DE1932309C3 - Antibiotikum 66-40 ("Sisomicin") und seine pharmazeutisch annehmbaren funktioneilen Derivate Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaltende pharmazeutischen Mittel - Google Patents

Description

CH₃ Π Ο NH₂

NHCH₃ HO-<^J>

CH₂NH₂ /~Γ

NH₇

NH₂

und seine pharmazeutisch annehmbaren funktioneilen Derivate.

2. Verfahren zur Herstellung der Antibiotika nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Art Micromonospora inyoensis, insbesondere des Stammes NRRL 3292, in an sich bekannter Weise in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben, vorzugsweise submersen Bedingungen bebrütet und das so erhaltene Antibiotikum in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren funktionellen Derivats isoliert.

3. Pharmazeutische Zubereitung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einer Verbindung gemäß Anspruch 1 neben einem üblichen inerten Träger.

Diese Erfindung bezieht sich auf das »Antibiotikum 66-40« (»Sisomicin«) genannte neue Breitbandantibiotikum, das das Wachstum von grampositiven und gramnegativen Bakterien ungünstig beeinflußt, ferner auf ein mikrobiologisches Verfahren zu seiner Herstellung und auf pharmazeutische Zubereitungen, die dieses Antibiotikum enthalten. Das Antibiotikum kann in seiner freien Form oder in der Form seiner pharmazeutisch annehmbaren funktioneilen Derivate hergestellt, isoliert und verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist das Antibiotikum 66-40 (»Sisomicin«) mit der allgemeinen Formel

OH

NH₂

NH₂
und seine pharmazeutisch annehmbaren funktionel-

Antibiotikum 66-40 (»Sisomicin«) ist ein biosynthetisches Produkt, das durch Kultivieren eines das Antibiotikum 66-40 erzeugenden Stammes der Gattung Micromonospora in einem wäßrigen Nähr-

medium erhalten wird.

Das Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums 66-40 (»Sisomicin«) ist dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus der Art Micromonospora inyoensis, insbesondere des Stammes

NRRL 3292, in an sich bekannter Weise in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben, vorzugsweise submersen Bedingungen bebrütet und das so erhaltene Antibiotikum in freier Form oder in Form eines pharmazeutisch annehmbaren funktioneilen Derivats isoliert.

Der entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus für die Herstellung des neuen Antibiotikums wurde Micromonospora inyoensis genannt (im folgenden als M. inyoensis

bezeichnet). Diese Art wurde aus einer Erdprobe isoliert, die im Inyo National Forest in den White Mountains von Kalifornien gezogen worden war. Eine der Charakteristiken dieses Stammes ist seine Fähigkeit, das Antibiotikum 66-40 zu bilden. Eine

so Kultur von lebenden Organismen wurde in der Kulturensammlung des Landwirtschaftsministeriums (Department of Agriculture) der Vereinigten Staaten von Amerika, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, hinterlegt,

ss wo sie mit der Nummer NRRL 3292 bezeichnet wurde. M. inyoensis ist aerob und wächst gut auf der Oberfläche von verschiedenen festen und flüssigen Nährmedien. M. inyoensis zeigt besonders gutes Wachstum und die Bildung des Antibiotikums unter submersen aeroben Bedingungen.

M. inyoensis ist durch eine Vielzahl von Kennzeichen von anderen Arten von Micromonospora unterscheidbar. Nach 14-tägigem Bebrüten bei 24 bis 26° C auf einem Agar-Agar-Nährboden, der 3% Amin Typ A (Sheffield Chemical Company, Norwich, New York), 1% Dextrose und 1,5% Agar-Agar enthält, wird nur befriedigendes bis schwaches Wachstum beobachtet. Makroskopisch ist an der Luft kein

Mvzel sichtbar. Gelegentlich treten später wenige «al entwickelte Kolonien an der Impfstelle auf. Auf manchen Platten wird ein schwachrötüchbraunes "jjjjjjsionsföbiges Pigment, verbunden mit den Kolonien, beobachtet. (Für die Beschreibung der beobachteten Farben wird folgendes System und werden foteende Kennzeichen verwendet: Die Farbbezeich-Ljigen bestehen aus 2 Teilen. Der erste ist ein r^jbname, entnommen dem Buch »Descriptive Color Name Dictionary« von Taylor, Knoche und Granville (1950), herausgegeben durch Container Corporation of America, USA, mit einer dem

carhnamen entsprechenden Farbkennziffer, wobei rau«»·— ../-„i„, u„~~ \t ι.. - .

Nährmedium

Czapek-Agar
Tyrosin-Agar

Pepton-Eisen-Agar

Charakteristik^

Wachstum befriedigend
Wachstum befriedigend, kein
diffusionsfähiges Pigment
Wachstum befriedigend, kein
diffusionsfähiges Pigment

IO

M. inyoensis ist fähig, verschiedene Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zu verwerten. In Tabelle B sind Beobachtungen über den Einfluß von Kohlehydraten auf das Wachstum zusammengestellt. Eine

Hie Kennziffer dem »Color Harmony Manual«, vierte "J«™«· «* «* wacnstum zusammengesieui. cmc fiESoS»). herausgegeben durch Container Cor- _IS ™«e«e Bewertung des Wachstumsgrades wird in 1"Sn of Amenca, entnommen worden ist. Der * !™f^ra.^M?£^Jum vorgenommen das aus 0^5% Hefe-

poration ,, . . .

zweite Teil der Farbbezeichnungen besteht aus einem Farbnamen und einer Zahl, die sich auf ein Synonym oder annäherndes Synonym bezieht, entsprechend lter Veröffentlichung »National Bureau of Standard /USA), Circular 553 vom 1. Novembei 1955«. Die Farbe der Oberfläche der Kolonie variiert von ziegelrot g5oe — tiefbraun 55 bis mahagonibraun m6pi. Mikroskopisch kann festgestellt werden, daß das Myzel lang, verzweigt und regelmäßig ausgebildet ist Mit Hilfe von Phasenkontrastmikroskopie wird beobachtet, daß es nicht durch eine Scheidewand getrennt (wandlos) ist. Der Durchmesser des Myzels beträgt ungefähr 0,5 μ. Die Sporen werden einzeln auf einfachen Sporophoren von 1,0 bis 1,5 μ Durchmesser ausgebildet. Die Sporen haben eine unebene Wand und sind eiförmig bis kugelförmig geformt.

M. inyoensis wächst gut bei 28 bis 37° C; kein Wachstum tritt bei 50⁰C auf. Auf Glukose-Asparaginextrakt, 1% Kohlehydrat und
destilliertem Wasser besteht.

1,5% Agar-Agar in

Tabelle B
Einfluß von Kohlehydraten auf das Wachstum

Agar-Nährböden ist das Wachstum schwach. Eine 35 _ς , wachsende Kolonie von M. inyoensis hydrolysiert ^ta™ Gelatine, Milch, Stärke und reduziert Nitrat zu Nitrit, wenn solche Tests nach Gor do η et al., J. Bacteriology 69, 147 (1956) und 73, 15 (1957) durchgeführt werden. Ferner ist Saccharose als Kohlenstoffquelle verwendbar.

Weitere Charakteristika von Kulturen von M. inyoensis sind in Tabelle A zusammengestellt:

Tabelle A Nährmedium

Bennett-Agar

Emerson-Agar

Tomatenmark-Hafermehl Agar

Glukose
Asparagin Agar

Glukose Hefe
Extrakt Agar

Kartoffelscheibe

(haraktenslika

Im Nährmedium enthaltenes Kohlehydrat	Wachstum
K onti oll versuch	schwach
L-Arabinose	schwach
D-Glukose	gut
D-Galactose	befriedigend bis schwach
/?-Lactose	befriedigend bis schwach
D-Laevulose	schwach
Raffinose	schwach
L-Rhamnose	schwach
35 Stärke	gut
Saccharose	gut
D-Xylose	befriedigend bis schwach
Inosit	schwach
4° D-Mannit	schwach
d( - )-Arabinose	schwach
- Galactit	schwach
D-Ribose	befriedigend
45 a-Melibiose	schwach
D( + )-Melizitose	schwach
Glycerin	schwach

Wachstum mittelmäßig Farbe: rostbraun-g5pg; tiefbraun-55 Wachstum befriedigend Farbe: ziegelrot-g6ng: mittelrotbraun-43 Wachstum befriedigend

Wachstum schwach

SS In der Tabelle C ist der Einfluß von verschiedenen Stickstoffquellen auf Grund von visueller Bewertung des Wachstums auf Agar-Platten, d'e aus 1% Glukose, 1,5% Agar-Agar und einer Stickstoffquelle in destilliertem Wasser bestehen, zusammengestellt.

Tabelle C
Einfluß von Stickstoffquellen auf das Wachstum

röt-

Wachstum gut — Farbe: Hchbraun-g7ni; dunkles graurot-20 (schwachkastanienbraunes diffusionsfähiges Pigment wurde durch einige Kolonien gebildet) Wachstum schwach, wird aber durch Zugabe von Calciumcarbonat (p.a.) verbessert

60 Im Nährmedium enthaltene StickstofTquelle

1 % Amin Typ A

0,5% Hefe
1 % Asparagin
1 % Glutaminsäure
1 % Ammoniumnitrat

Wachstum

befriedigend bis mittelmäßig
gut

schwach
schwach
schwach

Antibiotikum 66-40, die neue Verbindung dieser Erfindung, wird gebildet, wenn der das Antibiotikum erzeugende Mikroorganismus M. inyoensis in einem wäßrigen Nährmedium unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise unter submersen Bedingungen, gezüchtet wird, wie im folgenden beschrieben wird.

Antibiotikum 66-40 ist ein basisches Pseudooligosaccharid, das, wie \n folgenden dargelegt wird, durch seine biologischen, physikalischen und chemischen Eigenschaften leicht von anderen Pseudo- ίο oligosacchariden unterschieden werden kann.

Antibiotikum 66-40 hat ein charakteristisches Infrarotabsorptionsspektrum in Paraffinöl, das in Fig. 1 wiedergegeben wird. Die charakteristischen Absorptionsbanden sind in Tabelle D zusammengestellt, wobei folgende Bezeichnungen verwendet werden: s = stark, m = mittel, schw — schwach, br = breit, ss = sehr stark, sschw = sehr schwach.

Tabelle E

20

Tabelle D

Charakteristische lnfrarot-Absorptionsbandcn von Antibiotikum 66-40

2,98 μ (m-s)	6,82 μ	(Paraf-	10.46 μ (m-si
	finöl)
3,05 μ (m-s)	7,25 μ	(Paraf-	11.97« (m)
	finöl)
3,16 μ (m-s)	8,77 μ	(m-s)	12,75 μ (sschw.
			br)
3,35 3,50 μ	9.00 μ	(m-s)	13.45 13,90 μ
(Nujol)			(schw. br)
5,93 μ (schw-m)	9,47 μ	(S)
6,25 μ (ml	9.72	10,07 μ
	(s, br)

Antibiotikum 66-40 hat auch ein charakteristisches magnetisches Kernresonanzspektrum [NMR-Spektrum], das in F i g. 2 wiedergegeben ist. Das NMR-Spektrum wurde unter Verwendung eines Varian-A-60-A-Spektrometers (Varian Associates, 611 Hansen Way. Palo AUo. California) und einer Antibiolikumlosung in Deuteriumoxyd (D₂O) (ungefähr 0,4 ml; Konzentration ungefähr 20 mg/ml) erhalten. Das Spektrum ist in Teilen per Million (PPM), bezogen auf das Natriumsalz von 3-(Trimethybtlo>-propansufonsäure als internem Standard aufgezeichnet. S₅

In Tabelle E sind wertere Daten, die qualitative Untersuchungen und physikalische Konstanten von Antibiotikum 66-40 (freie Base) betreffen, zusammen gestellt:

a) Farbreaktionen	negativ
Sakaguchi	positiv
Stärke-Kaliumjodid	positiv
Ninhydrin	negativ
Zinnchlorid	negativ
Molisch	positiv
Biuret
b) Physikalische Konstanten	+ 188,9
[«]? (c = 0,3% in H2O)	185 bis 190 C
Schmelzpunkt (Monohydrat)	92
Äquivalentgewicht	8,0
PKa

Elemenlaranaly.se

(Differenz)

Gefundener Wert Berechneter Wert für das Monohydrat

49,80%

8,20%

14,95%

27.05%

49,02%

8,44%

15,04%

27,50%

30 Elementaranalyse entspricht der Formel C₁₉H₃₇N₅O₇ · H₂O

Molekulargewicht (bestimmt durch Massenspektrometrie) 447,26.

Ultraviolett-Absorption: transparent im Bereich zwischen 220 und 400 ηΐμ.

c) Löslichkeit des Antibiotikums 66-40 (freie Base) in verschiedenen Lösungsmitteln

Lösungsmittel	Löslichkeit
Methanol	sehr schwach löslich
Azeton	unlöslich
Chloroform	schwachlöslich
Äther	unlöslich
Benzol	unlöslich
Wasser In Tahdtff P rxrirA Am*	sehr gut löslich

biolikum 66-40 (freie Base) beschrieben. In der Ta bell bedeutet nve das Verhältnis von Masse zu Ladung ReI. Int. bedeutet relative Intensität. Die Werte, die mi ReI. Int. bezeichnet sind, geben die Intensität να Peaks bei verschiedenen m/e-Werten im Verhältni zur Intensität des Peaks bei dem m/e-Wert = 118 ai

Tabelle F Massenspektrum von Antibiotikum 66-40 (freie Base)

	RcI Int	I m c j	RcI InI	m c	Rei Jr.
40	3.0	75 !	3.0	113	II.0
4i	30.0		24.0	114	140

m c	Rd Im	ra/c	Rd Im	mt
146	11.0	199	ZO	300
147	3.5	200	2,0	304

Rd Im

4.0 41.0

Fortsetzung

m/e	ReI. Int.	me	Rel.lnl.	me	τ ReI. Im.	m e
42	63,0	81	19,5	115	2,5	151
43	50,0	82	35,5 .	116	2,5	152
44	>100%	83	16,5	117	1,0	155
45	8,0	84	51,0	118	1OU	156
					(Bezugs
					wert)
46	5.0	85	21,0	119	8.0	157
51	2,5	86	58,0	120	2,0	158
52	3,5	87	28,0	121	2,0	159
53	10,0	88	11.0	122	2,0	160
54	10,0	92	7,0	123	2.0	161
55	20,0	93	6.0	124	XO	162
56	50,0	94	15.0	125	6.0	163
57	23,5	95	7,0	126	20,0	164
58	64,0	96	10.0	127	35,0	168
59	40.0	97	15.0	128	12,0	169
60	13.5	98	23,0	129	5.0	170
65	4.0	99	11.0	130	15.0	173
66	3.5	100	44,0	131	2,5	174
67	12.0	101	14.0	133	2,0	176
68	65.5	102	17.0	135	2.0	178
69	21.0	107	3.0	138	2.0	185
70	19.0	1OS	7.5	140	3.0	186
71	30.0	109	17,0	142	16.0	187
72	66.0	110	50,0	143	3.5 /	188
7?	66,0	111	13.0	144	6,0	191
74	28.0	112	19,0	145 I	65.0	192

Rel.lnl.	m/e	Rel.lnl.	m/e	I	ReI. Int.
2,0	201	3,0	305	7,0
2,5	202	2,5	317	8,5
3,0	203	22,0	322	3,0
2,0	205	6.0	330	5,0
2.5	206	6,0	331	2,0
4.5	215	6,0	332	23.0
3,5	216	2,0	333	4,0
98,0	219	2.0	350	5,0
9,5	220	2,0	362	15,0
2,0	236	7.0	363	3.0
20.0	237	2.0	411	0,5
2,0	238	6,0	412	0,6
2.0	239	2,0	414	0,5
3,5	245	4,0	429	0.9
2.5	246	6,0	430	4.5
19.0	253	Z5	431	1.0
3,0	254	4,5	447	5,0
3,0	255	2,5	448	1.3
7,0	256	10.0
2.0	270	2.0
2.5	271	11.0
17.0	272	6.0
2.5	282	5.0
32.0	289	4.5
3.5	299	9.0

Wie bereits erwähnt, bezieh! sich diese Erfindung auch auf pharmazeutisch annehmbare Derivate von Antibiotikum 66-40, beispielsweise seine Solvate (z. B Hydrate). Salze und Kondensationsprodukte mit Aldehyden und oder Ketonen. Es ist selbstverständlieh, daß das Antibiotikum auch mehr als einer Nachbehandlung unterworfen werden kann: beispielsweise umfaßt die I rfindung auch Solvate von Salzen des Antibiotikums 66-40.

Einige dieser Derivate sind im folgenden cinjrehender beschrieben:

Das basische Antibiotikum 66-40 bildet leicht Salze mit organischen und anorganischen S.iuren. beispielsweise mit Salzsäure. Schwefelsäure. Phosphorsaure. Essigsaure. Stearinsaure. Propionsäure. Weinsäure. Maleinsäure und Benzoesäure. Ebenso können teilweise neutralisierte mchrhasischc S;iurcn (beispielsweise neutralisiert mil einer organischen oder einer anorganischen Base. / B. Natronlauge) verwendet werden Im allgemeinen sind Mineralsäurcsal/e. wie die mit Salzsäure. Schwefelsäure und Phosphorsäure gebildeten, in Wasser löslich und können durch Konzentrieren oder Gefriertrocknen aus einer wässerigen Lösung oder durch Ausfüllen Jnit Hilfe eines mil Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels, vorzugsweise einem niedrigen aliphatischen Alkohol oder Keton. erhalten »erden

Es sei hervorgehoben, daß Hydrochloride von Antibiotikum 66-40 gute Löslichkeit in Methanol zeigen und deshalb atypisch sind. Die Hydrochloride können aus wässerigen Lösungen durch Zusatz eines niedrigen Alkylketons, beispielsweise Aceton, ausgefällt werden. Durch Titrieren einer wäßrigen Lösung von Antibiotikum 66-40 mit weniger als der stöchiometrischen Menge der Säure ist es möglich, ein partielles Säureadditionssalz zu erhalten. Der in der

so Beschreibung verwendete Ausdruck »Säureadditionssal/« umfaßt alle diese Verbindungen.

Die oben beschriebenen ungiftigen Säureadditionssalze zeigen im wesentlichen das gleiche antibiotische Spektrum wie die freie Stickstoffbase. Sie unterscheiden sich nur in bezug auf ihre Löslichkeit.

Das neue Antibiotikum und seine Säureadditionssalze bilden mit Wasser Hydrate und andere Solvate mit organischen Lösungsmitteln Es ist daher offensichtlich, daß bei den hier beschriebenen Isolationsverfahren das Antibiotikum meist in Form seines Hydrats und sein Säureadditionssalz meist in Form des Solvais eines niedrigen aliphatischen Alkohols odc Ketons erhalten wird. Diese Hydrate und Solvate sind relativ stabil, weshalb die isolierten Pro-

6$ duktc Whsscr oder Lösungsmittel enthalten, meist ungefähr 1 Mol pro Mol Antibiotikum

Physikalische Daten einiger Derivate dieser Art sind in Tabelle G zusammengestellt:

509608/115

Tabelle G

Physikalische Konstanten von Salzen des

Antibiotikums 66-40

Hydrochlorid des Antibiotikums 66-40

als Methylalkoholat

[„]« (c = 1% in H₂O) +112,2°

Elcmcntar-	Gefundener	Berechneter
analyse	Wert	Wert
C	37,70	36,29
H	7,15	7,00
N	10,61	10,58
Cl	25.60	26.78

'5

Die Analyse entspricht der Formel

C₁₉H₃₇N₅O₇ 5HC! · CH₃OH

Ultraviolett-Absorption: transparent im Bereich zwischen 220 und 400 mu.

Sulfat des Antibiotikums 66-40 als Methylalkoholat [α]?(<· = 1% in H₂O) +105,1

ilementar-	Gefundener	Berechneter
analysc	W ei;	Wen
C	32.52	33.14
H	6,33	6.39
N	9.32	9.66
SO4	33.90	33.13

Die Analyse entspricht der Formel

(C_WH₃₇N_SO,), 5H₂SO₄ ■ 2CH₃OH

35

40

Ultraviolett-Absorption: Durchlässigkeit im Bereich zwischen 220 und 400 ΐημ.

Wie bereits erwähnt, bildet Antibiotikum 66-40 auch ungiftige Kondensationsprodukte mit Aidehyden und/oder Ketonen nach an sich bekannten Verfahren. Von den beschriebenen Verbindungen sind diejenigen Produkte, es handelt sich dabei wahrscheinlich um Schiffsche Basen, bevorzugt, die durch Kondensieren des Antibiotikums mit Aidehyden und/oder Ketonen mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen hergestellt sind Umfaßt sind aliphatisch^:, alicyclische. aromaiische. ebenso wie heterocyclische Aldehyde und Ketone Ferner können Aldehyde und Ketone, die einen geschlossenen Ring aufweisen. _s< Substituenten tragen, wie beispielsweise Hydroxyl-, Halogen-, Nitro-, niedrige Alkoxy- und niedrige Alkanoyloxygrupnen. Beispielsweise seien folgende Aldehyde und Ketone genannt: Acetaldehyd. Aceton. Melhyläthyiketon. Krotonaldehyd, Furfurol. Cyclepentylacetaldehyd. Vanillin. Veratraldehyd. Ben/ophenon. Benzaldehyd. Acetophenon. Salicylaldehyd und Pyridoxal. -

Us sei erwähnt, daß diese Kondensationsprnduklc in der (jegenwart von Wasser nicht stabil sind. 6s

Wie bereits erwähnt, wird Antibiotikum 66-40 gebildet, wenn der dasselbe erzeugende Mikroorganismus M. inyoensis in einem wässengen Nährmediiim unter aeroben, vorzugsweise unter submersen Bedingungen gezüchtet wird.

Für begrenzte Mengen an Antibiotikum kann eine Oberflächenkultur in Flaschen oder Schüttelkolben an Stelle einer submersen Kultur verwendet werden. Der Organismus wird in einem Nährmedium gezüchtet, das eine Kohlenstoffquelle enthält, beispielsweise ein assimilierbares Kohlehydrat. Ebenso ist eine assimilierbare Stickstoffverbindung oder ein eiweißhaltiges Material erforderlich. Bevorzugte Kohlenstoffquellen umfassen Glukose. Maltose. Mannose, Saccharose. Stärke. Getreidestärke u. dg!. Bevorzugte Stickstoffquellen sind Maisquellwasser, Hefeextrakte, Soyabohnenmchl. Fleischpeptone. Kaseinhydrolysate, Rindfleischextrakle u. dgl. Kombinationen dieser Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können vorteilhaft verwendet werden. Im allgemeinen ist es nicht erforderlich. Spurenelemente beizufügen, da Leitungswasser für die Herstellung des Nährmediums verwendet wird. Trotzdem wurde festgestellt, daß der Zusatz von Coballsalzen vorteilhaft ist.

Die Bildung des Antibiotikums 66-40 kann bei jeder Temperatur, die zu befriedigendem Wachstum des Mikroorganismus führt, erreicht werden, beispielsweise zwischen 20 und 40 C. vorzugsweise zwischen 25 und 30 C.

Meist ist optimale Bildung innerhalb von 3 bis 7 Tagen zu erreichen. Der pH-Wert des Mediums bleibt während der Fermentation nahe bei 7 Der tnd-pH-Wert ist zum Teil von den eventuell enthaltenen Puffern abhängig, und es ist vorteilhaft, diesen vor der Sterilisation auf ungefähr 8 einzustellen Wird das Züchten in großen Behältern und Tanks ausgeführt, so ist es wünschenswert, einen vegetativen Impfstoff in einer Nährbrühe herzustellen, indem man die Brühenkultur mit einer Nährbodenkultur oder einer gefriergetrockneten Kultur des Organismus impft. Sobald ein aktiver Impfstoff erhalten worden ist. wird dieser aseptisch in die großen Behälter oder Tanks übertragen. Das Medium, in dem der vegetative Impfstoff erzeugt wird, kann dem Medium, das fur die Herstellung des Antibiotikums in Tanks verwendet wird, gleich oder verschieden davon sein, solange gutes Wachstum des Organismas erreicht wird

Nach Beendigung der Fermentation kann das Nanrmedium beispielsweise wie folgt aufgearbeitet werden: Die ganze Brühe wird mit Mineralsäure aut einen pH-Wert von ungefähr 2 eingestellt, vorzugsweise mit wässeriger Schwefelsäure, wodurch das basische wasserlösliche Antibiotikum vom My/el getrennt und in dem wässerigen Fermentationsmcdium gelöst wird. Die ganze Mischung wird filtriert, um die Brühe abzutrennen Das Filtrai « ■'· neutralisiert, worauf Oxalsäure zugegeben wird, um aic Kalziumionen auszufallen. Nach einer weiteren Hitration und Neutralisation, vorzugsweise mit Ammoniumhydroxyd, wird das klare, neutralisierte riltrat durch einen Ionenaustauscher vorzugsweise «* 1 yps »Amberli! IRC-50« in seiner Ammoniumk>rm. geleuet. Beispiele von Harzen des »Amberlil«- 1 yps sowohl fur Anionen- als Kathonenaustausch, die hierin genannt werden, können in dem Hand-

pIduT ^{und Ph}y^sik· ⁴² Ausgabe. Chermcal Rubber Publishing Comp Clcvel Ohio (19601. nachgelesen werden. Die verbrauchte Brühe wird abgelas sen. und das Antibiotikum wird aus dem Harz mit Ammon.umhydroxyd eluiert Das Eluat wird kon-

zentriert und zu einem Rückstand eingedampft, der aus rohem Antibiotikum 66-40 besteht, der nach der im folgenden beschriebenen Untersuchungsmethode eine Aktivität von ungefähr 500 mcg/mg aufweist.

Die Reinigung des rohen Antibiotikums kann unter Verwendung eines Anionenaustauschharzes, vorzugsweise »Dowex LX 2« oder einem »Amberlit IRA 401S«, erreicht werden. Das rohe Antibiotikum kann aus einer wässerigen Lösung an der Säule adsorbiert und von derselben mit destilliertem Wasser eluiert werden. Nach dieser Methode erhaltenes Material weist eine Aktivität von ungefähr 900 mcg/mg auf. Eine andere Möglichkeit besteht beispielsweise darin, das rohe Antibiotikum durch Säulenchromatographie an Cellulose unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems von Chloroform zu Methanol zu I7%igem Ammoniumhydroxyd (2:1:1) zu reinigen; die obere Phase des Lösungsmittelsystems wird zuerst verwendet, um die Säule zu befeuchten, die untere Phase, um zu eltiieren. Das Antibiotikum kann durch Adsorption aus einer konzentrierten Lösung in der oberen Phase des vorher erwähnten Lösungsmittelsystems gebunden werden.

Um die Aktivität der verschiedenen Produkte in Mikrogramm pro Milligramm des Antibiotikums 2$ ausdrucken zu können, wird meist die Standardzylinderschalenmethode verwendet, wobei Staphylococcus aureus ATCC 6538 P (ATCC = American Type Culture Collection) als Testorganismus verwendet wird. Diese Methode entspricht genau der von Oden u. a. in Antimicrobial Agents and Chemotherapy (1963) beschriebenen Methode: Ein Mikrogramm antibiotischer Aktivität des Antibiotikums ist die Menge Material, die einen Hof von 16,3 ± 0,9 mm unter den Bedingungen der Untersuchungsmethodc erzeugt, und wird in mcg/mg ausgedrückt.

Die folgenden Beispiele sollen die Fermentationsund Isolationsverfahren, die zu Antibiotikum 66-40 führen, erläutern:

Beispiel 1

Fermentation von Micromonospora inyoensis
in einem Tank

45

Keimungsstufe 1

I inter aseptischen Bedingungen bringt man eine gefriergetrocknete Kultur oder Zellen von M. inyoensis, die einer Nährbodenkultur entnommen worden sind, in eine SOO-ml-Schüttelflasche ein. die 100 ml des folgenden sterilen Mediums enthält:

Rindfleischextrakt 3 g

Trypton 5 g

Hefeextrakt 5 g ss

Dextrose Ig

Stärke 24 g

Kalziumkarbonat 2 g

Leitungswasser 1000 ml

Man bebrüte: die Flasche und ihren inhalt 5 Tage tang bei 35 C auf einem rotierenden Schüttelapparat (280 Umdrehungen pro Minute [UpM]; 50.8 mm Hub).

Keimungsstufe 2 **

Man überträgt aseptisch 25 τ«Ι des Fermentationsmediums der Keunungsstufe I in eine 2-l-Schüitel· flasche, die 500 ml des oben beschriebenen sterilen Keimungsmediums enthält. Man bebrütet die Flasche und ihren Inhalt 3 Tage bei 28° C auf einem rotierenden Schültelapparat (280UpM; 50,8 mm Hub).

Fermentationsslufe

Man überträgt aseptisch 500 ml des in der Keimungsstufe 2 erhaltenen Mediums in einen 14-1-Fermentationstank, der 9,5 1 des folgenden sterilen Mediums enthält:

Dextrin 50 g

Dextrose 5 g

Soyabohnenmehl 35 g

Calciumcarbonat 7 g

Kobaltchlorid 10~⁶ molar

Leitungswasser HXX) ml

Antischaummittel 10 ml

(GE 60 = Silikonemulsion)

Vor der Sterilisation des oben beschriebenen Mediums stellt man den pH-Wert auf 8 ein. Die aerobe Fermentation erfolgt innerhalb von 66 bis 90 Stunden, während mit 250 UpM gerührt wird, bei einem Luftdurchsatz von 4,5 1 pro Liter/Minute und 22,5 at. Die Aktivität des erzeugten Antibiotikums erreicht am Ende dieser Periode ein Maximum von 150 bis 225 mcg/ml und bleibt relativ konstant. Der pH-Wert des Fermentationsmediums ändert sich etwas während der Bildung des Antibiotikums, er variiert im Bereich von 6,8 bis 7,3.

Beispiel 2
Isolierung von Antibiotikum 66-40

Die ganze Brühe des Beispiels 1 wird mn 6N-bchwefelsäure auf einen pH-Wert von 2 eingestellt (Die Angaben in diesem Beispiel beziehen sich auf 170 I Fermentationsbrühe, die durch Vereinigen von angesäuerten Brühen aus 17 nach Beispiel 1 erzeugten Ansätzen erhalten werden.) Man rührt die angesäuerte Brühe ungefähr 15 Minuten lang und filtriert danach. Man wäscht das Myzel mit Wasser und vereinigt die Waschwasser mit dem FiI-trat. stellt den pH-Wert des Filtrats mit 6N-Ammoniumhydroxyd auf 7 ein, fügt dem neutralisierten Filtrat genügend Oxalsäure bei, um das enthaltene Calcium auszufällen, und filtriert. Danach neutralisiert man wieder mit Ammoniumhydroxyd. Das Filtrat bringt man auf eine Kationenaustauschsäule. die 1500 bis 2000 g »Amberlit IRC-50« in Ammoniumform enthält. Man läßt das Elua» ab. wäscht das Harz mit Wasser und ehiier: mit 2N-Ammoniumhydroxyd. Man sammelt 400 ml Fraktionen und überprüft diese durch Plattentests mit S. aureus ATCC 6538 P Man vereinigt die aktiven Fraktionen und dampft diese im Vakuum zur Trockene ein. wodurch man ungefähr 28 g rohes Antibiotikum 66-40 erhält, das eine Aktivität von ungefähr 500 mcg/mg aufweist.

Beispiel 3 Reinigung von Antibiotikum 66-40

Man lost 28 g des rohen Antibiotikums 66-40. das nach Beispiel 2 erhalten worden ist. m 100 ml destillierten Wassers auf und bringt die Lösung auf eine Anionenaustauschsäuie (»Dowex LX 2«) in der Hydroxylionenform auf Die Sink besteht aus einer

Aufschlämmung von 2000 g Harz in Wasser in einer Säule von 64 mm DuiOomesser und 914 hub Höhe. Man eluiert die Säule mit destilliertem Wasser mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 23 ral/Min., sammelt 100 ml Fraktionen und überprüft diese mit einem Leitfähigkeitsmeßgerät und durch Plattentests gegen Staphylococcus aureus. Der Plattentest ermöglicht eine grobe Trennung zwischen Eluatfraktionen, die Antibiotikum enthalten, und solchen, die frei von Antibiotikum sind. Um sicher zu sein, daß die Fraktionen richtig vereinigt werden, wird ein Teil jeder Fraktion durch Papierchromatographie überprüft, indem die untere Phase eines Lösungsmittelsystems, bestehend aus Chloroform zu Methanol zu 17%igem Ammoniumhydroxyd (2:1:1) verwendet wird und jedes Papier mit Ninhydrin besprüht wird. Man vereinigt die Eluate, die gleiches Material enthalten, und gefriertrocknet diese, wobei man ungefähr 5,7 g Antibiotikum 66-40 erhält, das eine Aktivität von ungefähr 900 mcg/mg aufweist.

20

Beispiel 4
Herstellung des Sulfats von Antibiotikum 66-40

Man löst 3,9 g des nach Beispiel 3 erhaltenen Anti- z$ biotikums 66-40 (freie Base) in 60 ml Wasser und stellt den pH-Wert mit öN-Schwefelsäure auf 4,5 ein. Man rührt die Lösung mit entfärbender Aktivkohle ungefähr ^l/₂ Stunde und filtriert. Man setzt dem Filtrat ungefähr 1 1 Methanol zu, filtriert und trocknet, wobei man 4,8 g des Sulfats erhält. Die Aktivität beträgt ungefähr 640 mcg/mg.

Beispiel 5

Weitere Reinigung des Antibiotikums 66-40
über sein Sulfat

35

200 g von Whatman Nr. 1 Cellulose-Pulver werden mit 200 ml der oberen Phase eines Lösungsmittelsystems, bestehend aus Chloroform zu Methanol zu 17%igem Ammoniumhydroxyd (2:1:1). gemischt und in kleine Segmente in einer Säule mit einem inneren Durchmesser von 6,4 mm und einer Höhe von 508 mm eingebracht. Die untere Phase des Lösungsmittelsystems wird durch die Säule geleitet, bis ein gelbes Band von Verunreinigungen auftritt. 2 g des Sulfats von Antibiotikum 56-40, hergestellt wie im Beispiel 4 beschrieben wurde, werden in ungefähr 3 ml der oberen Lösungsmittelphase gelöst, mit etwas Cellulosepulver gemischt, im Vakuum getrocknet und auf die Deckfläche der Cellulosesäule aufgebracht. Die untere Phase des Lösungsmittelsystems wird mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/Min, durch die Säule geleitet. 5-ml-Fraktionen werden alle 15 Minuten gesammelt.

Aliquote Teile jeder Fraktion werden auf Filterpapier getüpfelt und mit Ninhydrinreagenz überprüft, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von Antibiotikum festzustellen. Durch Papierchromatographie der Antibiotikum enthaltenden Fraktionen wurde festgestellt, daß das gewünschte Material in den Fraktionen 121 bis 190 enthalten war.

Die Fraktionen 121 bis 190 werden vereinigt, zur Trockene eingedampft, in Wasser wieder gelöst und durch einen Anionenaustauscher »IRA 401S« in der Hydroxylionenform geleitet. Der pH-Wert des Eluats wird mit Schwefelsäure auf 4,5 eingestellt, das Eluat wird mit Aktivkohle behandelt, filtriert and auf ein kleineres Volumen X?*^entriert. D; Konzentral wird in einen Überschuß von Methan eingebracht, der gebildete weiße Niederschlag wü abfiltriert und in Wasser gelöst. Die Lösung wii durch eine Säule, bestehend aus IRA401S-Harz der Hydroxylfbrm, geleitet. Die abfließende Lösur wird gesammelt, konzentriert und gefriergetrockne wodurch ungefähr 300 mg Antibiotikum 66-40 (fre Base) mit einer Aktivität von ungefähr 1000 mcg n erhalten werden.

Beispiel 6

Herstellung des Hydrochloride von
Antibiotikum 66-40

Man löst 104,7 mg des Antibiotikums 66-40 (fre Base), das nach Beispiel 2 hergestellt worden wa in 2 bis 4 ml Wasser und stellt den pH-Wert m Salzsäure auf 4,5 ein. Man dampft die Lösung zi Trockene ein und löst den Rückstand wieder Methanol. Dieser Lösung fügt man einen Überschi. von Aceton bei und filtriert den erhaltenen Nu. ! schlag, wodurch man 130 mg Hydrochlorid des Am biotikums 66-40 mit einer Aktivität von unüi-fal 753 mcg/mg erhält.

Beispiel 7

Herstellung von kristallinem Monohydrai
von Antibiotikum 66-40

Man stellt eine Kieselsäuregelchromatogruphi säule (26 · 2,5 cm) her, indem man die untere (org. nische) Phase einer Lösungsmittelmischung, die ai einem Gemisch von Isopropanol zu CHCl₃ zu Amm« niumhydroxyd in: Volumenverhältnis von 1:2 besteht, als Entwickler/Eluierungsmittel verwende Man löst I g Antibiotikum 66-40 (freie Base) 5,0 ml der Lösungsmittelmischung. Man bringt d Antibiotikumlösung auf die Silicagelsäule auf un Chromatographien, sammelt 5 ml Fraktionen un stellt die Lage der gewünschten Fraktionen dun. Dünnschichtchromatographie auf Silicagelplatten fe> Man vereinigt die geeigneten Fraktionen (44 bis 7fr dampft diese im Vakuum ein und erhält dadun. einen blaßgelben Sirup, der nach azeotroper Desti lation mit Äthanol blaßgeibe kristalline Rosette ergibt.

Das Produkt, das auf diese Weise erhalten wir. ist das Monohydrat von Antibiotikum 66-40. d; bei ungefähr 585 bis 190 C schmilzt Die Ausbeu beträgt ungefähr 650 mg.

Beispiel 8

Herstellung des Benzaldehydkondensationsprodukti von Antibiotikum 66-40

Man behandelt S g Antibiotikum 66-40 in 60 η absolutem Äthanol mit 5,9 g Benzaldehyd (geringt Überschuß über 5 Äquivalente) und erhitzt 1 Stunt lang unter Rückfluß. Die Lösung kühlt man un filtriert, wodurch man 7 g eines weißen kristalline Feststoffes erhält; Schmp. 123 bis 126*C. [α] = +43,2° (c = 0,3% in CHCl₃). Die Elemente analyse ergibt fünf Benzaldehydreste.

Analog können andere Aldehydkondensationspn dukte (wahrscheinlich Schiffsche Basen) erhalten we den, indem man den Benzaldehyd in dem obi beschriebenen Beispiel durch eine äquivalente Ment

eines beliebigen Aldehyds ersetzt. Als solche Aldehyde kommen beispielsweise in Frage:

Azetaldehyd,

Furfurol,

Cyclopentylacetaldehyd, Crotonaldehyd,

Salicyialdehyd,

Vanillin,

Veratraldehyd,

Pyridoxal.

Antibiotikum 66-40 und seine pharmazeutisch annehmbaren funktioneilen Derivate besitzen ein breites antibiotisches Spektrum. Das Antibiotikum hat die Fähigkeit, das Wachstum von grampositiven und gramnegativen Bakterien zu hemmen und kann somit allein oder in Verbindung mit anderen Antibiotika verwendet werden, um Wachstum von Bakterien zu hindern oder die Anzahl von Bakterien in verschiedenen Fällen zu vermindern. Es kann z. B. zum Desinfizieren von Laboratoriumsglaswaren,/ahnärztlichen oder medizinischen Geräten verwendet werden, die mit Staphylococcus aureus oder anderen Bakterien, deren Wachstum durch Antibiotikum 66-40 ungünstig beeinflußt wird, infiziert sind. Wegen seiner besonders wirksamen Aktivität gegen gramnegative Bakterien !st es bei der Bekämpfung von Infektionen, die durch solche gruniucgaüve Organismen verursacht werden, nützlich

Die in vitro Aktivität von Antibiotikum 66-40 gegen eine Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Baktetien ist in Tabelle H zusammengestellt. Die Mindesthemmkonzentration (MlC) wurde ermittelt, indem Hefe-Rindfleischbrühe als Nährmedium ver- / wendet wurde. Eine Serien verdünnungsmethode (Verdünnungen jeweils 1:1) wurde eingesetzt. Die MIC ist der Mittelwert zwischen der durch visuelle Beobachtung festgestellten letzten klaren und der letzten getrübten Probe. Die Untersuchungen wurden durchgeführt, indem eine 10 '-Verdünnung einer 24 Stunden alten Brühenkultur der Testbakterien verwendet wurde. Alle Proben wurden 18 Stunden bei 37'C bebrütet. Für die Untersuchung wurde Antibiotikum 66-40 mit einer Aktivität von 1000 mcg/mg eingesetzt.

Verwendete Mikroorganismen

Streptococcus faecalis

ATCC 10 541

Streptococcus pyogenes DA 1 Streptococcus pyogenes DA 21 Streptococcus pyogenes DA 15

Gramnegative Bakterien

Escherichia coli ATCC 10 536 Escherichia coli DA 3
Escherichia coli DA 4
Escherichia coli DA 1
Klebsiella pneumoniae DA 20 Klebsieila pneumoniae

ATCC 10031
Proteus vulgaris DA 121
Proteus vulgaris ATCC 9921 Proteus vulgaris DA 13
Proteus vulgaris DA 12
Pseudomonas aeruginosa

ATCC 8709
Pseudomonas aeruginosa

ATCC 8689
Pseudomonas aeruginosa

ATCC 9027

Salmonella schottmuelleri DA 10 Salmonella sp. DA 101
Salmonella sp DA 102
Aerobacter sp. DA 3 a

45

Tabelle H
In-vitro-Aktivität von Antibiotikum 66-40

Verwendete Mikroorganismen

Grampositive Bakterien
Diplococcus pneumoniae DA 150')
Enterococcus sp. DA 800
Enterococcus sp. DA 801
Enterococcus sp. DA 802
Staphylococcus aureus

ATCC 6538 P
Staphylococcus aureus

ATCC 11631

Staphylococcus aureus Gray
Staphylococcus aureus DA 2033

MlC meg ml

3,0

2.25
2.25
2,25
0,23

0,21

0,05
0,08 MJC meg ml

3,0

3,0 3,7

0,6

0,3

0,6

0,6

0,23

3,0

0,6 0,6 0,3 3,0 0.45

0.6 0,6

0,53

0,3

0,3

Die akute Toxizität von Antibiotikum 66-40 in der Form seines Sulfats wurde an Mäusen mit einem Gewicht zwischen 18 und 20 g nach einer Standardmethode bei verschiedenen Verabreichungen ermittelt. Die Werte der Toxizität, die in Tabelle J angegeben sind, wurden in Werten der freien Base ausgedrückt.

Tabelle J Akute Toxizität von Antibiotikum 66-40

Art der Verabreichung

50 Subkutan
Intra peritoneal
Intravenös

288

221

34

') DA bezieht sich auf Sammlungsnummcrn der Schering Corpo-

(iltrtn

Antibiotikum 66-40 zeigt bei Laboratoriumstieren, insbesondere bei Mäusen, antibakterielle Wirkung gegen Infektionen, die durch pathogene Bakterien verursacht werden. Um die in-vivo-Schutzwirkung von Antibiotikum 66-40 gegen Infektionen durch pathogene Bakterien an Mäusen festzustellen, wurde das Antibiotikum Mäusen zweimal verabreicht: ein' mal unmittelbar vor der intraperitonealen Injektion der infizierenden Bakterien und einmal 4 Stünden nach einer solchen Injektion. Die Zahl der überlebenden wurde 48 Stunden nach der Infektion ermittelt, und diese Daten wurden nach bewährten Standardmethoden analysiert, um die ED₅₀-Werte rru't

einer 95%igen Sicherheit zu ermitteln. Tabelle K enthält die Schutzaktivität von Antibiotikum 66-«) gegen verschiedene pathogene Bakterien.

Tabelle K
Schutzaktivität von Antibiotikum 66-40 bei Mäusen

Staphylococcus aureus

Gray DC 445
Streptococcus pyogenes C

DC 28
Klebsiella pneumoniae

DC 801
Pseudomonas aeruginosa

ATCC R709

Salmonella parat > phi B
DC 837

An der Verabreichung

subkutan

oral

subkutan

su ok uian

oral

subkutan

subkutan

(mg kg)

0.12 25.« 0.87

0.70 50,0 U2

1.91

IO Die Antibiotika der vorliegenden Erfindung können auch in flüssiger Form angewendet werden, beispielsweise als Lösungen, Suspensionen u dgl für die Verwendung fiir Ohren und Augen und können auch ebenso parenteral durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Die injizierbare Losung oder Suspension wird meist in Mengen von ungefähr I mg bis ungefähr 5 mg Antibiotikum pro Kilogramm Körpergewicht pro Tag. verteilt auf ungefähr 2 bis 4 Dosen, verabreicht. Die genaue Dosis hängt von dem Stadium und dem Ausmaß der Infektion, der Empfindlichkeit des infizierenden Organismus gegenüber dem Antibiotikum und der individuellen C harakteristika der behandelten Tierart ab.

Das folgende Beispiel 9 behandelt die Bestandteile und die Herstellung einer injizierbaren Lösung

Beispiel 9
injizier bare Lösung

20 fur lO-ml Ampulle*.

li.i *· Γι

Der Tabelle K is; zu entnehmen, daß der therapeutische Index (LD₅₁, ED_V)) bei subkutaner Verabreichung /wischen 330 und 24(X) in bezug auf grampositive Organismen und zwischen 150 und 410 in bezug auf gramnegative Organismen liegt

Ferner wurde festgestellt, daß Mäuse, die intraperitoneal mit acht LD₅₍,-Dosen von Rickettsia akar»_; infiziert worden waren. 100%igen Schutz erhielten, wenn innerhalb von 4 Tagen e>nmal täglich 2 mg Antibiotikum 66-40 subkutan verabreicht wurden.

In Anbetracht der vorhergehenden in-vivo-Daten und insbesondere in Anbetracht des vorteilhaften therapeutischen Index de>« Antibiotikums 66-40 ist es offenbar, daß das Antibiotikum verwendet werden kann, um eine Vielzahl von Infektionen \on Lebewesen unter Kontrolle zu bringen und /u behandeln. Zu solchen Infektionen gehören beispielsweise solche. die von Organismen der Gattungen wie Streptococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Escherichia, Salmonella, Klebsiella. Proteus. Pseudomonas u. dgl. verursacht werden. Die genannten Organismen verursachen Mastitis bei Rindern, Infektionen des Harntraktes und Diarrhöen oder werden verdächtigt, diese Krankheiten zu verursachen. Man vermutet, daß Arten derselben Organismen bei Säugetieren Krankheiten der Hau" und der oberen Atmungswege ver Ursachen oder bereits existierende Anzeichen solcher Krankheiten verschlechtern. Antibiotikum 66-40 und seine Derivate stellen daher eine wirksame Waffe zur Bekämpfung solcher Organismen und der durch diese verursachten Krankheiten dar.

Antibiotikum 66-40 und seine Derivate können örtlich in Form von sowohl hydrophilen als auch hydrophoben Salben, in Form von Lotionen, die sowohl wässerig, nicht wässerig als auch in der Art von Emulsionen sein können, oder in Form von Cremen verwendet werden. Als zweckmäßige pharmazeutische Träger für die Herstellung solcher Zubereitungen kommen beispielsweise Wasser, öle, Fette, Polyester, Polyole u. dgl. in Frage. Im allgemeinen enthalten örtlich anwendbare Zubereitungen ungefähr 0,1 bis ungefähr 3 g Antibiotikum pro 100 g der Salbe, Creme oder Lotion. Die örtlich anwendbaren Präparate werden meist zwei- bis fünfmal pro Tag leicht auf Verletzungen aufgetragen.

84.0 mg
3.6 m,"

2100.0 g

90.Π L'

10.0 g

16(Ig
5.0 ι·

50.(H

Antibiotikum-66-40-Sulfat

ρ- H ydrox y benzoesä ure-

.nethy!ester, USP ⁺ I

(= Methylparabenl
p-Hvdroxybenzoesäure- j 0.4 mg

propylester, USP⁺I

( Propylparaben)

Natnumbisulfit. USP ⁺ I 6.4 mg

Dihydrat von Dinatrium- 0.2 mg

äthylendiamintetraazetat.

p.a.
Für Injektionswasser. USP⁺I 2.0 ml

q s. ad !

*l Beinhaltet 5% Her%tellur _

I rS-Pharmacopoea

Verfahren zur Herstellung des 50-l-Ansat/es

Man füllt ungefähr 50 1 Injektionswasser in einen entsprechenden, mit nichtrostendem Stahl ausgekleideten Behälter und erhitzt auf ungefähr 70 C. Man setzt Methylparaben und Propylparaben dem erhitzten Injektionswasser zu, löst unter Rühren Sobald die Parabene vollständig gelöst sind, kühlt man den Inhalt des Behälters auf 25 bis 30 C ab. indem man kaltes Wasser durch den Mantel des Tanks leitet. Man spült während mindestens 10 Minuten die Lösung mit Stickstoff und hält sie während der folgenden Verfahrensschritte unter Stickstoff. Man setz', das Dihydrat des Dinatriummethylendiamintetraazetats und das Natriumbisulfit zu und löst diese. Man setzt das Sulfat des Antibiotikums 66-40 zu und löst es. Man füllt mit Injektionswasser auf 50 I auf und rührt bis zur Homogenität.

Unter sterilen Bedingungen filtriert man die Lösung durch ein entsprechendes Bakterien zurückhallendes Filter und sammelt das Filtrat in einem Abfülltank.

Man füllt das Produkt aseptisch in sterile, pyrogenfreie Mehrdosenphiolen, stöpselt zu und versiegelt.

Beispiel IO
Arttibiotische Salbe

Antibiotikum 66-40 (freie Base) 10 g

Vaseline 990 ρ

Herstellung

(1) Man schmilzt die Vaseline;

(2) man mischt Antibiotikum 66-40 <freie Base) mit ungefähr 10% der geschmolzenen Vaseline:

(3) man führt die Mischung von Antibiotikum und Vaseline*fiurch eine Kolloidmühle:

(4) man fügt den Rest der Vaseline zu und kühlt die Mischung, bis sie halbfest ist. In diesem Stadium kann das Produkt in pussende Behälter gefüllt werden.

Die therapeutische Aktivität von Antibiotikum 66-40 (»Sisomicin«) und Gentamicin gegen gramnegative und grampositive Infektionen von Mäusen wurde verglichen. Dk. Methode und die Ergebnisse sind nachstehend aufgeführt.

Zusammenfassung der Methode

Es wurde die von J. Λ W a i t ζ, E. L. M ο s s jr., E. M. Oden und MJ. Weins* ein. J. Antibiotics 22. 265 bis 272. 1969 und J.A. Wait/ und

MJ. Weinstein, J. Infect. Dis. 119, 355 bis 360, i«J69 bescliritbene Methode im wesentlichen verwendet. Die Mäuse wa^ren männliche Albinos vom Stamm CF-I mit einem Gewicht von etwa 20 g. Eingesetzt wurden Gruppen von 7 Tieren bei 5 verschiedenen Dosen zusätzlich zu 10 Kontrollen. Die Mäuse wurden intraperitoneal mit etwa 10^? Organismen Maus infiziert Die nicht behandelten infizierten Kontrolltiere starben innerhalb von \& bis 24 Stunden mit der Ausnahme der mit Klebsielle infizierten Mäuse, die 36 bis 40 Stunden nach der Infektion starben. Alle behandelten Mäuse erhielten die Dosis in einem Volumen von 0.1 bis OJ ml subkutan. Es wurden zwei Arten der Dosierung angewandt, in-

is dem man einmal eine einzelne Dosis 1 Stunde nach der Infektion und zum anderen die Hälfte der Dosis ¹Z₂ Stunde vor und die andere Hälfte 4 Stunden nach der Infektion verabreichte. Die überlebenden Mäuse wurden 48 Stunden nach der Infektion gezählt und die PD₅₀-Werte wurden nach der Probitmethode

(probit procedures/ berechnet.

Therapeutische Aktivität von Antibiotikum 66-40 und Gentamicin gegen gramnegative und grampositive Infektionen von Mäusen. Die Antibiotika wurden subkutan verabreicht

A: Eine Dosis des betreffenden Antibiotikums wurde 1 Stunde nach der Infektion verabreicht

B: Die Gesamtdosis des betreffenden Antibiotikums wurde in 2 Teilen, und zwar ' ₂ Stunde und 4 Stunden

nach der Infektion verabreicht

	l'D„,(mg kg)	A	(jenl.min.in	£	Gentamicin	—	Gentamicin PD51,	2 Dosen
()r£tani-s!tiUN	Antibiotikum MS 4U	3.2	Antibiotikum 66 4(1	1.5	>50.0	Antibiotikum 66 40 PD	1.1
	1.7	1.5	1.4	0,5	9.1	I D. si·, ■ -	2,5
Escherichia coli Sc.	1.5	0.K4	0,2	0,9	4.4	1.9	1.1
Escherichia cdi Nr 1	0.84	1.5	0.8	1.8	7.5	1.0	1,2
Klebsieila pneumoniae Sc.	1.7	Vl	1.5	8.4	1.8	1.0	2,8
Proteus vulgaris 120.4	S.7	1.7	3.0	1.5	3.3	0.9	3,0
Proteus vulgaris Nr. 2	1.1	0.5	0,5	7.5	0.5	-
Pseudomonas aeruginosa Sc.	0.3	50.0	—	8,0	1.5	>l,0
Pseudomonas aeruginosa 9027	13.1	13.0	50,0	20.0	1,7	3.2
Pseudomonas aeruginosa Nr. 3	4.9	2.5	2.8	-	3.9	2.2
Pseudomonas aeruginosa Nr. 5	2,5	50.0	2.0	17.0	2.7	1.3
Pseudomonas aeruginosa Nr. 6	26.0	11.2	6.0	17,0	1.0	1.2
Pseudomonas aeruginosa Nr. 11	2.0	4.8	1.5	2.0	1.2
Salmonella schottmuelleri Sc.	1.7	2.4	2.8	5.6	1.1
Salmonella schottmuelleri Nr. 13	l.S	3.3	7.0	2.8	1,3
Staphylococcus aureus Gray	1.0	14.0	10.0	1.3	2.0
Staphylococcus aureus Smith	6.0	15.0	10,0	3.3	—
Streptococcus pyogenes C	2.0	18.0		2.3	2,9
Streptococcus pyogenes C 203	7.5	410	5.8	7.5	2,9
Enterococcus sp. 801	7,0	5.8	2.4
Enterococcus sp. 804		5.9

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   L Antibiotikum 66-40 (»Sisomicin«) mit der OH

   Formel

   len Derivate sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und diese enthaftende pharmazeutische MitteL

   jüngere Untersuchungen haben gezeigt, daß das Antibiotikum «MO (»Sisomicin«) die folgende mutmaßüche Strukturformel besitzt.