoI+EssigsäuFe 0,05	0,0fr t5	0,71		Ι Jvidbmy ein B Hygromycin B- Lividbmycin D	0,01
+ Wasser		0,71	15	Spectmomycin	0,00-
(J:t:tVohimteile>	0,65 15	0,06		Kasugamycin
Mit Wasser gesättigter 0,00 Essigsaures thylester		0,10		Butirosin A	0,00
MFt Wasser gesättigtes 0,10		037	20		0,00
n-ButanoI mit einem- Ge	0,00 4	0,62		tjutirosine β Gentamicin. A-	0,18
halt an 2% (GevrJWoiy	0,10 15	0,40		Gentarrfcin B	049
p-Toluolsulfonsäure und		0,37		Gentamicin d_a	038
2% (GewyVol.) Piperidin		0,58	25	Gentamicin Ci	0;t8
		0,06-0,16		Gentamicin Cj	0,00
		0,16		Sisomicin	0,01
		0,18		Neomycin A	0,00
Tabelle II		*) Laufmittel '·! Obere Phase eines Gemisches aus Chloro	30	Neomycin B Antibiotic Nr. 46Ο	0,02
		form, Methf'nol und 17% (GewVGew.) wäßrigem Ammo niak (2:1:' Volumteile).		Neomycin-C	0,01
	Laufmittel l\: 10% Ammoniumacetat		KanamyehvÄ	0,02
	Volumteile).		Kanamycin E	0,00
R₁-Werte bei der Dünnsehichtchromatographie an	35	Kanamycine	0,01
KieselgelJ^nacfr 3stündiger Laufzeit Raumtemperatur^		Paromomycin	0,02
*Laufmittel} Antibiotikum**		Nebramycin Komplex	0,02
	40	Tobramycin	0,01
t XK-62-3		Apramycin	0,00
I XK-62-4		Nebramycin Faktor 4	0,00
I Fortimicin A		Nebramycin Faktor 5	0,00
I Fortimicin B	45	Myomycin	0,01
I Fortimicin C		Seldomycin Faktor t	0,00
I Fortimicin D		Seldomycin Faktor 2	0,09
I Fortimicin KE		Seldomycin Faktor 3	0,49
I Gentamicin Komplex	50	Seldomycin Faktor 5	0,65
I Gentamicin Ci₈		XK-62-2	037
I Sisomicin		Fortimicin B	0,18
II XK-62-3		Fortimicin A	0,18
II XK-62-4		Fortimicin C	0,59
U Fortimicin A	55	Fortimicin D	0,40
II Fortimicin B		Fortimicin KE	0,70
Ih Fortimicin C		XK-62-3	Die Tabelle IV erläutert die antibakteriellen Wir
II Fortimicin D		XK-62-4	kungsspektren von XK-62-3 und XK-62-4 gegen ver
II Fortimicin KE	60	schiedene Mikroorganismen.
II Gentamicin Komplex
II Gentamicin Ct_a
II Sisomicin
65

Tabelle IV	y/m!, gemessen nach beim pH-Wert 8,0	XK-62-4 y/ml
Minimale Hemmkonzentration, der Agar-Verdünnungsmethode	XK-62-3 y/ml	< 0,0011
Mikroorganismus	< 0,0011	0,0021
Bacillus subtilis No. 10 707	0,0021	0,0082
Staphylococcus aureus ATCC 6538 P	0,0082	0,066
Klebsieila pneumoniae ATCC 10 031	0,066	0,033
Klebsiella pneumoniae KY 4261	0,066	0,066
Escherichia coli ATCC 26	0,066
Escherichia coli KY 8310	0,066
Escherichia coli KY 8327

(resistent gegen Kanamycin, Gentamicin und Tobramycin, ANT (2"))¹)

Escherichia coli KY 8332 (resistent gegen Kanamycin,

0,033

Escherichia coli KY 8348 (resistent gegen Getamicin, AAC(3)-1)3)

Escherichia coli KY 8356

Pseudomonas aeruginosa BMH No. 1

Pseudomonas aeruginosa KY 8563 (resistent gegen Gentamicin, AAC(S)-II)⁴)

Pseudomonas aeruginosa KY 8511 (resistent gegen Gentamicin, AAC(3)-I)3)

Pseudomonas aeruginosa Z 444 (resistent gegen Gentamicin, AAC(6')-III)5)

Pseudomonas aeruginosa Z 445 (resistent gegen Gentamicin, AAC(6')-1H)⁵)

0,033

0,26 0,26

0,25 0,26 >10

Proteus vulgaris ATCC 6897	0,26	0,13
Shigella sonnei ATCC 9290	0,13	0,066
Saimoneiia typhosa	0,033	0,011
ATCC 9992
Serratia marcescens KY 4248	1,52	03
Providencia sp. KY 8464	1,04	—

¹I ΑΝΤΪ2"): resistenter Stamm durch 2"-Adenylierung.

²) AAC(6')-I: resistenter Stamm durch 6'-N-AcetyIierung

σγρ)

³) ACC(3)-1: resistenter Stamm d rch 3-N-AcetyIierung

σνρ)

^A) AAQ3)-H: resistenter Stamm durch 3-N-AcetyIierung

(Typ II).
⁵) AÄC(6')-1II: resistenter Stamm durch 6'-N-AcetyIierung (Typ IH).

Die LD₃₀-Werte (mg/kg) von XK-62-3 und XK-62-4 bei dd-Mäusen mit einem Körpergewicht von 20 ±1 g betragen 106 bzw. 255 mg/kg. Aus den vorstehenden Werten ergibt sich, daß die Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 eine sehr starke antibakterielle Wirkung gegenüber den verschiedensten gram-positiven und gram-negativen Bakterien aufwei-■j sen. Die Verbindungen der Erfindung sind besonders wirksam gegen Mikroorganismen der Gattungen Proteus und Pseudomonas, gegen die nur wenige der bisher bekannten Antibiotika wirken. Ferner weist XK-62-3 eine starke antibakterielle Aktivität gegen bestimmte

in Stämme von Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa auf, die gegenüber verschiedenen herkömmlichen Antibiotika resistent sind. Insbesondere wirkt dieses Antibiotikum gegen bestimmte resistente Stämme, deren Inaktivierungsmechanismus beispielsweise durch 3-N-Acetylierung oder 2"-Adenylierung vor sich geht. Somit ist XK-62-3 Antibiotika wie Gentamicin, Sagamicin (Antibiotikum XK-62-2) und Kanamycin überlegen, die gegenüber bestimmten resistenten Stämmen unwirksam sind, die eine Inaktivierung, beispielsweise durch 3-N-Acetylierung oder 2"-Adenylierung, hervorrufen.

XK-62-4 zeigt eine starke antibakterielle Aktivität gegen bestimmte Stämme von Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa, die gegenüber verschiedener herkömmlichen Antibiotika resistent sind. Ferner isl diese Verbindung wirksam gegen bestimmte resistente Stämme, die eine Inaktivierung dieser Verbindunger _ durch bestimmte Mechanismen, beispielsweise durch

6'-N-Acetylierung, hervorrufen. Somit ist XK-62-4 bekannten Antibiotika, wie Sisomicin, Dibekacin (3,4-Didesoxy-kanamycin B) und Kanamycin A. überlegen

~~ die gegenüber bestimmten, resistenten Stämmen, die

0,26 beispielsweise eine Inaktivierung durch 6'-N-Acetylie-

rung hervorrufen, unwirksam sind.

Nachstehend werden XK-62-3 und bekannte Antibiotika miteinander verglichen. Es sind folgende wasserlöslichen, basisch reagierenden Antibiotika, di« durch Mikroorganismen der Gattung Micromonospon gebildet werden und ein breites antibakterielles Wir kungsspektrum aufweisen, bekannt: Gentamicin-Kom plex (vgl. M. J. Weinstein und Mitarb., Antimicrobia Agents and Chemotherapy, 1963, S. 1; D. J. Cooper unc Mitarb. J. Infect. Dis. Bd. 119 (1969), S. 342; und J. A Waitz und Mitarb., Antimicrobial Agents and Chemo therapy, Bd. 2 (1972), S. 464), Antibiotikum Nr. 460 (vgl JA-AS 46-16 153), Sisomicin (vgl. M. J. Weinstein um Mitarb, J. Antibiotics, Bd. 23 (1970), S. 551, 555 und 559] XK-62-2 (vgl. DE-OS 23 26 781), Fortimicin B (vgl DE-OS 24 18 349), Fortimicin A (vgL DE-OS 24 35 160] Fortimicin C (vgl. DE-OS 26 33 508) und Fortimicin E und KE (vgl. DE-OS 27 48 530).

Aus den in Tabelle IiI zusammengestellter. R,-Wer ten bei der Papierchromatographie ergibt sich jedoch daß sich XK-62-3 und XK-62-4 von den genannten be kannten Antibiotika unterscheiden.

Ferner lassen sich als wasserlösliche, basisch reagie rende Antibiotika, die durch Actinomyceten außerhalt der Gattung Micromonospora hergestellt werden unc ein breites antibakterielles Wirkungsspektrum aufwei sen, folgende Antibiotika erwähnen: Streptomycin / und B, Ribostamycin, Lividomycin A, B und D, Neo mycin A, B und C, Kanamycin A, B und C, Nebramycin Komplex, Nebramycin-Faktoren 4 und 5 und Paromo mycin. XK-62-3 und XK-62-4 unterscheiden sich voi diesen Antibiotika stark in ihren physikochemischei Eigenschaften. Außerdem ergibt sich aus Tabelle IH daß auch die Rf-Werte bei der Papierchromatographi« stark unterschiedlich sind

>

0,26

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung der Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 verwendete .Stamm von Micromonospora sagamiensis var. nonreducans erhielt die Hinterlegungsnummern NRRL 11 101 und FERM-P 3962. Bei beiden genannten Hinterlegungsstellen wurde der Stamm als Micromonospora sagamiensis KY 11 504 bezeichnet.

Dieser Stamm wurde durch γ-Bestrahlung von Micromonospora sagamiensis var. nonreducans MK-62-NG-164, ATCC 21 949 (vgl. DE-OS 23 26 781) erhalten. Morphologisch zeigt dieser Stamm die gleichen Eigenschaften wie der Ausgangsstamm, mit der Ausnahme, daß visuell die Sporenbildung bei der Mutante etwas geringer zu sein scheint.

Im erfindungsgemäßen Verfahren können herkömmliche Verfahren zur Züchtung von A.ctinomyceten angewendet werden. Das Züchtungsmedium kann verschiedene Nährstoffquellen enthalten. Beispiele für entsprechende Kohlenstoffquellen sind Glucose, Stärke, Mannose, Dextrin, Fructose, Saccharose und/oder Melassen. Je nach der Assimilationsfähigkeit der Mikroorganismen können auch Kohlenwasserstoffe, Alkohole, organische Säuren und dergl. angewendet werden. Beispiele für anorganische und organische Stickstoffquellen sind Ammoniumchiorid, Ammoniumsulfat, Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, die entweder allein oder in Kombination verwendet werden können. Ferner können natürliche Stickstoffquellen eingesetzt werden, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl, Casaminsäure und lösliches Pflanzenprotein. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumcarbonat und Phosphate, dem Medium zugesetzt werden. Ferner können auch organische und anorganische Produkte, die das Wachstum des speziellen Stamms und die Bildung von XK-62-3 und/ode- XK-62-4 fördern, zugesetzt werden.

Es können beliebige Züchtungsverfahren angewendet werden. Besonders bevorzugt ist ein Submersverfahren unter Rühren. Die Züchtungstemperatur beträgt vorzugsweise 25 bis 40⁰C. Die Züchtung wird vorzugsweise bei einem pH-Wert um den Neutralpunkt durchgeführt. Im allgemeinen reichern sich XK-62-3 und/ oder XK-62-4 nach 2- bis 15tägiger Züchtung im flüssigen Medium an. Nach Erreichen der maximalen Antibiotikaausbeute in der Kulturflüssigkeit wird die Züchtung abgebrochen und das gewünschte Produkt aus der Kulturflüssigkeit nach Abtrennen der Mikroorganismenzellen, beispielsweise durch Filtrieren, isoliert und gereinigt.

Die Isolierung und Reinigung von XK-62-3 und XK-62-4 kann nach üblichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von mikrobiellen Stoffwechselprodukten aus Kulturflüssigkeiten vorgenommen werden.

Da es sich bei den Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 um basisch reagierende Verbindungen handelt, die in Wasser leicht löslich, aber in üblichen organischen Lösungsmitteln schwer löslich sind, lassen sich diese Antibiotika nach den üblichen Verfahren zur Reinigung von sogenannten wasserlöslichen, basisch reagierenden Antibiotika reinigen. Insbesondere lassen sich XK-62-3 und XK-62-4 durch eine entsprechende Kombination an Adsorptions- und Desorptionsstufen von Kationenaustauscherharzen, Säulenchromatographie an Cellulose, Adsoprtion und Desorption an mit dreidimensional vernetzten! Dextragel (Sephadex® LH-20) und Säulenchromatographie an Kieselgel reinigen. Ein entsprechendes Verfahren zur Aufarbeitung der Kulturflüssigkeit, die nach Züchtung eines entsprechenden Mikroorganismenstamms erhalten worden ist und die XK-62-2, XK-62-3 und XK-62-4 sowie Nebenprodukte mit antibakterieller Aktivität enthält, ist nachstehend ^ri angegeben. Das zellfreie Kulturfiltrat wird auf einen schwach alkalischen pH-Wert eingestellt und sodann über ein Kationenaustauscherharz, wie Amberlite® IRC-50 (Ammoniumform), gegeben. Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser wird mit 1 η wäßri-

Ki ger Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird sodann mit einem Anionenaustauscherharz, wie Dowex® 1 χ 2 (OH--Form) behandelt. Die bei der Elution erhaltenen aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird auf einen pH-Wert von etwa 10,5 eingestellt und mit dem 4fachen Volumen Aceton versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert. Das Filtrat wird eingeengt und mit Schwefel-

.'0 säure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt. Sodann wird das 5- bis lOfache Volumen an Methanol zugesetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält ein rohes weißes Pulver mit einem Komplex der ΧΚ-62-Serie.

Dieses rohe Pulver wird in Wasser gelöst und über eine mit einem Kationenaustauscherharz (Amberlite® C-50, Typ I, NH4⁺-Form) gepackte Säule gegeben, wodurch die aktiven Bestandteile adsorbiert werden. Nach Waschen der Säule mit Wasser wird mit verdünnter wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Nach Elution von mehreren Spurenbestandteilen wird XK-62-4 eluiert. Anschließend erhält man bei weiterer Elution XK-62-3 und XK-62-2. Die Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-3 oder XK-62-4 werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man erhält ein weißes rohes Pulver von XK-62-3 bzw. XK-62-4.

Anschließend wird das rohe Pulver der Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Kieselsäure AR (Mallinckrodt Chemical Works) Als Kieselgelprodukt unterworfen. Als Laufmittel wird die obere Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol, Aceton und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung (2:2:2:2:1 Volumteile) bei der Reinigung von XK-62-3 und die obere Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung (2:1 :1 Volumteile) bei der Reinigung von XK-62-4 verwendet. Das erhaltene rohe Pulver wird im Lösungsmittel suspendiert und auf die Säule gegeben. Die Elution wird mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt

Zunächst werden einige Spurenbestandteile und sodann XK-62-3 bzw. XK-62-4 eluiert Die Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-3 bzw. XK-62-4 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft Der Rückstand wird in einer geringen Menge Wasser gelöst und gefriergetrocknet Man erhält gereinigtes XK-62-3 bzw. XK-62-4. .

Bei den vorstehend erläuterten Reinigungsverfahren wird die Anwesenheit von XK-62-3 bzw. XK-62-4 in den Fraktionen durch aufsteigende Papierchromatographie an Whatman-Filterpapier Nr. 1 festgestellt Die Elution wird mit der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (2:1:1 Volumteile) als Laufmittel nach 6- bis 15stündiger Laufzeit bei Raumtemperatur durchgeführt Die Rf-Werte von XK-62-3 und XK-62-4 bei der Papierchromatographie betragen 0,4 bzw. 0,7.

Beispiel 1 A. Züchtung des Stamms KY 11 504

Als Anzuchtstamm wird Micromonospora sagamiensis var. nonreducans KY 11 504, NRRL 11 101. FERM-P Nr. 3962 verwendet. Eine öse dieses Stamms wird auf 30 ml des ersten Anzuchtmediums in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben überimpft. Das erste Anzuchtmedium enthält 1 g/dl Dextrin, 1 g/dl Glucose, 0,5 g/dl Pepton, 0,5 g/dl Hefeextrakt und 0,1 g/dl Calciumcarbonat. Der pH-Wert dieses Mediums vor der Sterilisation beträgt 7,2.

Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 30° C durchgeführt. Anschließend werden 30 ml der Anzuchtkultur auf 300 ml des zweiten Anzuchtmediums in einem 2-Liter-Erlenmeyer-Kolben, der mit Prallplatten versehen ist, überimpft. Das zweite Anzuchtmedium hat die gleiche Zusammensetzung wie das erste Anzuchtmedium. Die zweite Anzuchtkultur wird 2 Tage unter Schütteln bei 3O⁰C durchgeführt. Anschließend werden 1,5 Liter der zweiten Anzuchtkultur (entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben) auf 15 Liter des dritten Anzuchtmediums in einem 30-Liter-Glasfermenter überimpft. Die Zusammensetzung des dritten Anzuchtmediums entspricht dem des ersten Anzuchtmediums.

Die Züchtung im Glasfermenter wird unter Belüftung (15 Liter/min) und Rühren (350 U/min) 2 Tage bei 30° C durchgeführt. 15 Liter der dritten Anzuchtkultur werden auf 150 Liter eines vierten Anzuchtmediums in einem 300-Liter-Fermenter überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Anzuchtmediums entspricht dem des ersten Anzuchtmediums. Die Züchtung im Fermenter wird unter Belüftung (100 Liter/min) und Rühren (150 U/min) 2 Tage bei 30° C durchgeführt. Schließlich werden 150 Liter der vierten Anzuchtkultur auf 1500 Liter eines Fermentationsmediums in einem 3000-Liter-Fermenter überimpft Das Fermentationsmedium enthält 5 g/dl Dextrin, 3,5 g/dl Sojabohnenmehl und 0,7 g/dl CaCO₃. Der pH-Wert dieses Mediums vor der Sterilisation beträgt 7,2. Die Züchtung im Fermenter wird unter Belüftung (500 Liter/min) und Rühren (150 U/min) 5 Tage bei 30⁰C durchgeführt.

B. Isolierung von rohem Komplex der ΧΚ-62-Serie

Nach beendeter Züchtung wird die Kulturflüssigkeit mit 12 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 2,0 eingestellt und 1 Stunde gerührt Anschließend werden etwa 20 kg Filtrierhilfe (Radiolite Nr. 600, Showa Kagaku Kogyo Co, Japan) zugesetzt Das nach dem Abfiltrieren der Mikroorganismenzellen erhaltene Filtrat wird mit 6 η Natriumhydroxkiiösung auf den pH-Wert 8,0 eingestei'it und über eine mit etwa 100 Liter Ionenaustauscherharz (Amberlite* IRC-50, Ammoniumform) gepackte Säule gegeben. Das Eluat wird verworfen. Die aktiven Bestandteile werden am Kunstharz adsorbiert Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser werden die aktiven Bestandteile mit 1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert

Die Aktivität des erhaltenen Eluats gegen Bacillus subtilis Nr. 10 707 wird nach dem Papierscheibenverfahren unter Verwendung einer Agarplatte bestimmt Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 3 Liter eingeengt Das Konzentrat wird mit 6 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 8,0 eingestellt und über eine mit 3 Liter Anionenaustauscherharz (Dowex® 1x2 (OH--

Form) gepackte Säule gegeben. Die Säule wird mil etwa 20 Liter Wasser gewaschen. Auf diese Weise werden die Verunreinigungen entfernt. Die aktiven Bestandteile werden mit 1 η Ammoniak eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf ¹Ao ihres Volumens eingeengt. Das Konzentrat wird mit 6 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 10,5 eingestellt und mit dem 4fachen Volumen Aceton versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert. Die Acetonphase wird auf 2 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird mit 6 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt und mit 10 Liter Methanol versetzt. Nach dem Abkühlen erhält man einen weißen Niederschlag. Dieser Niederschlag wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen unter vermindertem Druck erhält man 250 g eines weißen Pulvers (Sulfat).

C. Isolierung und Reinigung von XK-62-3

200 g des gemäß Stufe B erhaltenen weißen, rohen Pulvers (Sulfat) werden in 500 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 6 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 7,5 eingestellt und über eine mit 10 Liter Kationenaustauscherharz (Amberlite® CG-50, NH₄ ⁺ Form) gepackte Säule gegeben. Das Eluat wird verworfen. Die.aktiven Bestandteile werden am Kunstharz adsorbiert. Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser wird die Elution mit 0,2 η wäßriger Ammoniaklösung durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen von 500 ml abgenommen. Die einzelnen Fraktionen werden nach dem vorstehend erläuterten Papierscheibenverfahren und durch Papierchromatographie auf ihre Aktivität untersucht. Zunächst werden einige Spurenbestandteile mit einem Gehall an XK-62-3. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 50 ml eingedampft. Man erhält 12 g XK-62-3 in Form eines weißen, rohen Pulvers.
Dieses rohe Pulver wird auf eine mit etwa 500 ml Kieselgel (Kieselsäure AR, Mallinckrodt Chemical Works) gepackte Säule der Abmessungen 35 mm mal 60 cm in Form einer dünnen, gleichmäßigen Schicht aufgesetzt. Das Kieselgel ist vorher in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol, Aceton und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung (2:2:2:1 Volumteile) suspendiert und in Form einer festen, gleichmäßigen Schicht in die Säule gepackt worden. Das Kieselgel wird mit dem Lösungsmittelgemisch der vorgenannten Zusammensetzung gewaschen.

Nach dem Aufsetzen des rohen Pulvers wird das Lösungsmittelgemisch der vorgenannten Zusammensetzung allmählich von oben auf die Säule gegossen. Anschließend wird eine kontinuierliche Eiutior. mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 30 ml/Stunde durchgeführt Das Eluat wird in Fraktionen von 20 ml aufgefangen. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchromatographie unter Verwendung von Whatman-Papier Nr. 1 unterworfen, um die eluierten Bestandteile zu untersuchen. Die Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-3 werden vereinigt, und unter vermindertem Druck wird eine ausreichende Menge des Lösungsmittels entfernt

Der Rückstand wird in einer geringen Menge Wasser gelöst Die erhaltene Menge ergibt nach dem Gefriertrocknen 1,5 g eines gereinigten Präparats der freien Base von XK-62-3. Dieses Präparat weist eine Aktivität von etwa 985 Einheiten/mg auf (die Aktivität von 1 mg reinem Präparat entspricht 1000 Einheiten).

D. Isolierung und Reinigung von XK-62-4

200 mg des gemäß den Stufen A und B erhalienen weißen Pulvers (Sulfat) werden in 500 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 6 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 7,5 eingestellt und über eine mit 10 Liter Kationenaustauscherharz (Amberlite® CG-50, NH₄ ⁺ Form) gepackte Säule gegeben. Das Eluat wird verworfen. Die aktiven Bestandteile werden an dem Kunstharz adsorbiert. Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser wird die Elution mit 0,2 η wäßriger Ammoniaklösung durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen von 500 ml aufgefangen. Die Aktivität der einzelnen Fraktionen wird durch das Papierscheibenverfahren durch Papierchromatographie, wie vorstehend erläutert, bestimmt. Zunächst werden einige Spurenbestandteile und anschließend die Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-4 eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 50 ml eingeengt. Das Konzentrat wird gefriergetrocknet. Man erhält 15 g XK-62-4 in Form eines weißen, rohen Pulvers.

Dieses rohe Pulver wird oben auf eine mit 500 ml Kieselgel (Kieselsäure AR Mallinckrodt Chemical Works) gepackte Säule der Abmessungen 35 mm 0 χ 60 cm in Form einer dünnen, gleichmäßigen Schicht aufgesetzt Das Kieselgel ist vorher in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung (2:1 :1 Volumteile) eluiert und in Form einer festen, gleichmäßigen Schicht in die Säule gepackt worden. Das Kieselgel wird mit dem Lösungsmittelgemisch der vorgenannten Zusammensetzung gewaschen.

Nach dem Aufsetzen des rohen Pulvers wird das Lösungsmittelgemisch der vorgenannten Zusammensetzung allmählich auf die Säule aufgesetzt. Anschließend wird eine kontinuierliche Elution mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 30 ml/Stunde durchgeführt Das Eluat wird in Fraktionen von 20 ml abgenommen. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchromatographie an Whatman-Papier Nr. 1 unterworfen, um die eluierten Bestandteile zu untersuchen. Die Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-4 werden vereinigt und unter vermindertem Druck von einer ausreichenden Menge des Lösungsmittels befreit.

Der Rückstand wird in einer geringen Menge Wasser gelöst Nach dem Gefriertrocknen der Lösung erhält man etwa 2,2 g gereinigtes Präparat der freien Base von XK-62-4. Dieses Präparat weist eine Aktivität von etwa 980 Einheiten/mg auf (die Aktivität von 1 mg reinem Präparat entspricht 1000 Einheiten).

Beispiel 2
A. Züchtung des Stamms KY 11 504

Der gleiche Stamm wie in Beispiel 1 wird als Anzuchtstamm verwendet Das Anzuchtmedium, das von der ersten bis zur dritten Anzuchtkultur verwendet wird, enthält 2 g/dl lösliche Stärke, 0,5 g/dl NZ-Amin Typ A, O^ g/dl Hefeextrakt und 0,1 g/dl CaCO₃. Eine öse der Anzuchtkultur wird auf 300 ml des Anzuchtmediums in einem 2-liter-Erlenmeyer-Kolben überimpft Die erste Anzuchtkultur wird 4 Tage unter Schütteln bei 30⁰C durchgeführt Anschließend wird der Inhalt von 3 Kolben der ersten Anzuchtkultur auf 15 Liter eines frischen Anzuchtmediums in einem 30-Liter-Glasfermenter überimpft Die zweite Anzuchtkultur wird 2 Tage bei 30" C unter Belüftung und Rühren durcheeführt

Anschließend werden 15 Liter der zweiten Anzuchtkultur auf einen 300-Liter-Fermenter mit einem Gehalt an 150 Liter Anzuchtmedium übertragen. Die dritte Anzuchtkultur wird 2 Tage bei 30° C unter Belüftung und Rühren durchgeführt.

Sodann werden 150 Liter der dritten Anzuchtkultur auf einen 3000-Liter-Fermenter mit einem Gehalt an 1500 Liter Fermentationsmedium übertragen. Das Fermentationsmedium enthält 4 g/dl lösliche Stärke, 1 g/dl

ίο Maisquellflüssigkeit, 2 g/dl Sojabohnenmehl, 0,05 g/dl K₂HPO₄, 0,05 g/dl MgSO₄ ■ 7 H₂O, 0,03 g/dl KCl, ,0,005 g/dl CoCl₂ · 2 H₂O und 0,1 g/dl CaCO₃. Die Züchtung wird 4 Tage bei 3O⁰C unter Belüftung und Rühren durchgeführt.

B. Isolierung von rohem Komplex der ΧΚ-62-Serie

Nach beendeter Züchtung wird die Kuliurflüssigkeit mit 12 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 2,0 eingestellt und 30 Minuten gerührt Anschließend werden etwa 20 kg Filtrierhilfe (Radiolite Nr. 600, Showa Kagaku Kogyo, Japan) zugesetzt. Das nach dem Abfiltrieren der Mikroorganismenzellen erhaltene Filtrat wird mit 6 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 8,0 eingestellt und über eine mit 100 Liter Kationenaustauscherharz (Amberlite® IRC-50, NH₄+-Form) gepackte Säule gegeben. Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser werden die aktiven Bestandteile mit 1 η wäßriger Ammoniaklösung eluiert Das Eluat wird in Fraktionen abgenommen. Die Aktivität der einzelnen Fraktionen gegen Bacillus subtilis Nr. 10 707 wird nach dem Papierscheibenverfahren unter Verwendung einer Agarplatte bestimmt. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 2 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird mit 6 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt. Die erhaltenen unlöslichen Bestandteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird mit 20 Liter Methanol versetzt, wodurch sich ein weißer Niederschlag bildet. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen unter vermindertem Druck erhält man 500 g eines weißen Pulvers, bei dem es sich um rohe Antibiotika der ΧΚ-62-Serie (Sulfate) handelt

C. Isolierung von XK-62-3

200 g des gemäß Stufe B erhaltenen rohen Pulvers werden gemäß Stufe C von Beispiel 1 isoliert und gereinigt Man erhält 1,1 g gereinigtes XK-62-3 mit einer Aktivität von 970 Einheiten/mg.

D. Isolierung von XK-62-4

200 g gemäß vorstehender Stufe B erhaltenes rohes Pulver werden gemäß Stufe D von Beispiel 1 isoliert und gereinigt. Mail erhält 1,1 g gereinigtes Präparat mit einer Aktivität von 970 Einheiten/mg.

Beispiel 3
Herstellung des Sulfats von XK-62-3

Ig freie Base von XK-62-3 werden in 5 ml Wasser gelöst Anschließend wird die Lösung mit 1,8 ml 6 η Schwefelsäure versetzt Die erhaltene Lösung wird mit 100 ml Methanol versetzt wodurch ein weißer Niederschlag entsteht Dieser weiße Niederschlag wird ab filtriert und mit Methanol gewaschen. Anschließend wird der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet Man erhält Iß g Sulfat von XK-62-3 mit einer Aktivität von etwa 630 Einheiten/mg.

15 16

Beispiel 4 100 ml Methanol versetzt, wodurch ein weißer Nieder-

_, „ ,, ,,,, ,.„ , schlag entsteht Dieser weiße Niederschlag wird ab-

Herstellung des Sulfats von XK-62-4 ^^ _{und mh Methanol gewaschen}. Anschließend

1 g freie Base von XK.-62-4 werden in 5 ml Wasser wird der Niederschlag unter vermindertem Druck gegelöst. Anschließend wird die Lösung mit 1,8 ml 6 η 5 trocknet. Man erhält 1,2 g Sulfat von XK-62-4 mit einer Schwefelsäure versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit Aktivität von etwa 625 Einheiten.

Claims

Patentansprüche:

1. Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 der allgemeinen Formel I

NHCH₃
KO I CH₃

R²NH

NH,