DE1620604C - Hydrochloride von Lincomycindenvaten und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

SCH,

OH

in der R den Äthyl-, Propyl- oder Isopropylrest bedeutet, in Form ihrer Hydrochloride.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Lincomycin D der Formel

SCH,

OH

a) mit einem entsprechenden Alkyljodid umsetzt oder

b) mit einem entsprechenden Aldehyd bzw. Keton behandelt und die erhaltenen Verbindungen in Gegenwart eines Katalysators für die Hydrierung äthylenischer Doppelbindungen hydriert,

und die so hergestellten Lincomycinderivate in ihre Hydrochloride überführt.

Gegenstand der Erfindung sind Lincomycinderivate ■ der allgemeinen Formel

CH,

SCH₃

CH₃
HO-CH

CONH — CH
HO

SCH₃

OH

Bei der Behandlung mit Methyljodid -wird das am Stickstoff stehende Wasserstoffatom unter Bildung von Lincomycin durch die Methylgruppe ersetzt. Analog erhält man durch Alkylierung von Lincomycin D mit höheren Alky!halogeniden entsprechende Analoge des Lincomycins.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Lincomycin-Analogen besteht darin, daß man Lincomycin D der Formel

CH₃
HO —CH

CONH — CH
HO

SCH₃

OH

a) mit einem entsprechenden Alkyljodid umsetzt oder

b) mit einem entsprechenden Aldehyd bzw. Keton' behandelt und die erhaltenen Verbindungen in Gegenwart eines Katalysators für die Hydrierung äthylenischer Doppelbindungen hydriert,

und die so hergestellten Lincomycinderivaten in ihre Hydrochloride überführt.

Die erfindungsgemäße Umsetzung wird zweckmäßig bei Raumtemperatur durchgeführt, vorzugsweise in Gegenwart eines inerten flüssigen Verdünnungsmittels, z. B. eines Alkohols oder halogenieren Kohlenwasserstofflösungsmittels, vorzugsweise Methylenchlorid. Die Mengenverhältnisse der Reak-

OH

ionsteilnehmer können weitgehend variiert werden. Zweckmäßig wird jedoch mindestens die äquimolare VIenge bis zu einem Überschuß von etwa der 15fachen Menge an Jodid verwendet. Der Überschuß kann als Lösungsmittel für die Reaktionsteilnehmer dienen, was die Umsetzung begünstigt und die Isolierung des M-substituierten Lincomycins D vereinfacht. Die Reaktion ist gewöhnlich innerhalb weniger Minuten bis ;iniger Stunden beendet.

Das N-substituierte Lincomycin D kann aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, indem man das Gemisch zunächst einengt, den Rückstand in Wasser löst, auf einen pH-Wert von 10 einstellt und dann mit einem halogenierten Kohlenwasserstofflösungsmittel, vorzugsweise Methylenchlorid, extrahiert. Der organisehe Extrakt wird zur Trockne eingeengt und der Rückstand in alkoholischem Chlorwasserstoff gelöst. Beim Vermischen der Lösung mit einer geringen Menge eines niederen Alkanons in Äther fällt das N-substituierte Lincomycin D als Hydrochlorid aus.

Nach der alternativen Verfahrensweise wird Lincomycin D mit einem entsprechenden Aldehyd bzw. Keton umgesetzt und das erhaltene Produkt hydriert. Die Hydrierung kann über Palladium oder Platin oder unter Verwendung eines anderen, für die Sättigung von Doppelbindungen geeigneten Hydrierungskatalysators durchgeführt werden.

Die Hydrochloride der freien Basen erhält man dadurch, daß man die Basen mit Salzsäure auf einen pH-Wert unter etwa 7,0, vorzugsweise auf einen pH-Wert von 2 bis 6 einstellt.

Die Hydrochloride können für die gleichen Zwecke verwendet werden wie die freien Basen. Sie können auch zur Reinigung der Basen dienen. Man kann z. B. Lösungen der Hydrochloride in Wasser mit verschiedenen, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahieren, bevor man die freie Base regeneriert oder in ein anderes Salz überführt.

Die den erfindungsgemäßen Hydrochloriden zugrunde liegenden freien Basen können als Puffer oder Säureantagonisten verwendet werden. Sie reagieren mit Isocyanaten unter Bildung von Urethanen, die zur Modifizierung von Polyurethanharzen dienen können.

Durch die N-Äthylierung des Lincomycins D wird ein Antibiotikum mit unerwartet hoher Aktivität gegen gram-negative Mikroorganismen erhalten. Lincomycin wirkt in erster Linie gegen gram-positive Mikroorganismen, Lincomycin D bzw. N-Desmethyllincomyein besitzt das gleiche Wirkungsspektrum wie Lincomycin, jedoch weniger ausgeprägt. N-Äthyllincomyein D weist nun nicht nur starke Wirksamkeit gegen gram-positive Mikroorganismen auf, die mit derjenigen des Lincomycins vergleichbar ist, sondern auch starke Wirkung gegen gram-negative Mikroorganismen, insbesondere Klebsiella pneumoniae. Dabei ist seine Verträglichkeit ausgezeichnet. Die intraperitoneale Verabreichung einer wäßrigen Lösung von N-Äthyllincomycin-D-Hydrochlorid an Mäuse ergab eine LD₅₀ von 1047 mg/kg, die orale Verabreichung einer wäßrigen Lösung an Ratten eine LD₅₀ von mehr als 8000 mg/kg. Ferner wurde festgestellt, daß keine nachteiligen Wirkungen auftreten, wenn man N-Äthyllincomycin D Hydrochlorid in Form einer wäßrigen Lösung 5 Tage lang in einer Dosis von jeweils 50 mg/100 g oral an männliche Sprague-Dawley-Ratten verabreicht. Die »mittlere Schutz-Dosis 50« von Lincomycin beträgt hingegen von 15 bis 25 mg/kg je nach Verabreichungsform, wie z. B. der Veröffentlichung in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1967, S. 539, zu entnehmen ist.

Unter Verwendung einer Hirn-Herz-Infusionslösung (Brain Heart Infusion, Difco, Detroit, Mich.) wurden in vitro Vergleichsversuche durchgeführt. Proberöhrchen (18 x 150 mm) wurden nach der von S η e 11, E. E., Vitamin Methods, Bd. I, Academic Press, Inc., New York 1950, S. 327, beschriebenen Methode vorbereitet. Zur Beimpfung der Testmedien wurden Testorganismen verwendet, die man 18 Stunden bei 37° C gezüchtet hatte. Die Verdünnung betrug 1 bis 40 000. Das Wirkungsspektrum von Lincomycin, Lincomycin D und N-Äthyllincomycin D ist in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

Test-Organismus

Kleinste hemmende Konzentration
y/ml

N-Äthyllincomycin D Lincomycin D

Gram-positiv

Staphylococcus aureus UC 76..
Staphylococcus aureus UC 552.
Staphylococcus aureus UC 771.
Staphylococcus aureus UC 70..

Streptococcus hemolyticus

Streptococcus faecalis

Bacillus subtilis

Gram-negativ

Escherichia coli

Proteus vulgaris

Klebsiella pneumoniae

Salmonella schottmuelleri

Pseudomonas seruginosa

0,4	0,8	6,0
0,8	0,8	12,0
0,8	Q,8	—
0,4	0,4	3,0
0,8	0,8	3,0
0,8	0,8	1,6
25	100	100
>100	100	>100
>100	>100	>100
100	25	>100
>100	50	>100
>100	>100	>100

Die UC-Bezeichnung bezieht sich auf die Upjohn Culture Collection. Die Organismen sind auf Anfrage von The Upjohn Company erhältlich.

N-Äthyllincomycin D kann für dieselben Zwecke verwendet werden wie Lincomycin, ferner dort, wo ein breiteres antibiotisches Spektrum erwünscht ist, als es Lincomycin und Lincomycin D besitzen. Es kann zur Imprägnierung von Einlagen für Wasser-Verdampfungskühler dienen, wie sie im USA.-Patent 3 126 428 beschrieben sind, so daß die durch Bakterien verursachte Geruchsverschlechterung der kühlen Luft vermieden wird. Ferner können die neuen Verbindungen zum Waschen und Sterilisieren auspräparierter Tumore verwendet werden (s. USA.-Patentschrift 3 095 418) und zur Bekämpfung des Bakterienwachstums in Austernkulturen für die Gewinnung von Zuchtperlen. Sie beschleunigen das Zuwachsen der Schale und ermöglichen das Wachstum der Tasche, welche die Perle während ihres 3- bis 5jährigen Wachstums schützt.

Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.

20 Beispiel 1

N-Äthyllincomycin D

300 mg Lincomycin-D-Hydrochlorid werden in 50 ml Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wird unter Verwendung eines in der Hydroxidform vorliegenden Anionenaustauscherharzes (chlormethyliertes, gegebenenfalls mit Divinylbenzol vernetztes Polystyrol, anschließend mit Trimethylamin oder Dimethyläthanolamin quaternisiert (s. Kunin, Ion Exchange Resins, 2. Auflage, 1958, John Wiley and Sons, Inc., S. 88, 97 und 84) auf 9,4 eingestellt. Die alkalische Lösung wird dann gefriergetrocknet, worauf man das freie Lincomycin D erhält.

Es wird in 20 ml Methylenchlorid und 3 ml Methanol gelöst. Dann werden 3 ml Äthyljodid zugegeben, und das Gemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Anschließend werden weitere 5 ml Äthyljodid zugesetzt. Dann wird das Reaktionsgemisch 3 Stunden auf 40⁰C gehalten, über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 30 ml Wasser gelöst, mit 1 normaler wäßriger Natriumhydroxidlösung auf pH 10,0 eingestellt und die alkalisehe Lösung dreimal mit Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte werden zur Trockne eingedampft, und der Rückstand wird in methanolischer Salzsäure gelöst. Die Lösung wird mit 3 ml Aceton und 100 ml Äther gemischt, worauf 34,4 mg N-Äthyllincomycin-D-Hydrochlorid ausfallen, die abnltriert und getrocknet werden.

Das N-Äthyllincomycin-D-Hydrochlorid hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften:

55 Analyse für C₁₉H₃₇ClN₂O₆S:

60

Berechnet:
C 49,93, H 8,16, N 6,13, S 7,01, Cl 7,76;

gefunden:
C 47,77, H 8,13, N 6,15, S 6,45, Cl 7,36.

Molekulargewicht: 157; [α]? = 127° (c = 0,293 in Wasser).

In gleicher Weise wurde N-Propyllincomycin-D-Hydrochlorid hergestellt.

Beispiel 2
N-Äthyllincomycin-D-Hydrochlorid

Ein Gemisch aus 1,5 g(O,OO365 Mol) Lincomycin-D-Hydrochlorid, 0,6 g Acetaldehyd (0,0136 Mol), 5 ml Wasser, 150 ml Methanol und 0,7 g 30%igem Palladium-Kohle-Katalysator wird in einem Parr-Hydrierapparat hydriert. Nach 2V₂stündigem Schütteln in Wasserstoff bei 25⁰C wird das Reaktionsgemisch nitriert und das Filtrat im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der rohe feste Rückstand wird durch Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel in einem Methanol-Chloroform-System (1:4) analysiert. Danach besteht das Rohprodukt fast vollständig aus einem einzigen Material mit einem Rf-Wert, der nur wenig größer ist als der von Lincomycin. Das Rohprodukt wird in 50 ml Wasser gelöst und der pH-Wert mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf 11 eingestellt. Die Lösung wird sodann mit Methylenchlorid extrahiert und der Methylenchloridextrakt zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Aceton gelöst und mit einem geringen Überschuß an ätherischer Salzsäure versetzt. Der abgeschiedene Niederschlag wird sofort abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet. Das so gereinigte Produkt wiegt in Form des Hydrochlorids 400 mg.

Analyse:
Berechnet:

C 49,93, H 8,16, N 6,13, S 7,01, Cl 7,76;
gefunden:

C 47,77, H 8,13, N 6,15, S 6,45, Cl 7,36.

Beispiel 3
N-Isopropyllincomycin-D-Hydrochlorid

Ersetzt man im Verfahren des Beispiels 2 den Acetaldehyd durch Aceton, so erhält man N-Isopropyllincomycin-D-Hydrochlorid.

Analyse:
Berechnet:

C 50,99, H 8,35, N 5,95, S 6,81, Cl 7,53;
gefunden:

C 50,44, H 8,07, N 5,38, S , Cl 7,32.

Beispiel 4
N-Propyllincomycin-D-Hydrochlorid

Ersetzt man im Verfahren des Beispiels 2 den Acetaldehyd durch Propionaldehyd, so erhält man N-Propyllincomycin-D-Hydrochlorid.

Analyse: Berechnet:

C 50,99, H 8,35, N 5,95, S 6,81, Cl 7,53;
gefunden:

C 50,61, H 8,68, N 5,72, S 6,60, Cl 7,57.

Das als Ausgangsstoff verwendete Lincomycin-D war wie folgt hergestellt worden:

A. Fermentation

Ein mit Streptomyces lincolnensis var. lincolnensis NRRL 2936 hergestellter Schrägnährboden wurde zur Beimpfung von mehreren 500-ml-Erlenmeyerkolben verwendet, von denen jeder 100 ml eines sterilen Nährmediums der folgenden Zusammensetzung enthielt:·

7 8

Hefeproteinhydrolysat 10 g Aktivkohle gemischt und dann mit 5% Diatomeenerde

Glucose-Monohydrat .... 10 g als Filterhilfsmittel filtriert. Der Kohlekuchen wurde

Enzymatisches Gaseinhydrolysat 5 g nacheinander mit Wasser und 20%igem wäßrigem

Leitungswasser zum Auffüllen auf ... 11 Aceton gewaschen und einmal mit 70%igem wäßrigem

5 Aceton und noch zweimal mit 90%igem wäßrigem

Dieses Medium hatte nach der Sterilisierung einen Aceton eluiert. Die drei Acetoneluate (1 x 70% und

)H-Wert von 7,3· Es wurde 2 Tage bei 28° C auf einer 2 x 90%) wurden vereinigt, zu einer wäßrigen Lösung

jump-Schüttelmaschine mit 250 Bewegungen pro eingeengt und darauf gefriergetrocknet. Man erhielt

viinute (Bewegungslänge 6,25 cm) fermentiert. 121,7 g eines Präparats Nr. 1, das Lincomycin und

600 ml des auf diese Weise erhaltenen Impfstoffes io Lincomycin D enthielt. Der Kohlekuchen wurde nach

vurden zur Beimpfung eines 400-1-Tanks mit 250 1 der Acetonextraktion mit n-Butanol, Aceton und

ies folgenden sterilen Nährmediums verwendet: Wasser (3:3:2) aufgeschlämmt und dann filtriert.

Die Mutterlauge wurde zu einer wäßrigen Lösung

Glucose-Monohydrat 10 g eingeengt und lyophilisiert, worauf man 9 g eines

Hefe 10 g 15 Präparats Nr. 2 erhielt, das Lincomycin und Linco_:

Lösliche Rückstände aus der Alkohol- mycin D enthielt. 112 g des Präparats 1 und 6 g des

destillation 5 g Präparats 2 wurden zusammengegeben und in 400 ml

Natriumchlorid 4 g Wasser gelöst. Der pH-Wert der Lösung wurde durch

Leitungswasser zum Auffüllen auf ... 11 Zugabe von 11ml 5normaler wäßriger Natrium-

20 hydroxidlösung auf 10 eingestellt. Die Lösung wurde

Dann wurde mit 50%iger Natriumhydroxidlösung dann mit 500 ml Hexankohlenwasserstoffen extrahiert

luf einen pH-Wert von 7 bis 7,2 eingestellt und und der Extrakt verworfen. Die verbleibende Lösung

larauf Calciumcarbonat in einer Menge von lg/1 (425 ml) wurde viermal mit je 250 mlMethylenchlorid

ind Specköl in einer Menge von 2 ml/1 zugegeben. extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte

Vnschließend wurde 30 Minuten bei 121⁰C sterilisiert. 25 (950 ml) wurden zur Trockne eingedampft, worauf

Dieses Medium wurde 48 Stunden bei 28⁰C, einer man 4,5 g eines Präparats A erhielt, das nur Linco-

iielüftungsgesch windigkeit von 100 l/Min, und einer mycin enthielt. Die extrahierte wäßrige Lösung wurde

ichüttelgeschwindigkeit von 280 Bewegungen/Min. fünfmal mit je 250 ml n-Butylalkohol extrahiert. Die

ermentiert. . vereinigten Butanolextrakte wurden mit Wasser ge-

Für die Beimpfung eines 400-1-Gärtanks, der 250 1 30 waschen, zu einer wäßrigen Lösung eingeengt und

Ies folgenden sterilen Mediums enthielt, wurden 5% gefriergetrocknet. Das so erhaltene Präparat wurde in

Ies obigen Produktes (12,5 1) verwendet. 20 ml absolutem Methanol und 29 ml n-methano-

lischer Salzsäure gelöst. Der beim Vermischen mit

Glucose-Monohydrat 15g 500 ml Äthyläther ausfallende Niederschlag wurde

Stärke 40 g 35 abfiltriert und in Wasser gelöst. Die wäßrige Lösung

Melassen 20 g wurde lyophilisiert, worauf man ein Präparat B erhielt,

Enzymatisches Hydrolysat tierischer das Lincomycin und Lincomycin D enthielt.

Proteine 10 g

Maisquellwasser 20 g C. Gegenstromverteilung

Calciumcarbonat 8 g 40

Specköl 5 ml Das Präparat B wurde in 100 ml der unteren Phase

Leitungswasser zum Auffüllen auf ... 11 eines Lösungsmittelsystems aus gleichen Volumteilen

Butanol und Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit

Vor der Sterilisierung wurde der pH-Wert mit einer dem gleichen Volumen der oberen Phase des oben-O%igen Natriumhydroxidlösung auf 7.2 eingestellt. 45 genannten Systems vermischt und dann in einen Nach 48 Stunden wurden 2 g/l Methylthiolincos- Craig-Gegenstromverteiler aus Glas (10 ml/Phase) iminid zugegeben (bei ähnlichen Fermentationen gegeben. Nach 980 Überführungen wurde die Verwurden zur Herstellung von Lincomycin D bis zu teilung durch die Bestimmung der Feststoffe und ί g/l an Methylthiolincosaminid zugesetzt). Es wurde Dünnschichtchromatographie ermittelt. Die Dünn-)0 Stunden bei einer Temperatur von 28°C, einer 50 Schichtchromatographie zeigte, daß die Röhrchen 104 ßelüftungsgeschwindigkeit von 200 l/Min, und einer bis 170 hauptsächlich Lincomycin D enthielten. Der Schüttelgeschwindigkeit von 280 Bewegungen/Min. Inhalt dieser Röhrchen wurde vereinigt und im gearbeitet. Die Wirksamkeit gegen Sarcina lutea Vakuum eingeengt (auf etwa 80 ml), worauf 200 mg «trug danach 204 y/g. kristallines Lincomycin D ausfielen. Das Filtrat wurde Der Test gegen Sarcina lutea wurde auf Agar 55 auf 50 ml weiter eingeengt. Das hierbei ausfallende durchgeführt, der mit Phosphatpuffer (0,1 m) vom kristalline Lincomycin D wurde abfiltriert (Ausbeute pH 7 auf einen pH-Wert von 6 bis 8 gepuffert worden 200 mg). Die beiden rohen Kristallfraktionen wurden war. Eine Volumeinheit (0,08 ml) der das zu unter- vereinigt (400 mg) und in 17 ml Wasser gelöst. Nach suchende Material enthaltenden Lösung wurde auf Zugabe von 60 ml Aceton erhielt man ein hochreines „•ine 12,7 mm Testplatte aufgetragen, die dann auf die 60 kristallines Lincomycin D in Form farbloser, fedriger mit dem Testorganismus beimpfte Agarplatte gebracht Kristalle. Sie wurden abfiltriert und getrocknet. Auswurde, beute 170 mg.

B Gewinnung ^^{as verwen}dete Methylthiolincosaminid war wie

folgt hergestellt worden: Eine Lösung von 4 g Linco-

Die gesamte Gärbrühe (35 1) einer Lincomycin-D- 65 mycin in 20 ml Hydrazinhydrat (98 bis 100%ig) wurde

Fermentation wurde beim End-pH-Wert unter Ver- 21 Stunden unter Rückfluß erhitzt, überschüssiges

wendung von 4% Diatomeenerde als Filterhilfsmittel Hydrazinhydrat wurde im Vakuum unter Stickstoff

filtriert. Das Filtrat wurde 30 Minuten mit 5% auf dem Dampfbad abdestilliert, worauf eine pastöse

10

ristallmasse zurückblieb. Die Masse wurde gekühlt, Raumtemperatur 2,8 g (84%) kristallines weißes

lit Acetonitril versetzt und gerührt, bis die Kristalle Methyl thiolincosaminid. Dieses Produkt wurde durch

ispendiert waren. Die Kristalle wurden sodann Auflösen in heißem Dimethylformamid und Zugabe

'^sammelt und mit Acetonitril und Äther gewaschen. des gleichen Volumens Äthylenglykoldimethyläther

/lan erhielt nach dem Trocknen im Vakuum bei 5 umkristallisiert.

Claims (1)

1. Patentansprüche:
   1. Lincomycinderivate der allgemeinen Formel

   CH₃
   HO —CH

   CONH — CH
   HO

   in der R den Äthyl-, Propyl- oder Isopropylrest bedeutet, in Form ihrer Hydrochloride, und Verfahren zu ihrer Herstellung.
   Lincomycin D ist ein Antibiotikum, das vom Lincomycin produzierenden Actinomyceten erzeugt wird, wenn man während der Fermentation Methylthiolincosaminid zugibt. Lincomycin D kann durch Methylierung in Lincomycin übergeführt werden. Aus dieser Feststellung und anderen Beobachtungen schloß man, daß Lincomycin D N-Desmethyllincomycin ist und die folgende Strukturformel hat: