DE3851291T2

DE3851291T2 - Anthracyclin-Antibiotika.

Info

Publication number: DE3851291T2
Application number: DE3851291T
Authority: DE
Inventors: Tomoyuki Ishikura; Osamu Sanraku Hodogayaryo Jodo; Hiroshi Naganawa; Rokuro Okamoto; Tsutomu Sawa; Tomio Takeuchi; Yoshio Watanabe; Akihoro Yoshimoto
Original assignee: Mercian Corp
Current assignee: Mercian Corp
Priority date: 1987-10-06
Filing date: 1988-10-05
Publication date: 1994-12-22
Anticipated expiration: 2008-10-06
Also published as: DE3851291D1; EP0311054A2; EP0639581A1; US4918172A; EP0311054B1; EP0311054A3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Anthracyclin-Antibiotika, welche eine karcinostatische Wirkung aufweisen und welche als ein karcinostatisches Mittel brauchbar sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung der Antibiotika.
Als karcinostatische Anthracyclin-Antibiotika sind bisher Daunomycin (siehe U.S.-Patent 3,616,242) und Adriamycin (siehe U.S.-Patent 3,590,028) bekannt, und diese beiden sind Verbindungen, welche gegenwärtig breiteste Verwendung für den klinischen Gebrauch als ein karcinostatisches chemotherapeutisches Mittel finden. Diese weisen jedoch eine ernsthafte kardiotoxische Wirkung und myelotoxische Wirkung auf, auch wenn sie eine ausgezeichnete karcinostatische Wirkung besitzen. Daher sind diese als karcinostatische Mittel nicht absolut zufriedenstellend. Unter den Umständen ist die Herstellung von Verbindungen, deren schädliche Nebenwirkung verringert und deren karcinostatische Wirkung verbessert ist, erwünscht, und es wurde bereits vorgeschlagen, einige Anthracyclin-Antibiotika mittels eines Fermentätionsverfahrens, eines mikrobiellen Umwandlungsverfahrens und eines chemischen Syntheseverfahrens herzustellen. Spezifische Beispiele bekannter Antibiotika sind etwa Aclacinomycin A und Aclacinomycin B (siehe JP-B-51-34914 - die Bezeichnung "JP-B", wie hier verwendet, bedeutet eine "geprüfte Japanische Patentveröffentlichung"), Rhodomycin-Antibiotika (siehe JP-A-56- 15299 - die Bezeichnung "JP-A", wie hier verwendet, bedeutet eine "ungeprüfte veröffentlichte Japanische Patentanmeldung"), 4'O-Tetrahydropyranyl-adriamycin (siehe JP-B-57-13558), 3'-Deamino-3'-morpholino-daunomycin und 3'-Deamino-3'- morpholino-adriamycin (siehe JP-A-57-163393). Andere Daunomycin- und Adriamycin-Derivate sind beschrieben in Topics in Antibiotics Chemistry, Band 12, Seiten 102 bis 279 (veröffentlicht von Ellis Horwood Limited) und The Chemistry of Antitumor Antibiotics, Band 1, Seiten 63 bis 132 (veröffentlicht von Wiley-Interscience).
Die EP-A-0 063 776 beschreibt Anthracyclinonglycoside, die erhalten wurden, indem ein Trisaccharid (0-α-L-Cinerulosyl-(1 → 4)O-(3-O-acetyl-2-deoxy-α-L-fucosyl)-(1 → 4)-α-L-rhodosamin (3''-O- Acetyl RDC) mit verschiedenen Anthracyclinonverbindungen wie z. B. Aklavinon, Daunomycinon, Adriamycinon und Carminomycinon behandelt wurde, um die Glycosidbindung bei der Position 7 des Aglycons zu bilden und, falls erforderlich, die Realitionsprodukte hydrolysiert wurden. Die EP-A-0 063 776 beschreibt die Verbindungen allgemein, stellt jedoch keine speziellen Substanzen zur Verfügung, die eine extrem starke tumoricide Wirkung im allgemeinen Umfang der Anthracyclinonglycoside aufweisen.
Als ein tumoricides Mittel wurden verschiedene Arten analoger Verbindungen von Anthracyclin- Antibiotika vorgeschlagen, wie oben erwähnt, und einige von ihnen wurden bereits weitgehend für den klinischen Gebrauch angewendet, während einige andere einer klinischen Demonstration unterzogen wurden. Keine sind jedoch sowohl bezuglich der Nicht-Toxizität als auch der karcinostatischen Wirkung zufriedenstellend. Darüber hinaus stehen bei den meisten tumoriciden Mitteln die in-vivo-Testergebnisse und Tierversuchsergebnisse nicht immer direkt mit der karcinosttischen Wirkung bei Karzinomen beim Menschen in Zusammenhang, und daher sind komplexe Studien für tumoricide Substanen erforderlich. Deshalb besteht bezüglich der Anthracyclin-kareinostatischen Mittel, die bis zu einem gewissen Grad als wirksam als ein tumoricides Mittel bewertet wurden, der Wunsch, eine neue Gruppe von Verbindungen zu erhalten, die als ein klinisches Medikament wirksamer sind.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben früher Verfahren zum Herstellen spezifischer neuer Anthracyclin-Antibiotika mit einer ausgezeichneten Wirkung durch mikrobielle Umwandlung verschiedener Anthracyclin-Aglycone mit einem Aclacinomycin-produzierenden Stamm (Streptomyces galilaeus KE 303 (FERM BP-2048) zu veranschaulichen. Siehe zum Beispiel die JP-A-56-15299 (Rhodomycin- Antibiotika) und die JP-A-57-165399 (2-Hydroxyaclacinomycin A).
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Anthracyclin-Antibiotika zur Verfügung zu stellen, die neu sind und die eine starke tumoricide Wirkung aufweisen und die als ein karcinostätisches Mittel brauchbar sind.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung der zuvor erwähnten Antibiotika zur Verfügung zu stellen.
Durch Verwendung verschiedener Anthracycline als ein Umwandlungssubstrat bei der mikrobiellen Umwandlung stellten die Erfinder der vorliegenden Erfindung neue Anthracyclin-Antibiotika her, die zusätzlich einen neutralen Saceharidrest an der Position 4' aufweisen, und erforschten die tumoricide Wirkung der neuen Antibiotika. Als Ergebnis fänden wir Substanzen, die unter den neuen Antibiotika eine extrem starke tumoricide Wirkung aufweisen, und es gelang uns dadurch die vorliegende Erfindung.
Daher ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, neue Anthracyclin-Antibiotika der Formel (I):
worin R¹ eine Hydroxylgruppe, Methoxygruppe ist,
R² eine Hydroxylgruppe ist,
R³ eine Ethylgruppe ist,
R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe ist,
X eine Daunosamin-Rhodinose oder Daunosamin-Deoxyfucose ist, mit der Maßgabe, wenn R¹ und R² Hydroxylgruppen sind, R³ eine Ethylgruppe ist, R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe ist, dann stellt X Daunosamin-Rhodinose oder Daunosamin-Deoxyfucose dar; oder
wenn R¹ eine Methoxygruppe ist, R² eine Hydroxylgruppe ist, R³ eine Ethylgruppc ist, R&sup4; eine Methoxycbrbonylgruppe ist, dann stellt X Daunosamin-Rhodinose oder Daunosazin-Deoxyfucose dar;
sowie pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon zur Verfügung zu stellen.
Weiters wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Anthracyclin-Antibiotika der Formel (I):
in der R¹, R², R³, R&sup4; und X die gleichen Bedeutungen wie oben erwähnt haben, worin eine Verbindung der Formel (II):
in der R¹ und R² Hydroxylgruppen sind, R³ eine Ethylgruppe ist, R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe und X' Daunosamin ist; oder
R¹ eine Methoxygruppe, R² eine Hydroxylgruppe, R³ eine Ethylgruppe, R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe und X' Daunosamin ist;
oder mikrobiell behandelt wird, zur Verfügung gestellt.
Zumindest wird ein karcinostatisches Mittel zur Verfügung gestellt, welches zumindest eines der Anthracyclin-Antibiotika der oben erwähnten Formel (I) enthält.
Die neuen Anthracyclin-Antibiotika der vorliegenden Erfindung sind z. B. folgende Verbindungen:
(Dies wird als CG17A bezeichnet.)
(Dies wird als CG17B bezeichnet.)
(Dies wird als CG19A bezeichnet).
(Dies wird als CG19B bezeichnet.)
Diese Antibiotika sind nicht nur allein als eine tumoricide Substanz, sondern auch als ein Kern zum Herstellen chemischer Derivate in der Form, die eine Saccharidkette oder eine aktive Substanz mit niedrigem Molekulargewicht oder hohem Molekulargewicht, wenn an den Kern gebunden, aufweist, brauchbar.
Die Anthracyclin-Antibiotika der vorliegenden Erfindung werden aus den folgenden Verbindungen als ein Ausgangsmaterial hergestellt. Die Ausgangsmaterialien zum Herstellen der Anthracyclin-Antibiotika der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen wie dargestellt durch die folgende Formel (II):
in der R¹ und R² Hydroxygruppen sind, R³ eine Ethylgruppe ist, R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe und X' Daunosamin (D788-6) ist;
R¹ eine Methoxygruppe ist, R² eine Hydroxylgruppe ist, R³ eine Ethylgruppe ist, R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe und X' Daunosamin (D788-5) ist.
Die Anthracyclinverbindungen der vorliegenden Erfindung werden durch mikrobielle Behandlung der oben erwähnten Anthracyclinverbindungen als ein Ausgangsmaterial hergestellt.
Als ein Stamm Mikroorganismen, der für die Herstellung der Anthracyclinverbindungen der vorliegenden Erfindung zu verwenden ist, kann eine Mutante, die von einem Bodenstamm oder einem bekannten Stamm abgeleitet ist, welcher zu Actinomycetes sp. gehört und welcher eine Fähigkeit zum Produzieren von Aclacinomycinen, Cinerubin oder Rhodomycinen und deren Analoga aufweist, durch mutagene Behandlung mit einem Mutagen wie z. B. Ultraviolettstrahlen oder N-Methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidin (NTG) verwendet werden, wobei die Mutante keine Fähigkeit zur Herstellung von Antibiotika und Farbstoffen, jedoch eine Fähigkeit zum Binden einer Rhodinose oder Deoxyfucose an die Anthracycllnverbindung der zuvor genannten Formel (II), welche als eine Ausgangsverbindung verwendet wird, an ihre Position 4'-OH hat. Der Stamm kann in einem Medium mit geeigneten Nährstoffquellen inkubiert werden, und die Ausgangsverbindung kann während der Inkubation zugegeben werden, um dadurch das beabsichtigte Antliracyclin-Antibiotikum der Formel (I) der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Als eine typische Mutante, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, wird ein Mutantenstamm Streptomyces galilaeus MA144-M1, KE303 (FERM BP-2048), welcher von Streptomyces galilaeus MA144-M1 (ATCC 31133 oder FERM P-2455) abgeleitet wurde, als ein Stamm zum Produzieren eines Anthracyclin-Antibiotikums Aclacinomycin A (siehe JP-B-51-34915) bekannt ist, bevorzugt erwähnt, wobei der Mutantenstamm nicht Antibiotika-produzierend ist, jedoch die oben erwähnte mikrobielle Umwandlungsfähigkeit aufweist. Darüber hinaus können auch andere Mutantenstämme, wie abgeleitet von Stämmen, welche als ein Cinerubin- oder Rhodomycin-produzierender Stamm bekannt sind und welche die oben erwähnte mikrobielle Umwandlungsfähigkeit aufweisen, in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die konkrete Erklärung des Verfahrens zur Isolierung des KE303- Stammes ist in der JP-A 56-15299 beschrieben, auf welche Bezug genommen wird, anstatt das Verfahren hier zu erklären.
Die Anthracyclinverbindungen der zuvor genannten Formel (II), welche verwendet werden, um gemäß der vorliegenden Erfindung mikrobiell umgewandelt zu werden, wurden von den Erfindung der vorliegenden Erfindung isoliert, welche Verbindungen gemäß dem unten erwähnten Verfahren hergestellt werden können.
Genauer gesagt kann D788-6 dadurch hergestellt werden, daß Streptomyces sp. D788, RPM-5 (FERM BP-811), von dem vorgeschlagen wurde, daß er ein Stamm ist, welcher Anthracyclin-Antibiotika D788-6 produziert, durch das in der JP-A-61-33194 (EP-0 171 677) beschriebene Verfahren inkubiert wird.
Andererseits kann D788-5 hergestellt werden, indem Streptomyces sp. D788 4L-660 (FERM BP- 2049), von dem vorgeschlagen wurde, daß er ein D788-5-produzierender Stamm ist, durch das in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 60-185797 beschriebene Verfahren inkubiert wird.
Die Verfahren zur Herstellung der Anthracyclinverbindungen werden unten konkret erwähnt.

Herstellung von D788-6

Aus einer YS-Schrägkultur (0,3% Hefeextrakt, 1% lösliche Stärke, 1,5% Agar, pH 7,2) Streptomyces sp. D788, RPM-5 (FERM BP-811) wurde eine Schlingenmenge der mikrobiellen Zellen entnommen. Diese wurde in 100 ml eines sterilisierten Saatkulturmediums, urntassend die unten erwähnten Komponenten, inokuliert, welches Kulturmedium in einen Erlenmeyerkolben von 500 ml gegeben wurde und dann in einem Drehschüttelgerät (230 UpM) bei 28ºC zwei Tage lang unter Schütteln kultiviert wurde, um eine Saatkultur herzustellen.

Saatkulturmedium:

Lösliche Starke 0,5%
Glucose 0,5
Essan-Fleisch 1,0
Hefuextrakt 0,1
Natriumchlorid 0,1
Sekundares Kaliumphosphat 0,1
Magnesiumsulfat(7H&sub2;O) 0,1
Zapfwasser pH 7,4 (vor dem Sterilisieren)
Als nächstes wurden 15 Liter eines Produktionsmediums, umfassend die unten erwähnten Komponenten, in einen Gefäßfermenter von 30 Liter gegeben und sterilisiert, und 150 ml (entsprechend 15%) der oben erwähnten Saatkultur wurde diesem zugegeben und inokuliert.

Produktionsmedium:

Taiwan-Hefe 5%
Lösliche Starke 7,5
Hefeextrakt 0,2
Natriumchlorid 0,2
Calciumcarbonat 0,3
Mineralgemisch * 0,06
Zapfwasser pH 8,2 (vor dem Sterilisieren)
(*) Eine kleine Menge Salzsäure wurde 2,8 g CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 0,4 g FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 3,2 g MnCl&sub2;·4H&sub2;O und 0,8 g ZnSO&sub4;·2H&sub2;O zugegeben und in 500 ml destilliertem Wasser gelöst.
Die Inkubation wurde unter der Bedingung der Luftzufuhr von 15 Liter/min, Rühren mit 350 UpM und Temperatur von 28ºC 130 Stunden lang durchgeführt, wodurch das Kulturmedium aufgrund des darin gebildeten Produktes dunkelviolett wurde. Die Kulturbrühe wurde dem Gefaßfermenter entnommen, mit Wasser auf die ½ Konzentration verdünnt, mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH von 1,3 eingestellt und dann etwa eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. Ein Filtrationshilfsmittel wurde diesem in einer Menge von 2% zugegeben, und die Myzelzellen wurden durch Filtration getrennt, um 29,5 Liter Filtrat zu isolieren. Der Myzelkuchen wurde in 6 Liter Aceton suspendiert und 20 Minuten lang zur Extraktion gerührt. Nach dem Filtrieren wurde der Acetonextrakt entnommen und unter verringertem Druck auf etwa 1,5 Liter konzentriert. Dieser wurde mit dem vorigen Filtrat vereinigt.
Das auf diese Weise vereinigte Filtrat wurde durch eine Säule (pH 1,5), die 1 000 ml Diaion HP- 20 (synthetisches absorbierendes Harz, hergestellt von Mitsubishi Kasei Corp.) enthielt, bei einem SV von 4,5 geleitet, so daß das Produkt in das Harz absorbiert wurde. Die Säule wurde mit 2 000 ml wäßriger verdünnter Schwefelsäure (pH 1,5) gewaschen, und dann wurde das absorbierte Produlit mit 1 500 ml 50% Aceton (pH 1,7) eluiert. Das Eluat wurde unter verringertem Druck auf etwa 600 ml konzentriert, und dieses wurde dann mit 4 N Natriumhydroxid auf einen pH von 8,5 eingestellt und mit Chloroform (3 000 ml insgesamt) extrahiert. Der auf diese Weise erhaltene Chloroformextrakt wurde mit einer wäßrigen 20% Natriumchloridlösung gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach der Filtration wurde das erhaltene Filtrat unter verringertem Druck auf eine kleine Menge konzentriert, und eine Überschußmenge n-Hexan wurde diesem zugegeben, um ein Präzipitat zu bilden. Das Präzipitat wurde durch Filtration gewonnen und im Vakuum getrocknet, um 2,48 g eines rohen Pulvers zu erhalten, welches D788-6 und Dihydrocarminomycin enthielt.
100 g Wako Silikagel C-200 (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.) wurden in eine Säule mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol (20/1) gefüllt, und eine Lösung der gesamten Menge des oben erhaltenen rohen Pulvers, gelöst in einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol (20/1), wurde in der oberen Schicht der Silikagel-Säule absorbiert, die dann mit demselben Lösungsmittelsystem entwickelt wurde. Die ersten eluierten Aglycone wurden entfernt und der Säuleninhalt wurde dann mit 600 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Chloroform/Methanol (15/1), 500 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Chloroform/Methanol (13/1) und 550 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Chloroform/Methanol (12/1) in dieser Reihenfolge entwickelt, um dadurch eine Fraktion D788-6 zu eluieren.
Die Fraktion wurde bis zur Trockene konzentriert, um 130 mg eines teilweise reinen Pulvers zu erhalten. Dieses wurde weiter mit einer fraktionierenden dünnen Silikagel-Schicht (20 · 20 cm: PF&sub2;&sub5;&sub4;Silikagel, hergestellt von Merck Co.), wie unten erwähnt, gereinigt.
Kurz gesagt wurde das oben erwähnte, D788-6-enthaltende Pulver in einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol (20/1) gelöst und und quer auf die Dünnschichtplatte an der Position 15 mm über deren Boden punktförmig aufgetragen und dann mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol/Wasser (25/10/1) entwickelt. Das D788-6-Band wurde gewonnen und mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol (8/1) extrahiert. Nach dem Konzentrieren bis zur Trockene wurde dieses in 0,1 Mol Essigsäurepuffer (pH 3,0) gelöst und mit Chloroform gewaschen. Die wäßrige, nach der Extraktion verbliebene Schicht wurde auf einen pH von 8,5 mit 4 N Natriumhydroxid eingestellt und dann mit Chloroform extrahiert. Der erhaltene Extrakt wurde mit einer wäßrigen 20% Natriumchloridlösung gewaschen und dann mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Dieser wurde filtriert und konzentriert, und eine Überschußmenge n-Hexan wurde diesem zugegeben, um ein Präzipitat zu bilden. Das Präzipitat wurde durch Filtration entnommen und im Vakuum getrocknet, um schließlich 58 mg eines reinen D788-6 zu erhalten.

Herstellung von D788-5:

Aus einer YS-Schragkultur (0,3% Hefeextrakt, 1% lösliche Starke, 1,5% Agar, pH 7,2) Streptomyces D788, 4L-660 (FERM BP-2049) wurde eine Schlingenmenge der mikrobiellen Zellen entnommen. Diese wurde in 100 ml eines sterilisierten Saatkulturmediums (umfassend die unten erwähnten Komponenten) inokuliert, welches Kulturmedium in einen Erlenmeyerkolben von 500 ml gegeben wurde und dann in einem Drehschüttelgerät (220 UpM) bei 28ºC zwei Tage lang unter Schütteln kultiviert wurde, um eine Saatkultur herzustellen.

Saatkulturmedium:

Lösliche Stärke 0,5%
Glucose 0,5
Essan-Fleisch 1,0
Hefeextrakt 0,1
Natriumchlorid 0,1
Sekundares Kaliumphosphat 0,1
Magnesiumsulfat (7H&sub2;O) 0,1
Zapfwasser pH 7,4 (vor dem Sterilisieren)
Als nächstes wurden 15 Liter eines Produktionsmediums, umfassend die unten erwähnten Komponenten, in einen Gefäßtermenter von 30 Liter gegeben und sterilisiert, und 750 ml (entsprechend 5%) der oben erwähnten Saatkultur wurde diesem zugegeben und inokuliert.

Produktionsmedium:

Taiwan-Hefe 5%
Lösliche Stärke 7,5
Hefeextrakt 0,3
Natriumchlorid 0,2
Calciumcarbonat 0,3
Mineralgemisch * 0,06
Zapfwasser pH 8,2 (vor dem Sterilisieren) (*) 2,8 g CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 0,4 g FeSO&sub4;·7H&sub2;O, 3,2 g MnCl&sub2;·4H&sub2;O und 0,8 g ZnSO&sub4;·7H&sub2;O
wurden in destilliertem Wasser gelöst.
Die Inkubation wurde unter der Bedingung der Luftzufuhr von 5 Liter/min, Rühren mit 450 UpM und Temperatur von 28ºC 130 Stunden lang durchgeführt, wodurch die Kulturflüssigkeit dunkelrötlichbraun wurde, und diese enthielt etwa 300 ug·ml D788-5.
30 Liter Aceton wurden etwa 14 Liter der auf diese Weise erhaltenen Kulturflüssigkeit zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde auf einen pH von 3,5 unter Rühren eingestellt und dann weiter kontinuierlich 1 Stunde lang gerührt. Dieses wurde unter Saugen durch Verwendung eines Filtrationshilfsmittel (topco perlite) filtriert, und das auf diese Weise erhaltene Filtrat wurde unter verringertem Druck auf 10 Liter konzentriert. Die konzentrierte Flüssigkeit wurde zweimal extrahiert, jeweils mit 10 Liter Chloroform bei einem pH von 7,5. Der auf diese Weise erhaltene Chloroformextrakt wurde in einem sauren Wasser (10 Liter · 2) bei einem pH von 2,0 rückgelöst. Die entstandene wäßrige Schicht wurde auf einen pH von 7,5 mit 4 N Natriumhydroxid eingestellt und dann zweimal jeweils mit 5 Litern Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakt-Schicht wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter verringertem Druck bis zur Trockene konzentriert, um 3,2 g eines rohen Pulvers von D788-5 zu erhalten.
2,5 g des rohen D788-5-Pulvers wurden in einer kleinen Menge Chloroform gelöst und einer Chromatographie unter Verwendung einer Säule (Bettkapazität: 300 ml), zuvor gefüllt mit Silikagel (Wako Gel C-200, hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), unterworfen. Da die Substanz mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform/Methanol (10/1) eluiert wird, wurde die Chromatographie durch oben erwähnte TLC beobachtet. Die ausgewählte Fraktion wurde gewonnen und unter verringertem Druck auf eine kleine Menge konzentriert. Das fünfache Volumen n-Hexan wurde diesem zugegeben, um 1,78 g eines reinen D788-5 zu erhalten.
Die Verbindungen der Formel (I) der vorliegenden Erfindung können wie unten erwähnt hergestellt werden.
Genauer gesagt wird ein Stamm mit der oben erwähnten mikrobiellen Umwandlungsfähigkeit, der auf einem YS-Agar-Schrägmedium kultiviert wurde und bei 6 bis 7ºC gelagert wurde, zum Beispiel der Mutantenstamm KE303, in ein Medium inokuliert, welches umfaßt: Stärke, Glycerin, Glucose oder Maltose als eine Kohlenstoffquelle, organischen Stickstoff enthaltende Substanzen wie z. B. Sojabohnenpulver, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Pepton, Korneinweichflüssigkeit, Baumwollsaat-Waschlauge oder Fichpulver, sowie anorganischen Stickstoff enthaltendes Nitrat oder Ammoniumphosphat als eine Stickstoffquelle, und anorganische Salze, und darin bei 25 bis 35ºC, vorzugsweise 28ºC, 15 bis 48 Stunden lang, vorzugsweise 24 Stunden lang, unter Schütteln oder Rühren inokuliert. Dann wird eine Methanollösung, welche eine Anthracyclinverbindung enthält, die umgewandelt werden soll, dem Kulturmedium in einer Endkonzentration von 10 bis 500 ug/ml, vorzugsweise 50 ug/ml, zugegeben, und das Medium wird noch weiter 15 bis 96 Stunden lang, vorzugsweise 72 Stunden, unter Schütteln inkubiert, um die mikrobielle Umwandlung der zugegebenen Anthracyclinverbindung abzuschließen. Um zu verhindern, daß das Medium während der Fermentation schäumt, können Adeksnol (hergestellt von Asahi Denka Kogyo KK) oder Silikon (hergestellt von Shinetsu Chemical Co.) fakultativ als ein Antischaummittel zugegeben werden.
Um die Verbindung der vorliegenden Erfindung aus der Kulturbrühe zu isolieren, wird die Kulturbrühe in Myzelzellen und Filtrat getrennt, und ein roher Farbstoff, der die Verbindung enthält, wird aus dem Myzelkuchen und dem Filtrat extrahiert und dann gereinigt. Zur Extraktion kann Aceton, Methanol, Chloroform, Ethylacetat, Toluol, verdünnte mineralische Säuren oder Säurepuffer verwendet werden. Zur Reinigung können eine Säule oder Dünnschichtchromatographie, die Silikagel, vernetztes Dextrangel (zum Beispiel Sephadex LH-20, hergestellt von Pharmacia Co.) oder ein schwach saures Ionenaustauscher-Harz verwendet, eine Flüssigchromatographie, die ein geeignetes Lösungsmittel verwendet, oder eine Gegenstromverteilung vorteilhaft kombiniert werden.
Da die Verbindung der vorliegenden Erfindung ein basisches Aminosaccharid aufweist, kann dieses in Form einer freien Base oder auch in Form eines Additionssalzes mit einer anorganischen Säure oder organischen Säure erhalten werden. Die freie Base kann in der Form eines Additionssalzes mit einem nicht toxischen Salz, wie z. B. Schwefelsäure, Salzsäure, Salpetersäure, Apfelsäure, Essigsäure, Propionsäure, Maleinsäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Glutaminsäure, Pantothensäure, Laurylsulfonylsäure oder Methansulfonsäure durch ein bekanntes Verfahren zurückgewonnen werden.
Zur Bildung des Additionssalzes kann die freie Base mit der oben erwähnten, nicht toxischen Säure in einem geeigneten Lösungsmittel umgesetzt und dann gefriergetrocknet werden, oder das entstandene Additionssalz kann in einem Lösungsmittel, welches sich im Salz schwer löst, ausgefällt werden.
Es wurde festgestellt, daß die auf diese Weise gewonnene Verbindung der vorliegenden Erfindung als eine tumoricide Substanz brauchbar ist, aufgrund der Ergebnisse des Experiments mit tumoriciden Substanzen gegen die unten erwähnten Maus-Leukämie-L1210-Kulturzellen.
Wirkung der Hemmung der Fortpflanzung von Maus-Leukamie-L1210-Kulturzellen und der Hemmung der Nukleinsäuresynthese in den Zellen:
L1210-Zellen (5 · 10&sup4;/ml) wurden in ein RP1M 1640-Medium (Rose Wellberg Lahoratory) inokuliert, welches 20% Kalbserum enthielt, und die Verbindung der vorliegenden Erfindung (wie in Tabelle 1 unten angegeben) wurde diesem in einer Konzentration von 0,0005 bis 50,0 ug/ml zugegeben. Auf diese Weise wurden die Zellen in einem CO&sub2;-Incubator bei 37ºC 48 Stunden lang inkubiert, und die 50% wachsumshemmende Konzentration gegenüber der Kontrollgruppe wurde erhalten. Die Verbindung der vorliegenden Erfindung wurde in M/50 Essigsäure (pH 3,0) in einer Konzentration von 1 ug/ml gelöst und dann mit Dulbecco PBS (-) (hergestellt von Nissui Pharmaceutical Co.) verdünnt, bevor sie dem Medium zugegeben wurde.
Andererseits wurden die L1210-Kulturzellen in einem RPM1 1640-Medium, welches 10% Kalbserum enthielt, in einer Konzentration von 8 · 105 Zellen/ml suspendiert und dann in einem CO&sub2;-Inkubator bei 37ºC 1,5 Stunden lang inkubiert. Dann wurde eine Lösung der Verbindung der vorliegenden Erfindung, hergestellt wie oben erwähnt, dem Medium in einer anderen Konzentration zugegeben. 15 Minuten nach der Zugabe wurden ¹&sup4;C-Uridin (0,05 uCi/ml) oder ¹&sup4;C-Thymidin (0,05 uCi/ml) zugegeben, und das Medium wurde weiter bei 37ºC weitere 60 Minuten lang inkubiert. Eine kalte 10% Trichloressigsäure (TCA) wurde der Reaktionslösung zugegeben, so daß die Reaktion gestoppt, wurde, und die säureunlösliche Substanz wurde ausgefüllt. Diese wurde zweimal mit einer kalten 5% TCA gewaschen und dann in Ameisensäure gelöst. Dann wurde die Radioaktivität der erhaltenen Lösung gemessen, und die 50% aufnahmehemmende Konzentration wurde aus dem Radioaktivitätsaufnahmeverhältnis gegenüber der Kontrollgruppe erhalten. Die erhaltenen Ergebnisse wurden in Tabelle 1 unten gezeigt. Tabelle 1 inhibierende Konzentration Verbindung Zellwachstumshemmung Synthesehemmung Synthesehemmung Vergleich Vergleich Vergleich
Die folgenden Beispiele dienen einer eingehenderen Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung, jedoch nicht zu ihrer Beschränkung in irgendeiner Weise.

BEISPIEL 1

Aus einer YS-Schrägkultur (0,3% Hefeexrakt, 1% lösliche Starke, 1,5% Agar, pH 7,2) Streptomyces galilaeus MA144-M1, KE303 (FERM BP-2048) wurde eine Schlingenmenge der mikrobiellen Zellen entnommen. Diese wurde in 100 ml eines sterilisierten Saatkulturmediums (umfassend die unten erwähnten Komponenten) inokuliert, welches Kulturmedium in einen Erlenmeyerkolben von 500 ml gegeben wurde und dann in einem Drehschüttelgerät (230 UpM) bei 28ºC z'vei Stunden lang unter Schütteln kultiviert wurde, um eine Saatkultur herzustellen.

Saatkulturmedium: (Gew./Vol.%)

Lösliche Starke 0,5%
Glucose 0,5
Sojabohnenpulver (Essan-Fleisch) 1,0
Natriumchlorid 0,1
Sekundäres Kaliumphosphat 0,1
Magnesiumsulfut (7H&sub2;O) 0,1
Zapfwasser pH 7,4 (vor dem Sterilisieren)
Als nächstes wurden 5 Liter eines Produktionsmediums, umfassend die unten erwähnten Komponenten, in jedes von drei Gefäßfermentern von 10 Liter gegeben und sterilisiert. Dann wurden 200 ml der oben erwähnten Saatkultur dem Produktionsmedium zugegeben und inokuliert.

Produktionsmedium: (Gew./Vol.%)

Lösliche Starke 2,0%
Glucose 1,0
Sojabohnenpulver 3,0
Natriumchlorid 0,3
Sekundares Kaliumphosphat 0,1
Magnesiumsulfat (7H&sub2;O) 0,1
Hefeextraxt 0,1
Mineralgemisch * 0,1 (Vol./Vol.%)
Antischaummittel (Adekanol LG109) 0,05 (Vol./Vol.%)
Zapfwasser pH 7,0 (vor dem Sterilisieren)
(*) 2,8 g CuSO&sub4;·5H&sub2;O, 0,4 g FeSO&sub4;, 3,2 g MnCl&sub2;·4H&sub2;O und 0,8 g ZnSO&sub4;·2H&sub2;O wurden in 500 ml destilliertem Wasser gelöst.
Die Inkubation wurde unter der Bedingung der Luftzufuhr von 2,5 Liter/min, Rühren mit 300 UpM und Temperatur von 28ºC 1 Tag lang durchgeführt. Eine Methanollösung einer Substrat-Anthracyclinverbindung (D788-6 oder D788-5, 5 mg/ml) wurde dem Kulturmedium in einer Menge von 50 ml/Gefäß (was 250 mg jedes Substrates entspricht), zugegeben, und die Inkubation wurde weitere 3 Tage lang unter der gleichen Bedingung fortgesetzt.
Die Kultur wurde wiedergewonnen und einer Zentrifugation unterworfen, um die Bakterien von der überstehenden Flüssigkeit zu trennen. 10 Liter Aceton wurden den Bakterien zugegeben und gerührt und extrithiert, und der Acetonextrakt wurde durch Filtration isoliert. Dieser wurde unter verringertem Druck auf etwa 4 Liter konzentriert, mit Phosphorsäure auf einen pH von 3,0 eingestellt, mit 2 Litern Chloroform extrahiert und gewaschen.
Als nächstes wurde der erhaltene Extrakt auf einen pH von 8,0 mit 4 N Natriumhydroxid eingestellt und neuerlich mit 5 Litern (Gesamtmenge) Chloroform extrahiert. Der Chloroformextrakt wurde unter verringertem Druck auf eine kleine Menge konzentriert, und eine Überschußmenge n-Hexan wurde diesem zugegeben, um ein Präzipitat zu bilden. Das auf diese Weise gebildete Präzipitat wurde durch Filtration gewonnen und im Vakuum getrocknet, um einen rohen Extrakt eines Produktes zu erhalten, welches aus den entsprechenden Substraten in eine Menge von 270 bis 460 mg umgewandelt wurde.

BEISPIEL 2

275 g des rohen umgewandelten Produktpulvers, welches aus dem Substrat D788-6 von Beispiel 1 erhalten wurde, wurde einer Chromatographie mittels Silikagel-Säule (Durchmesser 30 mm, Silikagel C- 200, hergestellt von Wako Pure Chemical Co., 63 g) unterworfen, worauf der Säuleninhalt mit den unten erwähnten Lösungsmitteln entwickelt wurde, um eine Fraktion, die hauptsächlich CG17A enthielt, und eine Fraktion, die hauptsächlich CG17B enthielt, zu eluieren.
1. Chloroform/Methanol (20/1) 20ml
2. Chloroform/Methanol/Wasser (100/10/0,1) 200 ml
3. Chloroform/Methanol/Wasser (70/10/0,1) 180 ml
Jede der beiden Fraktionen wurde mit Wasser gewaschen, bis zur Trockene konzentriert und dann durch Chromatographie unter Verwendung einer fraktionierenden dünnen Silikagelplatte PF&sub2;&sub5;&sub4; (hergestellt von Merck, 20 · 20 cm) und eines Lösungsmittelsystems aus Chloroform/Methanol/Wasser/Essigsäure/konzentriertem wäßrigem Ammoniak (120/50/5/1/1) gereinigt. Das getrennte rote Band, welches CG17A oder CG17B entspricht, wurde gewonnen, mit Chloroform/Methanol (5/1) extrahiert und dann mit Wasser gewaschen. Die Lösungsmittelschicht wurde bis zur Trockene konzentriert.
Diese wurde in 20 ml 1/50 Mol Essigsäure (pH 3,0) gelöst und zweimal mit 10 ml Lösungsmittel zum Waschen extrahiert. Dann wurde diese auf einen pH von 8,0 mit 1 N Natriumhydroxid eingestellt und mit 30 ml (Gesamtmenge) Chloroform extrahiert. Der Extrakt wurde mit Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann konzentriert. Eine Überschußmenge n-Hexan wurde diesem zugegeben, um ein Präzipitat zu bilden, welches durch Filtration gewonnen und im Vakuum getrocknet wurde, um ein reines CG17A-Pulver oder ein reines CG17B-Pulver zu erhalten. Die Ausbeute an dem reinen CG17A-Pulver betrug 12 mg und jene an dem reinen CG17B-Pulver betrug 34 mg.
Physilkalischchemische Eigenschaften von CG17A:
Fp: 152 bis 155ºC (Zersetzung)
[α]²³D: +400º (C=0,02, Chloroform)
Masse (SI-MS): m/e 672 (M+H)&spplus;
Absorptionsspektrum im ultravioletten und sichtbaren Bereich (λ 90%Methanol max nm E1% 1cm):
204 (289), 235 (630), 254 (380) 294 (130), 493 (218), 527sh (146).
IR-Spektrum (vKBγMAXcm&supmin;¹): 3400,2920,1725,1600,1430,1400,1290,1240, 1195,1165,1120,1070,1000.
H-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;) (γ ppm): 1,11 (t, 3H), 1,17 (d, 3H), 1,26 (d, 3H), 2,2 - 2,4 (-, 2H), 3,0 (m, 1H), m 3,51 (b, 1H), 3,62 (b,1H), 3,71 (s, 3H), 4,12 (-, 1H), 4,20 (-,1H), 4,29 (s, 1H), 4,86 (b, 1H), 5,23 (b, 1H), 5,48 (b, 1H), 7,25 (d, 1H), 7,69 (t, 1H), 7,89 (d, 1H).
Physikalisch-chemische Eigenschaften von CG17B: Fp: 197 bis 202ºC (Zersetzung)
[α]²³D: +670 (C=0,02, Chloroform)
Masse (SI-MS): m/e 688 (M+H)&spplus;
Absorptionsspekrum im ultravioletten und sichtbaren Bereich (λ90%Methanolmax nm E1%1cm): 204 (273), 235 (600), 254 (355) 294 (120), 493 (213), 526 sh (137).
IR-Spektrum (vKBγMAX cm&supmin;¹): 3400,2930, 1725, 1600, 1430, 1400, 1290,1240, 1195, 1165, 1120, 1010,990, 805.
¹H-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;, (γ ppm): 1,10 (t, 3H), 1,29 (d, 3H), 1,30 (d, 3H), 2,30 (b, 2H), 3,0 (m, 1H), 3,5 (b, 1H), 3,67 (b,1H),
3,73 (s, 3H), 4,1 -(-, 1H), 4,2 (-,2H), 4,30 (s, 1H), 4,95 (b, 1H), 5,22 (b, 1H), 5,47 (b, 1H),
7,27 (dd, 1H), 7,69 (t, 1H), 7,88 (dd, 1H).

BEISPIEL 5

392 mg des rohen umgewandelten Extraktes, der aus dem Substrat D788-5 von Beispiel 1 erhalten wurde, wurde einer Chromatographie mittels Silikagel-Säule (Durchmesser 30 mm, Silikagel C-200, hergestellt von Wako Pure Chemical Co., 40 g) unterworfen, worauf der Säuleninhalt mit den unten erwähnten Lösungsmitteln entwickelt wurde, um eine teilweise gereinigte Fraktion, die hauptsächlich CG19A enthielt, und eine Teilfraktion, die hauptsächlich CG19B enthielt, zu eluieren.
1. Chloroform/Methanol (20/1) 140 ml
2. Chloroform/Methanol/Wasser (100/10/0,1) 200 ml
3. Chloroform/Methanol/Wasser (70/10/0,1) 130 ml Dann wurden die Fraktionen auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 zur Reinigung durch Dünnschichtchromatographie und Säurerücklösung bearbeitet. Auf diese Weise wurden 27 mg eines reinen CG19A-Pulvers und 52 mg eines reinen CG19B-Pulvers erhalten.
Physikalisch-chemische Eigenschaften von CG19A: Fp: 158 bis 162ºC (Zersetzung) [α]²³D: +1160 (C=0,02, Chloroform) Masse (SI-MS): m/e 686(M+H)&spplus;
Absorptionsspektrum im ultravioletten und sichtbaren Bereich (λ90%Methanolmax nm E1% 1cm): 204 (292), 234 (582), 252 (319) 289 (126), 479 (172), 494 sh (465).
IR-Spektrum (vKBγMAX cm&supmin;¹): 3400,2920, 1725, 1615, 1580, 1440, 1400, 1280, 1235, 1205, 1195, 1120 , 1000, 825 ¹H-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;) (δ ppm): 1,12 (t, 3H), 1,18 (d, 3H), 1,27 (b, 1H), 2,3 (b,2H), 2,9 - 3,0 (m, 1H), 3,5 (b, 1H), 3,66 (b, 1H), 3,74 (s,3H), 4,10 (s, 3H), 4,1 - 4,2 (-, 2H), 4,29 (s,1H), 4,87 (b, 1H), 5,27 (b, 1H), 5,51 (b, 1H), 7,33 (d, 1H), 7,73 (t, 1H), 8,02 (d, 1H). Physikalisch-chemische Eigenschaften von CG 19B:
Fp: 200 bis 204ºC (Zersetzung) [α]²³D: +490 (C=0,02, Chloroform) Masse (S1-MS): m/e 702 (M+H)&spplus;
Absorptionsspektrum im ultravioletten und sichtbaren Bereich (λ90%Metbanolmax nmE1% 1cm): 205 (292), 234 (591), 252 (324) 289 (124), 478 (175), 495 (169).
IR-Spektrum (vKBγMAXcm&supmin;1): 3400,2925, 1725, 1615, 1580, 1440, 1400, 1280,1235, 1205, 1195, 1155, 990, 805
¹H-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;, δ ppm): 1,12 (t, 3H), 1,23 (d, 3H), 1,28 (d, 3H), 2,3 (b,2H), 3,0 (m, 1H), 3,48 (b, 1H), 3,65 (b, 1H), 3,71 (s, 3H), 4,06 (s, 3H), 4,13 (-, 2H), 4,28 (s, 1H), 4,94 (b, 1H), 5,24 (b, 1H), 5,48 (b, 1H), 7,32 (d, 1H), 7,70 (t, 1H), 7,97 (d, 1H).

Claims

1. Anthracyclin-Antibiotika der Formel (I):

wobei

R¹ eine Hydroxylgruppe, Methoxygruppe ist,

R² eine Hydroxylgruppe ist,

R³ eine Ethylgruppe ist,

R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe ist,

X eine Daunosamin-Rhodinose oder Daunosamin-Deoxyfucose ist, mit der Maßgabe, wenn R¹ und R² Hydroxylgruppen sind, R³ eine Ethylgruppe ist, R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe ist, dann stellt X Daunosamin-Rhodinose oder Daunosamin- Deoxyfucose dar; oder

wenn R¹ eine Methoxygruppe ist, R² eine Hydroxylgruppe ist,

R³ eine Ethylgruppe ist, R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe ist, dann stellt X Daunosamin-Rhodinose oder Daunosamin- Deoxyfucose dar;

sowie pharmazeutisch verträgliche Säureadditionssalze davon.

2. Verfahren zur Herstellung von Anthracyclin-Antibiotika der Formel (I):

in der R¹ , R²&sub1; R³, R&sup4; und X die gleichen Bedeutungen wie in Anspruch 1 haben, dadurch gekennzeichnet, daß eine Verbindung der Formel (II):

in der R¹ und R² Hydroxylgruppen sind, R³ eine Ethylgruppe ist, R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe und X, Daunosamin ist; oder

R¹ eine Methoxygruppe, R² eine Hydroxylgruppe, R³ eine Ethylgruppe, R&sup4; eine Methoxycarbonylgruppe und X' Daunosamin ist,

mikrobiell behandelt wird.

3. Karcinostatisches Kittel, das mindestens eines der Anthracyclin-Antibiotika der Formel (1) enthält:

in der R¹, R², R³, R&sup4; und X die gleichen Bedeutungen wie in Anspruch 1 haben.