DE2239964A1 - Neue antibiotika und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

j
Die Erfindung betrifft ein neues mit G-418 bezeichnetes Antibiotikum und seine Herstellung duroh Kultivierung von zwei bisher unbekannten Arten der Gattung Mioromonspore, nämlioh Mioromonospora rhqdorangea und Mioromonospora grisea. '. » '

Ferner betrifft die Erfindung ein weiteres neues mit Verdamicin I bezeichnetes Antibiotikum, welches zusammen «it Antibiotikum G-418 duroh Bebriltung des Mioromonospora grisea hergestellt wird. Außerdem umfaßt die Erfindung ein n^ues Verfahren zur Herstellung der bekannten Antibiotika S$8omioin und Gentamicin A, welohe ebenfalls gleichzeitig durch die BebrUtung des M^grigea hergestellt werden. Die Erfindung betrifft auch die pharmazeutisch annehmbaren Derivate der neuen Antibiotika Verdamicin I und G-418, wie die Säureadditionssalze uid Sohiffsohe-Baee-Oxazolidln-

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Derivate, welche ebenfalls wertvolle Antibiotika

Die Erfindung bezieht sich auch auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die eines der neuen Antibiotika G-'ilB und Verdamicin I oder eines von deren pharmazeutisch annehm- . baren Derivaten enthalten.

Mioromonospora rhodorangea (iin weiteren manchmal als M.

rhodorangea bezeichnet) wurde auf Grund seiner taxonomischen und Waohstums-Eigensohaften auf einer Anzahl Standard-Agar-Medien als neue Art des Miororaonospora klassifiziert. Auf solchen Medien haben die Kolonien ein rot-oranges Aussehen und der Mioroorganismus wurde daher als Micromonspora rhodorangea bezeichnet. Die Bildung des Antibiotikum G-kiS ist ein Kenn-

zeiohen dieser Gattung. Mioromonospora rhodorangea wurde

an der Northern Utilization Research and Development Division,

U. S. Dept. of Agriculture, Peoria, Illinois hinterlegt, und deren Sammlung von Microorganismen als NRRL 5326 hinzufügt.

Der Microorganismus hat die folgenden mikroskopischen, makroskopischen und biooheraischen Eigenschaften:

(a) Makroskopische Beobachtung einer TO-Tage alten Kultur, bebrütet bei 24° - 26⁰C auf einem Medium mit 3% NZ Amin Type A, 1% Dextrose und 1,5% Agar, zeigt geringes Waohstum mit keinen siohtbaren unterscheidungakraftigen Kennzeichen.

(b) Mikroskopisohe Beobachtung derselben Kultur zeigt, daß

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das Mycel etwa 0_?'f-0,8/u Durchmesser hat und leicht verzweigt ist. Chlamydosporen werden gel genti ich heohachtet; echte Sporen sind jedoch nicht zu heohachten. Die Gattung scheint daher eine nichtsporende zu sein.

(c) Beobachtungen auf Emerson's Agar, Bennett's Agar, Hefeextrakt-Dextrose-Agär und Stärke-Agar sind im wesentlichen die gleichen wie unter (b) beschrieben.

Dieser Micro-organismus ist aerobisch' und kann leicht bei

ο _o
^Temperaturen von 20 bis hO C und bei einem Pjj-Wert von his 8,5 kultiviert werden. Der bevorzugte Temperaturbereich ist 28° bis 35°C und der bevorzugte p„-Bereich

ο 7,2 bis 8,3. Kein Wachstum ergibt sich bei öder über 45 C.

Micromonospora rhodorangea reduziert Nitrat»,

In den Beschreibungen der Microorgansimen M.rhodorangea und M. grisea werden im folgenden zwei Farbbezeichnungen verwen^· det» Die erste Farbbezeichnung wurden aus "Color Harmony Manual", k. Ausgabe, 1958, v. offentlicht von der Container Corporation of America (USA) genommen und die Boschreibung für die erste Farbbezeichnung wurde aus "Desriptive Color Name Dictionary" von Taylor, Knoche und Granyille, ebenfalls veröffentlicht von der Container Corporation of America (l95O) genommen. Die zweite Farbbezeichnung ist ein Synonym oder nahezu ein Synonym der ersten und wurde aus dem National Bureau of Standards Circular No..553 (l955) U.S.A. genommen.

In den Tabellen I, II und III sind weitere Eigenschaften des M.rhodorangoa gezoigt:

309824/1182.

ΤΑΠΙ'!LLE I

BEOBACHTUNGEN VON KOLONIEN DES MICROMONOSPORA RHODORANGEA

AUF VERSCHIEDENEN MEDIEN

Medium Beobachtung

Glukose Asparagin Agar kein Wachstum

Gelatine schwach verflüssigt

Milch

Czapek's Sukrose Agar (Firtco) Wachstum gut, Hydrolyse vollständig, Kolonie gefaltet, g6pa helles Korallenrot, lebhaftes rötliches Orange T>4

Sukrose	aufgebraucht	Hydrolyse voll—
Sta'rke	Wachstum gut, ständig
ZeIluloso	zersetzt

Wachstum schlecht, flach, Farbe: g7pl burgunder, dunkel grau, rötlich braun hl

Bennett's Agar Wachstum gut, gefaltet, membranartig, kein Luftmycel, kein diffundierbarcs Pigment, Farbe g6pg chinarot tief rötliches Orange

Toma tonmark— Hafermehl-Agar Wachstum schlocht, nicht aufzeich— nungsfähig

Glukose Hofooxtrnkt Agar Wachstum mäßig, niembranarti c koin Luftinycol , koin diffunddorbarcjs Pigniont, Farbe ci>pc rauchrot-, rötlich braun 43

— K «

Kartoffeleoheibe

keifa Waohsturn

Sukrose-Nitrat-Agar (Szapek's Agar) -Wachstum sohleoht, flach,* p7 ΐ/2ρϊ dünkelweinrot, dunkelrotbraun hk

Tyrosin

Agar (Tyrosin Hefe)

Tyrosin Rindfleisch /Beobachtungen nach 2, und lh Tagen (nach Gordon und Smith, J.Baot. 69:1^717 Wachstum gut, gefaltet, Kristalle gelöst, dunkel bernsteinfarbenes, diffundierbares Pigment.

Wachstum schlecht, flach, Kristalle nicht gelöst, schwach bernsteinfarbenes diffundierbares Pigment.

Pepton Eben Agar Beobachtungen nach 2, und 14 Tagen kein Wachstum

Czapek-Glukose Lösung

Wachstum nach 3 und 10 Tagen sdieoht Maserung ein sehr feiner flooku- lierender Niederschlag; eine matte gelblich orange Farbe in dem Brei nach 10 Tagen Bebrütung vorhanden.

Brom-Kresol Purpurailch vollständig peptonisiert, dunkel rotbraun

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TARELLE II VERWENDUNG VON KOHLENHYDRATEN

Kohlehvflrnt fieobaehttinc

L (+) Arabinoso

D (-) Ai*abinose Zellulose

D (+) Glukose D (-) Galaktose ß-Laktoso

D (-). Lävulose(Fruotose) D (+) Mannose D (+) Raffinose L (+) Rharanoso Stärke

Sucrose D (+) Xylose i-Inositol D (+) Mannitol Sorbitol

zur Kontrolle 0,5$ Hefe
Extrakt

Wachstum niäßip;

Ii	Il
H	mi ttolmäßig
ti	gut
»'	mittelmäßig
»1	Il
Il	schlecht
It	gut
It	schlecht

gut

schlecht

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TABELLE TIT

VERWENDUNG VON STICKSTOFFQÜELLEN

Stickstoffquellon + 1% Glukose

Beobachtung

0,5% nifco Hefe-Extrakt Wachstum mäßig, membranartig
kein Luftmycel, kein diffundierbares Pigment, Farbe g6 l/2 pg rauchrot,
tief rötlich-braun hl

1,0% NZ Amin Type A

Wachstum mittelmäßig, flach, gerillt, Icein Luftmycel, kein diffundierbares Pigment, g6pc chinarot, tief rötlich orange J6

Asparagin Wachstum schlecht, flach, kein Luft— nyool, kein diffundierbares Pipncnt, g6pi mahagonibraun, tief rötlichbraun hl

Vfn Glutaminsäure

Wachstum schlecht, flach, kein Luftmycel kein diffundiorbares Pigment, Farbe
g7pi dunkel woinrot, dunkel rötlichbraun hh

I⁰Jn Natriumnitrat

kein Wachstum

Ammoniumni trat

kein Wachstum

-S-

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Der Mikroorganismus Mioromonospora grlsea (im weiteren manchmal als M.griso. ozeiohnet) wurde aus Erdproben aus der Nähe von Topeka, Kansas, erhalten. Der Mikroorganismus wurde DeIm United States Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peorla, Illinois, wo Subkulturen erhältlich sind hinterlegt, und erhielt die Bezeich— ung NRRL 3800.

Mlcormonospora grisea wurde auf Grund seiner taxonomlsehen und Waohstums-Eigenschaften auf einer Anzahl von Standard-Medien als eine neue Gattung der Mloromonospora klassifiziert.

Mioromonospora grlsea bildet beim Kultivieren auf verschiedenen Medien, z.B. dem unten angeführten Kennzeiohnungs-Medium ein grau-grünes Pigment· Das unterscheidungskräftigste Kennzeichen des Mioromonospora grisea 1st seine Fähigkeit, unter

kontrollierten Bedingungen ein antlblotisoh wirksames Produkt 7IU bilden, welches aus vier, Im folgenden näher erläuterten Hauptkomponenten und kleineren Mengen anderer Substanzen, die nooh zu identifizieren sind, besteht.

Kennzeichnungsmedium

DIfoo Hefe °>5^

Sucrose 3

Kalziumkarbonat 0,1%

Difoo Agar 1,5$

Wässer (destilliert) 1,0 Liter

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Venn das sterilisierte Medium mit Microraonospora grisea beimpft und bei 26° - 28^eC für 2k Tage bebrütet wird, werden folgende Farbentwicklungon beobachtet:

Sfcorulationsbereich: schief ergrün g23H, graugrün 150; bei längerer Bebrütung kann der Spprulationsberelch schwarz werden.

Vegetativ-Bereioh: leioht getönt g3go, leicht gelblich braun 76*

Mioromonospora grisea kann weiters durch die folgenden taxonomi-•ohen Daten gekennzeichnet werden:

Medium: yfo NZ Amin Type A, 1% Dextrose

1,5^ Agar . . Beobachtungen (21 Tage nach Beimpfung)

Makroskopisch Mikroskopisch

Wachstum Mittelmäßig, gefaltet; Myoel lang,· spärlich verzweigt, Peripherie: leioht getönt .0,5-0^8 μ im Durchmesser. g3go, leicht gelblioh braun 76 Sporen verhältnismäßig reichlich Zentrum: blberfarben g31i, einzeln gebildet, erscheinen braundunkel grangeIbbraun 81, farbig bei einfallende» Licht,

fU im Bnrohiaesser, aöhei— zu sein.

grisea reduziert litrat nloht_f wäohst gut aaf■ Gelatin unter Hydrolyse und wüeSygt i» t_t5% Natrlnaoblerie «Kthelteuden Meäien, wSohst aber aiefet in ähnlisliOT M®<ii®is_? dl· 3% »Ätri«ti0iil©rid enthalten. .!

Hieroaonospora grisea braucht für gutes Wachstum nn&

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- IG -

■oh· Produktion assimilierbare Kohlenstoff und Stickstoff-Quallen· Eine Vielzahl solcher Quollen kann verwendet werden.

Dieser Mikroorganismus ist aerob und wächst hei Temperaturen von 20° bis *0°C, vorzugsweise 2B¹VbIs 35⁰C, und bei Pjj-Werten von 6,5 bis 8_f5_f vorzugsweise 7,2 bis S,3.

Zusätzlich zu den vorgenannten taxonomisehen Daten, wird der M.grlseä in den Tabellen IV, V und VI weiter gekennzeichnet:

TABELLE IV

BEOBACHTUNGEN VON KOLONIEN DES MICROMONOSPORA GRISEA AUF VERSCHIEDENEN MEDIEN

Medium Beobachtung

Czapek¹s Medina . Wachstum: sohleoht, nicht beschreibbar (Glukose)

Asparagin-Glukose Wachstum: mittelmäßig bis sohlecht, Medium körηiff, hellbraun g31g_v mK&ig gelb

lich braun 77

Kalzium- Wachstum: sohleoht, nicht beschreibbar

m*lat

Agar

Gewöhnliche· Agar (Wasser Agar)	Wachstum ι	sohlecht,	nicht	besehreibbar
Nähr-Agar	Wachstum:	schlecht,	»loht	beichreibbar
Loeffler 's Serum Medium (Difco)	• Wachstum:	sohlecht,	keine	Reaktion

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- ii -

Kartoffel

Wachstum: gut, gefaltet, leicht cetönt g3gc, hell gelblich braun 76

Pepton—Glukose Agar

Wachstum: schlecht, nicht beschreibbar

Ei-Agar (Dorset Egg Medium Difco)

Wachstum: schlecht, keine Reaktion

Stärke Agar

Sucrose Nitrat Agar :(Czapek¹s Agar)

Wachstum: gut, gefaltet-gerillt, kein Luftmyoel

Farbe: senfbraun g2$ri, mäßig olivegrUn 107

Hydrolyse: positiv

Lackmus Milch (Difco)	Teilweise peptonisiert mit Säure— ' Reaktion
Zellulose Medium	Zersetzung sehr langsam, braucht 3-6 Monate oder länger *
Bennettfs Agar	Wachstum: gut, gefaltet, g24ml efeu- farben, dunkel graugrün 151
Emerson's Agar	Wachstum: mittelmäßig, flach, g3gc leicht getönts hell gelblieh braun 76
Tomatenmark Hafermehl—Agar	Wachstum: mittelmäßig, erhöht,, gerillt, g'iga marillonfarbig, hell orange 52
Glukose Hefe extrakt Agar	Wachstum: gut, gefaltet, g31E kamel farbig, mäßig gelblich braun 77
Kartoffelscheibe	Wachstum: gut, gefaltet, leicht getönt g3gc, hell gelblich braun 76

Wachstum:mittelmäßig, flach, g3ec hellbeige, hell grau-gelblich braun 79

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- 12 -

• *

Tyrosin Agar Wit oh stum t sohleoht, keine Farbreaktion Beobachtungen noch 2,7

und lh TaRen (nach Gordon und

Smith, J.Bact. 69:147)

Pepton-Elsen-Agar _

Beobachtungen nach 2,7 und 1% Tagen Wachstumt aittelnK&ig, keine Farbreaktion . '

Glukove-Aaparagln« Agar

Wachstum: mittelmäßig bia schlecht, körnig, g^lg hell braun, mittleres gelblichbraun 77

Milch

Hydrolyse: positiv. Wachstum:schlecht

Csapek-Glukose Ltfsung

Wachstum nach 3 und 10 Tagen schlecht; Maserung nicht beobachtbar; eine blasse Strohfarbe In dem Brei nach 10 Tagen . BohrUtung vorhanden

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t ΐ

TABELLE V -

VERWENDUNG VON KOHLEHYDRATEN

Kohlehydrat Vaohstum

L (+) Arabinose gut

D {—) Aratiinose " ^ί

D {+) Glukose "

D C-) Lävulose »

D (<♦►) Mannose »

Sucrose ' « ■

D (+} Xylose "

Stärke ^5f

Dwlcitol

B C*) Galaktoso ^w

Glyoeri« "

1-Znositel ⁿ

ß-Laktose »

•i-B {■*-) Keliblose ■ ·_ ^Ά"

D C+) leffirtos© . - ^!S'

I» C*) Rbasiiosö "

S« Ii ein "

®A$. Hefe

TABELLE VI VERWENDUNG VON STICKSTOFFOUELLEN

Stickstoff Quelle (♦l£ Glukose)	Wachstums—Beobachtungen
0,5% Dlco Hefe Extrakt	Gut
1,0% NZ Amin Typ,· A	Gut
IiC Asparagin	Sohlecht
1% Glutaminsäure	Schlecht
1% Natriumnitrat	Schlecht
1% Ammoniumnitrat	Sohlecht

Jn Taboll VII sind M.grlsoa und M« rhodorangea mit anderen Mi,cromonospora_t welche Antibiotika produzieren, verglichen:

161124/1112

+) Sporenbildung schlecht oder

abortic

Tabelle VII

(NRRL 5326)

Vergleich von Micromonospora Grisea und M.Rhodorangea mit anderen Micromonospora

M.purpu- M.echino- M. cärbona- M.carbona- M. megalomi- M.grisea M.rhodorangea rea spora cea var. car- cea var. au- cea (NRRL (NRRL (NRRL bonacea(NRRL rantiaca (NRRL 3274 3800) 2953) 2985) 2972) (NRRL 2997) und 3275)

Sporenträger ₊ n · ' ·. lang ja'' ja ja ja ja

Sporen-:

träger " ₊s

verzweigt ja ja

Sporen- ₊n

träger kurzja ja

Wachstum auf mittel- mittel-Nähr-Agar massig massig bis bis schlechtesehleeht

Wachstum auf
Kartoffel schlecht schlecht

Gelatin

Verflüssig, schwach schwach Stärke

Hydrolyse ja ja

Sucrose
Umwandlung ja Zellulose in schwa-Zersetzung ehern Aus-

Antagoni"
sten

ja

in schwachem Ausmass ange- mass angegriffen . griffen

Gerita- Gentamicin mi ein

ja

ja

mittelmässig his schlecht

mittelmässig ■ ja ja

ja. ' ■

in schwachem Ausmass ange- - griffen

Everninomicin

ja

ja

ja

ja

ja

ja

mittelmässig

bis schlecht schlecht ' schlecht

mittelmässig nein

j a

in schwachem
Ausmass angegriffen

Everninomicin

nein
ja
ja

nein

'gut

ja

ja

ja

langsam

nein

nein nein schlecht

schlecht ja ja

ja

Megalomicin Antibioticum Antibioti-G-4l8,Verdami-cura G-

" "" :cin !,Sisomicin

Gentamicin A

Die Fermentation des Mlcromonospora rhodorangea und Mloromonospora grlsea wird unter Anwendung von Standardverfahren «ur Heretellung von Antibiotika duroh Kultivierung von Mikroorganismen durch* gefUhrt.

Wesentliche Mengen an Antibiotika werden erzengt, wenn die betreffenden Mikroor nismen in einen wässerigen Ntthrmedlttm welohee assimilierbare Kohlenstoff- und Stlokstoffquellen enthält, unter .aeroben, vorzugsweise eubnersen aeroben Bedingungen« kultiviert werden· Beispiele assimilierbarer Kohlenetoffquellen sind Kohle» hydrate, wie jene In den Tabellen II undW angegebene« insbesondere Glukose, Xylose und Mannose· Beispiele assimilier-

barer Stickstoffquellen sind Proteine und Aminosäuren, und ' . dleee enthaltende Substanzen, wie z«B_t ftlndfleleohextraktHefee*- trakt und So.iftbohnenmehl» ätitee Vaohstum und Antibiotikumbildung

-17-

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werden erhalten« wenn die in &®n folgenden Beispielen 1 und 5 111 β 7 angefühlten Fermente ti ©aerdrfafir en aisgewendet werden. Die Medien körnen «it Sjs«reiaü®ng@ti aaorgaasiafeer Salze» wie z»B, Magnesiumsulfat, Eieeiiaislfst mg& lgabeaOaderg ICöfoaltöhlorid₉ tr* werden» na dl«

Di· Fermentation wiy$ diirohgfführt, w^bei fen der Keimung ües g««lgneteti Ia©fe«iuE

80Bllii«lfl««oli*a->Ferattitetisü^ss

its

eSrei Stufen

g©wi^a@t sini« se ®in

;i %

0124/mi

- 18 -

fordern« Die Keimlings stufen werden unter aeroben Bedingungen unter Schütteln,' vorzugsweise Dreh-Schiit tel bei z.B. 250-400 Uadrehungen pro Minute, gowöhnlioh bei einer Temperatur la Bereich von etwa 25° bis 35°C für 1 bis 4 Tage, durchgeführt·

Dl· letzte Fernentationsstufe (Produktionsstufe) wird durch Beimpfung eines geeigneten Mediums mit dom vorher bereiteten Inokulua unter sterilen Bedingungen eingeleitet; Die Produktionestufe der Fermentation wird gewöhnlich in selben Temperaturbereich wie die Keiiiungestufe durchgeführt. Welters braucht sie gewöhnIi6h etwa 4 bis etwa 7 Tage, um Spitzen" Wirksamkeit zu erreichen· Zum Unterschied von der Keimungsstufe, bei der der ©«-Wert gewöhnlich stabil bleibt, erfordert die Produktlonsatufe eine Regulierung des Pjj-Vertes auf einen Bereich von etwa.7,2 bis etwa 8,3, Insbesondere . wenn M.grisea verwendet wird«

Ia Laufe der Fermentation,_:insbesondere nach den ersten 24 Stunden, wird die Fermentation, in geeigneten ZeitabstMnden (z«B «11· 6 bis β Stunden) überprüft, um festzustellen, wa»n dl· Spitz« der antibiotisohon Aktivität erreicht 1st.

Di· Prüfung ist vorzugsweite eine Stand rd-Scheiben-Platten-«

Frtbe unter Verwendung οines Standard-Mediums und T«st-Organls- · llnzelhelten bevorzugter Proben werden in einem späteren

S0§§2t/11t2

Abschnitt der Beschreibung gegebeia,.

Venn die Spitze der antibiotischen Aktivität erreicht ist, wird das Produkt gewonnen, im'allgemeinen durch" eine Kombination von Stufen^ wie Ansäuern, Filtration, Adsorption, Elution und Eindampfen, z.B. Lyophilisation. Ib -einem bevorzugten Isolierrerfahren werden vorhandene Kalzium!onesa als ein unlösliches Salz ausgefällt, die ganze Brühe angesäuert, vorzugsweise mit einer Mineralsäure, und das Fcnarantationsgemisch durch Filtration oder Zentrifugieren gelclärt. Räch dem Neutralisieren wird das antibiotische Produkt auf ein geeignetes Kationen—Austausch-JIarz adsorbiert, z.B» ein schwach saures· ionen—Austausch-Harz in der Ai2moninsf©yja,iait verdünntem Alkali, vorzugsweise Ammoniumhyäroxyd, eluiert und durch Eindampfen, z.B durch Lyophilisation, isoliert.

In einem besonders bevorzugten ¥©rfanreia werden zirka 5 bis 8 g/l der Fermentation Oxalsäure "zu der ganzen Brühe hinzugefügt, um Kalzium als das, lasltSsliefo© Oxalat auszufällen, und der p^-Vert der Fermentation wird mit starker Mineralsäure, z.B. 6n Schwefelsäure, auf 2,0 eingestellt, um die Antibiotika aus dqm Mycel freizusetzen. Nach dem fliltirieren wurd die geklärte Briilas mit Ammonium hydroxyd neutralisiert, die Antibiotika werden auf AmberIite IRG« 50 NTI* 20 - 50 Mesh Ionen-Austauscij-Harz (Rohm und Haas, Philadelphia, Pennsylvania) adsorbiert miä die verbrauchte (extrahierte) Brühe wird wecgeleert. Bi© antibiotische

- 20 -

■ „ ■ · * ■ ■

Zusammensetzung wird von des Hare Hit einer Bai«« vorttugsweise en Ammoniumhydroxyd, eluiert und das Bluat wird im Vakuum auf ein kleine« Volumen eingeengt und nur Trookene ein« gedampft, »«B« dnroh Lyophilisation*.

• I. . '

Wenn «an dae rohe>bei der Kultivierung Von Mloromonospora rhodorangea in der Isolieretufe erhaltene Produkt,einer Chromatographie und Bioautograptiie unterwirft, werden eine Anzahl von InhlbltatlonsKonen beobachtet» Beispiel S-weine werden bei Verwendung eines Chromatographieoben Systene bestehend aus e-Bptanon-tert.-Butanol-4fethanol*- konz· Aemoniak Im Verhältnis von I6t3sit6 (v/v) auf Vhatman No.4 Papier, fallend Über Naoht (16 Stunden), ein Haupt- und etwa fünf Nebenprodukte duroh Bioautographie gegen Staphylococcus aureus ATCC 6558P entdeokt. Antibiotikum G-418 (das Hauptprodukt) ist das an wenigsten polare der Gruppe»

Aue den folgenden physloohenlsohen Daten und den chemischen Abbau wird angenommen, defl Antibiotikum 0-418 die In der untenstehenden Formel I gezeigte Struktur hat· Aue der genannten Strukturformel₍können jedooh keine Schlüsse be- «Uglioh Stereoohemie gesogen

1 I

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- 2i -

1.

Wenn das Im wesentlichen reine Antibiotikum β-418 einem ohromatographisohen Standard-Verfahren unterworfen wird, zeigt es folgendes Sohemai

I« Chloroform-Methanol-konz. Ammoniak auf Chromar 500 (aufsteigend) 0

II. 2-Butanon-tert«- Butanol-

Methanol-konz. Ammoniak (fallend)

III« 80$ wässeriges Phenol (aufsteigend) 0,32

R₊(l6 Stdn)

0,24

IV· Methanol-Wasser, +3$ NaCl (fallend)

V« Propanol-Pyridin-Essigsäur©«»
Wasser (aufsteigend)

ώ Entfernung der Zone voisi ufgeprtuag

Afc * Ä " ' 1t · im hu ι·" ■ .Irin Ii *Μ!^οΜΗΜΜ(ΜΜΜ·ιι·ιιη min nil Ii Ij iijiiii v* »aJümmmmMB ι m ι·*

^ Entfernung vo« Ursprunl anis End& i

0,64

0,31 Zeit

Papiers

/»■

Antibiotikum G-418 let ei$ Arefnoglykosiä-AntiDiotikuai und gehört datier ssur Klases, φΐο^β Gentamicin_$ Hsowyoin, Paromoy-

und Kanaay^in Umfaßt» B* nitfä gawöftnllofe in

309824/1102 . -M-

Fora einen amorphen weißen Feststoffen mit folgenden physikalischen Konstanten Isoliert: Schmelzpunkt 11R°-14^|I^OC; Drehung: + 140° * 9° (c=0,3, H₂ ⁰)? Molekulargewicht (Massenspektrometrie) » 497? Summenformelt ^C2oⁿ4O°lO^li% (Base);

N.M.R.Spektrum: Im wesentlichen wie in Figur k der angeschlossenen Zelohnungen gezeigt, welohes aus einer LHsung erhalten wurde, die 15% des Antibiotikum G-418 in Deuterium -Methanol enthftlt mit "% Tetranethylellan» welches als Standard zugesetzt wurde.

I.R.Spektrum ι In einem Nu.tolmull, Im wesentliohen wie in Figur 3 der angeschlossenen Zeichnungen gezeigt, welohes die folgenden kennzeichnenden Absorptionsbänder hats

3,02 μ

6.S2 >

7,76 >

8,70 μ

9,07 /J

9,49 /ι ι

9,77 μ

10,42 μ I

11.86 ja fW

13.87 μ (W]

(S) a Stark, (μ) = MIttel, (w) = Schwaoh. Die Feststellung der Antibiotika und Bestimmung der . Homogenität der Fraktionen bei der Kultivierung von Micromonospore grlsea wird mittels Papierohromatographle durchgeführt und wird durch zwei Verfahren erreicht]

1) durch die Verwendung von Reagenzien und

2) durch ein Miorobial-Verfahren· Das erste Verfahren wird durchgeführt, indem Papierchromatografie mit 0,25# Ninhydrtn in Pyridin-Azeton besprüht und daraufhin auf 105⁰C für

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mehrere Minuten erhitzt werden. Die Zonen erscheinen gegen einen weißen Hintergrund als farbige Flecken»

Microbiale Feststellung der antibiotischen Zonen wird durchgeführt, indem man das Papier auf..eine mit Staphylococcus aureus ATCC 6538P besäte Agarplatte legt. Nach 10 Minuten wird das Papier entfernt und nach einer geeigneten Inkubationsperiode (gewöhnlich 16 - IB Stunden) werden Inhibit tionszonen beobachtet, die die Antibiotika darstellen.

Diese und ähnliche Teste zeigen, daß das mittels des Oben beschriebenen Fermentationsverfahrens erhaltene antiblotische Produkt aus einer Mehrzahl von Komponenten besteht. Vier der Komponenten scheinen den Hauptanteil des Produktes darzustellen; diese werden im folgenden als die "vier Hauptkomponenten¹¹ bezeichnet*

Die Trennung wird mittels einer Anzahl von bekannten Techniken erreicht, wie z.B. Gegenstrom-Extraktion oder Chromatographie auf Ionen—Austausch-Harzen oder auf anderen festen Adsorbenten, wie z.B. Silicagel, Chromosorb und Zellulose. Die Silicagel-Chromatographie wird bevorzugt. Die ersten sswei der vier Hauptkomponenten werden mit der niederen Phase einer Lösungsmittel-Mischung bestehend aus Chloroforn, Isopropanol und konz« Ammoniumhydroxyd (2 ti ti v/v) eluiert; die Elution wird mit der niederen Phase einer lti:i Mischung derselben Lösungsmittel fortgesetzt bis die Desorption der verbleibenden Antibiotika vollständig ist.

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- 2k -

Auf Grund verschiedener physikalischer, chemieeher und

biologischer Daten kann gezeigt werden, daß die vier

Hauptkonponenten folgende sind:

1· Verdamicin I; ein bisher unbekanntes Antibiotikum.

2. Sisomicin; die biologischen Eigenschaften des Sisonycin

sind im Journal of Antibiotics, Band XXIII No. 11, Seiten 551—565 beschrieben. Die Herstellung und Eigenschaften des Antibiotikums sind in der belgischen Patentschrift Nr. 755 1^5 beschrieben.

*$. Antibiotikum G-¹IiB; ebenfalls durch Kultivierung von hierin bereits beschriebenem Mioromonospora rhodorangea hergestellt.

4. Gentamvcion A; die antibakteriellen Eigenschaften des Gentamycin A wurden von Weinstein et al in Antimicrobial Agents und Chemotherapy, 1965, Seiten 816—820 festgehalten, und seine Struktur wurde von Maehr und Schaffner im Journal of the American Chemical Society, «9:25, 6. Dezember 1967, veröffentlicht.

Das Verhalten dieser vier nauptkomponenten bei der Papier-Chromatographie wird in Tabelle VII dargelegt.

Zusätzlich zu den vier Ilauptkomponenten ist manchmal die Anwesenheit anderer antibakterieller Materlallen feststellbar. Diese Materialien werden ledoch in solch geringen Mengen gebildet, daß ihre Isollierung, Reinigung und Kennzeichnung noch nicht erfolgreich durchgeführt wurden. Beispielsweise wurde ein roher, im wesentlichen alle bei

' - 25 -

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der Fermentation erzeugten Antibiotika enthaltender Extrakt im Volumen auf ein öirupartiges Konzentrat eingeengt. Das Konzentrat wurde dann einer fallenden Chromatographie auf Chromar 500 für etwa 1 Stunde unter Verwendung eines Systems, bestehend aus Chloroform,.^ethanol und konz.

Annaoniumhydroxyd (l:I:l v/v") unterworfen. Als das

Chromatogramm gegen Staphylococcus aureus ATCC 653BP bioautographiert wurde, waren kleine Mengen von drei zusätzlichen Fermentationsprodukten schwaoh feststellbar. Diese Produkte hatten die folgenden B_f Werte (so genau wie dies bestimmt werden konnte): 0_?41, 0,30 und 0^12.

- 26 -

θ 2

TABELLE VlTI

VEIlOLET CIIR von Ιϊ - und R_f-Vor lon

R_f dor Antibiotika

Papier	Verda	Sisomi	An t L— ftGiii.a—
Chroma to—	micin	cin	hier ι— micin
graphische	I		lcui.i Λ
Systeme			C-U8 '
Chloroform:	0,65	0,58	Ο,^ιΙ Ο,ΐβ
Methanol:
konz.Aramonlum-
hydroxyd (1:1: t)
auf Chrom.ir
500 Matt,
ansteigend		It. der	AnfcihLotika
		* t= 6	Stuiidon
Chloroform:	0,40	0,21	0,05
Methanol: 17$			r
Ammonium hydro-
xyd 2:i:i auf
Whatman Nr. 1
Papier fallend
		It. der	Antihiottka
		f t =	l6 Stunden
2 nutanon:	0,Vi	0,36	0 07 _ « J " I
tertr-Butanol:			/
Methanol:fconz.
Ammoniumhydr oxyd
16:3:1:6 auf
Whatman No· I
Papier, fallend

Entfernung dor Zone vom Ursprung . </ ' t

Entfernung vom Ursprung zum linde do« Papioros ^{ζχιγ /lOir>}

109824/1

Wie bereits erwähnt, deutet dio physikalisch—clicJiuscne " Analyse des Verdamicin I darauf hin, daß es sich um eine neue Substanz; handelt; es ist strukturell .jedoch mit Gentamicin C„ verwandt. Dio Hydrolyse dieser beiden Antibiotika mit 6n Chlorwassorstoffsäure bei 100⁰C für 2 Stunden und anschließende Papier-Chromatographie in einen Lösungsmittelsystem bestehend aus entweder (i) n-Butanol Pyridin:Wasser:Essigsäuro im Verhältnis 6:4:3:1 v/v oder (2) Propanol:Pvridin:Wasser:EssigsKure im Verhältnis 6:'i:3:i v/v, sowie Besprühung der Chroma toßramir.o mit Ninhydrin, zeigt eindeutig, daß Gentamicin Cg und Verdamicin I unterschiedliche Hydrolyseprodukte liefern. In beiden Systemen deuten die Chromatogramme auf die Anwesenheit von ζΛίοί pe— meinsamen Produkten; eines davon ist 2-Deoxystreptamin. Das verbleibende Hydrolyseprodukt von Verdamicin I ist .iedoch anders als das entsprechende von Gentamicin C₀. Auf Grund der unten angeführten physikalischen und chemischen Daten und nach Analyse seiner Hydrolyseprodukte wird angenommen, daß Verdamicin I die folgende strukturelle Formel ohne stereochemische Festsetzung hat:

II

-2R-

309824/1182

Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Verdamicin I sind in Tabelle IX angeführt:

TABELLE IX

Chemische und physlkaiisehe.Eigenschaffen des Verdamicin!

Bnse Sulfat

Elementar- Durchschnitt Durchschnitt Durchschnitt Durchschnitt analyse von 2 _# von 2 von 2 von 2

C 47,98 48,04 31,10 30,95

H 8,13 8,22 6,61 6,60

N 13,43 13,28 8,99 8,69

O(durch 30,45

Diff.)
SO₁₁

Drehung +155,7° +167,1° +96,5° +99,4° (Wasser) c=0,3 o=0,3 · c=0,3 c=0,3

Äquivalent 108,5 gewicht

pKa 8,1

Summenformel C^TI-qO-N,-⁴Analysen übereinstimmend mit 0₂₀Π__0_Ν-,3Η₂0

Verdamicin I bildet gern Solvate und Hydrate, von welchen es Bohwer 1st das ungelöste oder das wasserfreie Antibiotikum zu erhalten. Dementsprechend stimmt die Elementaranalyse gemäß Tabelle IX in vorbildlicher Weise mit dem Antibiotikum als Trihydrat (d.h. Ο_2ΟΠ__Ο_Ν(-.3Η₂θ) iiberoin. Verdamicin I zeigt keine Absorption im Ultra-Violett-Bereich von 220-40Om μ. Weiterhin iet es stabil gegen Kochen für

309824/1182

48,04	31,10	-
8,22	6,61
13,28	8,99
30,47
-	29,30
+167,1°	+96,5°
o=0,3	c=0,3
104,9
8,1

wenigstens dreißig (50) Minuten in 0,1 molaren Puffern im von 2-10.

Verdamicin*I (freie Base) hat ein charakteristisches kernmagnetlsohes Resonanzspektrum (NMR), wie dies in Figur 2 der angeschlossenen Zeichnungen gezeigt ist. Das NMR-Spektrum wurde unter Verwendung eines Varian Λ-60-Α Spektrometer« (Varian Associates, 6II Hanson Way, Palo Alto, Kalifornien) mit einer Lösung von etwa 0,31ml, die etwa 22mg Antibiotikum in einer Deutorium-oxyd (D„0)-Dirnethylsulfoxyd (UMSO) Mischung enthielt, erhalten * Das Spektrum lit aufgezeichnet in Teilen/Million (PPM) von 3-(Triaethylailyl)-propansulfonsäure—Natriumsalz, dem inneren Standard.

Verdamicin I-Sulfat hat ein charakteristisches infrarotes Absorption Spektrum in Mineralöl (Nujol), wie dies in Figur 1 der.angeschlossenen Zeichnungen gezeigt ist. Die charakteristischeren Absorptionbänder sind in der folgenden Tabelle X aufgezeigt.

TABELLE X Charakter! s ti ache Infrarot—Absorption sbä'nder

	3,8 μ	Verdamicin	I-Sulfat	-	μ	(Nu.iol)
2,9 -	3,52 μ	(VS,V brd.)	7,25		μ	(W-M)
3,38-·	μ	(NU.I0I)	7,25	• 9,6	μ	(VS,V brd.)
%,25	μ	(Shd.)	8,6 -		μ	(W-M)
4,80	μ	(W, brd.)	10,30		μ	(Shd.)
5,93		(Shd.)	10,92		μ	(W)
6,16	(MS)	11,42

3019824/1182

6,50 6,ej

(MS)

12,10 13,75

/a (VW, brd.) A» (W,

Abkürzungen: hrd. = breit; M= MIttel; Shd.= Schulter; S β stark; V » sehr; V « sohwaoh

Weitere chemisohe und physikalische Eigenschaften der Antibiotika Verdamicin I und G-418 sind in den folgenden Tabellen XI und XIX angegeben:

TABELLE XI Antiblotische Klassikfikatlonsteste

Verdaaloin I Sulfat	Ninhydrin I Sakaguohi Spray I Reagenz	Negativ	Hypochlorit starke KI	Elson Mor gan Test
Antibiotikum G-%18 Sulfat	Positiv	Hegatlv	Positiv	Negativ
Positiv	Positiv	Negativ

TADELLE XII Löslichkeit (Terminologie entsprechend U.S.Pharmacopeia XVIII, Seite R)

Lösungs mittel	Verdamicin I	Verdamicin I Sulfat	Antibioti kum G-418	Antibiotikum G-%lfl Sulfat
Methanol Chloro form Benzol	wen i/r lHslich wenig läslioh sehr wenig löslioh	unlöslitfh sehr wenig löslioh unlöslich	wonig löslioh sehr wenig löslich unlöslich	unlöslich sehr wenig löslioh· · unlöslich

309824/1182

• · · * · t mm «

- 31 -

Die mikrobiologische Probe des Antibiotikum G-418 1st eine Standard-Scheiben-Platten-Probe unter Verwendung von Difco Antibiotikum Medium No. 5 und Bacillus sub- tilis A.T. C.C. 6633 als Testorganismus. Die physikalischen Bedingungen des Tests e%nä im lies ent liehen die von Grove und Randall für Neomycin in "Assay Methods of Antibiotics" beschriebenen, veröffentlicht von Medical Encyclopedia Incorporated (l955). Die Probe wurde gegen eine Standard-Präparation von Antibiotikum G-^18 mit einer bestimmten Potenz von 1000 mcg/mR durchgeführt« Ein Mikrogramm des Standards ergibt eine Inhibitons- zone von 16,5-1,5 mm im Test.

Das Standard-Antibiotikum-Sulfat-Salz ergibt-etwa 750 meg/ mg gegen die Standard-Antibiotikum-Base.

Die mikrobiologische Probe von Verdamicin I und anderen mittels M.grisea hergestellten Antibiotika ist eine Seheiben-Platten-Probe, wobei Staphylococcus aureus ATCC 6538P als Testorgansimus verwendet wird. Die physikalischen Bedingungen der Probe sind ähnlich wie die für Gentamicin beschriebenen (Odon et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, I963, American Society for Microbiology). Die normale Verdamicin I Base hat eine bestimmte Potenz von 1000 mcg/mg. Ein meg. des Standards bei den Bedingungen dieser Probe erzeugt eine Inhibitionszone von 17,pil,3 mm.

Verdamicin I Base ergibt 1000 racg/mg in der Gentamicinprobe und die Kurve der Ansprechdosen von Verdamicin

309824/1182

- 32 -

läuft parallel zu der von Gentamicin. Verdamioin !-Sulfat ergibt 674 racg/mg in der Gentamlcinprobe und 695 mog/mg gegen die eigene Base als Vergleichsstandard·

Die neuen Antibiotika dieser Erfindung, nämlich Verdamicin I und G-418, sind basisch und bilden mit organischen und anorganischen Säuren Säureadditionssalze, Beispiele solcher Säuren sind Schwefelchlorwasserstoff, Phosphor-, Toluol-p-sulfon-, Bernstein-, Malein-, Essig-, Propion-, Cyolopropanoajrbon-, Adamantancarbon-, Furoln-, Benzoen— und Phenylessigsäure; die S_nlze umfassen weiters die Alkalimetall-Derivate der antlbiotischon Salze der zweibasischen oder dreibaslschen Säuren· Im Allgemeinen sind die Salze wasserlöslich und können durch Behandlung einer wässerigen Lösung des Antibiotikum mit einer stöchioaetrisohen Menge an Säure und Lyophilislerung der eich ergebenden Lösung gebildet werden. Die Salze werden auch aus einer wässerigen Lösung durch den Zusatz von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, wie z.B. niederen Alkylketonen (z.B. Aceton), niederen Alkoholen (z.B. Methanol), cyclischen Äthern (z.B. Tetrahydrofuran), oder niederen tort. Amiden, wie z.B. Dimethylformamid und Dläthylaoetamid, ausgefällt.

Antibiotikum G-'ii8 und Verdamicin I bilden auch antibakterielle Schiffsche Base-Oxyzolidin-Dorivate mit Aldehyden mittels bekannter Verfahren. Besonders bevorzugte Schiffsche

- 33 -

309824/1182

Base-Oxazolidin-Derivate sind jene die duroh Kondensieren des "Antibiotikums mit aliphatischen, alicyclisohen, aromatischen oder heterocyclischen Aldehyden mit bis zu etwa i'2 Kohlenstoffatomen, z.B. Acetaldehyd, Propionaldchyd, Furfural, Cyolopentylaoetaldehyd, Vanillin, Pyridoxal, Veratraldehyd, Butyraldehyd, Aorolein, Salloylaldohyd, Bernsteindialdehyd, Croto»- aldehyd, Benzaldehyd und p-Nitrobenzaldehyd, gebildet werden.

Die pharmazeutisch annehmbaren Schifische Base-Oxazolidin-Derivate -werden im allgemeinen durch Behandlung eitler alkoholischen Lösung der antibiotischen stickstofffreien Base mit einem Übersohuß an Aldehyd oder dessen roaktiven Derivat, z.B. einen Acetal, insbesondere Diäthylacetal, oberhalb Raumtemperatur für etwa eine Stunde, und Kühlung der Lösung zur Gewinnung des gewünschten Produktes gewöhnlioh in

Form eines kristallinen Feststoffes erhalten. Wie aus Formel I zu entnehmen ist, hat Antibiotikum G-IiIS drei primäre Aminogruppen, von welchen jede eine Schiffsche Base bilden kann. Weiterhin hat das Antibiotikum eine sekundäre Aminogruppe und benachbart dazu eine tenure Hydroxygruppe, welche Gruppen'beim Reagieren mit einem Aldehyd einen Oxazolidinring ergeben. Wenn das Antibiotikum also mit einem Überschuß an Aldehyd R.CHO, oder dessen reaktivem Derivat» zur Reaktion gebracht, wird, reagieren vier Mole Aldehyd mit ,ledern Mol Antibiotikum und es entsteht das in Formel III gezeigte Sohiffsohe Base-Oxazolidin-Derivat:

309824/1182

R₁CH-NCII CH CHOH

III

N=CHR,

In dieser Formel bedeutet R. vorzugsweise einen Alkylrest mit 1 bis Ii Kohlenstoffatomen, einen Cycloalkylrost mit bis Ii Kohlenstoffatomen, oinen Cyclo-alkyl-alkyl-rest mit

ode» oinen
k bis 11 Kohlenstoffatomen'aromatisch-heterocyclischen Rest oder aromatisoh-heterocyclisehen Alkylrest mit 5 bis 11 Kohlenstoffatomen.

Wie aus Formel II orsischtlich ist, hat Verdamicin I vier primäre Aminogruppen, welche eine Schiffsche Base bilden, und auch eine sekundere Aminoßruppe und eine dazu benachbarte tertiäre IT/droxygruppo, welche beim Ron/ri or cn mit oinora Aldehyd einen Oxazqlidinring ergeben. Beim Reagieren mit einem Überschuß an Aldehyd R.CIIO odor dossen reaktivem Derviat ergibt Verdamicin I also ein Schiffsche Base-Oxazolidin-Derivnt.

Die Schiffsche Baso-Oxazolidin-Dorivatc sind in Wasser nicht merkbar löslich, jnclocli in gewöhn 1 ichon organsiclion LösutiKS—

309824/1102

mittel, wie Chloroform, Methanol, Aceton, Äthylacetat u.dgl.. Weiterhin sind diese Dorirate in organischen, Spuren an Wasser enthaltende Lösungsmittel unstabil und gehen in das freie Antibiotikum über. Die Anwesenheit einor Spur an Säure erleichtert die Rückwandlung.

In den Tabellen XIII und XIV sind die in vitro antibakteriellen Aktivitäten von Antibiotikum G-^18 gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Eakoerion, bei Verwendung von in der Technik anerkannten Standard-Vorfahren, aufgezeigt:

TABETiLF, XIII

In Vitro antibakterielle Aktivität_t - Medium: Tryptose Phosphatbriihe p_R 7,2 -"7,5

Organismus MIG* (mcg/ml)

Staphylococcus aureus 209P 0,8

Gray 7,5

Wood 0,8

Ziegler 0,8

Streptococcus sp. C j> 25

C203 17,5

Escherichia coil Sc 3_;0

894 7,5

Klebsiella pnoumoniae DA20 ^>°

Pseudomonns fiorüginosa VA6 3^0

37 . 17,5

♦Minimale hemmondo Konzentration.

303824/1 1 8 2 ""'- 36 -

TABELTiE XIV

In Vitro nntihnlcterietle Aktivität, (Muellor-Hinton-BrUhe P_n 7,2 - 7,5)

Organismus

BnoiUus subtilis 6635

Staphylococcus aurcus	12
	1257
	Sm 1
	6
	23
•	26
	32
Streptococcus sp, l	30
	27
	16245
	6589
Escherichia coll	777
	887
Peeudomonas aerucinosa	1262
	1236
	20
	S3
Proteus miraMHs	12Ί53
r.or/rnnli	8019
rettporl	9250

MI C (ine,i/ml) 3-,0 3,0 0,3 0,3 0,3 0,3 3,0

7,5

7,5

7,5

7_t5

7,5

7,5

3,0

. 3,0 17,5 17,5

3,0

7,5

0,3

- 37 -

309824/1182

I ι

In Tabelle XV sind die rait Antibiotikum G-418 in vivo «•hfclttnen·antibakteriellen Ergebnisse angegeben* Die zur Zielung der Ergebnisse verwendeten Tiere waren Carworth Farms CF-i Mäuse, alt einem Gewioht von etwa 18-2Og, unterteilt in Gruppen von 7« In vivo Schutz

(PD-₀) wird bestimmt durch lntraperltonale Injizierung der Mäuse mit einer lethalen Dosis pathogener Bakterien« Eine Gruppe Mäuse dient als Kontrolle) die anderen Gruppen erhalten eine Stunde später verschiedene Einzeldosen Antibiotikum G-418. Die ^ioh^ geschützten Kontrolltiere sterben Jn 18-24 Stunden. Der Tes/fc endet 48 Stunden naoh Infektion, y\na die Anzahl lebender M.äuse in jeder Gruppe, die Antiblotikum G-418 erhielten,, werden gezählt« Die Ergebnisse werden mittels statistischer,. Standard Methoden analysiert, um PD₅₀ Werte mit 95% Ver.trayensgrenzen zu bestimmen«

η Antibakterielle Wirksamkeit In Vivo

A« Sohutzwlrkung Organismus f ' Weg PD^₀(mg/kg)

Ä } I

Staphylococcus aureus Gray S.C ,2,5

I t" % Oral * 40

^riieiloh'tB ooli So. ► λ S.C. i.5

äftäphylöooooua aureus StJM r

No.1 S.C. 3,0

II ρ ij *

Pseudomonag aeru^inosa No«I S.C. 5*0

,1 π

B. Akute Toxlgjtat Weg LDg ₀(

^{M B} i.v.

Γ 5 ■

¹I' ⁵V ■ '" . - - '

j · ;. ^r . · ■ "³⁸""

^>n ■ 3 0 S 8 2'Λ /118 2

ft ' f ι ■ ^:' ■' -"

Tabelle XVI zeigt in vivo Teilergebnisse, die die anti-

protozoale Wirksamkeit von Antibiotikum G-41B veransohau- 1 lohen. Die Träger für die Teste waren .lung entwöhnte männliche

Royal Hart Ratten (3-4 Woohen alt) mit einem Gewioht von

rtwa 5<V7Og.

Das Teetverfahren 1st eine Abwandlung eines von R.J. Schnitzer

auf den Seiten 355-^^3 in "Experimental Chemotherapy"

Band 1, Aoaderalo Press, Hew York (1963 beschriebenen Verfahrens.)

- 39 -

309824/1182

TABELLE XVI

Orale Wirksamkeit von Antibiotikum G—418 und Beaugaaubstanzen gegen experimental^ Ceeal E.Histolytica Infektionen bei Ratten.

Präparat

Orale Dosis Tage fcarasitolOgisohe- A.D.I.* mg/kg/Tag bebau- Heilungen/Total . delt

Antibiotikum	25 ■	6	519/19	0
G-UlS	12,5	6	24/24	O
	10		7/7	0
	10 "'	1	V7
	6,5 L	έ	.4/4 ■	0
„	'6,5·.-	3	V5	0,4
I	6,5	1	2/5·	1,0
	5;5	6	5/6	0,2
	5,5 '	3 -	0/7	• 1|7
Paromomycin	25	.6	6/7	0
	12	6	4/8	0,8 .
	10 .		2/6	1,0
•	10		0/7	2,1
	6,5		2/4	1.3
	6,5		1/5 .	1,0 .
	6,5	-i " ·	0/4	1,0
	5)5		. i/6	1*5
	5,5		1/7	1»9
Metronidazole	25		1/5	0,8
	15		2/6	0,8
-	6;5	i6	1/4	. 0,8
	6,5		0/3
I . ι ■ ■ ι - ■	6,5	.1	0/4	1,5-
Kontrollen mit			4/45	2,2
Wasser behandelt	■.

30 9 824/ii82

- 4o -

*A.D«I# bedeutet Durohsohnittsgrad an Infektion auf Grund grober Beobachtung der pathologischen Änderungen In der Geourn und mikroskopischer Beobachtung dör Anzahl gefundener Amoebae. Diese Beobachtungen sind auf einer Skala von Null bis vier aufgezeichnet, wobei Null eine im wesentlichen normale Cθcum

• ·. ■

darstellt. Unbehandelte aber infizierte Kontrollen erreiohen etwa 2 bis 4.

Λ. *

Jn den aufgezeigten Daten sind die Kontrollen durchschnittlich

²f²· , ,

Verdamicin I zeigt ein breites Spektrum antibakterieller

Wirksamkeit bei In vitro T,este,n gegen repräsentative grarapqeitive und gram-negative, Bakterien. Es ist wirksam gegen k^namyoinbeständige Bakterien», scheint ,jedooh Überschneidend mit Gentamicin zu se1,n. tyas Antibiotikum zeigt keine wesentliche in vitro Aktivität gegen Hefe. Tabelle XVII zeigt die minimalen Hemmkonzentrationen von Ve.rdamloln I-Sulfat gegen repuäsentative Arten von Bakterien uij(d Hefe. Die Versuohe wurden in Hefe-Fleisoh-Brühe (pH 7,^) durchgeführt, wobei die Inhibition naoh 2k Stunden und noohmals nach 48 Stunden bestimmt wurde· Zum Vergleich werden Ergebnisse mit Gentamioin-Sulfat angegeben·

ι Ι

30982 A/ 1182

~ 41 -

TABELLE XVII Minimale Hemmkonzentration - MIC

(mcg/ml)

Verdamicin I-Sulfat Organismus 24 Stunden 48 Stunden

Gentamicin

Sulfat

24 Stunden

Staphylococcus aureus 209P

Streptococcus pyogenes C

Streptococcus pyogenes 6

0,3 '* " 0,75

0,75 0,3

Aerobacter aero- 0*3 genes JJ-.

Aerobacter aero- 0,3 ! genes 4 · .

ι ι- t

Escherichiä ι coli Sc

: Edcherichia ■ coil· 5

. Escherichia coli 19

Kl'ebsiella pneumoniae Ad KR*

Klebsiella pneumoniae 17 KR

Proteus mirabilis MeP ' -

Proteus· vulgaris 2

Pseudomonas aeruginosa 8689

0,3

0,5 0,075

3,0

0,75

: ,0,3

,0,3 0,3

0)3

Pseudomonas O»75 0^

aeruginosa Miller 309824/1182 O₁I

3,0

0,3	O1O
o,3	0,3·
0,75	0,75
0,75 Λ	0.3

0,3 0,3 0,3 0,3

	- 42 -	' 0,75	2239964
Salmonella paratyphi Bl	0,3	0,3
Salmonella paratyphi E2	0,3	,;>'io	0,5
Candida albicans 4o6	>io	>10	>5O .
Candida albicans 1K)I	·>ιο·	>io	^ 50 ■
Candida albicans 411	}io	>·10*	^ 50
Saccharomyces oerevisiae	>10

- kanamyolnbeständig

Verdamicin I wurde in vivo gegen vier (4) Arten von infektiösen Bakterien in Mäusen getestet, wobei als einzelne suboutane Dosis eine (l) Stunde nach Infektion mittels intraperltonaler Injektion eiife lethale Menge Pathogen verabreicht wurde, fiine Gruppe Mäuse dient als Kontrolle; die anderen

1*

Gruppen erhielten verschiedene Dosen Verdamicin I· Die nioht geschützten Kontrollen starben in 18 - 24 Stunden· Der Versuch endet 48 Stunden naoh Infektion, und die Anzahl lebender Mäuse in .jeder Gruppe, die Verdamicin I erhalten haben, wurden gezählt. Die Ergebnisse Wurden mittels statistischer Standard-Methoden analysiert und FD-₀Verte mit 95% Vertrauensgrenzen -bestimmt. in

F in ·

In Tabelle XVIII sind die· Ergebnisse dieser in vivfc Versuche

309824/1182 „ - « -

angegeben, welche zeigen, daß Verdamicin I'ein starkes antibakterlelles Mittel gegen gram-positive und gratnnegative Organismen ist. Zum Vergleich sind mit Gentamicin erhaltene Ergebnisse aufgezeigt; Tabelle XVIII

feibt auch die akute Toxisitab von Verdamicin I bei intra- « ». ■

venöser Verabreichung an.

TABELLE X.VIII

Schützwlrkürife in MRusen

PP'₅₀ (mg/kg)

OrgantBTwus Weg Verdamicin I Gantamlolii

Staphylococcus

aureus Gray S.C, 2_t5 2.4

Sjtreptococcus ι. ι -

pyogenes C S.C. 1,0 5;0

r 1 .

Escherichia .

coil 10536 S.C. . 1_?5 l_t7

Pseudomonas

aeruglnosa 8689 S.C» 2.0 · 1^7

Akute Toxizittit^ in Mäusen

Weg LD ₅₀(iag/kg) I.V. 75

Die antibiotische durch Kultivierung von Micromonospora

ι ■

giiisea erhaltene Mischung,, welche hauptsächlich Verdamicin I, Sisomicin, Antibiotikum G-418 und Gentamicin A umfaßt, zeigt ein breites Spektrum antibakterieller Wirksamkeiten, wenn sie in vitro gegen gram-po.sitive und gram-negative Bakterien getestet wird. Tabelle XIX zeigt die minimalen Hemmkonzen-

I. ι
trationen der antibiotisclfen Mischung gegen repräsentative Arten von Bakterien und Hefe. Die Versuche wurden in Hefe-Flelsoh-BrUhe (ρΠ 7,4) durchgeführt.

_s 309924/1182 -44-

TABELLE XIX	• MIC (mog/ml)
• Organismus	0,03
Bacillus subtllls 6633	0.8 0j3 "
Staphylooooous aureus 2O9P Staphytoooocus aureus G	3,0
Streptococcus pyogenes C [	0,8 0,8
! I Escherichia coil 10536 Escherichia coil 3	0,8
Klebslella sp. 803	0,8 0,3
Proteus sp. 126 ( Proteus ep. MoFadden	0,3 0,3
Pseudomonas aeruginosa So' Pfseudomonae aeruginosa 13	3,0
Salmonella sp. So

Wie oben gezeigt, sind Antibiotikum 6-418 und Verdamicin I und deren pharmazeutisch annehmbaren Derivate hochwirkeame Antibiotika, die dem Wachstum von gram-positiven und gramnegativen Mikroorganismen entgegenwirken. Sie sind z.B. wirksam gegen Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Bacillus subtilis, Escherichia coil, Salmonella, Klebsiella, Proteus und Pseudomonae. Weiterhin beeinträchtigt Antibiotikum .G-J* 18 das Wachstum von Helminthes, wie z.B. Syphacia obvelata und Hymenolepsis nana, und Protozoen, insbesondere parasitärer Protozoen wie z.B. Trichfpmonas vaginalis und Entamoeba histolytlca. Beide Antibiotika sind jedoch unwirksam gegen Hefe und Fadenpilze wie p.B«, Saccharomyces, Candida, Aspergillus μηά Trichophyton. ^ ■■

Die Antibiotika und deren'pharmazeutische annehmbaren Derivate kHnnen unter in vivo oder'in vitro Bedingungen verwendet werden . Sie können zum Verhindern des Waohstums oder zur

3Q9S24/1182

- ii5

Vernichtung empfindlicher Arten der oben beschriebenen Organismen und in Verbindung mit Seifen und Reinigungemitteln zum Entfernen solcher Organismen von den Oberflächen von Laboreinrichtungen, ehriirurgisehen Instrumenten, Ijabor-ßlaswaren u.dg. verwendet werden. In Anbetracht ihrer in vivo Wirksamkeit können die Antibiotika und deren pharmazeutisch annehmbaren Derivate zum Vernichten oder Waohstumverhinern empfindlicher Organismen in Säugetieren verwendet werden, z,B« in MSusen, Ratten, Katzen, Hunden und Rindern·

> i ι ■

D,ie Antibiotika und deren«! pharmazeutische annehmbaren Derivate können auch zur behandlung von duroh.empfindliche Organismen in Menschen hervorgerufene Krankheiten verwendet werden. _f

Zur Zubereitung für ihre in y;ivo Verwendung wird ein aus Antibiotikum G-klS und Verdamicin, I und deren pharmazeutisch abnehmbaren Derivaten ausgewähltes Antibiotikum in eine zur-ftherapeutlsohen Verabreichung geeignete Form gebracht, z.B. d,uroh Vermischen mit einem pharmazeutischen Träger oder bindemittel· Duroh die Erfindung werden daher pharmazeutische Zusammensetzungen geschaffen* die als wirksamen Bestandteil mindestens eine Verbindung, die aus Antibiotikum G-418 und Verdamicin I und deren pharmazeutisch annehmbaren Derivaten ausgewählt wird, zusammen mit einem pharmazeutischen Träger o,der Bindemittel enthält. Die, Zusammensetzungen können in der Form einer Doseneinhejf» »z.B. ein geformtes Produkt, sein.

I ■ . ■ ■ ■ * τ .

¹ 309924^1182 . - 46 -

ί- i f

Die Zusammensetzungen liegen .led ο oh vorzugsweise in For« yon injtzierbaren Präparaten in Ampullen oder Salben, Cremen oder Lotionen vor·

Die Schiffsche Base-Oxazolidin Derivate von Verdamicin I und von Antibiotikum G-418 können gewünsohtenfalls als eine Lösung in einem organischen Lösungsmittel (z.B. als eine Tinktur) angewendet werden. Sie können auoh in örtlich anwendbaren Cremen und Salben verwendet werden, wenn Verträglichkeit nit Lipoid-Substanzen von Vorteil ist,

Beispiel It Tankfermentatlon von Nioromonospora rhodorangea A* Erste Keimungsstufet Zu 1000 ml Wasser wird folgendes beigefügt: "5g Fleischextrakt, 5g Tryptose, 5g Hefe-Extrakt, ig Dextrose, 24g Stärke, 2g Kaliumcarbonat. Die Mischung wurd unter Schütteln erhitzt bis die Feststoffe gleichmäßig verteilt und/oder im wesentlichen aufgelöst sind. Die Mischung wird in 10 glelohe Volumentelle geteilt und in 300ml Sohüttel flasohen gegeben. Das Medium wird bei 121⁰C unter l,05kg/cm Druok für 20 Minuten sterilisiert und dann auf etwa Rauratem teaperatur abgekühlt. Unter sterilen Bedingungenrifird jede Flasche mit 5ml eines vorher bereiteten Ganz-Brühe-Präparates beimpft. Die Flaschen werden bei etwa ?5°C unter Dreheohüttlung (300rpm) für 3 Tage bebrütet.

B* Zweite Keimungsstufet Zu 500ml eines wie oben beschrieben bereiteten sterilen Mediums werden unter aseptisohen Bedungen 25ml des Mediums άβτ ersten Keimunsstufe gegeben und bei 28° für *5 Tage unter Dreh-Sohütfcelun* (300 rpm) bebrütet.

309824/1182 - 47 -

C. Fermentation: In einem 141 Fermentor werden 101 Fermentationsmedium mit der folgenden Zusammensetzung "bereitet: So,1abohnentnenl, 500g Dextrin, 50g Dextrose, 70g Kölziumcarbonat, 130meg Kobaltchlorid, und 101 Wasser. Der Fermentor und das Medium werden bei 121°C unter l,05kg/cm für 30 Minuten sterilisiert und dann auf etwa Raumtemperaturen abgekühlt. Das Fermentationsmedium wird durch Hinzufügen von 500ml des Inokulums der zweiten Keimungsstufe unter aseptischen Bedingungen beimpft. Die Fermentation wird bei einer Temperatur von etwa 35°C unter Einleitung von Luft in einer Menge von etwa 2,5 bis 5jO 1 pro Minute durchgeführt. Das Medium w^Lrd bei einer Geschwindigkeit von etwa 250 bis 500 rpm (Umdrehungen pro Minute) geschüttelt. Die Fermentation wird fortgesetzt bis Spitzenaktivität erreicht wird, die durch bereits beschriebene Probetechniken bestimmt wird, und wie in Beispiel 2 beschrieben aufgearbeitet. ' ,
Beispiel 2: Isolation von Antibiotikum G-418 Ζμ 201 Fermentationsbrühe-werden etwa 130g Oxalsäure unter heftigem Schütteln hinzugefügt. Der pH der Brühe wird mit . 6n Schwefelsäure auf 2.0 eingestellt. Die Mischung wird für etwa 30 Minuten gerührt und dann filtriert. Der Niederschlag wird mit Leitungswasser gewaschen bis die Waschflüssigkeit im wesentlchen farblos ist. Das Fi^trat und die Waschflüssigkeit werden vereint und der p„-Wert mit 6n Ammoniumhydroxyd auf 7 eingestellt. Das mit der Waschflüssigkeit vereinte Filtrat wird durch eine Ionen-Austausch-Harz-Säule, die etwa 25Og IRC -50 in der Ammoniuraform beinhaltet, bei einer Geschwindigkeit von etwa 50 bis 75ml/Minu^e hindurchgeführt. Das Harzbett wird gewaschen bis die Waschflüssigkeit farblos ist und das

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.4R

Antibiotikum wird mit 2n AmmoniumhydroJcyd elulert« Das Eluat wird im Vakuum eingeengt und lyophlIieiert und ergibt etwa 9g ' rohes Antibiotikum enthaltend etwa 105 mog/rng. Eine Papierchromatographie dieses rohen Antibiotikums in einem fallenden System bestehend aus 2-Butanonltert.-Butanol»Methanol: konz. Ammoniumhydroxyd (l6t3tlt6), gefolgt, von einer Bioautographie gegen Staphylococcus aureus ATGC 653BP, ergibt ein Bioautogramm welohes Im wesentlichen aus einem Fleck mit einigen kaum sichtbaren kleineren Flecken besteht| dap Antibiotikum 1st also nahezu eine einzige Verbindung»

Beispiel 3t Teilweise Reinigung von Antibiotikum G-418 kg des nach Bespiel 2 erhaltenen Antibiotikums G-418 werden In ml Wasser gelöst. Der pH-Wert wird mit 2n Schwefelsäure auf 4,2 eingestellt, und 250 mg aktivierte Holzkohle (Daroo G-60_/ Atlas Powder Co., Wilmington, Delaware) werden hinzugefügt. Die Suspension wird etwa eine Stunde gerührt und <flann foltriert. Das FiItrat wird auf etwa 50ml eingeengt und in 500ml Methanol ausgefällt· Der ßntstandene Niederschlag wird abfiltlert, mit Methanol gewaschen und in etwa 20ml Wasser gelöst· Eine Säule IRA-401A (ein Amberlit Anlonenaustausoherharz) -Rohm und Haas, Philadelphia, Pennsylvania) mit wesentlichen folgenden Ausmaßen wird bereitet: 65om Höhe; 25 cm innerer Durohmesser; 200g Harz. O\e ahtibiotisohe Lösung wird auf die Harzsäule gegeben und j die Lösung duroh die Säule mit deionisiertem Wasser gewaschen. Das Säuleneluat wird im Vakuum auf etwa 20ml eingeengt und das Produkt lyophilisiert, wobei etwa 800mg bis etwa 1,2g des Antibiotikums G-418 erhalten wird, enthaltend etwa 480mog/mg·

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Beispiel 4 s Weitere Reinigung des Antibiotikums Herstellung von Antibiotikum G-418-Sulfat. 2,6g des nach

' Beispiel 3 bereiteten Antibiotikums G-418 werden in 250 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit verdünnter (i-6n) Schwefelsäure auf 4,2 eingestellt. 5g Daroo g-60 werden der Lösung beigefügt und es wird etwa eine Stunde boi Raum- ,temperatur gerührt. Die Suspension wird filtriert !,und das Piltrat Im Vakuum zur Trockene eingeengt. Der RUokstand wird In 20ml Wasser gelöst und die Lösung tropfenweise unter heftigem Schütteln zu 500.ml Methanol hinzugefügt« Die entstandenθ Suspension >wifd Filtriert, das feste Produkt mit Methanol gewaschen und be} etwa 40⁰C im Vakuum getrocknet, wobei 3.36g Antibiotikum 6-418 Sulfat erhalten werden, enthal-

tend etwa 700mcg/mg, ,·,

In ähnlicher Weise können_nduroh Ersetzen der Schwefelsäure duroh eine äquivalente Men,ge einer anderen anorgansiohen oder organs!chen ^säure und durch Verwendung von Aoeton als Aus- ■ fällungsmittel andere Säureadditionssalze hergestellt werden.

Beispiel 5: 1. Herstellung des Antibiotikums mittel M.grisea in Sohüttelflaschen. ^ -_s

a) Bereitung des Inokulumqi Eine 300ml Flasohe enthaltend 100ml des folgenden sterilen Mediums wird mit M.Grisea beimpftt Medium A. Fleischextrakt 3g

η Tryptose ^ *' 5 g r| Hefe-Extrakt } ] 5g

Dextrose ,< , ig

Särke . 24g

Kalziumkarbonatρ , 2g Leitungswasser" ~~*' " TtöOOml " ""

Die Flasche wird unter fortlaufendem Schütteln auf einem Dreheohtittler bei 250 bis 300 rpnt (Umdrehungen pro Minute) bei 25° bis 35°C bebrütet bis wesentliches Vaohstum erreicht wird* Dies dauert gewöhnIioh 1 bis etwa A Tage· b) Fermentation ι Eine 2,0 1 Flasche enthaltend 500ml des untenstehenden Mediums wird mit 5% des in Stufe a bereiteten Inokulums beimpft·

Medium B.Sdjabohnenmetil ,- 30g. Dextrin 50g

Kalziumkarbonat , 7g

Dextrose 5g

Leitungswasser 1000ml

Das beimpfte Medium wird»in einem Temperaturbereich von etwa 26⁰C bis etwa 35°C für etwa Ii bis etwa 7 Tage unter fortlaufendem Schütteln auf einem Drehsohttttler bei 200-300 rpm fermentiert Die Fermentation wird periodisch 'naoh den ersten 48 Stunden geprüft, um festzustellen, wenn die Spitze der antibiotischen

. ■ ; ' * ■'■' ■■■'■■

Wirksamkeit erreicht ist, und von diesem. Zeitpunkt an wird die Fermentation naoh dem Verfahren des Beispiels 8 aufgearbeitet·

Beispiel 6i 14 Liter Tankfermentation von M.grisea

») Keimungestufe ι Ein 25ml Amteil des wie in Beispiel 5 be reltoten Inokulums wird in eine 21 Erlenmeyer-Flasohe gegeben, die 500 ml steriles Inokulum^Medium enthalt. Daa Inokulum wird fetwa 2 bis etwa k Tage unteri fortlaufendem Sohtltteln bei etwa

i280 rpm bei etwa 28⁰C beHrUtet.

"b) Fermentationsstufei Der volle Inhalt der Keimungsflasche

Vird itiiein ttl Fermentationsgefäß, das 10 1 steriles Medium B

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enthält, gegeben. Die Fermentationsmisohung wird bei etwa 35⁰C unter ständigem Schütteln bei etwa 250-500 rpm für etwa 90 Stunden bebrütet. Der pH—Wert wird während der Fermentation zwischen 7»2 und 8,3 gehalten, während das Kulturmedium mit etwa 3 bis etwa 5 1 Luft pro Minute belüftet wird. Die Fermetationsmischung wird periodisch nach den ersten 48 Stunden geprüft, um festzustellen, wann die Spitze der antibiotischen Wirksamkeit erreicht wirdi, und von diesem Zeitpunkt an wird die Fermentation naoh dem Verfahren des Beispiels 8 aufgearbeitet

» "l

Beispiel 7: 95 Liter (25 (Gallonen) Tankfermentation von Mgrisea

Inokulumstufe /

Medium 0 ι

Hefe-Extrakt ' 5,0 g

Fleischextrakt 3_f0g i

Trypton 5_f0g ■

Kartoffelstärke 24_t0g »

Cerelose IjOg

Kalziumkarbonat IjOg

Wasser ljQ'1

ijO Liter des Mediums C wird mit der oben angeführten Zusammensetzung hergestellt. Der pH-Wert wird auf 7»3 eingestellt und aliquote Teile von 0.5 1 werden in 21 Erlenmeyerflasohen

ο gegeben. Das Medium wird für 45 Minuten bei 121 C sterilisiert. Danach wird auf Raumtemperatur abgekühlt und ,jede Flasche wird mit 5ml einer M,grisea Kultur beimpft. Jede Flasohe wird für 72 Stunden in einem Drohsohüttler (200rpm) bei 3O⁰Q bebrütet. Das Inokulum (25ml pro Flasche) wirä ^u 0.51 steriles Medium C gegeben und .1ede Flasohe wird für 48 Stunden auf einem Drehschüttler bei 30°C bebrütet. 5.01 dieses Inokulums werden

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vereint und zu 901 sterilen Mediums C hinzugefügt, die Temperatur wurd auf 30⁰C gebracht, der pH-Wert auf etwa 7#3- 7,7, die Belüftung beträgt etwa 1-2 Kublkfuß (2fl-56Liter) pro Minute, und die Schtlttelung etwa 200-400 rpm. Die Fermentation wird für etwa 100 bis etwa 130 Stunden fortgesetzt bis die Spitze der antibiotlschen Wirksamkeit erreicht

ist, und dann wird die Fermentation nach dem Verfahren des Beispiels B aufgearbeitet·

Beispiele isolierung des antlbiotischen Komplexes Zif 601 der nach dem in den* Beispielen 5 bis 7 beschriebenen Verfahren hergestellten FeVmeTftaticmsbrHhe werden etwa ¹IOOg Oxalsäure unter heftigem SYjhütfteln hinzugefügt. Der pH-Wert der Fermentetionsmisohung Wird mit 6n Schwefelsäure auf 2,0 eingestellt und es wird für etwa ^20 Minuten geschüttelt. Die angesäuerte Fermentetionsnlischung wird filtriert und das FiItrat zurückbehalten. Der My*celkuohen wird mit Leitungswasser gewasohen und die Waschflüssigkeit wird mit der filtrierten Brühe vereint.,i Zu >diesem Zeitpunkt ist es vorteilhaft, die Filtrate und die WaeohflUsslgkeitön von etwa Fermentationen (d.h. etwa 1801) zu vereinen. Die vereinten Filtrate und Waschflüssigkeiten werden mit 6n Ammoniumhydroxyd neutralisiert (man braucht etwa 500 bis etwa 900ml). Der antibiotisohe Komplex yird auf IRC-50 in der Ammonium-Form adsorbiert, indem die;neutrale Brühe durch eine Harzsäule, welche 2" hoch (5.1 x 65.69m) ;ist, hlndurchgefUhrt. Die Durohflußgeschwindigkiet wird auf etwa 175-2OOml/Mlnute gebraoht bis die ganze Brühe verarbeitet ist. Die Säule wird mit deionisiertem Wasser (etwa 20l), farbfrei gewasohen· Der antibioti,sohe Komplex wird mit 2n Amm^oniumhydroxyd bei einer Gesohwin-

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1. ι- ' - 53 -

digkeit von etwa 80ml/Minute desobiert, anschließend mit defonisiertani Wasser, wenn der pH-Wert des Eluats iO erreioht hat. Das Eluat wird im Vakuum auf etwa 11 eingeengt und lyophilisiert, um den antlbiotischen Komplex zu erhalten. Wenn das Eluat stark gefärbt ist, kann eine Behandlung mit

IRA-4O1S vorgenommen werden. Diese Behandlung wird gewöhnlich durchgeführt, indem das Eluat der vorhergehenden Säule durch eine Säule von IRA-401S (l"Durohmesser χ 20" Höhe; d.h.2.54 χ 50.8cm) mit einer Geschwindigkeit von etwa 120pl /Minute hindurchgefiihrt wird. Die IRA-401S Säule wird frei von Antibiotikum gewaschen

und das Eluat und die Waschflüssigkeit wird wie oben beschrieben eingeengt. ♦

Beispiel 9« A. Bereitung des Sulfatsalzes des antibiotisohen Komplexes

37g der naoh Beispiel 8 erhaltenen rohen Komplex-Base werden in iOOOml Wasser gelöst und der pH-Wert wird mit Schwefelsäure auf 4,5 eingestellt. Die Lösung wird mit Daroo G60 für etwa l/2 Stunde gerührt und dann filtriert* Ds Piltrat wird auf etwa , 100ml eingeengt und zu einem MethanolUbersohuß hinzugefügt. Der entstandene Niederschlag des gemischten Sulfates wird abfiltriert und unter Vakuum getrocknet.

B. Umwandlung des Sulfatsalzes in die antlblotisohe Komplex-Base

Die naoh Stufe A erhaltenen gemisohten Sulfate werden in IOOOml Chloroform suspendiert und Ammoniak-Gas wird durch die Suspension für etwa l/2 Stunde durohgeblasen. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat zur Trockenheit eingedampft, um die

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Antibiotikum-Komplex-Base zu erhalten.

Beispiel 10t Isolierung von Verdamoin I, Sisomicin, Antibiotikum G-418 und Gentamicin Λ

121b (5^45kg) Silioagel werden in der niederen Phase einer Lttsungsmlttelmisohung bestehend aus Isopropanol!Chloroform: konts. Ammoniumhydroxyd (lt2:l v/v) suspendiert» Die Suspension wird auf eine ohromatographisohe Säule mit einen Inneren Durohmesser von etwa 4" (lO^2cm) gebraoht· 100g des nach Beispiel B erhaltenen antibiotisohen Komplexes werden in etwa 1,0 Liter der niederen Phase des zur Bereitung der ohromatographisohen Säule verwendeten Lösungseittelsystems suspendiert. Die β,ο erhaltene Suspension wird filtriert

* ■ ■■ "

und die unlösHohen Teile ,werden zur weiteren Behandlung zurückbehalten. Das FiItrat wird auf ca. 1,01 eingeengt bevor es auf die Säule gebraoht wird. Unter Erhitzen und Rühren wird das vorher erhaltene unlösliohe Material (oa, 66g) in Methanol gelöst und dann filtriert, um das vorhandene anorganische Material (etwa 6g) zu entfernen. Die methanolisohe Lösung wird ,pn Luft gekühlt und nochmals filtriert us das meiste des geringfügig lösliohen Gentamicin A Karbonates zu entfernen. .

Der antibiotisohe Komplex,, von dem das meiste des Gentamicin A entfernt wurde, wird auf die wie oben bereitete Silioagel-SSuIe adsorbiert und das Chromatοgramm wird mit der Lösungsmittelmisohung entwickelt,: wobei 2,0 1 Fraktionen mit der SHuIe bei vollem Fluß genommen werden. Venn das Sisomicin desorbiert ls-t (was normalerweise etwa 90 bis etwa 100 Fraktionen erfordert), wird das Verhältnis der Lösungsmittel zu ltitl ge-

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Hiidert und Elution wird fortgesetzt bis das verbleibende Material desorbiert ist. Bei der Durchführung der Trennung des antibiotischen Komplexes auf einer Säule dieser Größe ist die Anzahl der gesammelten Fraktionen im allgemeinen etwa 250 bis etwa 350. Jede Fraktion wird auf Filterpapier getupft und mit Ninhydrin Reagenz getestet, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antibiotikum, d.h. Ninhydrin—positives Material, zu bestimmen. Jene Fraktionen, die antibiotische Substanzen enthalten, werden einer Papier-Chromatographie in einem System bestehend aus Chloroform; Methanol χ 17$ Ammoniumhydroxyd (2:1:1 v/v) unterworfen, an die sich eine Bioautographie gegen Staphylococcus aureus ATCC 6538P anschließt, um-festzustellen, welche Fraktionen dasselbe Antibiotikum enthalten. Die Fraktionen werden entsprechend der mittels Chromatographie und Bioautographie gemachten Bestimmung vereint, die vereinten Fraktionen werden im Vakuum auf etwa 100ml eingeengt und dann lyophilisiert.

Die Verteilung der Antibiotika von der E>ä'ule ist im wesentlichen

wie folgt:

Fraktionen ί Antibiotika

i- 65 unwirksame organische Materialien

66- 87 Verdamicin I

88- 91 Sisomicin

119- 259 . · Antibiotikum G-418

259- Ende . zurückgebliebene Gentamicin A

Befepiel ils Bereitung von Verdamicin I-Sulfat

500mg des nach dem Verfahren des Bespiels 10 bereiteten Verdamicin

I '

I werden in 90ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung

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wird mit verdünnter Schwefelsäure auf 4,5 eingestellt. Die Lösung wird mit i bis 2g entfärbender Holzkohle (Dareo G-6o) flir etwa 30 Minuten gerührt und dann filtriert. Das Piltrat wird im Vakuum auf etwa iOml eingeengt und unter Rühren in etwa iOOml Methanol geleert. Die entstandene Suspension wird filtriert, das feste Produkt mit frischen Methanol gewasohen und dann getrocknet, wobei etwa 450mg Verdamicin I 8ulfat erhalten werden.

Beispiel 12t Bereitung des Verdamicin I-Hydroohlorid 400mg dee in Πobpiel 10 bereiteten Verdamloin I werden In etwa 75ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung wird mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf 4,5 eingestellt. Die Lösung wird mit i bis 2g entfärbender Holzkohle (Daroo G-6o) für etwa 30 Minuten gerührt und dann filtriert. Das Piltrat Filtrat wird im Vakuum auf etwa 30 Minuten gerührt und wird im Vakuum auf etwa 7!>ml eingeengt und unter Rühren in 150ml einer Methanolt Azeton (it2 v/v) Misohung geleert, Die entstandene Suspension wird filtriert, das feste Produkt mit frieohem Aoeton gewasohen und getrocknet, wobei etwa 300mg Verdamicin I-Hydrochlorid erhalten werden. Das obige Verfahren ist von allgemelier Anwendbarkelt und kann mit einer äquivalenten Menge der vorher beschriebenen Säuren verwendet werden, un nicht-toxische Säureadditionssalze zu bilden, welohe die funktionelle Äquivalente von Verdamicin I-Hydrochlorid ttnd Verdamicin I Sulfat sind.

Beispiel 13t Bereitung der_: Verdamicin I Base

390 mg des wie in Beispiel Ji bereiteten Verdamicin I-Sulfates werden in iOml Wasser gelöst. Eine IRA-401S Säule (AmberIite

Anionauetauscher-Harz, Rohm und Haas) mit den folgenden Aus-

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maßen wird bereitet: Höhe 25 cm, äußerer Durohmesser 2cm. Di« antibiotieohe LHsutig wird der HarzeHule zugeführt und mit deionisiertem Wasser eluiert bis das Eluat mit Ninhydrin nicht reagiert. Das Exuat wird auf etwa 25 ml eingeengt und dann lyophilisiert, wobei 230 mg Verdamioin' I erhalten werden.

- 58 ■-

30982471182

Claims (1)

1. Patentansprüche :

   1« Verfahren zur Herstellung einer antlbiotisoh wirksamen, ein neues Antibiotikum G-418 enthaltenden Substanz und deren Derivate, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Gattung Mioromonospora rhodorangea oder der Gattung Micromonospora grisea in einem wässerigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen kultiviert wird bis dem Medium wesentliche antibiotische Wirksamkeit verliehen ist.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus in einem Nährmedium unter submersen aeroben Bedingungen kultiviert wird.

   3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einer Temperatur von 20° bis 40⁰C durchgeführt wird.

   ; ι

   k_t Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur 28? bis 35°C beträgt.

   - 59 -

   309824/1182

   ! ■

   5. Verfahren nach einem der Ansprüche i bis (!,.dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung bei einem pH-Wert von 6,5 bis 8,5 durchgeführt wird.

   6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet», daß die Kultivierung bei einem pH-Wert von 7,2 bis 8,3 durchgeführt wird*

   7» Verfahren nach einem der Ansprüche i bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus der Gattung Micromonospora igrisea der als NRRL 3800 bezeichnete Stamm ist.

   8. Verfahren nach einen der Ansprüche i bis 6, dadurch gekennzeichnet., daß der Mikroorganismus der Gattung Micromonospotra rhodorsfangea der ale NRRL 5326 bezeichnete Stamm ist.

   1 r ·

   9* Verfahren nach einen der Ansprüche 1 bis 8,- dadurch gekennzeichnet, daß eine das neue Antibiotikum G-418 enthaltende antibiotlsch wirksame Substanz aus dem Fermentationsmedium oder aus dem Myeel gewonnen wird. 1 r

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   J.O. Verfahren nach einen der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung folgende Schritte umfaßt: AnSäuerung des Fernentatlonsnediums, Abtrennung des Hycele, Neutralielerung des Fernentationsnediuns und Extraktion einer das neue Antlbiotlkun G-418 enthaltende antlbiotisch wirksamen Substanz.

   11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch ge- ! kennzeichnet, daß das Anibiotlkue G-418 der Fomel

   CH-CHOH -0

   In freier Form isoliert wird.

   309824/1182

   - 61 -

   12. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum G-418 in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Derivates isoliert wird.

   13» Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das pharmazeutisch annehmbare Derivat ein Säureadditionsealz ist,

   Ik, Verfahren nach Anspruch 13» dadurch gekennzeichnet, daß das pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalz das SuIfa^ isjt.

   15» Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß das pharmazeutisch annehmbare Derivat ein Schiffsche-BaserOxazolidin-Deriyät ist«

   l6. Verfahren nach Anspruch 151 dadurch gekennzeich· net, daß das Schiffgche-Base-Oxazolidin-Derivat die allgemeine Formel · ,

   -0. ft

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   N=GHR.

   N^GHR₁

   i?'

   U^CHR

   hat, worin R. ein Alkylrest mit 1 bis 11 Kohlenstoffatomen, ein Cycloalkylrest mit 3 bis 11 Kohlenstoffatomen, ein Cycloalkylalkylrest mit k bis 11 Kohlenstoffatomen, ein Aryl- oder Aralkylreet mit 6 bis 11 Kohlenstoffatomen oder ein aromatisch-heterocyölischer Rest oder aromatisoh-

   heterocyolisoher Alkylrest mit 5 bis 11 Kohlen-Stoffatomen ist·

   17· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß eine nicht nur das neue Antibiotikum 6-418, 'Sondern auoh wenigstens ein Antibiotikum ausgewählteunter Gentamicin A, Sisomicin und dem neuen Antibiotikum Verdamicin I enthaltende antibiotisch wirksame Substanz duroh Kultivierung ▼on Nlcromonospora grisea erzeugt wird und aus dem Fermentationsmedium oder aus dem Myoel gewonnen wird.

   ι r

   18. Verfahren nach Ansprach_R17» dadurch gekennzeichnet, daß die Gewinnung folgende Schritte umfaßtt AnSäuerung des Fermqntationsmediums, Abtrennung des Nycels, Neutralisieren des Fermentationsmediums und Extraktion der «ntibiotisoh wirksamen Substanz.

   - 61 309824/1182

   19· Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß das als Verdamicin I bezeichnete neue Antibiotikum der formel

   HO

   NHCH₃ OH

   in freier Form aus Üer»antibiotisch wirksamen Substanz isoliert wird*

   20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß Verdamicin I id Form eines pharmazeutisch annehmbaren Derivates isoliert wird.

   21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das pharmazeutisch annehmbare Derivat ein Säure· additionssalz ist. < '

   22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das pharmazeutisch ,annehmbare Säureadditionssalz das Sulfat ist. ■

   - 64 -

   309824/i 182

   ι ι

   23. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß das pharmazeutisch annehmbare Deritat ein Sohiffeohe-Base-Oxazolidin-Derivat ist.

   24. Verfahren naoh Anspruoh 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß eine" Misohung aus zwei oder mehreren der Antibiotika Sisomicin, Verdamicin I, Gentamicin A und Antibiotikum G-418 aus der antibiotisoh wirksamen Substanz isoliert wird.

   > h

   25· Verfahren naoh Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischung^aus zwei oder mehreren der Antibiotika Verdamicin I, Sisomicin, Gentamicin A und Antibiotikum Gf-4i8> in freier Form isoliert wird. f ι

   26. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß eine Mischung* aus zwei oder mehreren der Antibiotika Verdamicin I, Sisomicin, Gentamicin A und Antibiotikum G-418 in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Derivates Isoliert wird.

   27. Verfahren naoh Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat ein Säureadditionesalz ist.

   r » ' -65-98 2 4/1182

   28. Verfahren nach Anspruch 27» dadurch gekennzeichnet, daß das Säureadditionssalz das Sulfat ist..

   29. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch ge- , kennzeichnet, daß Gentamicin A und/oder Sisomicin von der das neue Antibiotikum G-418 enthaltende antibiotisch wirksamen Substanz isoliert wird.

   30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeich- < net, daß Gentamicin A un<d/oder Sisomicin in Form

   eines pharmazeutisch,; annehmbaren Derivates isoliert wird.

   ι ■ ■ ■ ■ ι

   31« Verfahren nach Anspruch ,30, dadurch gekennzeichnet, daß das Derivat: ein Säureadditionssalz ist.

   32. Verfahren nach Anspruch 1, im wesentlichen wie hierin beschrieben··!

   ;■-■■·. -A ·.■■ - .-■-.'

   33* Verfahren nach Anspruchjl,'im wesentlichen wie hierin beschrieben unter Bezugnahme auf irgendeines der Beispiele 1 und 5 bis ,7.

   - 66 -

   309824/1182

   Antibiotisch wirksame Substanz hergestellt nach einen Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 33.

   35. Antibiotikum 6-418 isoliert mittels des Verfahrens nach Anspruch 11.

   36« Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionsealz· des Antibiotkums 6-418 isoliert mittels des Verfahrens nach Anspruch 1(5 oder 14.

   Ii

   57. Pharmazeutisch annehmbare Schiffsohe-Base-Oxyzolidin-Derivate des Antibiotikums 6-418 Isoliert mittels des Verfahrens nach Anspruch 15 oder 16.

   38. Verdamicin I isoliert mittels des Verfahrene nach Anspruch 19. I ι

   39* Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze des Verdamicin I isoliert mittels des Verfahrene nach Anspruch 21 oder 22.» ι

   ·> ι

   40. Pharmazeutisch annehmbare Sohiffsohe-Base-Oxazolidin· Derivate des Verdamicin I isoliert mittels des Verfahrens naoh Anepruoh 23.

   ,3 0 9824/1182 - 67 -

   41. Gentamicin A und Sisomicin und pharmazeutisch annehmbare Derivate davon, isoliert mittels des

   : Verfahrens nach einem der Ansprüche 29 bis 31»

   42. Antibiotikum G-418 der Formel

   . HO

   mit dem Infrarot-Spektrum in Mineralöl und dem N.M.R.Spektrum in Deuteriummethanol wie sie Im wesentlichen in Fig.3 und 4 der Zeichnungen gezeigt sind.

   43. Pharmazeutisch annehmbare Derivate des in Anspruch 42 definierten. Antibiotikums G-418, ,

   44. Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze des in Anspruch 42 definierten Antibiotikums G-418.

   - 68 -

   309824/1182

   45. Antibiotikum G-418-Sulfat.

   46· Pharmazeutisch annehmbar« Sctiiffsche-Baee-Oxazolidin-Derivate des in Anspruch 42 definierten Antibiotikum G-418.

   47. Pharmazeutisch annehmbare Schiffiohe-Baae-Oxazolidin-Derivate dee Antibiotikum· G-418 mit der Formel

   CH₃CHOH -0

   W ¹I

   worin R₁ ein Alkylrest mit 1 bis 11 Kohlenstoff-

   t t

   atomen, ein Cycloalkylrest mit 3 bis 11 Kohlenstoffatomen, ein Cycloalkylalkylrest mit 4 bis 11 Kohlenstoffatomen, ein Aryl- oder Aralkylrest mit 6 bis 11 Kohlenstoffatomen, oder ein aromatisoh-heterocyolischer Rest oder aromatisoh-heterocyolischer Alkylrest mit 5 bis L· Kohlenstoffatomen let·

   ^09824/^182

   tP

   - 69 -

   48. Antibiotikum Verdamicin I der Formel

   HO

   NH,

   t und dem Infrarot-Spektrum in Mineralöl und dem

   N.M.R.Spektrum in einer Mischung aus Deuteriumoxyd und Dimethylsulfoxyd wie sie im wesentlichen in den Fig.i und 2 der angeschlossenen !Zeichnungen gezeigt sind.

   49» Pharmazeutisch annehmbare Derivate des in Anspruch 48 definierten Verdamicin

   50. Pharmazeutisch annehnbaxie Säureadditionssalze des in Anspruch 48 definierten Verdamicin I«

   51. Verdamicin !-Sulfat.η « ι

   52. Verdamicin I-Hydrochlorid.

   ir ·ι

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   1 11

   53* Pharmazeutisch annehmbare Schiffsche-Base-

   Oxazolidin-Derivate des in Anspruch 48 definierten Verdamicin I.

   I ι

   54. Antibiotisch wirksame Zusammensetzung, welche

   das in Anspruch 42 definierte Antibiotikum 6-418 oder ein pharmazeutisch annehmbares Derivat davon, au β aminen mit mindestem einen Antibiotikum tuig·- wählt von dem in Anspruch 48 definierten Verdamicin I,

   • Sisomioin und Gentamioin A oder deren pharmazeutisch annehmbaren Derivaten enthält.

   55· Verdamicin I oder ein pharmazeutisch annehmbares Derivat davon,sowie ,mindestens eines der Antibiotika Sisomicin und Gentamicin, A oder von deren pharmazeutisch annehmbaren. Derivaten enthaltende antibiotisch wirksame Zusammensetzung.

   56. Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche als wirksamen Bestandteil mipdestens eine Verbindung ausgewählt von dem in Anspruch 42 definierten Antibiotikum G-418 und d,em ^n Anspruch 48 definierten Verdamicin I und der,en pharmazeutisch annehmbaren

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   ι '

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   Derivaten zusammen mit einem pharmazeutischen

   Träger oder Bindemittel enthalten·

   57. Zusammensetzungen nach Anspruch 56,in Form einer

   Doseneinheit,

   58. Zusammensetzungen nach Anspruch 56 oder 57 in Fora injizierbarer Präparate in Ampullen*

   59. Zusammensetzungen nach Anspruch 56, in Form von Salben, Cremen oder Lotionen*

   60. Zusammensetzungen nach einem der Ansprüche 56 bis 59, dadurch gekennzeichnet, daß der wirksame Bestandteil ein pharmazeutisch annehmbares Säure-' additionssälz des Antibiotikums G-418 oder Verdamicin I ist. τ

   61. Verfahren zur Herstellung einer antibiotisoh wirksamen Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß ein wirksamer Bestandteil, ausgewählt unter Antibiotikum 6-418 (in Anspruch 42 definiert) und Verdamicin I (in Anspruch 48 definiert) und den pharmazeutisch annehmbaren Derivaten davon in eine zur therapeutischen, Verabreichung geeignete Fora gebracht wird.

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   62. Vorfahren nach Anspruch 61, dadurch gekennzeich- ' net, daß der wirksame Bestandteil mit einem pharmazeutischen Träger oder Bindemittel gemischt wird.

   63. Antibiotikum G-**18. 6h) Verdamicin I,

   65. Verwendung eines Mikroorganismuses der Gattung Micromonospora zur Herstellung eines neuen Antibiotikums, ausgewählt unter den Antibiotika G-418 und Verdamicin I₁ durch Fermentation·

   66. Jede neue Verbindung, Zusammensetzung und Methode und jedes Verfahren, welche bzw, welches hierin geoffenbart ist.

   SoheMoo Ltd. durcht

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