DE2821948B2

DE2821948B2 - Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 und ihre Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen

Info

Publication number: DE2821948B2
Application number: DE2821948A
Authority: DE
Inventors: Takao Tokio Iida; Shinzo Shizuoka Ishii; Takashi Tokio Nara; Ryo Machida Tokio Okachi; Kunikatsu Mashida Tokio Shirahata
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1977-05-19
Filing date: 1978-05-19
Publication date: 1980-11-20
Also published as: US4310661A; FR2391222B1; DE2821948C3; DE2821948A1; US4298690A; GB1593130A; FR2391222A1

Description

R²NH

NH-,

mit folgender Bedeutung und Zuordnung der Substituenten R¹ und R²

R'

R-'

XK-62-3 XK-62-4

Wasserstoff Methyl

Methyl Wasserstoff

sowie deren Salze mit Säuren.

2. Verfahren zur Gewinnung der Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Micromonospora sagameinsis var. nonreducans NRRL 1110t in einem Nährmedium züchtet und die aktiven Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-3 bzw. XK-62-4 nach üblichen Verfahren aus der Kühlflüssigkeit abtrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei einem neutralen pH-Wert 2 bis 15 Tage bei 25 bis 40⁰C durchführt.

4. Verwendung der Verbindungen nach Ansprucn 1 bei der Bekämpfung bakterieller Infektionen.

Die Erfindung betrifft die in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstände.

Nach Antibiotika mit einem breiten Wirkungsspektrum gegenüber Bakterien besteht ständig ein großer Bedarf. Es ist festgestellt worden, daß bestimmte Stämme von Micromonospora bei Züchtung in einem Nährmedium verschiedene Antibiotika in der Kulturflüssigkeit bilden. So wurde das Antibiotikum XK-62-2 aus der Kulturflüssigkeit von Micromonospora sagamiensis MK-65, ATCC 21826 (FERM-P 1530) und Micromonospora sagameinsis var. nonreducans MK-62, ATCC 21803 (FERM-P 1477) isoliert; vgl. DE-OS ■23 26 781.

Dieses Antibiotikum weist folgende Strukturformel auf.

CH₂NHCH₃

NHCH₃ j CH₃

H, N

NH,

Die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften dieses Antibiotikums sind in der vorerwähnten DE-OS erläutert.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß ein neuer Mutantenstamm von Micromonospora sagamiensis bei der Züchtung zusätzlich zu XK-62-2 zwei weitere Wirk stoffe freisetzt Aufgrund der chemischen, physikali schen und biologischen Eigenschaften dieser Wirkstoffe ergibt sich, daß es sich dabei um neue Antibiotika handelt, die mit XK-62-3 und XK-62-4 bezeichnet werden.

ίο Die Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 der im Patentanspruch 1 aufgeführten allgemeinen Formel I werden hergestellt, indem man den in Anspruch 2 genannten Mikroorganismus der Gattung Micromonospora, der zur Bildung von einem oder beiden Antibiotika in der Lage ist, in einem Nährmedium züchtet, bis sich in der Kulturflüssigkeit eine wesentliche antibakterielle Aktivität nachweisen läßt. Nach beendeter Züchtung werden die· aktiven Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-3 bzw. XK-62-4 nach üblichen Verfahren aus der Kühlflüssigkeit abgetrennt, beispielswe'se durch Behandlung mit einem lonenaustauscherharz.

XK-62-3 und XK-62-4 weisen ein breites antibakterielles Wirkungsspektrum auf und sind daher unter anderem zur Reinigung und Stei ilisation von Glasge-

>i raten im Laboratorium und von chirurgischen Instrumenten geeignet. Ferner können sie zusammen mit Seifen, Waschmitteln und Waschflüssigkeiten für hygienische Zwecke verwendet werden. Ferner weisen diese Verbindungen wertvolle therapeutische Eigenschaften

in bei verschiedenen durch Bakterien verursachten Infektionen auf.

Die Erfindung betrifft auch Salze von XK-62-3 und XK-62-4 mit Säuren, insbesondere die pharmakoiogisch verträglichen Salze. Beispiele dafür sind Salze mit

r> Mineralsäuren, wie Hydrochloride, Hydrobromide, Hydrojodide, Sulfate, Sulfamate und Phosphate, und Salze mit organischen Säuren, wie Maleate, Acetate, Citrate, Oxalate, Succinate, Benzoate, Tartrate, Fumarate, Malate, Mandelate und Ascorbate.

Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften der freien Base des Antibiotikums XK-62-3 zusammengestellt:

■n (1) Es handelt sich um ein weißes, basisch reagierendes Pulver.

(2) Elementaranalyse:

C = 49,77°/o, H =9,02%. N = 14,26%.

(3) F. 95 bis 103⁰C.

V) (4) Das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung von XK-b2-3 zeigt zwischen 220 und 360 nm keine charakteristischen Absorptionsmaxima sondern nur eine terminale Absorption.

(5) Spezifische Drehung

[tx]',,' = +182° (C= 0,5, H₂O).

(6) IR-Absorptionsspektrum (KBr-Preßling):

Die freie Base von XK-62-3- zeigt folgende Ab-

sorpttonsmaxima:

3330, 2920, 1590, 1450, 1360, 1040 und 1020 cm '.

(7) Farbreaktionen:

Ninhydrin-Reaktion: positiv

Kaliumpermanganat-Reaktion: positiv Elson-Morgan's-Reaktion: negativ

Biuret-Reaktion: negativ

(8) Bei der Messung des PMR-Spektrums von XK-62-3 in Deuteriumoxidlösung (pD=10,2) unter Verwendung eines JEOL JNM-PS-100-Geräts ergeben sich folgende Werte:

ό (ppm) UI (3 H, s), 0,8-1,95 (6 H, m), 1,95-3,05 (6 H, m), 234 (3 H, s), 2,54 (3 H, s), 3,05 bis 4,20 (7 H, m), 5,06 (1 H, d, J =4), 53 (lH,d,J=4).

(9) Bei der Messung des CMR-Spektrums von ί XK-62-3 in Deuteriumoxidlösung (pD = 11,0) unter Verwendung eines JEOL-PFT-I OOA-Geräts ergeben sich folgende Werte: o(ppm) 102,4, 101,1, 87,4, 85,8, 75,4, 733, 71,7,

70,2, 68,5, 64,2, 57,9, 51,4, 50,6, 45,8, 37,8, 32m8, 32,6, 28,2, 26,8, 22,5.

(10) Das Massenspektrum von XK-62-3 zeigt das folgende M + l-Ion und die folgenden Ionenfragmente (die in Klammern angegebenen Summenformeln sind durch hochauflösende Massenspek- trometrie erhalten):

m/e 464 M +1 (C₂₀H₄₂N₅O₇), 446 (C₂₀H₃₈N₄O₇), 388(C₁₇H₃₄N₅O₅), 364 (C₁₅H₃₀N₃O₇), 346(C₁₅H₂₈N₃O₆), 336 (C₁₄H₃₀N₃O₆), 333 (C₁^mN₄O₅), 318 (C₁₄H₂₈N₃O₅), 289 (CuH₂SN₂O₅). 272 (CuHs₁NjO₃), 205 (C₈H₁₇N₂O₄), 177 (C₇H₁₇N₂O₃), 160 (C₇H₁₄NO₃), 129 (C₆H₁₃NO₂).

Aus den vorstehenden Werten läßt sich ein Molekulargewicht von 463 und die Summenformel C₂₀H₄IN₅O₇ ableiten. Aus der Summenformel lassen sich folgende Werte für die Elementaranalyse (mit 1 Mol H₂O hydratisiert) errechnen:

C=49,88%, H = 9,00%, N = 14,54%. "'

(11) Somit kommt dem Antibiotikum XK-62-3 die nachstehende Strukturformel zu.

NHCH₃

OH

■1(1

NH

H₃CNH

•»■"1

(6) Das IR-Absorptionsspektrum (KBr-Preßling) der freien Base von XK-62-4 zeigt folgende Absorptionsmaxima:

3350, 2920,1570,1460, 1340, 1050 und 1020 cm-'.

(7) Farbreaktionen:

Ninhydrin-Reaktion: positiv

Kaliumpermanganat-Reaktion: positiv Elson-Morgan's-Reaktion: negativ

Biuret-Reaktion: negativ

(8) Bei der Messung des PMR-Spektrums von XK-62-4 in Deuteriumoxidlösung (pD=IO3) unter Verwendung eines JEOL-JUM-PSlOO-Geräts ergeben sich folgende Werte:

δ (ppm) Ul (3 H,s),0,8-2,10(6 H,m),2^4(6 H.s), 235-2,68 (3 H, m), 234 (3 H, s), 2,68 bis 3,05 (3 H, m), 3,05-4,20 (7 H, m), 5,07 (1 H, d, J =4), 5,17(1 H,d,J=4).

(9) Bei der Messung des CMR-Spektrums von XK-62-4 in Deuteriumoxidlösung (pD=10,5) unter Verwendung eines JEOL-PET-IOOA-Geräts ergeben sich folgende Werte:

<5 (ppm) 101,2,1OU, 87,6, 87,4, 75,1, 73,2. 70.1, 68,5,

67.6, 64,2, 633. 51.6. 50,6, 50,4, 45,7, 45,7,

37.7, 36,4, 293. 263. 22,4.

(10) Das Massenspektrum von XK-62-4 zeigt das folgende Molekülion und die folgenden lonenfragmente (die in Klammern angegebenen Summenformeln sind durch hochauflösende Massenspektrometrie erhalten):

m/e 477 M (C₂₁H₄₃N₅O₇), 460 (C₂₁ H₄₀N₄O₇), 360 (C₁₆H₁₂N₄O₅), 350 (C₁₄H₂₈N₃O₇), 347 (C₁₅H₃₁N₄O₀), 322 (C₁₃H₂₈N-O₆). 304 (C₁₃H₂₆N₃O₅). 286 (C₁₄H₂₈N₃O₃), 160 (C₇H₁₄NO₃), 157 (C₈H₁₇N₂O).

Aus den vorstehenden Werten ergibt sich ein Molekulargewicht von 477 und die Summenformel C₂IH₄₃N₅O₇. Die berechneten Werte für die Elementaranalyse (hydratisiert mit Ui Mol H₂O) sind

C = 51,83%. ri = 9,11 %, N = 1439%.

(11) Aufgrund der vorstehenden physikochemischen Eigenschaften kommt dem Antibiotikum XK-62-4 folgende Strukturformel zu.

(12) Die freie Base von XK-62-3 ist in Waiser stark löslich, löslich in Methanol und geringfügig löslich in Ethanol und Aceton und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Essigsäureethylester, Essigsäurebutylester, Diethylether. Butanol, Petrolether und n-Hexan.

Nachstehend sind die physikochemischen Eigenschaften dei freien Base des Antibiotikums XK-62-4 angegeben:

(1) Es handelt sich um ein weißes, basisch reagierendes Pulver.

(2) Elementaranalyse:

C = 5l,6t%. H = 9,28%, N= 14,18%.

(3) F. 101 bis tl2°C.

(4) Das UV-Absorptionsspektrum einer wäßrigen Lösung von XK-62-4 zeigt zwischen 220 und 360 nm keine charakteristischen Absorptionsmaxima, sondern nur eine terminale Absorption.

(5) Spezifische Drehung: [α]?-143° (C-O₁H

CH₂N(CH₃J₂

NHCH₃

55

65

(12) Die freie Base von XK-62-4 ist stark löslich in Wasser, löslich in Methanol und geringfügig löslich in Ethanol und Aceton und unlöslich in organischen Lösungsmitteln, wie Chloroform, Benzol, Essigsäureethylester, Essigsäurebutylester, Diethylether, Butanol, Petrolether und n-Hcxan.

Die Rf-Werte von XK-62-3 und XK-62-4 bei Papier- und Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von verschiedenen Laufmitteln sind in den Tabellen I bis IH zusammengestellt. Zu Vergleichszwecken sind die Rf-Werte von mit XK-62-3 und XK-62-4 verwandten Antibiotika angegeben.

Tabelle I

Rr-Werte von XK-62-3 und XK-62-4 bei aufsteigender Papierchromatographie (bei 28⁰C)

Laufmittel

R,-Wert Rr-Wert Laufzeit. XK-62-3 XK-62-4 Sid

20% Ammoniumchlorid 0,96 0,96

Mit Wasser gesättigtes 0,00 0,00

n-Butanol

n-Butanol + Essigsäure 0,05 0,05

+ Wasser

(3:1:1 Volumteile)

Mit Wasser gesättigter 0,00 0,00

Essigsäureethylester

Mit Wasser gesättigtes 0,10 0,10

n-Butanol mit einem Gehalt an 2% (GewTVol.)
p-Toluolsulfonsäure und
2% (GewyVol.) Piperidin

Tabelle Il

Rr-Werte bei der Dünnschichtchroinatographie an Kieselgel) (nach 3stiindiger Laufzeit bei Raumtemperatur)

Laufmittel*) Antibiotikum

Rr-Wert

XK-62-3
XK-62-4
Fortimicin A
Fortimicin B
Fortimicin C
Fortimicin D
Fortimicin KE Gentamicin Komplex Gentamicin Ci_a Sisomicin
XK-62-3
XK-62-4
Fortimicin A
Fortimicin B
Fortimicin C
Fortimicin D
Fortimicin KE
Gentamicin Komplex Gentamicin Ci., Sisomicin

0,67

0,71

0,74

0,80

0,75

0,74

0,78

0,71

0,06

0,10

0,37

0,62

0,40

0,37

0,58

0,06-0,16

0.16

0.18

Tabelle III

Rf-Werte von verschiedenen Antibiotika bei aufsteigender Papierchromatogiraphie unter Verwendung der unteren Phase eines Gemische!, aus Chloroform, Methanol und 17% (Gew^Gew.) wäßrigem Ammoniak (2:1 :1 Volumteile) als laufmitte! und Whatman Nr. 1-Papier (nach 12stöndiger Laufzeit bei Raumtemperatur)

Antibiotikum

Rf-Wen

*) Laufmitlcl I: Obere Phase eines Gemisches aus Chloroform. Methanol und 17% (Gcw./Gew.) wäßrigem Animo niak (2 : i : 1 Volinriteile).

Laufmittcl M: 10% Ammoniuiiiacelat und Methanol (I : I Voliimteile).

Streptomycin A 0,02

Streptomycin B 0,00

Bluensomycin 0,0!

Ribostamycin 0.00

Lividomycin A 0.00

Lividomycin B 0,03

Hypromycin B 0,02

Lividomycin D 0,02

Spectinomycin 0,45

Kasugamycin 0,01

Butirosin A 0,00

Butirosine B 0,01

Gentamicin A 0,00

Gentamicin B 0.00

Gentamicin Ci₁, 0.!8

Gentamicin Ci 0.59

Gentamicin C: 0,38

Sisomicin 0,18

Neomycin A 0,00

Neomycin B 0,03

Antibiotic Nr. 460 0,01

Neomycin C 0,00

Kanamycin A 0,02

Kanamycin B 0,01

Kanamycin C 0,02

Paromomycin 0,00

Nebramycin Komplex 0,01

Tobramycin 0,02

Apramycin 0,02

Nebramycin Faktor 4 0,01

Nebramycin Faktor 5 0,00

Myomycin 0,00

Seldomycin Faktor I 0.00

Seldomycin Faktor 2 0.01

Seldomycin Faktor 3 0.00

Seldomycin Faktor 5 0.09

XK-62-2 0.49

Fortimicin B 0.65

Fortimicin A 0,37

Fortimicin C 0,18

Fortimicin D 0.18

Fortimicin KE 0.59

XK-62-3 0.40

XK-62-4 0.70

Die Tabciie IV erläutert die aniibiiktiHcllcn Wirkungsspektren von XK-62-3 und XK-62-4 gegen verschiedene Mikroorganismen.

Tabelle IV

Minimale Hemmkonzentration, j'/ml. gemessen nach der Agar-Verdünnungsmethode beim pH-Wert 8.0

Mikroorganismus	XK-62-3	XK-62-4
	;'/tril	•//ml
Bacillus subtilis No. IO7O7	< 0.0011	< 0.0011
Staphylococcus aureiis	0.0021	0.0021
ATCC 6538P
Klebsiclla pneumoniac	0.0082	0.0082
ATCC 10 Oil
Klcbsiella pneumoniac	0.06b	0.066
KY 4261
Eschcrichia coil ATCC 26	0.066	0.0 j 3
Eschcrichia mli KYStI(I	0.066
Eschcrichia coll KY 8327	0.066	_
(resisicni gegen Kanamycin.
Gentamicin und Tobramycin.
WT (2))')
Escherichia coil KY 83 32	—	0.033
(resisicni gegen Kanamycin.
AAC(6)-I)-)
Kscherichia coll KY 8348	0.03!
(rcsisicnt gegen Cicl.imicm.
A AC (3)-1)')
Kscherichia coli KY -S35o	0.26

Pseudomonas ;icrug:n(r,;i (1.26 0 26

BMH No. 1

Psetidomon.is aeruginosa 0.25 -■ IO

KY' 856 3 (resisient gegen
Gentamicin. AAC(B)-II)¹)

Pseudorvin.i'· .teruginosa 0.26 —

KV" 8511 (^rcM^"cnt gegen
Gentamicin. Λ AC (3)1)-)

Pseudomonas ,ieruginosa ,· !0 0.26

/. 4J4 (resistent gegen
Ge-\i;?iic:r. A A( ,'6 )-lll)·)

■^c·:.[.r.rr-inat aerueinosa Geri',:-\cn. AAC(^ (-1Ii;'')	0.26	0.26
?rr ·-.·■:<. Mi!g.,r:. \J( ( 6897	0.1 3	0.1 3
Sh:gc-,^:.> s. -γ··. ATr C O₂QO	0.033	0.066
ATC¹L 9992	1.52	0.01 1
Serratia marcescens KY 4248	1.04	0.26
Providencia sp. KY 8464

T(2 i. residenter Stamm durch 2' - Adern iierung. '■} WCIb)-I: resistenter Stamm durch 6'-N-Acetvlierun^

(T;o I).
'■) ACCiJi-C resistenter Stamm durch 3-^vw-Acetylierung

^Ji AACO)-M: -esistenter Stamm durch 3-N-Acetylierung

(Typ Ii).

•i AAC(6')-III: -existenter Stamm dü-ch 6-N-AeetUierung

(T;.ρ III). "

Die LD;-..-We-ie (mg/kg) von XK-62-3 und XK-62-4 be: dd-Mäusen mit einem Körpergewicht von 20±l g beiragen 106 bzw. 25.9 mg.'kg.

Aus den vorstehenden Werten ergibt sich, daß die Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 eine sehr starke antibakterielle Wirkung gegenüber den verschiedensten gram-positiven und gram-negativen Bakterien aufweisen. Die Verbindungen der Erfindung sind besonders wirksam gegen Mikroorganismen der Gattungen Proteus und Pseudomonas, gegen die nur wenige der bisher bekannten Antibiotika wirken. Ferner weist XK-62-3 eine starke antibakterielle Aktivität gegen bestimmte ι Stämme von Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa auf. die gegenüber verschiedenen herkömmlichen Antibiotika resistent sind. Insbesondere wirkt dieses Antibiotikum gegen bestimmte resistcnte Stamme, deren Inaktivieriingsmechanisnuis beispielsweise durch J-N-Acetylierung oder 2"-Adcnylicrung vor sich gehl. Somit ist XK-62-3 Antibiotika wie Gentamicin. Sagamicin (Antibiotikum XK-62-2) und Kanamycin überlegen, die gegenüber bestimmten rcsistenien Stamm cn üinwiksaiii sind, die eine inaktivierung, beispielsweise durch 3-N-Acctylierung oder 2"-Adenylierung. hervorrufen.

XK-62-4 zeigt eine starke antibakteriell Aktivität gegen bestimmte Stamme von Escherichia coli oder Pseudomonas aeruginosa. die gegenüber verschiedenen herkömmlichen Antibiotika resistent sind. Ferner ist diese Verbindung wirksam gegen bestimmte resistcnte Stämme, die eine Inaktivierung dieser Verbindungen durch best!; -..ntc Mechanismen, beispielsweise durch 6-N-Acclylicrung. hervorrufen. Somit ist XK-62-4 bekannten Antibiotika, wie Sisomicin. Dibckacin (3.4-Didesoxy-kanamycin B) und Kanamycin A. überlegen, die gegenüber bestimmten, rcsistenien Stämmen, die beispielsweise eine Inaktivierung durch b'-N-Acetylierung hervorrufen, unwirksam sind.

Nachstehend werden XK-62-3 und bekannte Antibiotika miteinander verglichen. Es sind folgende wasserlöslichen, basisch reagierenden Antibiotika, die durch Mikroorganismen der Gattung Micromonospora gebildet werden und ein breites antibakteriell Wirkungsspektrum aufweisen, bekannt: Gentamicin-Komplex (vgl. M. J. Weinstein und Mitarb.. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1963. S. 1: D. ). Cooper und Mitarb.. J. Infect. Dis.. Bd. 119 (1969). S. 342: und j. A. Waitz und Mitarb.. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Bd. 2 (1972). S. 464). Antibiotikum Nr. 460 (vgl. JA-AS 46-16 153). Sisomicin (vgl. M. J. Weinstein und Mitarb.. J. Antibiotics. Bd. 23 (1970). S. 551. 555 und 559). XK-62-2 (vgl. DE-OS 23 26 781). Fortimicin B (vgl. DE-OS 24 18 349). Fortimicin A (vgl. DE-OS 24 35 160). Fortimicin C (vgi. DE-OS 26 33 508) und Fortimicin D und KE(vgl. DEOS 27 48 530).

Aus den in Tabelle III zusammengestellten R,-Werten bei der Papierchromatographie ergibt sich jedoch, daß sich XK-62-3 und XK-62-4 von den genannten bekannten Antibiotika unterscheiden.

Ferner lassen sich als wasserlösliche, basisch reagierende Antibiotika, die durch Actinomyceten außerhalb der Gattung Micromonospora hergestellt werden und ein breites antibakterielles Wirkungsspektrum aufweisen, folgende Antibiotika erwähnen: Streptomycin A und B, Ribostamycin. Lividomycin A. B und D. Neomycin A. B und C, Kanamycin A. B und C. Nebramycin-Komplex, Nebramycin-Faktoren 4 und 5 und Paromomycin. XK-62-3 und XK-62-4 unterscheiden sich von diesen Antibiotika stark in ihren physikochemischen Eigenschaften. Außerdem ergibt sich aus Tabelle Ül. daß auch die Rf-Werte bei der Papierchromatographie stark unterschiedlich sind.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Gewinnung der Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 verwendete Stamm von Micromonospora sagamiensis van nonreducans erhielt die Hinterlegungsnummern NRRL Il 101 und FtRM-P 3962. Bei beiden genannten Hinterlegungsstellen wurde der Stamm als Micromonospora sagamiensis KY 11 504 bezeichnet.

Dieser Stamm wurde durch y-Bestrahlung von fi»:cromonospora sagamiensis var. nonreducans MK-62-NG-I64. ATCC 21 949 (vgl. DE-OS 23 26 781) erhalten. Morphologisch zeigt dieser Stamm die gleichen Eigenschaften wie der Ausgangssunnm. mit der Ausnahme, daß visuell die Sporenbildung bei der Mu lantc etwas geringer zu sein scheint.

Im erfindungsgemäßen Wriahren können herkömmliche Verfahren zur Züchtung von Actinomyceten angewendet werden. Das Züchtungsmedium kann verschiedene Nahrstoffquellen enthalten. Beispiele für entsprechende Kohlenstoffquellen sind Glucose, Stärke, mannose, Dexiiiri. rruciose. Saccharose und/oder Melassen, je nach der Assimilationsfähigkeit dti Mikroorganismen können auch Kohlenwasserstoffe, Alkohole, organische Säuren und dergl. angewendet werden. Beispiele für anorganische und organische Stickstoffquellen sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat. Harnstoff, Ammoniumnitrat, Natriumnitrat, die entweder allein oder in Kombination verwendet werden können. Ferner können natürliche Stickstoffqucllen eingesetzt werden, wie Pepton. Fleischextrakt, Hefeextrakt. Trockenhefe, Maisquellflüssigkeit, Sojabohnenmehl. Casaminsäure und lösliches Pflanzenprotein. Gegebenenfalls können anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid. Calciumcarbonat und Phosphate, dem Medium zugesetzt werden. Feiner können auch organische und anorganische Produkte, die das Wachstum des speziellen Stamms und die Bildung von XK-62-3 und/oder XK-62-4 fördern, zugesetzt werden.

Es können beliebige Züchtungsverfahren angewendet werden. Besonders bevorzugt ist ein Submersverfahren unter Rühren. Die Züchtungstemperatur beträgt vorzugsweise 25 bis 4O⁰C. Die Züchtung wird vorzugsweise bei einem pH-Wert um den Neutralpunkt durchgeführt. Im allgemeinen reichern sich XK-62-3 und/ oder XK-62-4 nach 2- bis I5tägiger Züchtung im flüssigen Medium an. Nach Erreichen der maximalen Antibiotikaausbeute in der Kulturflüssigkeit wird die Züchtung abgebrochen und das gewünschte Produkt aus der Kühlflüssigkeit nach Abtrennen der Mikroorganismenzellen, beispielsweise durch Filtrieren, isoliert und gereinigt.

Die Isolierung und Reinigung von XK-62-3 und XK-62-4 kann nach üblichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von mikrowellen Stoffwechselprodukten aus Kulturflüssigkeiten vorgenommen werden.

Da es sich bei den Antibiotika XK-62-3 und XK-62-4 um basisch reagierende Verbindungen handelt, die in Wasser leicht löslich, aber in üblichen organischen Lösungsmitteln schwer löslich sind, lassen sich diese Antibiotika nach den üblichen Verfahren zur Reinigung von sogenannten wasserlöslichen, basisch reagierenden Antibiotika reinigen. Insbesondere lassen sich XK-62-3 und XK-62-4 durch eine entsprechende Kombination an Adsorptions- und Desorptionsstufen von Kationenaustauscherharzen, Säulenchromatographie an Cellulose, Adsoprtion und Desorption an mit dreidimensional vernetzten! Dextragel (Sephadex® LH-20) und Säulenchromatographie an Kieselgel reinigen. Ein entsprechendes Verfahren zur Aufarbeitung der Kulturflüssigkeit, die nach Züchtung eines entsprechenden Mikroorganismenstamms erhalten worden ist und die XK-62-2, XK-62-3 und XK-62-4 sowie Nebenprodukte mit antibakterieller Aktivität enthält, ist nachstehend > angegeben. Das zellfreie Kulturfiltrat wird auf einen schwach alkalischen pH-Wert eingestellt und sodann über ein Kationenaustauscherharz, wie Amberlile® IRC-50 (Ammoniumform), gegeben. Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser wird mit I η wäßri-

I» ger Ammoniaklösung eluiert. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird sodann mil einem An ionenaustauscherharz, wie Dowex^s I χ 2 (OH -Form) behandelt. Die bei der F.lution erhaltenen aktivvn Frak- > tionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird auf einen pH-Wert von etwa 10,5 eingestellt und mit dem 4fachcn Volumen Aceton versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird ab filtriert. Das Filtrat wird eingeengt und mit Schwefel-

_>m saure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt. Sodann wird das 5- bis lOfache Volumen an Methanol zugesetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält ein rohes weißes Pulver mit einem Komplex der ΧΚ-62-Serie.

_>i Dieses rohe Pulver wird in Wasser gelöst und über eine mit einem Kationenaustauscherharz (Amberlitc-⁵ C-50, Typ I, NH4 * Form) gepackte Säule gegeben, wodurch die aktiven Bestandteile adsorbiert werden. Nach Waschen der Säule mit Wasser wird mit verdünnter

in wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Nach Elution von mehreren Spurenbestandteilen wird XK-62-4 eliiiert. Anschließend erhält man bei weiterer Elution XK-62-3 und XK-62-2. Die Fraktionen mit einem Gehal' an XK-62-3 oder ΧΚ-Ί2-4 werden vereinigt und unter ver-

r> mindertem Druck /ur Trockne eingedampft. Man erhält ein weißes rohes Pulver von XK-62-3 bzw. XK-62-4.

Anschließend wird das rohe Pulver der Säulenchromatographie an Kieselgel unter Verwendung von Kieselsäure AR (Mallinckrodt Chemical Works) Als Kievel-

w gelprodukt unterworfen. Als Laufmittel wird die obere Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chlorofon... Methanol. Aceton und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung (2:2:2:2: I Volumteile) bei der Reinigung von XK-62-3 und die obere Phase eines Lösungsmittel-

4Ί gemisches aus Chloroform, Methanol und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung (2:1 :1 Volumteile) bei der Reinigung von XK-62-4 verwendet. Das erhaltene rohe Pulver wird im Lösungsmittel suspendiert und auf die Säule gegeben. Die Elution wird mit dem gleichen Lösungsmittel durchgeführt.

Zunächst werden einige Spurenbestandteile und sodann XK-62-3 bzw. XK-62-4 eluiert. Die Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-3 bzw. XK-62-4 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft.

Der Rückstand win! in einer geringen Menge Wasser gelöst und gefriergetrocknet Man erhält gereinigtes XK-62-3 bzw. XK-62-4.

Bei den vorstehend erläuterten Reinigungsverfahren wird die Anwesenheit von XK-62-3 bzw. XK-62-4 in den Fraktionen durch aufsteigende Papierchromatographie an Whatman-Filterpapier Nr. 1 festgestellt. Die Elution wird mit der unteren Phase eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform, Methanol und 17prozentiger wäßriger Ammoniaklösung (2:1:1 Volumteile) als Laufmittei nach 6- bis 15stündiger Laufzeit bei Raumtemperatur durchgeführt Die Rf-Werte von XK-62-3 und XK-62-4 bei der Papierchromatographie betragen 0,4 bzw. 0,7.

Beispiel I A. Züchtung des Stamms KY 11 504

Als Anzuchtstamm wird Micromonospora sagamiensis var. nonreducan« KY 11 504, NRRL 11 101. FERM-P Nr. 3962 verwendet. Eine Öse dieses Stamms wird auf 30 ml des ersten Anzuchtmediums in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben überimpft. Das erste Anzuchtmedium enthält 1 g/dl Dextrin, I g/dl Glucose. 0,5 g/dl Pepton. 0.5 g/dl Hefeextrakt und 0.1 g/dl Calciumcarbonat. Der pH-Wert dieses Mediums vor der Sterilisation beträgt 7.2.

Die Züchtung wird 5 Tage unter Schütteln bei 30 C durchgeführt. Anschließend werden 30 ml der Anzuchtkultur auf 300 ml des zweiten Anzuchtmedium.s in einem 2-Liter-Erlcnmeyer-Kolben, der mit Prallplatten versehen ist, überimpft. Das zweite An/uchtmcdium hat die gleiche Zusammensetzung wie &<■"· crr.'c An zuchtmedium. Die zweite Anzuchtkultur wird 2 Tage unter Schütteln bei 30°C durchgeführt. Anschließend werden 1,5 Liter der zweiten Anzuchtkultur (entsprechend dem Inhalt von 5 Kolben) auf 15 Liter des dritten Anzuchtmediums in einem 30-Liter-Glasfermenter überimpft. Die Zusammensetzung des dritten Anzuchtmediums entspricht dem des ersten Anzuchtmediums.

Die Züchtung im Glasfermenter wird unter Belüftung (15 Liter/min) und Rühren (350 U/min) 2 Tage bei 30 C durchgeführt. 15 Liter der dritten Anzuchtkultur werden auf 150 Liter eines vierten Anzuchtmediums in einem 300-Liter-Fermcntcr überimpft. Die Zusammensetzung des vierten Anzuchtmediums entspricht dem des ersten Anzuchtmediums. Die Züchtung im Fermenter wird unter Belüftung (100 Liter/min) und Rühren (150 ü/min) 2 Tage bei 30⁰C durchgeführt. Schließlich werden 150 Liter der vierten Anzuchtkultur auf 1500 Liter eines Fermentationsmediums in einem 3000-Liter-Fermenter überimpft. Das Fermentationsmedium enthält 5 g/dl Dextrin, 3,5 g/dl Sojabohnenmehl und 0.7 g/dl CaCOi. Der pH-Wert dieses Mediums vor der Sterilisation beträgt 7,2. Die Züchtung im Fermenter wird unter Belüftung (500 Liter/m^:n) und Rühren (150 U/min) 5 Tage bei 30⁰C durchgeführt.

B. Isolierung von rohem Komplex der ΧΚ-62-Serie

Nach beendeter Züchtung wird die Kulturflüssigkeit mit 12 η Schwefelsäure auf den pH-Wea 2,0 eingestellt und 1 Stunde gerührt. Anschließend werden etwa 20 kg Filtrierhilfe (Radiolite Nr. 600, Showa Kagaku Kogyo Co., Japan) zugesetzt. Das nach dem Abfiltrieren der Mikroorganismenzellen erhaltene Filtrat wird mit 6 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 8.0 eingestellt und über eine mit etwa 100 Liter Ionenaustauscherharz (Amberlite® IRC-50, Ammoniumform) gepackte Säule gegeben. Das Eluat wird verworfen. Die aktiven Bestandteile werden am Kunstharz adsorbiert. Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser werden die aktiven Bestandteile mit I η wäßriger Ammoniaklösung eluierL

Die Aktivität des erhaltenen Eluats gegen Bacillus subtilis Nr. 10 707 wird nach dem Papierscheibenverfahren unter Verwendung einer Agarplatte bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 3 Liter eingeengt Das Konzentrat wird mit 6 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 8,0 eingestellt und über eine mit 3 Liter Anionenaustauscherharz (Dowex® 1x2 (OH--

Form) gepackte SHuIe gegeben. Die Säule wird mit etwa 20 Liter Wasser gewaschen. Auf diese Weise werden die Verunreinigungen entfernt. Die aktiven Bestandteile werden mit I η Ammoniak eluiert. Die akti-

-. ven Fraktionen werden vereinigt und auf '/io ihres Volumens eingeengt. Das Konzentrat wird mit 6 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 10,5 eingestellt und mit dem 4fachen Volumen Aceton versetzt. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert. Die Aceton-

Ki phase wird auf 2 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird mit 6 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 4,5 eingestellt und mit 10 Liter Methanol versetzt. Nach dem Abkühlen erhält man einen weißen Niederschlag. Dieser Niederschlag wird abfüllten und mit Methanol gewaschen.

r. Nach dem Trocknen unter vermindertem Druck erhält man 250 g eines weißen Pulvers (Sulfat).

C. isolierung iiiiu Reinigung voll XK-62-3

200 g des gemäß Stufe B erhaltenen weißen, rohen Pulvers (Sulfat) werden in 500 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 6 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 7.5 eingestellt und über eine mit 10 Liter

r, Kationenaustauscherharz (Amberlite® CG-50. NH₄'-Form) gepackte Säule gegeben. Das Eluat wird verworfen. Die aktiven Bestandteile werden am Kunstharz adsorbiert. Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser wird die Elution mit 0,2 η wäßriger Ammoniak-

Ki lösung durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen von 500 ml abgenommen. Die einzelnen Fraktionen werden nach dem vorstehend erläuterten Papierscheibenverfahren und durch Papierchromatographie auf ihre Aktivität untersucht. Zunächst werden einige Spurcnbe-

r, standteile mit einem Gehalt an XK-62-3. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 50 ml eingedampft. Man erhält 12 g XK-62-3 in Form eines weißen, rohen Pulvers.

Dieses rohe Pulver wird auf eine mit etwa 500 ml Kieselgel (Kieselsäure AR, Mallinckrodt Chemical Works) gepackte Säule der Abmessungen 35 ir-n mal 60 cm in Form einer dünnen, gleichmäßigen Schicht aufgesetzt. Das Kieselgel ist vorher in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform, Methanol, Aceton und kon-

4-, zentrierter wäßriger Ammoniaklösung (2:2:2:1 Volumteile) suspendiert und in Form einer festen, gleichmäßigen Schicht in die Säule gepackt worden. Das Kieselgel wird mit dem Lösungsmittelgemisch der vorgenannten Zusammensetzung gewaschen.

in Nach dem Aufsetzen des rohen Pulvers wird das Lösungsmitteigemisch der vorgenannten Zusammensetzung allmählich von oben auf die Säule gegossen. Anschließend wird eine kontinuierliche Elution mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 30 ml/Stunde

γ, durchgeführt Das Eluat wird in Fraktionen von 20 ml aufgefangen. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchromatographie unter Verwendung von Whatman-Papier Nr. 1 unterworfen, um die eluierien Bestandteile zu untersuchen. Die Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-3 werden vereinigt und unter vermindertem Druck wird eine ausreichende Menge des Lösungsmittels entfernt

Der Rückstand wird in einer geringen Menge Wasser gelöst Die erhaltene Menge ergibt nach dem Gefriertrocknen 1,5 g eines gereinigten Präparats der freien Base von XK-62-3. Dieses Präparat weist eine Aktivität von etwa 985 Einheiten/mg auf (die Aktivität von 1 mg reinem Präparat entspricht 1000 Einheiten).

D. Isolierung und Keinigung von XK-62-4

2no mg des gemäß den Stufen A und B erhaltenen weißen Pulvers (Sulfat) werden in 500 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 6 η Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 7,5 eingestellt und über eine mit 10 Liter Kationenaustauscherharz (Amberlite® CG-50, NHi'-Form) gepackte Säule gegeben. Das Eluat wird verworfen. Die aktiven Bestandteile werden an dem Kunstharz adsorbiert. Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser wird die Elution mit 0.2 η wäßriger Ammoniaklösung durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen von 500 ml aufgefangen. Die Aktivität der ein/einen Fraktionen wird durch das Papierscheibenverführen durch Papierci'romatographie. wie vorstehend erläutert, bestimmt. Zunächst werden einige Spurenbestandtcile und anschließend die Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-4 eluierl. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und auf 50 ml eingeengt. Das Konzentrat wird gefriergetrocknet. Man erhält 15 g XK-62-4 in Form eines »veißen. rohen Pulvers.

Dieses rohe Pulver wird oben auf eine mit 500 ml Kieselgel (Kieselsäure AR Mallinckrodt Chemical Works) gepackte Säule der Abmessungen 35 mm 0 χ 60 cm in Form einer dünnen, gleichmäßigen Schicht aufgesetzt. Das Kieselgel ist vorher in einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform. Methanol und konzentrierter wäßriger Ammoniaklösung (2 : 1 : I Volumteile) eluiert und in Form einer festen, gleichmäßigen Schicht in die Säule gepackt worJen. Das Kieselgel wird mit dem Lösungsmittelgemisch tier vorgenannten Zusammensetzung gewaschen.

Nach dem Aufsetzen des rohen Pulvers wird das Lösungsmittelgemisch der vorgenannten Zusammensetzung allmählich auf die Säule aufgesetzt. Anschließend wird eine kontinuierliche Elution mit einer Durchflußgeschwindigkeit von etwa 30 ml/Stunde durchgeführt. Das Eluat wird in Fraktionen von 20 ml abgenommen. Die aktiven Fraktionen werden der Papierchromatographie an Whatman-Papier Nr. I unterworfen. um die eluierten Bestandteile zu untersuchen. Die Fraktionen mit einem Gehalt an XK-62-4 werden vereinigt und unter vermindertem Druck von einer ausreichenden Menge des Lösungsmittels befreit.

Der Rückstand wird in einer geringen Menge Wasser gelöst. Nach dem Gefriertrocknen der Lösung erhält man etwa 2,2 g gereinigtes Präparat der freien Base von XK-62-4. Dieses Präparat weist eine Aktivität von etwa 980 Einheiten/mg auf (die Aktivität von I mg reinem Präparat entspricht 1000 Einheiten).

Beispiel 2
A. Züchtung des Stamms KY 11 504

Der gleiche Stamm wie in Beispiel 1 wird als Anzuchtstamm verwendet. Das Anzuchtmedium, das von der ersten bis zur dritten Anzuchtkuitur verwendet wird, enthält 2 g/dl lösliche Stärke, 0,5 g/dl NZ-Amin Typ A. 0,5 g/dl Hefeextrakt und 0,1 g/dl CaCO₁. Eine Öse der Anzuchtkultur wird auf 300 ml des Anzuchtmediums in einem 2-Liter-ErIenmeyer-Kolben überimpft. Die erste Anzuchtkultur wird 4 Tage unter Schütteln bei 30°C durchgeführt. Anschließend wird der Inhalt von 3 Kolben der ersten Anzuchtkultur auf 15 Liter eines frischen Anzuchtmediums in einem 30-Liter-Glasfermenter überimpft Die zweite Anzuchtkultur wird 2 Tage bei 30⁰C unter Belüftung und Rühren durchgeführt.

Anschließend werden 15 Liter der zweiten Anzuchtkultur auf einen 300-Liter- Fermenter mit einem Gehalt an 150 Liter Anzuchtmedium übertragen. Die dritte Anzuchtkuitur wird 2 Tage bei 30⁰C unter Belüftung . und Rühren durchgeführt.

Sodann werden 150 Liter der dritten Anzuchikultur auf einen 3000-Liter-Ferrner.ter mit einem Gehalt an 1500 Liter Fermentationsrnedium übertragen. Das Fermentationsmedium enthält! 4g/d! lösliche Stärke, ι _L, til in Maisquellflüssigkeit, 2 g/dl Sojabohnenmehl, 0.05 g/d! K-HPO₁. 0.05 g/dl MgSO₄ -7 H₂O. 0,03 g/dl KCI. 0.005 g/dl CoCI, · 2 H₂O und 0,1 g/dl CaCO₁. Die Züchtung wird 4 Tage bei 30"C unter Belüftung und Rühren durchgeführt.

B. Isolierung von rohem Komplex der ΧΚ-62-Serie

Nach beendeter Züchtung wird die Kulturflüssigkcil mit 12 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 2,0 eingestellt und in Minuten gerühr!. Anschließend werden c;«,t > 20 kg Filtricrhilfe (Radiolste Nr. 600. Showa Kagaki: Kogy.'. lapan) zugesetzt. Pas nach dem Abfiltrieren der Mikroorganismenzcllcn erhaltene Filtrat wird mit 6 π Natriuriihvdroxidlösung auf den pH-Wert 8,0 eingestellt und über eine mit 100 Liier Kationcnaustauscherhar/ J-. (Ambcrlitc-' IRC-50, NlL -Form) gepackte Säule gegeben. Nach dem Waschen des Kunstharzes mit Wasser werden die aktiven Bestandteile mit I η wäßriger Ammoniaklösung eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen ab genommen. Die Aktivität der einzelnen Fraktionen gern gen Bacillus subtilis Nr. 1(1707 wird nach dem Papierscheibenverfahren unter Verwendung einer Agarplatie bestimmt. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf ein Volumen von 2 Liter eingeengt. Das Konzentrat wird mit 6 η Schwefelsäure auf den pH-Wert 4.5 einge-1Ί stellt. Die erhaltenen unlöslichen Bestandteile werden abfiltriert. Das Filtrat wird mit 20 Liter Methanol versetzt, wodurch sich ein weißer Niederschlag bildet. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Nach dem Trocknen unter vermindertem Druck 4ü erhält man 500 g eines weißen Pulvers, bei dem es sich um rohe Antibiotika der ΧΚ-62-Seric (Sulfate) handelt.

C. Isolierung von XK-62-3

200 g des gemäß Stufe B erhaltenen ruiien Pulvers '"> werden gemäß Stufe C von Beispiel 1 isoliert und gereinigt. Man erhält 1,1 g gereinigtes XK-62-5 mit einer Aktivität von 970 Einheiten/mg.

D. Isolierung von XK f)2-4

200 g gemäß vorstehender Stufe B erhaltenes rohes Pulver werden gemäß Stufe D von Beispiel 1 isoliert und gereinigt. Man erhält 1,1 g gereinigtes Präparat mit einer Aktivität von 970 Einheiten/mg.

Beispiel 3 Herstellung des Sulfats von XK-62-3

bo 1 g freie Base von XK-(i2-3 werden in 5 ml Wasser gelöst. Anschließend wird die Lösung mit 1.8 ml 6 π Schwefelsäure versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit 100 ml Methanol versetzt, wodurch ein weißer Niederschlag entsteht. Dieser weiße Niederschlag wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Anschließend wird der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 13 g Sulfat von XK-62-3 mit einer Aktivität von etwa fiin Finholton/mn

Beispiel 4
Herstellung des Sulfats von XK-62-4

1 g freie Base von XK-62-4 werden in 5 ml Wasser gelöst. Anschließend wird die Lösung mit 1,8 ml 6 π Schwefelsäure versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit

100 ml Methanol versetzt, wodurch ein weißer Niederschlag entsteht. Dieser weiße Niederschlag wird abfiltriert und mit Methanol gewaschen. Anschließend wird der Niederschlag unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,2 g Sulfat von XK-62-4 mit einer Aktivität von etwa 625 Einheiten.

030 147/310

Claims

Patentansprüche:

1. Antibiotika XK-62-3 und XK-l>2-4 der allgemeinen Formel I

CH,NRi NHCH₃

HO I CH₃

VYOH
OH Ao'

o I ο

NH,