DE2437159C2

DE2437159C2 - Mutamicine 1, 2, 4, 5 und 6, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2437159C2
Application number: DE2437159A
Authority: DE
Inventors: Peter John Lovell Cedar Grove N.J. Daniels; Raymond Verona N.J. Testa; Gerald Howard East Brunswick N.J. Wagman; Marvin Joseph East Brunswick N.J. Weinstein
Original assignee: Scherico Ltd
Current assignee: MSD International Holdings GmbH
Priority date: 1973-08-06
Filing date: 1974-08-01
Publication date: 1983-03-24
Also published as: IL45387A; DE2437159A1; FR2240016A1; ZA744938B; JPS562080B2; GB1480374A; IE39909B1; IT1043872B; SE7409945L; AU7194074A; IE39909L; JPS5749199B2; NL7410364A; SE404375B; FR2240016B1; IL45387A0; ZA744939B; CH606434A5; BE818429A; JPS5047951A

Description

Mut- V₂
amide

1	H	OH	OH	H
2	H	H	H	H
4	OH	OH	H	H
5	H	NH₂	H	H
6	H	H	H	OH

und deren Salze.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet, daß man Micromonospora inyoensis 1550F-1G (NRRL 5742) in einem wäßrigen Nährmedium unter Zugabe eines Aminocyclitols der allgemeinen Formel
NH₂ V₂

NH,

HO

W₅ OH

in der V₂, Vs, W₂ und Ws wie in Anspruch 1 zuzuordnen sind,

unter aeroben Bedingungen bei Temperaturen zwischen 24 und 40⁰C und einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 kultiviert, das jeweilige Mutamicin aus der Gärbrühe isoliert und gegebenenfalls in ein Salz überführt.

3. Antibakteriell wirksame Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägerstoffen.

Der ursprüngliche Mikroorganismus, Micromonospora inyoensis ist im Journal of Antibiotics (Japan), Band XXIIL S. 551-558 (1970), von M. J. Weinstein und Mitarbeitern ausführlich beschrieben worden, und ein Muster davon wurde beim U.S. Department of Agriculture, Northern Utilization Research and Development Division, Peoria, Illinois, unter der Registrierungsnummer NRRL 3292 hinterlegt

Die Mutante, Micromonospora Inyoensis Stamm 1550F-1G, die in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann durch bekannte Mutierungsverfahren aus dem obenerwähnten, ursprünglichen Mikroorganismus erhalten werden. Im vorliegenden Fall wurde sie durch Behandlung von Mikromonospora Inyoensis NRRL 3292 mit Nitrosoguanidin und darauffolgenden Stammselektionsverfahren bekannter Art hergestellt. Es ist

dem Fachmann aber klar, daß auch andere Mutierungs-

W₂ W5 20 verfahren angewendet werden können, wie beispiels

weise UV-Licht, Gammabestrahlung etc. Bei der

obenerwähnten Hinterlegungsstelle hat ein Muster des

Mikroorganismus die Registrierungsnummer NRRL 5742 erhalten.

Micromonospora inyoensis Stamm 1550F-1G zeigt Wachstumscharakteristika, die denen des ursprünglichen Mikroorganismus sehr ähnlich sind. Die folgenden Tabellen zeigen einige taxonomische, biochemische und morphologische Eigenschaften des Organismus.

Tabelle I zeigt Beobachtungen des Mikroorganismus auf verschiedenen Nährböden. Tabelle II enthält Beobachtungen bezüglich der Stickstoffverwertung und Tabelle III bezüglich der Kohlenhydratverwertung.
Für die Beschreibung der beobachteten Farben wird folgendes System und werden folgende Kennzeichen verwendet: Die Farbbezeichnungen bestehen aus zwei Teilen. Der erste ist ein Farbname, entnommen dem Buch »Descriptive Color Name Dictionary« von Taylor, Knoche und Granville (1950), herausgegeben durch

w Container Corporation of America, USA, mit einer dem Farbnamen entsprechenden Farbkennziffer, wobei die Kennziffer dem »Color Harmony Manual«, vierte Auflage (1958), herausgegeben durch Container Corporation of America, entnommen worden ist. Der zweite Teil der Fn~bbezeichnungen besteht aus einem Farbnamen und einer Zahl, die sich auf ein Synonym oder annäherndes Synonym bezieht, entsprechend der Veröffentlichung »National Bureau of Standard (USA), Circular 553, vom 1. November 1955«.

Auf einem Agar-Nährboden, der 3% NZ Amin Typ A enthält (ein Pepton, das durch enzymatische Behandlung von Kasein enthalten wird und hier als Stickstoffquelle funktioniert), zeigt der Mikroorganismus ein so geringes Wachstum, daß eine Charakterisierung unmöglich ist.

Die Erfindung betrifft neue antibiotisch wirksame Verbindungen, nämlich die Mutamicine 1, 2, 4, 5 und 6 und deren Salze, ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel, wie in den Ansprüchen dargelegt.

Es ist bekannt, daß gewisse Mutanten von bekannten Mikroorganismen, die nicht fähig sind, Antibiotika zu 60 bilden, wenn sie in einer üblichen Nährlösung kultiviert werden, Antibiotika produzieren, wenn gewisse Aminocyclitole zum Nährmedium hinzugefügt werden. Das hinzugefügte Aminocycliton wird dabei als Ganzes in das komplizierte Molekül des gebildeten Antibiotikums 65 eingebaut. Solche Verfahren zur Herstellung neuer Antibiotka sind in der US-PS 36 69 838 beschrieben Aerobisch oder worden. Anaerobisch

Tabelle I

Beobachtungen des Mikroorganismus auf verschiedenen Nährböden

Medien bzw. Bedingungen Beobachtungen

Temperatur Wachstum: gut bei 28° und
37°C, kein Wachstum
bei 50⁰C

aerobisch

Fortsetzung

Medien bzw.
Bedingungen

Beobachtungen

Reduktion von Nitrat unterschiedlich

Czapeks Medium (Glucose)

Asparagin-Glucose Medium

Kalzium Monohydroxysuccinat Agar

Gewöhnliches Agar Nähr Agar

Löffler's Serum

Medium

(Difco*)

Kartoffel

Pepton Glucose Agar

Ei Agar

(Dorset Egg Medium-

Difco*)

Gelatine Medium

Medien bzw. Bedingungen

Beobachtungen

Wachstum: mittelmäßig bis schwach, membranförmig, kein diffundierbares Pigment Farbe: g3ic heller Bernstein (light amber) ~ dunkles orangegelb 72 (dark orange yellow)

Wachstum: mittelmäßig bis schwach, flach-membranförmig, kein diffundierbares Pigment Farbe: g3ic heller Bernstein (light amber) - dunkles orangegelb 72 (dark orange yellow)

Wachstum: schwach, flach, kein diffundierbares Pigment Farbe: g3ic heller Bernstein (light amber) - dunkles Orangegelb 72 (dark orange yellow)

Wachstum: schwach, ungenügend für Beobachtungen

Wachstum: mittelmäßig bis schwach, flach bis leicht runzlig

Farbe: g4ne Lederbraunstarkes Braun (luggage tanstrong brown) bis g4pn Schokoladebrauc-dunkles Braun 59 (chocolate browndark brown)

Wachstum: mittelmäßig, Substrat teilweise verflüssigt Farbe: g5pe Terrakotta (teracotta) starkes Braun SS (strong brown)

kein Wachstum

Wachstum: mittelmäßig bis

schwach, flach bis leicht

gerillt, kein diffundierbares

Pigment

Farbe: g4ne Lederbraun

(luggage tan) starkes

Braun 55 (strong brown)

Wachstum: schwach, ungeiiügend für Beobachtung

Wachstum: mittelmäßig bis schwach, flach bis leicht gefurcht, kein diffundierbares Pigment Farbe: g41e Torfbraun (turftan) - helles Braun 57 (light brown)

Stärke Agar Tyrosin Medium

Lackmus-Milch (Difco·)

Zellulose Medium Bennett's Agar Emmerson's Agar

Tomatenmark-Hafermehl Agar

Glucose-Hefe-Extrakt Agar

Kartoffelscheibe

Tyrosin Agar-Hefe Extrakt

Tyrosin-Fleisch-Extrakt (Beobachtungen nach 2,7 und 14 Tagen nach Gordon und Smith, J. Bact. 69: 147 (1955)

Pepton Eisen Agar (Beobachtungen nach 2,7 und 14 Tagen)

Wachstum: mittelmäßig,

flach, kein diffundierbares

Pigment

Stärke schwach hydrolysiert

aber nur direkt unter der

Kolonie

Farbe: g31e Ahorngelb

(yellow maple) — starkes

Gelbbraun 74 bis schwarz

(strong yellowish brown to

black)

Wachstum: mittelmäßig bis

schwach flach, leichte

Dunkelfärbung des Mediums Farbe: g41e Torfbraun (turf

tan) - helles Braun 57

(light brown)

Peptonisierung, saure

Reaktion

schwache Zersetzung der Zellulose (schwache Hydrolyse der Zellulose)

Wachstum: gut, membranförmig - faltig, kein diffundierbares Pigment Farbe: Schwarz Wachstum: gut, membranförmig, kein diffundierbares Pigment

Farbe: g3n Nelkenbraun (clove brown) - dunkles Gelbbraun 78 (dark yellowish brown)

Wachstum: mittelmäßig, erhöht, gefurcht, kein diffundierbares Pigment Farbe: g4ne Rotbraun (sunset orange) starkes Orange 50 (strong orange)

Wachstum: gut, membranförmig, kein diffundierbares Pigment Farbe: Schwarz mit CaCO₂ gutes Wachstum, ohne CaCO₃ kein Wachstum Farbe: Schwarz

Wachstum: gut, membranförmig, Kristalle gelöst Hellbraunes diffundierbares Pigment gebildet

Wachstum: mittelmäßig bis schwach, Kristalle schwach gelöst, braunes Pigment nur bei »cross-hatched« Methode gebildet

kein Wachstum, keine Reaktion

Tabelle Π
StickstofFverwertung

Stickstofiquelle +1% Glucose

Beobachtungen

0,5% Hefe Extrakt
(Difco*}

1,0% NZ Amin
TypA

1% Asparagin
1% Glutaminsäure
1% Natriumnitrat
1% Ammoniumnitrat

Wachstum: gut, membranförmig, kein diffundierbares Pigment Farbe: Schwarz

Wachstum: gut, membran-

förmig

Farbe: g4nc Rotbraun

(sunset orange) starkes

Orange SO (strong orange)

bis Schwarz

Schwaches Wachstum, ungenügend für Charakterisierung

Schwaches Wachstum, unge-. nügend für Charakterisierung

Tabelle III
Kohlenhydratverwertung

Medium

Wachstum

Kontrolle

D-Arabinose

L-Arabinose

Dulcit

D-Galactose

D-Glucose

Glycerin

I-Inosit

B-Lactose

D-Fnictose

D-Mannit

Mannose

Melibiose

Melizitose

Raffinose

L-Rhamnose

D-Ribose

Salizin

Saccharose

D-Xylose

± Schwach ± Schwach

_< ± Schwach ± Schwach + Mittelmäßig

++ Gut ± Schwach ± Schwach ± Schwach ± Mittelmäßig ± Schwach +++ Gut ± Schwach ± Schwach ± Schwach ± Schwach + Mittelmäßig ± Schwach + Mittelmäßig

++Gut

Die Fermentierung

Eine lyophilisierte Kultur oder Zellen von einer Schrägkultur von MicromoL-ospora inyoensis Stamm 1550F-1G NRRL 5742 werden zu einem sterilen, wässerigen Inokulierungsmedium, das assimilierbare Quellen von Kohlehydrat und Stickstoff, sowie übliche Spurenelemente enthält, übergeführt Das inokulierte Medium wird unter aeroben Bedingungen bei Temperatüren zwischen 24° und 40⁰C, vorzugsweise 35° C₁2 bis 5, vorzugsweise 3, Tage inkubiert Der pH-Wert wird zwischen 6,0 und 8,0, vorzugsweise zwischen 6,8 und 7,4, gehalten.

Das so hergestellte Inokulum wird asceptisch zu einem Fermentationsmedium übergeführt Dieses Medium kann die gleiche Zusammensetzung wie das Inokulationsmedium haben; kann aber auch verschieden sein. Das zu verwendende Aminocyclitol kann vor der Sterilisierung, zur Zeit der Inokulierung oder bis zu 48 Stunden nach der Inokulierung dem Medium zugefügt werden. Das Aminocyclitol (oder ein Salz davon) wird normalerweise in Wasser gelöst und steril filtriert bevor es zum Medium hinzugefügt wird. Im allgemeinen liegt die Konzentration an Aminocyclitol zwischen 100 bis 1500mcg/ml (oder auch darüber) der Fermentationsbrühe. Die Fermentation wird wiederum unter aeroben Bedingungen und bei etwa denselben Temperaturen und pH-Werten, wie die Herstellung des Inokulums durchgeführt Die Kontrollversuche, um festzustellen, wann die optimale Menge an Antibiotikum produziert worden ist sind die gleichen wie für Sisomicin [J. Antibiotics, Band XXIII, S. 559-565 (1970)]. Das gebildete Mutamicin wird nach bekannten Verfahren isoliert und von kleineren Mengen mitproduzierten antibiotisch wirksamen Substanzen getrennt So kann man beispielsweise das Fermentationsmedium ansäuern und die Brühe von Mycelium trennen. Nach Neutralisierung, wird das Antibiotikum durch Ionenaustauscher von der Brühe getrennt und durch Desorbtion in Form einer wässerigen Lösung gewonnen. Die Lösung kann lyophiliisert werden, um das Antibiotikum in fester Form zu erhalten, oder man unterwirft die Lösung einer Reinigung, beispielsweise durch Chromatographie, wobei das Antibiotikum frei von Nebenprodukten in relativ reiner Form anfällt

Die Antibiotika (Mutamicine)

Die Mutamicine sind Analoge zu bekannten Antibiotika und unterscheiden sich von diesen nur durch

so Struktur und Substituenten des Aminocyclitolgliedes. Die Hauptkomponenten, die durch die Kultivierung von Micromonospora inyoensis Stamm 1550F-1G NRRL 5742 entstehen (die Mutamicine) sind Analoge des bekannten Antibiotikums Sisomicin. Die allgemeine Formel I könnte daher auch folgendermaßen dargestellt werden:

NH₂ V₂

XO

NH₂

da)

OY

worin X 2,6-Diamino-2,3,4,6-tetradeoxy-«-D-glycerohex-4-eno-pyranose; Y 3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-j9-L-arabino-pyranose- und V₂, W₂, V5 und W₅ wie oben definiert sind. Für Sisomicin, da« hier nicht beansprucht wird, sind V₂, W₂ und W5 Wasserstoff und

V₅ Hydroxy, also eine Verbindung, in der der Aminocyclitolring 2-Deoxystreptomin ist Falls 2-Deoxystreptamin als Aminocyditol im erfindungsgemäßim Verfahren eingesetzt wird, erhält man Sisomicin.

Mutamicin 1 ist das Analog zu Sisomicin, in dem 2-Deoxystreptamin durch Streptamin ersetzt ist, d.h. eine Verbindung der allgemeinen Formel Ia, worin X und Y wie oben definiert sind, W₂ und V₅ Hydroxy und V₂ und W₅ Wasserstoff bedeuten.

Mutamicin 2 ist das Analog zu Sisomicin, in dem 2-Deoxystreptamin durch 2,5-Dideoxystreptamin ersetzt ist, also eine Verbindung der allgemeinen Formel Ia, in der X und Y wie oben definiert sind und V₂, W₅, V₅ und W₅ alle Wasserstoff bedeuten.

Mutamicin 4 ist das Analog zu Sisomicin, in dem 2-Deoxystreptamin durch 2-Episireptamin (Myo-inosü-13-Diamin) ersetzt ist, also eine Verbindung der allgemeinen Formel Ia, in der X und Y wie oben definiert sind, V₂ und V₅ Hydroxy und W₂ und W₅ Wasserstoff bedeuten.

Mutamicin 5 ist das Analog zu Sisomicin, in dem 2-Deoxystreptamin durch 1,3,5-Triaminocyclohexam-4,6-diol ersetzt ist, also eine Verbindung der allgemeinen Formel Ia, in der X und Y wie oben definiert sind; V₂, W₂ und W₅ Wasserstoff und V₅ Amino bedeuten.

Mutamicin 6 ist das Analog zu Sisomicin, in dem 2-Deoxystreptamin durch 5-epi-2-Deoxystreptamin ersetzt ist, also eine Verbindung der allgemeinen Formel Ia, in der X und Y wie oben definiert sind; V₂, W₂ und V₅ Wasserstoff und W₅ Hydroxy bedeuten.

Die Mutamicine bilden leicht Salze mit organischen und anorganischen Säuren. Beispiele für solche Säuren sind: Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Stearinsäure, Propinsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Benzolsäure. In allgemeinen sind die Salze wasserlöslich und können durch Lyophilisierung oder Konzentrierung einer Lösung des Salzes oder durch Ausfällen mit Hilfe eines mit Wasser mischbaren

ίο organischen Lösungsmittels, vorzugsweise niedrigen aliphatischen Alkohols oder Ketone, erhalten werden.

Herstellung der Aminocyclitole

Die Aminocyclitole, die bei oben vorliegenden Verfahren benötigt werden, können nach zwei Verfahren erhalten werden. Das erste Verfahren beruht auf Hydrolyse von bekannten Antibiotika, gefolgt von Trennung, Isolierung und Gewinnung des Aminocyclitols. Beispiele von Aminocyclitolen, die so erhalten werden, sind Streptamin und 2-Deoxystreptamin. Die letztgenannte Verbindung erhält man durch Hydrolyse von Gentamicin oder Kanamycin. Die Herstellung von Streptamin durch stufenweise Hydrolyse von Streptomycin wurde von Fried, J. et al. in »J. Biological Chemistry, 162,381 (1946) beschrieben.

Das zweite Verfahren besteht in einer chemischen Synthese, ausgehend von bekannten Ausgangsverbindungen. So kann man beispielsweise 2,5-Dideoxystreptamin nach dem folgenden Reaktionsschema erhalten:

O H	NH S (PhO)₃PCH₃I ]	0 [-<	υ Μ	\ 1 H₂ZPd(OH)₂
Il C 0	NH	O	Il C >—<	( * ' "νη ^2Η
\_ ο \ C Il			ν—< C Η
Il 0		Il O
(vim		αχ)

NH₂

W
X OH

(VIII)

Das Dicarbamat des 2-Deoxystreptamins wird mit Methyltriphenoxyphosphoniumiodid behandelt, und man erhält das 5-Iodderivat (IX). Das Iod wird durch Hydrogenolyse entfernt, wodurch das 2,5-Dideoxystreptamincarbamat entsteht, welches in Gegenwart einer wässerigen Säure in ein Säureadditionssalz des 24-Dideoxystreptamins (X) übergeführt wird.

Durch Ringöffnung mit Periodat entsteht aus einem Ν,Ν-Diacylderivat von 2-Deoxystreptamin (XIII) zunächst ein U-Dialdehyd (XIV). Behandelt man den Dialdehyd mit Nitromethan unter alkalischen Bedingungen, so vollzieht sich eine Ringbildung, wobei gleichzeitig eine Nitrogruppe in 5-Stel!ung angeführt wird (XV). Reduktion der Nitrogruppe und Hydrolyse der Ν,Ν-Diacylgruppen führt zum 5-Aminoanalog (XVI) von 2-Deoxystreptamin (l^-Triaminocyclohexan^ö-diol):

ίο

(XIID (XIV) (XV)

©Η,

'©HOH/H®

NH₂

y--k^N

^NO₂

HO

OH

(XVD

2-Epi-streptamin kann man nach dem von Tetsue erhält 7,0 g des Produktes (F.P. 192°-194°C; Zerset-

Suami et al. im J. Org. Chem. 33, 2831-2834 (1968) zung).

beschriebenen Verfahren herstellen. _ß , _t.r\u NO-

Andere Aminocyclitole können nach analogen Ver- 30 ^e£^e^ ^ ,_n0/ ¹V, ³_ ²J. ,_a0/

fahren erhalten werden. _n % ~. ' ' ~ '

Gefunden:

„ , „ .pi C = 44,84%; H = 9,32O/o
Herstellung von Aminocychtolen

A.2-Deoxy-myo-inosa-l,3,5-triamin ₃₅ B. 2-Deoxy-5-epistreptamin

13,0 g (1,3/2, 4,6)-4,6-Diacetamido-2-amino-cyclohe- Die unten angeführte Verbindung XVII wird zunächst

xan-13-diol werden mit 100 ml 6N HCl unter Rückfluß durch das Verfahren nach Hasagawa und Sable

18 Stunden gekocht Nach Abkühlung auf Zimmertem- (Tetrahedron, 25,35-67 (1969) erhalten. Diese Verbin-

peratur wird die Mischung mit Amberlite IRA-401S dung wird dann durch die folgende Reaktion in das

(O — Η-Form) behandelt bis sie alkalisch ist. Die 40 gewünschte Produkt übergeführt:
Mischung wird filtriert und das Filtrat eingedampft. Man

NHR NH

OH OR OH OH

(XVIiD

0,8 g der Verbindung XVII werden mit 12 ml 6N HCl NMR:

3 Stunden unter Rückfluß erhitzt Nach Abkühlen wird Triplett, 4,14 ppm (J = 2,5 H_z, 1H, H-5 eq)

die Mischung durch Behandlung mit Amberlite® 55 3,8 - 2,85 ppm, 4H, Multipletts

IRA-401S (OH-Form) alkalisch gemacht, filtriert und 2,34 ppm, 1H, Doublett oder Triplett J = 3,5,12Hz,

das Filtrat zur Trockene eingedampft. Der Rückstand H-2 eq

wird gelöst und über Silicagel chromatographiert Für 1,53 ppm, IH, Quartett, J = 12 Hz, H-2 eq

die Eluierung wird die untre Phase eines Chloro- 1,53 ppm, IH, Quartett, J = 12 Hz, H-2 ax.

form : Methanol: konz. Ammoniumhydroxid (1:1:1)- 60

Gemisches verwendet Die Fraktionen, die die Haupt- Physikochemische Daten für die Mutamicine
menge des gewünschten Produktes erhalten, werden

gesammelt und eingedampft Man erhält eine weiße, Die chemische Struktur der Mutamicine wurde durch

amorphe Substanz. konventionelle chemische Analyse ermittelt Daten über

65 die Massenspektra werden in der folgenden Tabelle gegeben. Die Bestimmung der Struktur aus diesen

Massenspektrum: Daten erfolgte nach der Methode von P. J. L Daniels et

m/e = 163(M + 1)⁺ al. [Chemical Communications Nr. 24,1629-31 (1971)].

11

Tabelle Massenspektral Daten

Mutamicin

Maxima bei (M/e)

464 446

378

366 348 338 320

333 315

127

Zuordnung

(M + I)⁺

(M-NHj)⁺

CH₂NH₂" M-C =

I = CH₁

Disaccharid Ionenserie

Streptamin Ionenserie

Ungesättigtes Monosaccharid

Garosamin Ionenserie 12

Mutamicin 2	Zuordnung
Maxima bei (M/e)	(M + I)⁺ M⁺
432 431	[M-NHj]⁺
414	CH₂NH₂"
346	M-C = O C = CH₂
	Disaccharid Ionenserie
336 316 306 288	Disaccharid Ionenserie
	2,5-Dideoxy- streptamin [onenserie
301 ) 283 I 274 I 255 l	Garosamin [onenserie
175 1 157 1 147 I 129 >	Ungesättigtes Monosaccharid
160 I 142 118 J
127

Tabelle 4 (Fortsetzung)

Mutamicin

Maxima bei Zuordnung

Mutamicin 5

Maxima bei Zuordnung

Mutamicin

Maxima bei Zuordnung

464 446

378

(M + I)⁺

(M-NHj)⁺

CH₂NH₂

M-C = C=

Disaccharid Ionenserie

(M + I)⁺
M⁺

Disaccharid
Ionenserie

Triaminodihydroxy cyclohexan Ionen

448

447

350 332 322 304

317 299 289 271

160 142 118

(M + I)⁺

M⁺

Disaccharid Ionenserie

Disaccharid Ionenserie

Garosamin Ionenserie

Fortsetzung

Mutamicin 4

Maxima bei Zuordnung

Mutamicin

Maxima bei Zuordnung

Mutamicin 6

Maxima bei Zuordnung

Disaccharid
Ionenserie

Garosamin
Ionenserie

127

Ungesättigtes
Mooosaccharid

127

Garosamin
Ionenserie

Umgesättigtes
Monosaccharid

127

Umgesättigtes
Monosaccharid

5-Epi-2-deoxy-

streptamin

Ionenserie

Chromatographische Daten

Die Mutamicine können auch durch bekannte chromatographische Techniken voneinander und von Sisomicin unterschieden werden. Chromatographiert man beispielsweise 4 Stundeil mit Hilfe eines Whatman No.l -Papier in der unteren Phase eines Chloroform : Methanol: 17%-Ammoniumhydroxid-Gemisches (2:1:1), so kann man das folgende Resultat beobachten:

Inokulum, 2. Stufe

251 des Fermentationsmediums der Stufe 1 wird unter aseptischen Bedingungen zu einer 2-Liter-Schüttelflasche, die 500 ml des oben beschriebenen Mediums enthält, übergeführt Die Mischung wird für weitere 3 Tage bei 28°C inkubiert (Schütteltisch; 280UpM; 5,1 cm).

Fermentierungsstufe

	Rr
Sisomicin	0,23
Mutamicin 1	0,11
Mutamicin 2	035
Mutamicin 4	0,15
Mutamicin 5	0,22
Mutamicin 6	0,08

500 ml des Inokulums aus Stufe 2 werden unter aseptischen Bedingungen zu einem 14-I-Fermentationstank übergeführt Im Tank befinden sich 9,51 des folgenden sterilen Mediums:

Verwendet man Sisomicin als Bezugspunkt, so haben die Mutamicine folgende R Sisomicin-Werte

Sisomicin	1,0
Mutamicin 1	0,48
Mutamicin 2	1,52
Mutamicin 4	0,65
Mutamicin 5	0,95
Mutamicin 6	035

Herstellung der Mutamicine

Beispiel 1

Herstellung von Mutamicin 1

Inokulum, 1. Stufe

Unter aseptischen Bedingungen fügt man eine lyophilisierte Kultur von M. inyoensis Stamm 1550F-1G zu 100 ml eines Mediums, bestehend aus:

Fleisch-Extrakt	3g
Tryptose	5g
Hefe-Extrakt	5g
Dextrose	ig
Stärke	24 g
Calciumcarbonat	2g
Leitungswasser	1000 ml

das sich in einer 300-ml-Schüttelflasche befindet Die Mischung wird 2-5 Tage bei 35°C auf einem Schütteltisch inkubiert (280 UpM, 5,1 cm).

Dextrin	50 g
Glucose	5g
Sovabohnenmehl	35 g
Calciumcarbonat	7g
Kobaltchlorid	10-⁶ molar
Leitungswasser	1000 ml
Antischaummittel (GE 60) *)	10 ml

*) Siliconemulsion, Hersteller General Electric Company, Schenectady.

Vor der Sterilisierung des Mediums wurde der pH-Wert auf 8,0 gebracht und eine wässerige Lösung von 8 g Streptamin wurde hinzugefügt Das Medium wird unter aerobischen Bedingungen 48—240 Stunden unter Schütteln inkubiert (250 UpM, Luftzufuhr 4,51/ Min. unter einem Druck von 1,8 kg/cm² = 1,77 bar. Der pH-Wert des Mediums ändert sich leicht während der Fermentation und schwankt zwischen 6,8 und 73.)

Die Bildung des Antibiotikums wird durch Probenziehen kontrolliert (wie bei der Herstellung von Sisomicin beschrieben), und wenn die optimale Menge am Antibiotikum erreicht ist, wird die Fermentation abgebrochen. Dieser Zeitpunkt ist normalerweise nach etwa 7 Tagen erreicht

D-e maximale Produktion der Mutamicine liegt in der Größenordnung zwischen 5 und 50 mcg/ml.

Isolierung von Mutamicin 1

Zu der Fermentationsbrühe werden zunächst 7,0 g Oxalsäure unter Rührung hinzugefügt, und dann wird der pH-Wert mit Hilfe von 6N Schwefelsäure auf 2,0 gebracht Die Mischung wird etwa 15 Minuten gerührt und danach filtriert Das Fiitrat wird mit 6N Ammoniumhydroxid neutralisiert (pH = 7,0) und durch einen Kationenaustausch er in der Arornomumicrin

geschickt (ζ. B. Amberlite® IRC-50). Die Säule wird mit 2N Ammoniumhydroxid eluiert, und man sanunelt mehrere Fraktionen von etwa 100 mL Jede Fraktion wird gegen Staphylococcus ATCC 6538P getestet, und die antibiotisch aktiven Fraktionen werden gesammelt. Die gesammelten Fraktionen werden auf etwa 100 ml eingedampft und lyophilisiert, wodurch man das Mutamicin 1 erhält Das Produkt wird mehrmals mit warmem Methanol behandelt, die Lösung filtriert und das Filtrat zur Trockene eingedampft Zur Reinigung wird das Produkt über Silicagel chromatographiert,

wobei man die untere Phase Chloroform: Methanol : konz. Ammoniumhydroxid (1:1:1) = Gemisches als Eluierungsmittel verwendet Die Fraktionen, die antibiotisch aktives Material enthalten, werden kombiniert

-, und eingedampft Man erhält so Mutamicin 1.

Ersetzt man im obigen Beispiel das Streptamin durch eine äquivalente Menge 2,5-Dideoxystreptamin, 2-Epistreptamin, l^S-Triaminocyclohexan-^e-diol oder 5-Epi-2-deoxystreptamin, so erhält man die Mutamicine

in 2,4,5und6.

Tabelle 5

Platten Tests (Replicate Tests) mit den Mutamicinen, Sisomicin und Gentamicin (nach Bauer-Kirby mit 10 Meg. Platten)

Organismus	Zonengröße	(mm)	Mutamicin 4	Mutamicin S	Sisomicin	Gentamicin	308112/86
	Zonen
	Mutamicin 1	Mutamicin 2	26	18	24	23
Escherichia coli			13	10	15	13
589	29	24	16	-ι-	13	12
W677/RS5	30	21	16	Ο	11	11
LA290/R55	29	21	22	0	0	0
JR8S	11	22	17	0	24	23
JR90	0	25	27	24	28	28
Swidinsky 4195	28	25	24	-	-	-
ATCC1O536	31	28	25	22	-	-
Baker 2	-	-	18	0	-	-
St Michael 1574-1	-	27
JR66	-	26	28	16	27	27
Pseudomonas aeruginosa			20	12	25	25
Stone 20	31	33	14	0	14	12
Stone 39	29	27	11	0	10	10
Stone 130	14	25	19	±	25	24
Stone 138	15	23	19	10	26	25
St. Michael 762	24	26	19	0	26	26
St Michael 1262	18	27	19	11	26	26
St Michael 1395	29	28	19	10	-	-
St Michael 413	27	27	17	0	24	23
St Michael 836	-	28	16	0	14	12
D-2	21	26
Capetown 18	19	22	25	22	—	-
Salmonella typhimurium
Group B	-	27	25	20	22	22
Klebsiella pneumonia			24	21	23	25
Ad 17	24	23	26	-	-	-
Ad 18	26	25	19	0	14	13
Ad 22	-	-	19	0	13	11
Georgetown 3694	26	22	0	9	13	11
Georgetown 3020	26	21
Providence 164	15	25

	Fortsetzung	Zonengj-nße	24 37	159	24	18	Sisomicin	Gentamicin
17	Organismus	Zonen			26
	Mutamicin 1			24		25	25
		(mm)		26		29	27
Staphylococcus aureus	26			14	Mutamicin S	26	26
ATCC 6538P	28	Mutamicin 2 Mutamicin 4	13		28	28
Wood	25			21	-	-
Ziegler	26	27	12	25	-	-
59N	-	29	-	23
1118	-	28	12	23	13	13
Grey		29		±	15	16 I
Streptococcus pyogenes	13	14	29	±	-	1
C	17	16				I
B-Cruz	-		±	31	31 I
27		15	-
Bacillus subtilis	31	17	±
ATCC 6633	-
		28
	33

Proteus miiabilis Harding - 26 21 19

Proteus rettgeri - 24 14 13 Bauer, Kirby, Herris and Turck, American Journal of Clinical Pathology, Band 45, Seiten 493-496 (1966).

iaoeue ο	Sisomicin	Sisomicin	J5	Organismus	MlC (mcg/ml)	Sisomicin
	η Mueller-				pH 7,2	0,3
In-Vitro-Aktivität von Mutamicin 1 und	MIC (mcg/ml)		40		Mut amicin 1	0,3
Mindestinhibititionskonzentration (MIC) i Hinton-Brühe:	pH 7,2			Baker 2	3,0	17,5
Organismus	Mut	0,08		F14-Bk	3,0	0,8
	amicin 1	0,03		Genta. adenyl LA29O-R55	3,0
		0,08		Tobra. R 4195	3,0	0,08
		0,03	45	Klebsiella pneumoniae		0,3
	0,3	3,0 3,0		Ad 18	0,3	7,5
Staphylococcus aureus	0,08			Kana. phos. Ad 22	0,3	7,5
ATCC 6538P	0,08	3,0		Genta. adenyl 3694	0,3	0,08
Wood	0,3	3,0	50	Genta. adenyl 3020	0,3	0,8
Ziegler	3,0 3,0	3,0		Genta. adenyl 121	3,0	0,3
59N		3,0		Pseudomonas aeruginosa 1262	3,0	0,08
1118 Grey	3,0	3,0		762	3,0	0,08
Streptococcus pyojenes	7,5	0,8	55	1395	3,0	0,08
C	3,0			NRRL B3223	0,3	>25
27	7,5			D-2	0,8	17,5
Cruz	7,5	0,03		Genta. Tobra.-R. Travers	>25	7,5
Alvarez	3,0			Genta. acetyl Stone 130	17,5	0,3
Labay		0,08	bO	Genta. acetyl Stone 138	17,5	0,8
Karipeds		7,5		Genta. acetyl Stone 20	3,0	7,5
	0,03	0,8		Genta. acetyl Stone 39	3,0	0,8
Pacillus subtilis		0,3		Genta. acetyl Capetown 18	7,5	>25
ATCC 6633	0,3		<■>■>	Proteus rettgeri	3,0
Escherichia coli	0,8		Providence (Genta. R.) 164	>25
ATCC 10536	3,0				0,3
Genta. adenyl W677/R55	3,0		Salmonella typhimurium
Kana. phosphor. 589		B	3,0
Kana. phosphor. C-13

Fortsetzung

	Organismus	MIC (mcg/ml) pH 7,2
		Mut- Sisomicin
I		amicin 1
Ι	Serratia
I	127	0,8 0,8
I	Candida albicans	>25 >25
I	Trichophyton nibrum	>10 >25
	Aspergillus niger	>10 >25
ι i	Tabelle 7
I	In-Vivo-Aktivität von	Mutamicin 1 und Sisomicin
	Organismus	Schutzwirkung bei Mäusen PD₅₀ (mg/kg)
	Mutamicin 1 Sisomicin

Staphylococcus	6,0	1,8
Gray
Escherichia coli	5,0	1,7
Sc.	2,5	2,0
6922
Pseudomonas
aeruginosa	15,3	2,8
2552	17,1	2,7
2557	2,5	1,1
Sc.	Akute Toxizität
	LD₅₀ (mg/lg)
Verabreichung:	110	34
I.V.	>100	190
I. P.

Wie aus den Tabellen hervorgeht, sind die Mutamicine Breit-Spektrum-Antibiotika, die sowohl in vivo, als auch in vitro verwendet werden können.

Die In-Vivo-Verwendung bezieht sich auf die Behandlung von Tieren (und Menschen), die an bakteriellen Infektionen leiden. Insbesondere können die Mutamicine gegen Bakterien, die gegenüber -, bekannten, aminoglycosiden Antibiotika resistent sind, Verwendung finden.

In vielen Fällen beruht die bakterielle Resistenz darauf, daß die Organismen die Fähigkeit besitzen, die Antibiotika durch enzymatische (biochemische) Umsetzungen zu inaktivieren. Einige Organismen inaktivieren aminoglycoside Antibiotika durch Azetylierung, andere durch Phosphorylierung und wiederum andere durch Adehylierung. Einige Arten haben die Fähigkeit nach mehreren Methoden zu inaktivieren. Die Inaktivierung

υ erfolgt an ganz bestimmten Stellen im Molekül des Antibiotikums. Die oben angeführen Tabellen zeigen, daß Änderungen in der Struktur der Antibiotika an gewissen Stellen, die nicht direkt am Inaktivierungsprozeß beteiligt sind, nichtdestoweniger die Inaktivierungsprozesse frustrieren (hemmen) können. Die Aktivitätstabellen umfassen viele Organismen, die eine der obenerwähnten Resistenzmöglichkeiten besitzen, und zeigen eindeutig, daß gewisse Mutamicine gegenüber Organismen wirksam sind, die gegen Gentamicin, Sisomicin, Kanamycin, Neomycin und Tobramycin resistent sind. Beispielsweise sind einige Mutamicine gegenüber gewisse Arten von E Coli, die aüenylierende R-Faktoren enthalten, wie z. B. E CoIi W677/R55 und LA290/R55, wirksam. Diese E Coli Arten sind

in gegenüber Gentamicin, Sisomicin und Tobramycin resistent Andere Mutamicine sind wirksam bei adenylierenden Stämmen von Klebsiella pneumoniae, die gegenüber Gentamicin, Tobramycin und Kanamycin resistent sind. Das gleiche gilt für gewisse phosphorylie-

ij rende Stämme von E. CoIi und Klebsiella pneumoniae, die gegen Kanamycin und Neomycin resistent sind. Weiters sind einige Mutamicine wirksam gegen Gentamicin und Sisomicin resistente Stämme von Pseudomonas aeruginosa und gegen Gentamicin-,

ίο Sisomicin- und Tobramicin-resistente Stämme von Providence. Zusammenfassend kann man sagen, daß die Mutamicine gegenüber Stämmen wirksam sind, die schon mehrere Möglichkeiten zur Inaktivierung von bekannten Antibiotika entwickelt haben.

Claims

Patentansprüche: Der Mikroorganismus

1. Die Mutamicine I₁2,4,5 und 6 der allgemeinen Formel I

CH₂NH₂

H₃C

OH

mit folgenden Substituenten-Zuordnungen: