JP2708800B2 - 新規アントラサイクリン抗生物質 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、制癌作用を有する新規アントラサイクリン
抗生物質に関する。

〔従来の技術〕

制癌性アントラサイクリン抗生物質としては、従来よ
りダウノマイシン（米国特許第3,616,242号明細書参
照）およびアドリアマイシン（米国特許第3,590,028号
明細書参照）が知られている。そしてこの両剤は癌化学
療法剤として現在臨床的に最も広く利用されている化合
物である。しかし、両剤は優れた抗癌作用を示すが、反
面重篤な心毒作用や骨髄障害を有し、制癌剤として決し
て満足できるものではない。そのため、かかる副作用を
軽減し、なお且つ制癌効果を高めた化合物の創製が望ま
れ、醗酵法、微生物変換法及び化学合成法等の手段によ
り、既に幾つかのアントラサイクリン抗生物質が提案さ
れている。例えば、これらの具体的なものとしては、ア
クラシノマイシンＡ及びＢ（特公昭51−34914号公報参
照）、ロドマイシン群抗生物質（特開昭56−15299号公
報参照）、４′−Ｏ−テトラヒドロピラニールアドリア
マイシン（特公昭57−13558号公報参照）、３′−デア
ミノ−３′−モルホリノ−ダウノマイシン及び同一アド
リアマイシン（特開昭57−163393号公報参照）等に開示
され、その他のダウノマイシン又はアドリアマイシンの
誘導体についてはトピックス・イン・アンテイビオテッ
ク・ケミストリー（Topics in Antibiotic Chemistry）
12巻，第102〜279頁（El lis Horwood Limited 発行）
及びザ・ケミストリー・オブ・アンテイチューモアー・
アンテイビオテック（The Chemistry of Antitumor Ant
ibiotics）,1巻，第63〜132頁（Wiley−Intersciencs
発行）が知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕 抗腫瘍剤としてアントラサイクリン抗生物質は、上述
の如く、各種の類縁化合物が提案され既に一部は臨床的
に広く利用されているものもあり、また、臨床試験に供
せられているものもある。しかし、毒性，抗癌作用双方
について共に満足できるものはない。しかも、抗腫瘍剤
は、試験管内試験及び動物試験の成績が必ずしも直接ヒ
ト癌に対する制癌作用と相関しないため、多角的な研究
が要求される。そのため抗腫瘍剤として一応の評価がな
されているアントラサイクリン抗生物質についても、臨
床薬として更に有効な新たな部類に属する化合物の提案
が望まれている。

本発明者らは先に、アクラシノマイシン非生産菌（ス
トレプトミセス ガリラエウス KE303,微工研菌寄第48
08号）による各種アントラサイクリンアグリコン類の微
生物変換により優れた活性を有する特異な新規アントラ
サイクリン抗生物質の製造を開示した。例えば、特開昭
56−15299号公報（ロドマイシン群抗生物質）、特開昭5
7−165399号公報（２−ヒドロキシアクラシノマイシン
Ａ）等がある。

本発明は、新規で、かつ抗腫瘍活性の強いアントラサ
イクリン抗生物質を提供することを目的とするものであ
る。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は変換基質として各種のアントラサイクリ
ン類を使用することにより、４′位に更に中性糖の結合
した新規アントラサイクリン抗生物質を製造し、その抗
腫瘍性を検討した結果その活性の極めて強い物質を見出
し本発明を完成した。

本発明は式（１） （式中、 R¹及びR²が水酸基、R³がエチル基、R⁴がメトキシカル
ボニル基の場合はＸはダウノサミン−ロデノース又はダ
ウノサミン−デオキシフコースを示し、 R¹及びR²が水酸基、R³が１−ヒドロキシエチル基、R⁴
が水素原子の場合はＸはダウノサミン−ロデノース又は
ダウノサミン−デオキシフコースを示し、 R¹,R²及びR⁴が水酸基、R³がエチル基の場合はＸはロ
ドサミン−ロデノース,N−モノメチルダウノサミン−ロ
デノース又はＮ−モノメチルダウノサミン−デオキシフ
コースを示し、 R¹がメトキシ基、R²が水酸基、R³がエチル基、R⁴がメ
トキシカルボニル基の場合はＸはダウノサミン−ロデノ
ース又はダウノサミン−デオキシフコースを示し、 R¹及びR⁴が水酸基、R²が水素原子、R³がエチル基の場
合はＸはダウノサミン−デオキシフコースを示す） で表される新規アントラサイクリン抗生物質又は薬理
学的に許容されるそれらの付加塩である。

本発明の化合物は次のものが挙げられる。

本化合物をCG17Aと称す。

本化合物をCG17Bと称す。

本化合物をCG18Bと称す。

本化合物をCG19Aと称す。

本化合物をCG19Bと称す。

本化合物をCG20Aと称す。

本化合物をCG20Bと称す。

本化合物をCG21Aと称す。

本化合物をCG22Aと称す。

本化合物をCG22Bと称す。

これらの抗生物質はそれ自体で抗腫瘍活性を有するだ
けでなく、更に糖鎖の結合、低及び高分子活性物質との
結合体等の化学的誘導体を創製する合成母核として有用
である。

本発明のアントラサイクリン抗生物質は次の化合物を
原料として製造する。

原料化合物は下記化合物である。

式（２） 式中、 R¹,R²が水酸基、R³がエチル基、R⁴がメトキシカルボ
ニル基、Ｘ′がダウノサミンである化合物（D788−
６）。

R¹,R⁴が水酸基、R²が水素原子、R³がエチル基、Ｘ′
がロドサミンである化合物（Y262−３）。R¹がメトキシ
基、R²が水酸基、R³がエチル基、R⁴がメトキシカルボニ
ル基、Ｘ′がダウノサミンである化合物（D788−５）。

R¹,R²が水酸基、R³が１−ヒドロキシエチル基、R⁴が
水素原子、Ｘ′がダウノサミンである化合物（ジヒドロ
カルミノマイシン）。

R¹,R²,R⁴が水酸基、R³がエチル基、Ｘ′がロドサミン
である化合物（β−ロドマイシン−１）。

R¹,R²,R⁴が水酸基、R³がエチル基、Ｘ′がＮ−モノメ
チルダウノサミンである化合物（LB−１）。本発明のア
ントラサイクリン化合物は、上記原料のアントラサイク
リン化合物を微生物的処理により製造する。

使用する微生物はアクテイノミセイテス属に属するア
クラシノマイシン、シネルビン或いはロドマイシン類及
びその類縁化合物を生産する能力を有する土壌分離菌株
又は公知の菌株を、変異源として、例えば紫外線或いは
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン
（NTG）を用いる通常の変異処理により容易に単離され
る抗生物質（乃至色素）非生産性で上記式（２）で表さ
れる原料に使用されるアントラサイクリン化合物をそれ
ぞれ４′−OH位にロデノース或いはデオキシフコース１
個を結合せしめる能力を有する菌株を、適当な栄養源か
ら成る培地で培養し、これに原料化合物を添加培養する
ことにより行うことができる。これらの菌株のうち具体
的なものとしてはアントラサイクリン系抗生物質アクラ
シノマイシンＡ（特公昭51−34915号公報参照）の生産
菌として知られているストレプトミセス ガリラエウス
（Streptomyces galilaeus）MA144−M1（ATCC 31133又
は微工研菌寄第2455号）から単離した抗生物質非生産性
で、且つ上記変換能をもつ変異株ストレプトミセス ガ
リラエウスMA144−M1,KE303株（微工研条寄第2048号）
が好適に用いられるが、シネルビン及びロドマイシン生
産菌として公知の菌株より分離した上記変換能を有する
菌株も用いることができる。なお、該KE303菌株の単離
法の具体例については、特開昭56−15299号公報に記載
されいるので、この引例を示すことにより本明細書の説
明に代える。

本発明の原料である前記式（２）で示される変換用ア
ントラサイクリン化合物は本発明者らにより単離された
化合物で、それぞれ下記の方法に準じて調製することが
できる。

D788−６物質及びジヒドロカルミノマイシンは、新規
アントラサイクリン抗生物質D788−6,D−788−７ほかの
生産菌株として提案しているストレプトミセス（Strept
omyces）sp.D788,RPM−５菌株（微工研菌寄第7703号）
を特開昭61−33194号明細書に記載の方法で培養するこ
とにより調製することができる。

また、Y262−３物質及びβ−ロドマイシン−１はY262
−１及びY262−３の生産菌株として提案しているストレ
プトミセス ビオラセラス（Streptomyces violaceus）
A262,SC−７菌株（微工研条寄第1331号）を特願昭61−2
10607号明細書に記載の方法で培養することにより調製
することができる。

一方、D788−５物質は、本物質の生産菌株として提案
しているストレプトミセス（Streptomyces）sp.D788 4
L−660株（微工研条寄第2049号）を特願昭60−185797号
明細書の記載の方法で培養することにより調製すること
ができる。

以下にその調製法を具体的に説明する。

Y262−３及びβ−ロドマイシン−１の調製 ストレプトミセス ビオラセウス A262,SC7菌株（微
工研条菌寄第1331号）のYS（0.3％酵母エキス,1％可溶
性デンプン,1.5％寒天,pH7.2）斜面培養より一白金耳を
採り、下記の種母培地100mlを分注殺菌した500ml容三角
フラスコに接種し、28℃でロータリーシェーカー（200
回転／分）にて、３日間振盪培養して種母を作成した。

種母培地： 可溶性デンプン 0.5 ％ グルコース 0.5 エスサンミート （大豆粉，味の素社製） 1.0 酵母エキス 0.1 食塩 0.1 第二リン酸カリ 0.1 硫酸マグネシウム（含7H₂O） 0.1 水道水 pH7.4 （殺菌前） 次いで、下記組成の生産培地15を入れ殺菌した30
容ジャーファーメンター１基に上記の種母培養液を750m
l（５％に相当）添加接種した。

生産培地： 可溶性デンプン 4.0 ％ pH8.2（殺菌前） エスサンミート 2.5 酵母エキス 0.1 食塩 0.25 炭酸カルシウム 0.3 ミネラル混液＊ 0.2 水道水で15とする ＊CuSO₄・5H₂O 2.8g,FeSO₄・7H₂O 0.4g, MnSO₄・4H₂O 3.2g,ZnSO₄・2H₂O 0.8g, 蒸留水500mlに溶解したもの。

通気量15／分，撹拌300回転／分で28℃,130時間培
養した。培養液を集め6N塩酸でpH1.0に調整し、65℃で
２時間穏やかに加温した後、濾過助剤を２％添加し、濾
過した。菌体区分にアセトン10を加え、１時間撹拌抽
出、濾過し、アセトン抽出液を得た。およそ２程度に
減圧濃縮し、4N苛性ソーダーでpHを8.0に調整し、クロ
ロホルム（総量４）で抽出した。一方上清区分は4N苛
性ソーダーでpH8.0に調整した後、クロロホルム３で
抽出した。得られた両クロロホルム抽出層を混合、飽和
食塩水で洗浄し、芒硝を添加して乾燥させた。クロロホ
ルム抽出層を濾別し、少量まで減圧濃縮し、これにｎ−
ヘキサンを過剰に添加して沈澱せしめ、濾過集積し、真
空乾燥してβ−ロドマイシン−１及びY262−３を含有す
る粗粉末10.9gを得た。

この粗粉末10.9gをクロロホルムに溶解し、予めクロ
ロホルムで充填したシリカゲルカラム（径35mmカラム：
ワコーゲルＣ−200（和光純薬工業社製）、105gに吸着
させた。最初にクロロホルム／メタノール（100/1）混
液で展開し、アグリコン類を含む夾雑物を除去した後、
同（10/1）混液で展開してβ−ロドマイシン−１及びY2
62−３を抽出した。減圧濃縮乾固し、β−ロドマイシン
−１の単一組成標品及びY262−３の部分精製標品を得
た。

Y262−３の部分精製物に関しては、分取用シリカゲル
薄層（20×20cm:PF₂₅₄シリカゲル、メルク社製）を用い
て精製した。即ち薄層プレートの下端より15mmの位置に
クロロホルム／メタノール（15/1）混液に溶解した溶液
を横線状に塗布し、風乾後クロロホルム／メタノール／
ギ酸（4/1/0.1）系で展開した。Y262−３相当分画をか
き集め、クロロホルム／メタノール（7/1）混液で抽出
した。抽出液に適当量の水を添加、4N苛性ソーダーで水
層のpHを8.0に調整、振盪して、分離する下層を分取、
減圧濃縮乾固して、Y262−３の単一組成標品を得た。

次いで、各標品を適当量の0.1M酢酸緩衝液（pH3.0）
にそれぞれ溶解し、1/2量のトルエンで２回抽出洗浄し
た。水層に飽和重炭酸ソーダー水を添加してpH7.5に調
整し、クロロホルムで抽出した。各クロロホルム抽出液
を水洗し、芒硝で乾燥させたのち、濾別、少量まで減圧
濃縮し、これにヘキサンを過剰に加え沈澱させた。濾過
集積、真空乾燥して、β−ロドマイシン−１及びY262−
３の95％以上純度の粉末をそれぞれ5200mg及び110mgが
得られた。

D788−６及びジヒドロカルミノマイシンの調製 ストレプトミセス sp D788,PRM−５菌株（微工研菌寄
第7703号）のYS（0.3％酵母エキス,1％可溶性デンプン,
1.5％寒天,pH7.2）斜面培養より一白金耳を採り、下記
する種母培地100mlを分注、殺菌した500ml容三角フラス
コに接種し、28℃でロータリーシェイカー（220rpm）に
て２日間振盪培養して種母を作成した。

種母培地 可溶性デンプン 0.5 ％ グルコース 0.5 ％ エスサンミート 1.0 ％ 酵母エキス 0.1 ％ 食塩 0.1 ％ 第二リン酸カリ 0.1 ％ 硫酸マグネシウム（含7H₂O） 0.1 ％ 水道水 pH7.4（殺菌前） 次いで、下記組成の生産培地15を入れ、殺菌した30
容ジャーファーメンター１基に上記の種母培養液を15
0ml（15％に相当）ずつ添加接種する。

生産培地 台湾酵母 5 ％ 可溶性デンプン 7.5 ％ 酵母エキス 0.2 ％ 食塩 0.2 ％ 炭酸カルシウム 0.3 ％ ミネラル混液＊ 0.06％ 水道水 pH8.2（殺菌前） ＊CuS₄・5H₂O 2.8g,FeSO₄・7H₂O 0.4g,MnCl₂・4H₂O 3.2
g,ZnSO₄・2H₂O 0.8gに少量の塩酸を添加し、蒸留水500m
lに溶解したもの。

通気量15/2,撹拌350回転／分で28℃,130時間培養す
ると、生産物のため培養液は濃紫色を呈する。ジャーフ
ァーメンターより培養液を集め、水で２倍に希釈したの
ち濃硫酸でpH1.3に調整し、室温でおよそ１時間撹拌す
る。濾過助剤を２％添加し、濾過により菌体を分離して
濾液29.5を得た。更に、菌体区分はアセトン６に懸
濁し、20分間撹拌し抽出した。濾過し、アセトン抽出液
を採り、そよそ1.5まで減圧濃縮し、先の濾液と混合
した。

ダイヤイオンHP−20（合成吸着樹脂、三菱化成社製）
1000mlのカラム（pH1.5）に上記濾液をSV4.5で通過させ
生成物を吸着させた後、2000mlのpH1.5水（希硫酸）で
洗浄し、次いで50％アセトン（pH1.7）の1500mlで吸着
物を溶出した。溶出液を減圧濃縮しておよそ600mlにし
た後、4N苛性ソーダーでpHを8.5に調整し、クロロホル
ム（総量3000ml）で抽出した。得られたクロロホルム抽
出液を20％食塩水で洗浄し、芒硝を添加して乾燥した。
濾別後、少量まで減圧濃縮し、ｎ−ヘキサンを過剰に加
えて沈澱せしめ、濾過集積、真空乾燥してD788−６及び
ジヒドロカルミノマイシンを含む粗粉末2.48gを得た。

ワコーシリカゲルＣ−200（和光純薬工業社製）100g
をクロロホルム−メタノール（20:1）混液でカラムに充
填し、上記で得た粗粉末全量をクロロホルム−メタノー
ル（20:1）混液に溶解し、シリカゲルカラム上層に吸着
させ、同溶媒系で展開した。先に溶出するアグリコンを
除去した後、クロロホルム−メタノール（15:1）混液60
0ml,同（13:1）混液500ml、次いで同（12:1）混液550ml
で展開してD788−６区分を溶出した。更にクロロホルム
−メタノール（10:1）混液500ml、次いでクロロホルム
−メタノール水（200:20:0.5）混液600ml及び同（180:2
0:1）混液600mlで溶出してジヒドロカルミノマイシンを
含む画分を得た。

それぞれ濃縮乾固して130mg及び145mgの部分精製粉末
を得た。更に、下記する分取用シリカゲル薄層（20×20
cm,PF₂₅₄シルカゲル，メルク社製）を用いて調製した。

D788−６は上記粉末をクロロホルム−メタノール（2
0:1）に溶解し、薄層の下端により15mm位置に横線状に
スポットし、クロロホルム−メタノール−水（25:10:
1）の混液で展開した。D788−６バンドをかき集め、ク
ロロホルム−メタノール（8:1）混液で抽出した。濃縮
乾固後、0.1M酢酸緩衝液（pH3.0）に溶解し、クロロホ
ルムで洗浄した。抽出残水層を4N苛性ソーダーでpH8.5
に調整し、クロロホルム抽出した。抽出液は20％食塩水
で洗浄した後、芒硝を添加して乾燥し、濾別し濃縮し、
過剰のｎ−ヘキサンを添加して沈澱せしめ、濾過集積し
真空乾燥して純粋なD788−６物質58mgを得た。

ジヒドロカルミノマイシンはD788−６分画を全く同様
に、但し展開溶媒としてクロロホルム−メタノール−水
−酢酸−濃アンモニア水（120:50:5:1:1）を用い、薄層
クロマトグラフィー及び酸転溶による精製を行い純粋な
ジヒドロカルミノマイシン85mgを得た。

D788−５物質の調製 ストレプトミセスD788（Streptomyces D 788）4L−66
0菌株（微工研条寄第2049号）のYS（0.3％酵母エキス,1
％可溶性デンプン,1.5％寒天,pH7.2）斜面培養より一白
金耳を採り、下記する種母培地100mlを分注殺菌した500
ml容三角フラスコに接種し、28℃，ロータリーシェカー
（220rpm）にて２日間振盪培養して種母を作成した。

種母培地 可溶性デンプン 0.5 ％ グルコース 0.5 ％ エスサンミート 1.0 ％ 酵母エキス 0.1 ％ 食塩 0.1 ％ 第二リン酸カリ 0.1 ％ 硫酸マグネシウム（含7H₂O） 0.1 ％ 水道水 pH7.4（殺菌前） 次いで、下記組成の生産培地15を入れ、殺菌した30
容ジャーファーメンター１基に上記種母培養液を、75
0ml（５％に相当）ずつ添加接種した。

生産培地 台湾酵母 5 ％ 可溶性デンプン 7.5 ％ 酵母エキス 0.3 ％ 食塩 0.2 ％ 炭酸カルシウム 0.3 ％ ミネラル混液＊ 0.06％ 水道水 pH8.2（加熱殺菌前） ＊CuSO₄・5H₂O 2.8g,FeSO₄・7H₂O 0.4g, MnCl₂・4H₂O 3.2g,ZnSO₄・7H₂O 0.8gを蒸留水に溶解
したもの。

通気量５／分，撹拌450回転／分で、28℃,130時間
撹拌すると培養液は濃赤褐色を呈し、培養液1ml中およ
そ300μｇのD788−５を蓄積した。

以上の如くして得た培養液およそ14にアセトン30
を加え撹拌しながらpHを3.5に調整し、更に１時間撹拌
を続けた。これを濾過助剤（トプコパーライト）を用い
て吸引濾過し、得られた濾液を減圧下に10にまで濃縮
した。濃縮液をpH7.5でクロロホルム10ずつを用いて
２回抽出した。得られたクロロホルム抽出液をpH2.0で
酸性水に転溶（10×２）し、この水層を4N苛性ソーダ
ーでpHを7.5となしクロロホルム５で２回抽出した。
クロロホルム抽出層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、減
圧下濃縮乾固してD788−５の粗粉末3.2gを得た。

D788−５の粗粉末2.5gを少量のクロロホルムに溶解
し、予めクロロホルムで充填したシリカゲル（ワコーゲ
ルＣ−200:和光純薬社製）カラム（ベッド容量300ml）
に吸着させクロマトグラフィーを行った。本物質はクロ
ロホルム−メタノール（10:1）混液で溶出されるので、
前述のTLCで監視し、選択されたフラクションを集め、
減圧下に少量となるまで濃縮した。これに５倍容量のｎ
−ヘキサンを添加すると純粋なD788−５ 1.78gが得ら
れた。

LB−１の調製 β−ロドマイシン−１ 300Tmgをクロロホルム−メタ
ノール混液（100:1）混液200mlに溶解し、これを光反応
装置（UVL−400H−300P型（高圧水銀ランプ：理工科学
産業社製）中で１時間（24℃）照射した。反応液を減圧
濃縮乾固した後、分取用シリカゲル薄層（20×20cm:PF
₂₅₄シルカゲル，メルク社製）を用いて調製した。薄層
の下端より15mm位に少量のクロロホルム−メタノール
（15:1）混液に溶解した上記反応生成物を溶解、横線状
に塗布し、風乾させた後クロロホルム−メタノール−水
−酢酸（35:10:0.4:0.2）で展開した。LB−１に相当す
る分画シリカゲル層をかき集め、クロロホルム−メタノ
ール（6:1）混液で抽出した。抽出液に水を補添し振盪
後、4N苛性ソーダーで水層のpHを8.0に調整し、再びよ
く振盪して溶媒層に完全に転溶させた。溶媒層を減圧濃
縮乾固し、0.1M酢酸緩衝液（pH3.5）20mlを加えて溶解
させ、これを10mlトルエンで２回振盪して洗浄した。水
層に飽和重炭酸ソーダー水を添加してpH7.5に調整し、
クロロホルムで抽出した。クロロホルム抽出液は飽和食
塩水で洗浄し、芒硝で乾燥させた後、少量まで減圧濃縮
した。これにｎ−ヘキサンを過剰に加え沈澱せしめ、濾
過集積、真空乾燥を行って純粋なLB−１の粉末82mgを取
得した。

本発明の式（１）で表される化合物は次のようにして
製造することができる。

先ず、YS寒天斜面培地で培養し、６〜７℃で保存され
た上記の変換能を有する菌株（例えばKE303菌株）を、
例えば炭酸源としてデンプン，グリセリン，グルコース
或いはマルトーズ、窒素源として大豆粉，肉エキス，酵
母エキス，ペプトン，コーンスチープリカー，綿実粕，
魚粉などの有機物並びに硫酸アンモニウム，塩化アンモ
ニウム，硝酸ナトリウム或いはリン酸アンモニウムなど
の無機体窒素及び無機塩類よりなる培地に接種し、25〜
35℃、好ましくは28℃、で15〜48時間、好ましくは24時
間振盪或いは撹拌培養を行い、これに変換用アントラサ
イクリン類のメタノール溶液を最終濃度10〜500μg/m
l、好ましくは50μg/mlとなるように添加し、更に15〜9
6時間、好ましくは72時間、振盪培養を続けて微生物変
換を完結せしめる。なお、醗酵中の発泡を抑制するた
め、消泡剤としてアデカノール（旭電化工業社製），シ
リコーン（信越化学工業社製）等を適宜添加することが
できる。

この培養物より本発明の化合物を採取するには、培養
液を菌体と濾液に分離し、菌体及び濾液から該化合物を
含有する粗色素を抽出、精製を行う。抽出にはアセト
ン，メタノール，クロロホルム，酢酸エチル，トルエ
ン，薄い鉱酸，酸性緩衝液等が用いられる。精製にはシ
リカゲル，交叉結合デキストランゲル〔例えば、セファ
デックスLH−20（ファルマシア社製）〕，弱酸性イオン
交換樹脂等を用いたカラム及び薄層クロマトグラフィ
ー、適当な溶媒を用いた液体クロマトグラフィー及び向
流分配法等の常法を組み合わせることにより有利に行う
ことができる。

また、本発明の化合物は塩基性のアミノ糖を有するか
ら遊離の塩基又は無機酸もしくは有機酸との付加塩とし
ても得られる。遊離の塩基は公知の方法によって無毒性
の酸例えば、硫酸，塩酸，硝酸，リンゴ酸，酢酸，プロ
ピオン酸，マレイン酸，クエン酸，コハク酸，酒石酸，
フマール酸，グルタミン酸，パントテン酸，ラウリルス
ルホン酸，メタンスルホン酸等の付加塩として回収され
る。付加塩の形成は遊離塩基を適当な溶媒中で上記無毒
性の酸と反応させて凍結乾燥させるか、又は酸付加塩が
僅かしか溶けない溶媒を用いて沈澱させる方法で得るこ
とができる。

このようにして得られる本発明の化合物は、以下に示
すマウス白血病L1210培養細胞に対する試験法により、
その抗腫瘍性物質としての有用性を確認することができ
る。

マウス白血病L1210培養細胞に対する増殖及び核酸合成
阻害作用 20％仔牛血清を含むRPM11640培地（日水製薬社製）へ
L1210細胞を５×10⁴ケ/ml接種し、これに本発明の被験
化合物を最終濃度0.005〜10.0μg/mlになるように添加
し、37℃にて炭酸ガス培養器中（3.5％炭酸ガス混入空
気）で２日間培養し、無添加の対照区に対する50％増殖
阻害濃度を求めた。更に、上記のL1210培養細胞を10％
仔牛血清を含むRPMI1610培地へ５×10⁵ケ/mlとなるよう
に懸濁し、37℃にて炭酸ガス培養器中で１時間培養を行
った後、本発明の化合物を0.1〜100μg/mlになるように
添加し、15分後更に¹⁴C−ウリジン（0.05μC/ml）また
は¹⁴C−チミジン（0.05μg/ml）を添加して、直ちに37
℃で60分間培養した。

次いで、培養液に冷10％トリクロロ酢酸（TCA）を添
加して反応を中止すると同時に、酸不溶物として培養細
胞を沈澱させた。冷５％TCAにて沈澱物を２回洗浄した
後、ギ酸に溶解、放射活性を測定した。かくして、無添
加対照区に対する放射能取込み率から５％取込み阻害を
生ずる濃度を求めた。第１表にその結果を示す。

以下に本発明を実施例をもってより詳細に説明する。

〔実施例〕

例 １ ストレプトミセス ガリラエウス（Streptomyces gal
ilaeus）MA144−M1,KE303菌株（微工研条寄第2048号）
のYS（0.3％酵母エキス,1％可溶性デンプン,1.5％寒天,
pH7.2）斜面培養より一白金耳を採り、下記する種母培
地に100mlを分注殺菌した500ml容三角フラスコに接種
し、28℃でロータリーシェーカー（220rpm）にて２時間
振盪培養して種母を作成した。

種母培地 （W/V％） 可溶性デンプン 0.5 ％ グルコース 0.5 ％ 大豆粉（エスサンミート，味の素社製） 1.0 ％ 食塩 0.1 ％ 第二リン酸カリ 0.1 ％ 硫酸マグネシウム（含7H₂O） 0.1 ％ 酵母エキス 0.1 ％ 水道水 pH7.4（殺菌前） 次いで、下記組成の生産培地５を入れ殺菌した10
容ジャーファーメンター３基に上記種母培養液を１基当
たり200mlずつ添加接種した。

生産培地 （W/V％） 可溶性デンプン 2.0 ％ グルコース 1.0 ％ 大豆粉 3.0 ％ 食塩 0.3 ％ 第二リン酸カリ 0.1 ％ 硫酸マグネシウム（含7H₂O） 0.1 ％ 酵母エキス 0.1 ％ ミネラル混液＊ 0.1 ％ （但しV/V％） 消泡剤（アデカノールLG109） 0.05％ （但しV/V％） 水道水 pH7.0（殺菌前） ＊CuSO₄・5H₂O 2.8g,FeSO₄・7H₂O 0.4g, MnCl₂・4H₂O 3.2g,ZnSO₄・2H₂O 0.8gを蒸留水500ml
に溶解した。

通気量2.5／分，撹拌300rpm,28℃で１日間培養し、
これに基質のアントラサイクリン類（D788−6,D788−5,
Y262−3,β−ロドマイシン−1,LB−１及び13−ジヒドロ
カルミノマイシン）のメタノール溶液（5mg/ml）を基質
ごとにジャー１基当たり50mlを加え（各基質に関し250m
g添加）、更に３日間同一条件で培養を継続した。

培養液を回収し遠心操作にて菌体と上清に分けた。菌
体にアセトン10を加え撹拌抽出した後、濾過にてアセ
トン抽出液を得た。これをおよそ４まで減圧濃縮した
後、リン酸でpHを3.0となし、クロロホルム２で抽出
洗浄した。

次いで4N苛性ソーダーでpHを8.0に調整し、クロロホ
ルム５（総量）で抽出した。このクロロホルム抽出物
を少量まで減圧濃縮し、これに過剰のｎ−ヘキサンを添
加して沈澱させ、濾過集積、真空乾燥して、各基質の変
換生成物の粗抽出物270〜460mgを得た。

例 ２ 例１の基質D788−６より得た変換用生成物粉末275mg
をシリカゲルカラムクロマト〔径30mm,シリカゲルＣ−2
00（和光純薬工業社製）63g〕にかけ、下記する溶媒系
で順次展開してCG17A及びCG17Bを主成分とする区分を分
離した。

1.クロロホルム−メタノール（20:1） 200ml 2.クロロホルム−メタノール−水（100:10:0.1） 200ml 3.クロロホルム−メタノール−水（70:10:0.1） 180ml 両画分をそれぞれ水洗した後、濃縮乾固し、次いで分
取用シリカゲル薄層プレートPF₂₅₄（メルク社製）（20
×20cm）を用い、溶媒系としてクロロホルム−メタノー
ル−水−酢酸−濃アンモニア水（120:50:5:1:1）を用い
てクロマト精製を行った。CG17A及びCG17Bに相当する分
離赤色バンドをそれぞれかきとり、クロロホルム−メタ
ノール（5:1）で抽出し、次いで水洗した後、溶媒層を
濃縮乾固した。

それぞれ1/50M酢酸（pH3.0）20mlに溶解し、トルエン
10mlで２回抽出洗浄した後、1N苛性ソーダーでpHを8.0
に調整し、クロロホルム30ml（総量）で抽出した。水洗
し芒硝を添加して乾燥させた後、濃縮し過剰のｎ−ヘキ
サンを添加して沈澱し濾過集積せしめ、真空乾燥して精
製CG17A及びCG17B粉末をそれぞれ12mg及び34mgを得た。

CG17Aの理化学的性状 CG17Bの理化学的性状 例 ３ 例１の基質β−ロドマイシン−１より得た変換粗抽出
物321mgをシリカゲルカラムクロマト〔径30mm,シリカゲ
ルＣ−200（和光純薬工業社製）38g〕にかけ、下記する
溶媒系で順次展開し、CG21A及びCG21Bを主成分とする部
分精製区分を分取した。

1.クロロホルム−メタノール（20:1） 75ml 2.クロロホルム−メタノール−水 （100:10:0.1） 150ml 3.クロロホルム−メタノール−水 （70:10:0.1） 120ml 以降、例２と同様の方法に従って薄層クロマトグラ
フ、酸転溶等の処理を行い精製した。そして、CG21A及
びCG21Bの粉末をそれぞれ16mg及び6mgを得た。なお、CG
21Bは既知物質ベタクラマイシンＳ（Betaclamycins）
〔ジャーナル オブ アンティビオティック（Journal
of Antibiotic）第37巻 第920頁 1984年参照〕。

CG21Aの理化学的性状 例 ４ 例１の基質Y262−３より得た変換抽出物270mgを例２
と全く同一の方法で処理し、CG18Bの精製粉末を15mg得
た。

CG18Bの理化学的性状 例５ 例１の基質D788−５より得た変換粗抽出物392mgをシ
リカゲルカラムクロマト〔径30mm,シリカゲルＣ−200
（和光純薬工業社製）40g〕にかけ、下記する溶媒系で
順次展開し、CG19A及びCG19Bを主成分とする部分精製区
分を分取した。

1.クロロホルム−メタノール（20:1） 140ml 2.クロロホルム−メタノール−水 （100:10:0.1） 200ml 3.クロロホルム−メタノール−水 （70:10:0.1） 130ml 以降、例２に示したと全く同一の方法で、薄層クロマ
ト酸転溶等の処理を行い、精製したCG19A及びCG19Bの粉
末をそれぞれ27mg及び52mgを得た。

CG19Aの理化学的性状 LG19Bの理化学的性状 例６ 例１の基質13−ジヒドロカルミノマイシンより得た変
換粗抽出物287mgをシリカゲルカラムクロマト〔径30mm,
シリカゲルＣ−200（和光純薬工業社製）25g〕にかけ、
下記する溶媒系で順次展開し、CG20A及びCG20Bを含む部
分精製区分を分取した。

1.クロロホルム−メタノール（20:1） 150ml 2.クロロホルム−メタノール−水 （100:10:0.1） 100ml 3.クロロホルム−メタノール−水 （70:10:0.1） 150ml 以後、例２に示したと全く同一の方法で、薄層クロマ
ト酸転溶等の処理を行い、精製したCG20A及びCG20Bの粉
末をそれぞれ35mg及び28mgを得た。

CG20Aの理化学的性状 CG20Bの理化学的性状 例７ 例１の基質LB−１より得た変換粗抽出物456mgをシリ
カゲルカラムクロマト〔径30mm,シリカゲルＣ−200（和
光純薬工業社製）38g〕にかけ、下記する溶媒系で順次
展開し、CG22A及びCG22Bを主成分とする部分精製区分を
分取した。

1.クロロホルム−メタノール（20:1） 120ml 2.クロロホルム−メタノール−水 （100:10:0.1） 150ml 3.クロロホルム−メタノール−水 （70:10:0.1） 150ml 以後、CG22Aに関しては、例２に示したと全く同一の
方法で、薄層クロマト、酸転溶等の処理を行い、CG22A
の精製粉末38mgを得た。一方、CG22Bに関しては該CG22B
分画を濃縮乾固したのち下記する逆相シリカゲルクロマ
トにより精製した。

逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー： カラム：径23mm（オープン） シリカゲル:YMCゲル（ODS）60Å、170/120メッシュ
（山村化学）50g 溶媒系：アセトニトリル−0.05M ギ酸アンモン（p
H4.0）（15:85） 450ml アセトニトリル−0.05M ギ酸アンモン（p
H4.0）（20:80） 450ml を順次展開しCG22B区分を集め、IN苛性ソーダでpH8.0に
調整し、クロロホルムで抽出、次いで水洗した後、濃縮
乾固した。1/50M酢酸（pH3.0）30mlに溶解し、トルエン
15mlで２回抽出洗浄したのち、IN苛性ソーダーでpH8.0
に調整し、クロロホルムメタノール（10:1）混液30ml
（総量）で抽出した。

水洗い、芒硝を添加して脱水した後、濃縮し、過剰の
ｎ−ヘキサンを添加して沈澱、濾過集積せしめ、真空乾
燥してCG22Bの精製粉末を15mg得た。

CG22Aの理化学的性状 CG22Bの理化学的性状 〔発明の効果〕 本発明の新規アントラサイクリン抗生物質は極めて優
れた抗腫瘍活性を有する有用な物質である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 長縄 博 東京都大田区田園調布本町３―17 (72)発明者 沢 力 神奈川県綾瀬市綾西４―６―７ (72)発明者 竹内 富雄 東京都品川区東五反田５―１―11

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】式 （式中、 R¹及びR²が水酸基、R³がエチル基、R⁴がメトキシカルボ
   ニル基の場合はＸはダウノサミン−ロデノース又はダウ
   ノサミン−デオキシフコースを示し、 R¹及びR²が水酸基、R³が１−ヒドロキシエチル基、R⁴が
   水素原子の場合はＸはダウノサミン−ロデノース又はダ
   ウノサミン−デオキシフコースを示し、 R¹,R²及びR⁴が水酸基、R³がエチル基の場合はＸはロド
   サミン−ロデノース,N−モノメチルダウノサミン−ロデ
   ノース又はＮ−モノメチルダウノサミン−デオキシフコ
   ースを示し、 R¹がメトキシ基、R²が水酸基、R³がエチル基、R⁴がメト
   キシカルボニル基の場合はＸはダウノサミン−ロデノー
   ス又はダウノサミン−デオキシフコースを示し、 R¹及びR⁴が水酸基、R²が水素原子、R³がエチル基の場合
   はＸはロドサミン−デオキシフコースを示す） で表される新規アントラサイクリン抗生物質又は薬理学
   的に許容されるそれらの酸付加塩。