DE2606517A1 - Aminocyclitol-antibiotika und verfahren zu deren herstellung - Google Patents

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Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assnr.ann · Dr. R. Koenigsberger
Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.-!ng. F. Kliogseisen - Dr. F. Zumstein jun.

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STERLING DRUG INC., NEW YORK, N.Y. / U.S.A.

Aminocyclitol-Antibiotika und Verfahren zu deren Herstellung

Die Erfindung betrifft Aminocyelitol-Antibiotika und insbesondere Verbindungen der Formel

CH-NH-R

HO-

H-R,

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worin R^ Wasserstoff oder Niedrig-alkyl bedeutet, R-, und Wasserstoff bedeuten oder einer der Reste R₁, R, und Rn OJ-Amino-o£-hydro xy-niedrig-alkanoy!gruppe der Formel

, (CH₂)_nCHOHCO-

darstellt, worin η den Wert Null oder 1 hat und die anderen der Reste R₁, R^ und Rn Wasserstoff sind; R₀ Wasserstoff oder Hydroxy

L J O d.

bedeutet; R,- Wasserstoff, Hydroxy oder Halogen (einschließlich Fluor, Chlor, Brom und Jod) bedeutet, wobei jedoch, wenn Rp Wasserstoff ist, R keine Hydroxygruppe in cisrStellung zu den Amino-

gruppen in 1- und 3-Stellung ist; und Rg und R„ jeweils Wasserstoff oder Methyl bedeuten.

Verbindungen der Formel I , worin R-, R., und Rn Wasserstoff darstellen, werden nach dem in der U.S. Patentschrift 3 669 8j58 beschriebenen Verfahren hergestellt. Dieses Verfahren umfaßt die Kultivierung eines Nährmediums, das Kohlehydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein zugefügtes Aminocyclitolderivat der Formel

HO.

II

worin R₁, R₂, R₅ und R^ die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen und worin R. und R-, zusätzlich eine einfache, je zwei Aminostickstoffatome miteinander verbindende Bindung darstellen können, in Gegenwart eines geeigneten Mutanten-Mikroorganismus, wobei dieser Mutanten-Mikroorganismus zur Synthese dieses Aminocyclitols selbst nicht befähigt ist, jedoch befähigt ist, dieses Aminocyclitol in die Verbindung der Formel I einzubauen, speziell eine Mutante von Micromonospora purpurea mit der Bezeichnung Micromonospora purpurea ATCC J5l 119, enthält und Isolieren des Produkts aus dem Kulturmedium. Die Verbindungen der Formel I, worin sowohl R^ als auch R, Wasserstoff bedeuten, werden gebildet, wenn das Aminocyclitol der Formel II, worin R< und R, eine Einfachbindung darstellen, verwendet wird. Gemäß dem in der vor-

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stehenden U.S. Patentschrift beschriebenen Verfahren ist die Natur der Mutante derart, daß sie nicht befähigt ist zur Synthese der Aminoeyclitol-Untereinheit aus einem Nährmedium, um hierdurch das Antibiotikum zu bilden, jedoch befähigt ist, die letztere in ein Antibiotikum einzubauen, wenn zu dem Nährmedium das Aminocyelitol zugefügt wird.

überdies haben Untersuchungen mit Radioisotopen versetzten Verbindungen gezeigt, daß nicht Stickstoff enthaltende Cyclitole voraussichtlich biogenetische Vorläufer von Aminocyclitolen des durch die Formel II dargestellten Typs, wie Streptamin und Deoxystreptamin sind [Rinehart et al, J. Am. Chem. Soc. J)6, 226j5-2265 (I974); Walker u.a., Biochem. 8, 763-770 (I969); Demain et al, Bacteriol. Rev. ^, I-I9 (1970)]. Obwohl es jedoch bekannt ist, daß Aminocyclitole in Aminocyclitol-Antibiotika entweder durch Kultur eines Nährmediums, das die Aminoeyclitol-Untereinheit als solche nicht enthält;, und in Gegenwart eines geeigneten Mikroorganismus [z.B. der Einbau von Deoxystreptamin in Neomycin nach Waksman et al., Science JLOJ), 305-307 (19^9) ] oder durch Kultur eines eine Aminoeyclitol-Untereinheit enthaltenden Nährmediums in Gegenwart einer Mikroorganismus-Mutante, die zur Biosynthese des Aminocyclitols als solchen nicht befähigt ist, Jedoch befähigt ist, das Aminocyclitol in das Antibiotikum einzubauen (z.B. der Einbau von Streptamin oder Epistreptamin in Hybrimicin-AntibiotLka, US-Patentschrift 3 669 838) wie vorstehend beschrieben eingebaut werden können, wurde der direkte Einbau von Cyclitolen in Aminocyclitol-Antibiotika bisher nicht erreicht. Tatsächlich waren die Versuche entweder Myo-inosit, ein vermutlicher biogenetischer Vorläufer von Streptamin oder einen Hexahydroxy-eyclohexan-monomethyläther (Quebrachit) in Aminocyclitol-Antibiotika unter Verwendung der Rinehart/Shier-Methode einzubauen, bisher völlig erfolglos. (Testa et al, J. Antibiotica 2J_,-917-921 (1974)].

Jedoch würde ein Verfahren, das die Verwendung von Cyclitolen anstelle von Aminocyclitolen zum Einbau in Antibiotika vom Aminocyclitoltyp durch Mikroorganismus-Mutanten unter Verwendung der Rinehart/Shier-Methode gestattet, einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der Aminocyclitol-Antibiotika darstellen, da eine derartige Methode durch überlegte Auswahl des Mikro-

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Organismus und der Cyclitol-Untereinheit bis zu einem gewissen Grad eine biogenetische "Maß-Anfertigung" des resultierenden antibiotischen Moleküls ermöglichen würde. Überdies würden, da die Aminocyclitole ganz erheblich teurer sind als die nicht-aminierten Cyclitole, beträchtliche Kosten des Endprodukts eingespart werden (beispielsweise kostet Streptamin zum gegenwärtigen Zeitpunkt ca. 1 Dollar je Gramm, wohingegen der vermutliche biogenetische Vorläufer Scyllo-inosose in ca. 80 #-iger Ausbeute durch fermentative Oxydation von Myo-inosit erhalten wird, das lediglich ca. 2 Cents je Gramm zum gegenwärtigen Zeitpunkt kostet).

Gemäß dem verbesserten Verfahren der Erfindung wurde überraschenderweise gefunden, daß Aminocyclitol-Antibiotika vom Typ des Streptamin, Deoxystreptamin oder Dideoxystreptamin der allgemeinen Struktur der vorstehenden Formel I hergestellt werden können, indem man ein Nährmedium kultiviert, das" Kohlenhydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein Cyclitol der Klasse des 2-Rp¹^-R₂ ¹-5-Rc¹-1,4,6-Trihydroxycyclohexanone oder 2-R₂ ^l-5-Rc'-¹i5i^2|"i6-Tetrahydroxycyclohexans, dargestellt durch die Formel

IHa

oder der Klasse des 5-Rc¹ -lj^iö-Trihydroxycyclohex^-en, dargestellt durch die Formel

RO-

HIb

worin jeweils R Wasserstoff oder Acetyl bedeutet; R-,¹ Oxo (=0) oder Hydroxy ist; und R₂' und R^¹ jeweils Wasserstoff, Hydroxy

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oder OR darstellen, in Gegenwart von Mutanten von Organismen, die lediglich zur Biosynthese von Antibiotika des Typs des Streptamin, Deoxystreptamin oder Dideoxystreptamin in Gegenwart der genannten Cyclitole befähigt sind, enthält.

Beispiele für Aminocyclitol-Antibiotika, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden können und für Organismen, deren Mutanten zu deren Bildung verwendet werden, können durch die folgenden Typen veranschaulicht werden:

Antibiotikum Mikroorganismus

Hybrimicin . Streptomyces fradiae

Gentamicin. Micromonospora purpurea und

Micromonospora echinospora

Tobramicin Streptomyces tenebrarius

Ribostamicin Streptomyces ribosidificus

Sisomicin Micromonospora inyoensis

Kanamicin Streptomyces kanamyceticus

Butirosin Bacillus circulans.

Das vorstehende Verfahren kann zur Herstellung von Antibiotika des Gentamicin-Typs der Formel I, worin Rg und R₇ jeweils Wasserstoff oder Methyl darstellen, Rp und Rj- jeweils Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten und R^, R^ und Rg Wasserstoff bedeuten, verwendet werden, wobei man ein Nährmedium kultiviert, das Kohlenhydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein Cyclitol der Formel IHa oder IHb in Gegenwarc eines Mikroorganismus-Stammes, insbesondere einer Mutante von M. purpurea, nämlich M. purpurea ATCC 31,164, der nicht zur Biosynthese der Cyclitol-Einheit befähigt ist, jedoch zum Einbau des Cyclitols in das antibiotische Molekül in Form einer Aminocyclitol-Einheit befähigt ist, enthält.

Es ist auch bezeichnend, daß die gleiche Mutante M. purpurea ATCC 31 16²* auch dazu befähigt ist, in die Antibiotika der Formel I ein Aminocyclitol der Formel

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HO

Ha

worin Rp. und R₁- *" jeweils Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten und Rj,¹ Amino-niedrig-alkylamino oder Hydroxy bedeutet oder Schiff¹ sehe Basen der Verbindung der Formel Ila, z.B. Schiffsche Basen von Benzaldehyd und den Aminocyc lit ölen der Formel Ha mit der Formel

HO—. N=CHC₆H

Hb

worin R^¹ Hydroxy oder Benzylidenimino (CgHgCH=N) darstellt und Rp¹ und Rf-¹ die in Formel Ha angegebenen Bedeutungen besitzen, einzubauen. Das Verfahren,nach dem Verbindungen der Formel I, worin Rg und R~ jeweils Wasserstoff oder Methyl darstellen, Ro und Rc jeweils Wasserstoff oder Hydroxy darstellen, R^ Wasserstoff oder Niedrig-Alkyl bedeutet und R-, und Rg Wasserstoff bedeuten, hergestellt werden können, wird in Gegenwart von M. purpurea ATCC 31 16^ unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens durchgeführt und umfaßt die Kultivierung eines Nährmediums, das Kohlenhydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein Aminocyclitol der Formel Ila oder lib in Gegenwart von M. purpurea ATCC Jl 164 enthält. Dieses Verfahren wird als in dem Bereich der Erfindung liegend angesehen.

Wie vorstehend beschrieben, kann die Herstellung von Verbindungen der Formel I durch Kultivierung eines Nährmediums, das Kohlenhydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein Aminocyclitol der Formel II, worin R. und R-, Wasserstoff bedeuten, R₂ Wasserstoff oder Hydroxy ist und R^ Wasserstoff, Hydroxy oder Halogen bedeutet, enthält, auch in Gegenwart der

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MIkroorganismus-Mutante Micromonospora purpurea ATCC ?1 119 durchgeführt werden. Jedoch sind, wie vorstehend ausgeführt, die als Substrate in diesem Verfahren erforderlichen Aminocyclitole ziemlich kostspielig und somit sind die Kosten des gebildeten Endproduktes entsprechend hoch. Das Verfahren, das die Verwendung von Cyclitolen in Gegenwart der Mutante M. purpurea ATCC J5l 164 zum Einbau in Aminocyclitol-Antibiotika umfaßt, stellt somit gegenüber dem zuerst beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren einen Vorteil dar.

In jedem Fall werden unabhängig davon, ob die nicht-Stickstoffenthaltenden Cyclitole der Formel IHa oder IHb oder die Aminocyclitole der Formel II, Ila oder Hb als Substrate verwendet werden, die Verbindungen der Formel I durch Kultivierung eines Nährmediums, das Kohlenhydrate, eine Stickstoffquelle, essentielle Salze und ein zugefügtes Cyclitol der Formel IHa oder IHb oder ein Aminocyclitol der Formel Ha oder Hb in Gegenwart der Mutante M. purpurea ATCC 31 164 enthält, und Isolierung des Produkts aus dem Kulturmedium hergestellt.

Die Verbindungen der Formel I, worin einer der Reste R-, R-, und Rg eine CJ-Amino-ol-hydroxy-niedrig-alkanoylgruppe darstellt, werden nach dem in der U.S. Patentschrift 3 780 018 beschriebenen Verfahren hergestellt, das die Umsetzung einer Verbindung der Formel I, worin jeweils R^, R, und Rg Wasserstoff bedeuten, mit einem N-Hydroxysuccinimidester der Formel

/Λ H

J/ \\ CH₀O-C-

_ow-ν.-NHCH₀ (CH₀) CHOHCO-O-N δ i JL η

worin η die vorstehend angegebene Bedeutung besitzt, umfaßt. Die erhaltene Mischung der Verbindungen der Formel I, worin einer der Reste R₁, R, und Rg die mJ-(N-Benzyloxycarbonyl)-amino-Ot»- hydroxy-niedrig-alkanoylgruppe

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(CH₂)_nCH0HC0-

bedeutet und die anderen verbliebenen Reste Wasserstoff bedeuten, wird dann einer Hydrogenolyse der Benzyloxycarbonylgruppe mit Wasserstoff über einem Katalysator unterworfen.

Wie vorstehend angegeben, wird, wenn eine Verbindung der Formel I, worin jeweils PL , R-, und Ro Wasserstoff darstellen, als Ausgangsmaterial in der AcyIierungsreaktion verwendet wird, eine Mischung der drei möglichen isomeren Mono-amide erhalten, worin einer der R.-, R-,- oder Ro-Amin-wasserstoffatome durch die &-(N-Benzyloxycarbonyl)-amino-O^-hydroxy-niedrig-alkanoylgruppe ersetzt ist. Ist eine individuelle Charakterisierung und Untersuchung dieser Produkte erwünscht, so müssen sie selbstverständlich voneinander getrennt werden. Die Acylierungsreaktion wird durch Umsetzung molaräquivalenter Mengen der Verbindung der Formel I und des N-Hydroxysuccinimidesters vorzugsweise bei einer Temperatur von -10⁰C bis ca. 10^QC und in einer wässrigen Lösung eines inerten organischen Lösungsmittels, z.B. Tetrahydrofuran, Dioxan, Äthylenglykol-dimethylather, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, Propylenglykol-dimethylather und dergl. durchgeführt.

Die Hydrogenolyse der Benzyloxycarbonylgruppe wird über einem Palladium-Aktivkohle-Katalysator in einem inerten, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z.B. Methanol, Äthanol, Dioxan, Tetrahydrofuran, Ä*thylenglykol-d imethy lather, Propylenglykol-dimethylather und dergl. durchgeführt.

Die Aminocyclitole der Formel II, worin R^, Rp und R, Wasserstoff darstellen und Rj- Fluor oder Jod bedeutet, sind neue Verbindungen, die in den Bereich der Erfindung fallen und wie nachstehend beschrieben hergestellt werden. Andere Aminocyclitole der Formel II, die bei der Durchführung der Erfindung verwendbar sind, sind bekannte Verbindungen. Diese sind:

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Streptamin-sulfat [Peck et al, J. Am. Chem. Soc. 68, 776 (1946)]5

2-Epistreptamin-dihydrochlorid [Suami et al, J. Org. Chem. 22, 28^1 (I968)];

2,5-Dideoxystreptamin-dihydrochlorid, Fp. >300°C; und 6,7-Diazabicyclo[5,2,l]octan-2,4-diol (exo, exo), Pp. I85-I93 C. [die beiden letztgenannten Verbindungen sind von Testa et al, J. Antibiotics 27j. 917-921 (1974) beschrieben].

Die N-Hydroxysuccinimidester der Formel IY sind eine allgemein bekannte Verbindungsklasse.

Die Verbindungen der Formel I wurden in einem antibakteriellen Standard-Reihenverdünnungstest untersucht, und es wurde gefunden, daß sie eine antibakterielle Aktivität, insbesondere gegenüber Gentamicin resistenten Organismen besitzen. Die Verbindungen sind somit als antibakterielle Mittel verwendbar.

Die Verbindungen der Formel I sind insbesondere für die orale, topische oder parenterale Verabreichung bestimmt und können zu ihrer Verwendung mit einem pharmazeutischen Träger durch Suspension entweder in Form ihrer freien Basen oder als pharmazeutisch annehmbare, nicht-toxische Säureadditionssalze in einem inerten Träger, wie Polyäthylenglykol, oder durch Tablettieren oder Einkapselung für die orale Verabreichung entweder allein oder mit geeigneten Adjuvantien hergestellt werden oder sie können alternativ mit herkömmlichen Cremes oder Gallerten bzw. Gelees für die topische Verabreichung formuliert werden.

Die molekularen Strukturen der erfindungsgemäßen Verbindungen wurden ermittelt unter Zugrundelegung eines Studiums ihrer chromatographischen Eigenschaften, bestimmt durch Dünnschicht-Chromatographie (TLC)-Analyse^ihrer Kernresonanz (NMR)- und Massenspektren >durch Abbau zu bekannten Verbindungen,durch Vergleich der Produkte, hergestellt durch Fermentation mit der Mutante M. purpurea ATCC j51 119 unter Verwendung von Amlnocyclitolen der Formeln II, Ha oder Hb als Substrate mit Produkten, hergestellt durch Fermentation mit der Mutante M. purpurea ATCC 51 164, unter Verwendung von Cyclitolen der Formeln IHa oder IHb und durch die Übereinstimmung zwischen berechneten und gefundenen Werten für die Elementaranalyse der einzelnen.Elemente.

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Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung der Verbindungen und die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Herstellung neuer Zwischenprodukte Herstellung 1

0,40 Mol dl-Viboquercitol [dl-l,2,3,**5-Cyclohexanpentol^(1,2,4-cis)] [McCasland et al, J.Am. Chem. Soc. 7£, 4020 (1953)] wurden einer mikrobiologischen Oxydation durch Acetobacter suboxydans unter Verwendung des von Posternak, HeIv. Chim. Acta ^, 1594-I596 (I950) beschriebenen Verfahrens unterworfen. Zu der erhaltenen Brühe wurden 5 g Bleiacetat in 60 ml Wasser zugegeben, die Lösung wurde durch eine Filterhilfe filtriert und das Piltrat wurde über I80 g eines Ionenaustauscherharzes (Dowex 50-124) geleitet. Das erhaltene Eluat wurde auf ein Volumen von ca. I50 ml konzentriert, mit einem gleichen Volumen an Äthanol verdünnt und abgekühlt. Das sich abscheidende Material wurde unter Erzielung von 15,1 g dl-Deoxyinosose[dl-2,3,4,5-Tetrahydroxy-l-cyclohexanon(2,4-cis)] mit einem Fp. von 221-222⁰C gesammelt. Eine weitere Konzentrierung des Filtrats des ersten Anteils ergab drei weitere Anteile von insgesamt 28,7 g mit einem Fp. von 220-221⁰C.

Herstellung 2

Man erwärmte eine Lösung von 4,5 g (0,031 Mol) 2,5-Dideoxystreptamin in 20 ml Benzaldehyd auf einem Dampfbad, spülte die Mischung mit Stickstoff und stellte ca. 8 Stunden zur Seite. Die Lösung wurde dann mit I50 ml Benzol verdünnt, gekühlt, und der sich abscheidende Feststoff wurde gesammelt und unter Erzielung von 8,5 g Rohprodukt, das aus Acetonitril unter Erzielung von 4,23 g 4,6-Bis-(benzylidenamino)-l,3-cyclohexandiol{i,3-cis) mit einem Fp. von 151-154⁰C kristallisierte, getrocknet.

Herstellung 3

Man reduzierte eine Lösung von 9,5 g (0,053 Mol) dl-Epi-inosose [Posternak, HeIv. Chim. Acta 1£, 1333 (1936)] in 300 ml 0,1-N-Salzsäure mit Wasserstoff über 6 g Platinoxid bei einem anfäng-

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lichen Wasserst off druck von ca. 3,94 at (5β psi)·* Das Produkt wurde durch Filtration der Reaktionsmischung,. Konzentrierung des Piltrats zur Trockne und Umkristallisation des Rückstandes aus wässrigem Methanol isoliert. Es wurde auf diese Weise dl-Epiquercitol mit einem Fp. von 214-215°C erhalten.

Die letztere Verbindung wurde einer mikrobiologischen Oxydation durch Acetobacter suboxydans unter Verwendung des vorstehend in Herstellung 1 genannten Verfahrens von Posternak unterworfen, und das Produkt wurde wie in Herstellung 1 beschrieben isoliert und unter Erzielung von dl-2,3,4,6-Tetrahydroxy-1-cyclohexanol2,4,6-cis) mit einem Fp. von 175-177°C aus Äthanol umkristallisiert.

Herstellung 4

Man fügte zu einer Lösung von 22,5 g (0,11 Mol) 3-Chlorperbenzoesäure in 150 ml Methylen-diChlorid 11,4 g (0,1 Mol) 4-CyclohexenloO,2ß-diol [McCasland et al, J. Org. Chem. 28., 898 (1963)] und rührte die erhaltene Lösung unter Kühlen, wobei man die Temperatur unterhalb 30⁰C hielt. Die Mischung wurde eine Stunde gerührt, mit I50 ml Diäthylather verdünnt, weitere 3 Stunden gerührt und dann mit I50 ml Wasser verdünnt. Das Produkt wurde aus der organischen Schicht in üblicher Weise unter Erzielung von 9*1 gRohprodukt isoliert, das aus Äthanol/Äther unter Erzielung von zwei Anteilen von insgesamt 4,75 g 4,5-Epoxycyclohexan-l^,2i3-diol mit einem Fp. von 80⁰C und 70-75°C umkristallisiert wurde.

Man behandelte eine Lösung von 6,63 g (0,051 Mol) der letztgenannten Verbindung in 20 ml Dimethylsulfoxid mit 9,06 ml Bortrifluoridätherat. Die erhaltene Lösung wurde auf einem Dampfbad ca. 20 Minuten erhitzt, und man fügte weitere 0,03 ml Bortrifluorid-ätherat hinzu und entfernte das Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wurde mit 50 ml Äthanol behandelt und der erhaltene Feststoff abgetrennt und das Filtrat unter Erzielung von 7,75 g eines rötlichbraunen Öls zur Trockne eingedampft, von dem 1,1 g auf Siliciumdioxidgel-Platten Chromatograph!ert wurden, wobei man mit Tetrahydrofuran unter Erzielung von 550 mg 2,4,5-Trihydroxycyclohexanon (2,4-cis) eluierte, dessen Massenspektrum Maxima, bei 144 und 145 und dessen Infrarotspektrum ein starkes Maximum bei I723 cm zeigte.

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Herstellung ^

Man suspendierte 47 g (0,21 Mol) 2-Deoxy-l,6:3,4-dicarbonylstreptamin [Umezawa et al, Bull. Chem. Soc. (Jap.) 44, 1411-1415 (1971)] in 500 ml Pyridin und behandelte die gerührte Suspension mit 45 ml Methansulfonylchlorid. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung mit ca. 3 1 Methanol verdünnt und das Produkt filtriert und unter Erzielung von 39 g 2-Deoxy-5-methan-sulfonyl-l,6:3,4-dicarbonylstraptamin mit einem Pp. von 264-266°C getrocknet.

Man erhitzte eine Mischung von 2 g (0,00β9 Mol) 2-Deoxy~5-methansulfonyl-l,6:3,4-dicarbonylstreptamin, wie vorstehend beschrieben, und 4,8 g (0,0^2 Mol) Natriumiodid in 70 ml Dimethylformamid während 24 Stunden bei 125°C und brachte dann zur Trockne. Das rohe 2,5-Dideoxy-5-jod-l,6:3,4-dicarbonylstre.ptamin wurde mit 30 ml 6N-Salzsäure gemischt, die Mischung zweieinhalb Stunden am Rückfluß gekocht, anschließend abgekühlt und dann zur Trockne im Vakuum eingedampft. Das rohe 2,5-Dideoxy-5-jodstreptamin-dihydrochlorid wurde in 30 ml Essigsäure-anhydrid gelöst, die Lösung mit 5>25 g Natriumacetat behandelt und die Mischung zweieinhalb Stunden am Rückfluß gekocht. Die Mischung wurde dann abgekühlt, in 200 ml Wasser gegossen und mit Chloroform extrahiert. Die Chloroform-Extrakte ergaben beim Waschen - einmal mit einer Natriumthiosulfat-Lösung, einmal mit einer Salzlösung, einmal mit Wasser und Eindampfen zur Trockne ein öl, das aus Äthanol unter Erzielung von zwei Anteilen von insgesamt 1,1 g N,N¹-Diacetyl-2,5-dideoxy-5-jodstreptamin mit einem Pp. von 256-258⁰C kristallisierte. Die Hydrolyse der letztgenannten Verbindung durch Rückfluß-Kochen mit wässriger Salzsäure und die Isolierung aus einem basischen Medium ergab 2,5-Dideoxy-5-jodstreptamin.

Herstellung 6

Man suspendierte 39 ß (0,12 Mol) des in Herstellung 5 beschriebenen 2-Deoxy-5-methansulfonyl-l,6:3,4-dicarbonylstreptamins in ca. 200 ml 6N-Salzsäure, erwärmte die Mischung 2 Stunden auf dem Dampfbad, dampfte im Vakuum zur Trockne ein, mischte mit 200 ml Isopropylalkohol und dampfte erneut zur Trockne ein. Das verbliebene Öl wurde mit Methanol behandelt, abgekühlt und der Peststoff gesammelt und aus Methanol unter Erzielung von 2-Deoxy-5-

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methansulfonylstreptamin-dihydrochlorid mit einem Fp. von 208-210⁰C umkristallisiert.

Analyse	C	26	C7H16N2	CvS 5	•	2HCl	N	8	,94
ber.:	C	26	,84	H	5	,79	N	9	,17.
gef.:		,77	H	5	,76

Man kühlte eine Lösung von 28,7 g (0,09 Mol) 2-Deoxy-5-methansulfonylstreptamin in 45 ml Wasser und 90 ml 2N-Natriumhydroxid in einem Eisbad und behandelte tropfenweise unter Rühren mit einer Lösung von 45 ml Benzyl-chlorformiat in 80 ml Toluol, die über einen Tropftrichter zugegeben wurde, und mit I6o ml 2N-Natriumhydroxid, das aus einem anderen Tropftrichter zugegeben wurde. Nach Beendigung der Zugabe wurde die Mischung weitere 15 Minuten gerührt, mit ca. 50 ml Toluol verdünnt, J> Stunden gerührt und abfiltriert. Die Umkristallisation des Feststoffs aus Äthanol ergab 4,0 g N,N'-Dicarbobenzoxy-2-deoxy-5-methansulfonylstreptamin mit einem Fp. von l98-201°C.

Analyse	ber.:	C	C	;23H28N2	O9S	H	5	,55	N	5,51
	gef.:	C	54,32	H	UI	,61	N	5,60
	54,75

Die Reaktion der letztgenannten Verbindung mit Kaliumfluorid in Benzol oder Acetonitril enthaltend einen Kronenäther (crown ether), z.B. l^^ilOil^jlö-Hexaoxacyclooctadecan, unter Verwendung des von Liotta et al, J. Am. Chem. Soc. C)6, 2250-2252 (1974) beschriebenen Verfahrens ergab N,N¹ -Dicarbobenzoxy^^-dideoxy-S-fluorstreptamin, das bei der Hydrolyse mit wässriger Mineralsäure bzw. wässriger anorganischer Säure 2,5-Dideoxy-5-fluorstreptamin ergab.

Herstellung 7

Man fügte zu einer Lösung von 11,2 g (0,1 Mol) 1,4-Cyclohexadiencis-diepoxid in 250 ml 2-Methoxyäthanol 23 g (0,5 Mol) N-Methylhydrazin und rührte die Lösung unter Rückfluß 21 Stunden. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum unter Erzielung eines weißen Feststoffes entfernt, der aus Äthanol unter Erzielung von 12,0 g

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6-Methyl-6,7-diazabicyclo[3,2,l]oGtan-2_J4-diol-(exo,exo) mit einem Pp. von 162-177°C umkristallisiert wurde.

Analyse	C7H14N	2°2	,15	H	8	,92	N	17	,71
ber.:	C	53	,36	H	9	,13	N	17	,76.
gef.:	C	53

3,9 g (0,025 Mol) der letztgenannten Verbindung wurden in einer Lösung von 40 ml 2-N-Salzsäure und 10 ml Wasser gelöst und über 0,2 g Platinoxid in einem Parr-Hydriergefäß bei Raumtemperatur und unter einem Druck von ca. 3,52 at (50 psi) reduziert. Nach Beendigung der Reduktion wurde der Karalysator durch Filtration entfernt, das Piltrat wurde im Vakuum zur Trockne gebracht und der Rückstand bestehend aus einer gelbbraunen harzartigen Masse wurde mit Äthylacetat unter Erzielung von 5,3 g eines Materials behandelt, das aus Methanol/Äther unter Erzielung von 4,0 g N-Methyl-2,5-dideoxystreptamin-dihydrochlorid mit einem Pp. von 238-243^oC umkristallisiert wurde.

Analyse	C7H16N2O2	•2HC1	H	7	,78	N	12	,02	Cl	30	,41
ber	.: C 36	,06	H	7	,79	N	11	,96	Cl	30	,37
gef	.: C 35	,96
	Herstellung 8

Unter Verwendung eines Verfahrens analog dem in Herstellung 7 beschriebenen Verfahren wurden 16,7 g (0,15 Mol) 1,4-Cyclohexadieneis-diepoxid mit 44,6 g (0,77 Mol) Äthylhydrazin in 370 ml 2-Methoxyäthanol unter Erzielung von 18,8 g 6-Äthyl-6,7-diazabicyclOi-[3,2,l]octan-2,4-diol-(exo, exo)-hydrochlorid mit einem Fp. von 17O-172°C umgesetzt.

Analyse CgH₁₆N₂O₂

ber.: C 46,04 H 8,21 Cl 16,98 gef.: C 45,38 H 8,37 Cl 16,70.

Die letztgenannte Verbindung wurde mit Wasserstoff in einer Lösung von I50 ml 2N-Salzsäure und 150 ml Äthanol über 1,7 g Platinoxid

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reduziert. Es wurden 17,5 g N-Äthyl^^-dideoxystreptamin-dihydro· Chlorid mit einem Fp. von 304-306°C erhalten.

Analyse	ber.:	CgH18N2O2*2HCl	H	8	,16	Cl	28	,69
	gef.:	C 38,88	H	8	,27	Cl	28	,68
		C 38,65
	Mutationsverfahren

Bei den folgenden Verfahren wurden verschiedene Medien, die wie folgt zusammengesetzt waren, verwendet.

Medium 1:	-	Medium 2:	N-Z-Amin	10
			20
	Glucose	5
	Lösliche Stärke	5
	Hefeextrakt	1
	N-Z-Amin Typ A (Difco)	15
CaCO,	:illiert
Agar
keimbildungsmedium (in des1

Rindfleischextrakt 0,3 %

Trypton 0,5 %

Dextrose 0,1 %

Lösliche Stärke 2,4 %

Hefextrakt 0,5 %

CaCO, 0,4 %

Medium 3:	Sojabohnen-Glucose	g/1
	Sojabohnenmehl	30
	Dextrose (Cerelose)	40
	CaCO,	1
Medium 4:	TGE	B/l
	Trypticase-glucose-Extrakt	5,0
	Trypticase-pepton Glucose	3,0 1,0
	Agar	15,0

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Medium 5ί Produktionsmedium	0,3 %
Rindfleischextrakt	0,5 %
Hefeextrakt	0,5 %
S ο j abohnenmehl	0,1 %
Maltose	2,4 %
Stärke	0,1 %
Casaminosäure	0,4 %
CaCO,	1 mg/1
COCl2-6H2O	BÜ.
Medium 6: Streptomicin-Versuchsagar	1,5
Rindfleischextrakt	3,0
Hefeextrakt	6,0
Pepton

Agar 15,0

Der Organismus Micromonospora purpurea wurde von dem United States Department of Agriculture unter der Bezeichnung NRRL 2953 erhalten und auf N-Z-Amin-Schrägen (Medium 1) belassen.

Es wurden Eintauchfermentationen in Flaschen, die das Keimbildungsmedium 2 enthielten, während 4 Tagen bei 37°C auf einem Rotationsschüttler durchgeführt. Aus den Erträgen dieser ersten Stufe wurde ein 10 #-iger Impfstoff'in das Keimbildungsmedium (Medium 2) übergeführt und die Fermentation wurde -wie-vorstehend-—-, 7 Tage bei 28°C fortgesetzt.

Um die Befähigung des Organismus zur Biosynthese von Gentamicin in Abwesenheit von zugefügtem Deoxystreptamin zu ermitteln, wurde eine dritte Fermentationsstufe unter Verwendung eines 5 #-igen Impfstoffes in einem 10 Liter-Fermentationsgefäß in einem Sojabohnenglucose-Medium (3) bei 28⁰C unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 200 Umdr./Min. und Zufuhr von 2 l/Min, an gefilterter Luft durchgeführt. Nach 6 Tagen wurde der Gefäßinhalt mit 6N-Schwefelsäure auf einen pH von 2,0 angesäuert, filtriert und ein Anteil von 500 ml wurde mit Ammoniumhydroxid neutralisiert und durch ein-IRC-50 Ionenaustauscherharz (Na⁺- Form) geleitet. Die Säule wurd¥~dann mit Wasser gespült und mit 2N-Schwefelsäure eluiert. Nach dem in der U.S. Patentschrift

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3 09I 572 beschriebenen Verfahren wurde eine 300 mg-Probe an rohem Gentamicin isoliert, das sich als biologisch aktiv erwies und drei Komponenten entsprechend Gentamicin C^, Cp und C^ aufgrund der dünnschicht-chromatographischen Untersuchung enthielt.

Um den Organismus zu mutieren, wurden Kulturbrühen in Medium 2 (37⁰C während 3 Tagen) kultiviert und die erhaltenen Zellen durch Zentrifugation gewonnen, gewaschen und erneut in gepuffertem Salz suspendiert. Diese Suspension wurde mit dem Mutanten bildenden Mittel (mutagenic agent) N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin behandelt. Proben der Mutanten bildenden Kultur wurden in Medium 4 bei 37⁰C plattenförmig aufgebracht, bis Kolonien sichtbar wurden (gewöhnlich ca. 1 Woche). Die Kolonien wurden in doppelte Platten (Medium 4) aufgeteilt, wobei man auf einen Satz derselben eine Sporensuspension von B. subtilis aufbracht. Nach Inkubation bei 37°C während 18 - 20 Stunden wurden die "Bruchstücke", die keine Zone der Inhibition auf der B.subtilis-Platte zeigten, von der Stammplatte (kein B. subtilis) zu Medium !-Schrägen übergeführt und inkubiert, bis volles Wachstum ersichtlich war.

Diese potentiell nicht-produktiven Mutanten wurden dann mit Deoxystreptamin in einem Versuch zur Stimulierung der antibiotischen BixJSyntireHe^wi^^fölgi geprüft. Stammkulturen der potentiellen Mutanten wurden als Strichkultur in Form von Banden auf die Oberfläche der Medium 4-Platten aufgebracht und bei 37°C inkubiert, bis das Wachstum sichtbar wurde (ca. 3-4 Tage). Es wurden dann Pilterpapierscheiben in eine Lösung von Deoxystreptamin (500 mcg/ml) eingetaucht und auf eine Strichkultur aufgebracht. Nach Inkubation während 24 Stunden wurde die Oberfläche der Platte mit B. subtilis unter Verwendung der Überschichtungstechnik (overlay technique) geimpft, und die Inkubation wurde weitere 18 - 20 Stunden fortgesetzt. Isolationen, die-die Inhibierung um die Scheibe herum zeigten, wur4err"als Deoxystreptamin-Mutanten bezeichnet.. Eine derartige Mutante, die als Mutante VIB gekennzeichnet und iei^jäer American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockvllle, Md. 20852 als Micromonospora purpurea ATCC 31 119 hinterlegt wurde, wurde für

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die Bildung von Antibiotika des Gentamicin-Typs wie nachfolgend beschrieben verwendet.

Der letztgenannte Organismus seinerseits, der dem gleichen Mutati ons verfahr en wie vorstehend beschrieben unterworfen worden war, und Proben der Mutanten bildenden Kultur wurden in Medium 4 bei · 37°C plattenförmig aufgebracht, bis Kolonien sichtbar wurden (gewöhnlich ca. 1 Woche). Es wurden Kolonien in doppelte Platten, die Streptomicin-Versuchsagar (Medium 6) enthielten, aufgeteilt.

Ein Satz diente als Stammplatte für die spätere Gewinnung, während der zweite Satz 25 lig/ml S tr ept amins ulf at und eine überschichtete Sporensuspension von B. subtilis als Testorganismus enthielt. Diese Platten wurden 24 Stunden bei 37°C inkubiert und vier Inhibitionszonen untersucht. Diejenigen, die die größten Zonen zeigten, wurden von der Stamiriplatte auf N-Z-Amin-Schrägen (Medium 1) übergeführt und eine Woche bei 37°C inkubiert.

Diejenigen Mutanten, die niedrige Gehalte an Streptaminsulfat einbauten, wurden dann mit Streptamin und Scyllo-inosose bei einer Konzentration von 500 /ig/ml als Base klassiert. Stammkulturen wurden in Flaschen, die Medium 2 sowie die vorstehenden Zwischenstufen enthielten, übergeführt und bei 37°C auf einem Rotationsschüttler 7 Tage inkubiert. Die Flaschen wurden periodisch hinsichtlich ihrer antibiotischen Aktivität nach der Versuchsmethode der Scheibendiffusion unter Verwendung von B. subtilis als TestOrganismus untersucht. Die Isolate, die Inhibitionszonen um die Scheibe herum aufwiesen, wurden als Streptamin- oder Scyllo-inosose-Mutanten bezeichnet. Eine derartige Mutante, als Mutante VIB-3P bezeichnet und bei der American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20851 als Micromonospora purpurea ATCC"Jl 164 hinterlegt, wurde für die Bildung der Aminocyclitol-Antibiotika vom Typ des Streptamin, Deoxystreptamin und Dideoxystreptamin wie nachstehend beschrieben verwendet.

Biosynthese mit M. purpurea ATCC 31 119 Beispiel 1

Der Mutantenorganismus wurde auf N-Z-Amin-Agar-Schrägen (Medium 1)

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belassen, von denen Übertragungen in Flaschen, die 500 ml Keimbildungsmedium 2 enthielten, vorgenommen wurden. Die Flaschen wurden bei 28⁰C 4 Tage auf einem Rotationsschüttler (2-rSekunden-Takt) bei 225 Umdr./Min. inkubiert.

Man überführte einen 10 #-igen (VoI.AoI.) Impfstoff von der Keimbildungsstufe aseptisch in 14 1-Fermentationsgefäße, die 9 1 steriles Keimbildungsmedium 2 enthielten. Diese wurden bei 450 Umdr./Min. bei 28 - 29⁰C gerührt und es wurden 5 1 pro Minute an gefilterter Luft zugeführt. Zum Zeitpunkt des Impfens wurden 200 mg/1 Streptaminsulfat in Form einer Suspension in sterilem destillierten Wasser zugegeben. Die Fermentation wurde 8 Tage fortgesetzt.

Alle 24 Stunden wurden 10 1 Impfstoff, der wie vorstehend aseptisch hergestellt worden war, in Γ20 1-Fermentationsgefäße übergeführt, die 70 1 steriles keimbildungsmedium 2 enthielten, und es wurden 0,31 g/l Streptaminsulfat, suspendiert in sterilem destilliertem Wasser,zugegeben. Es wurde 7 Tage bei 29°C eine aerobe Fermentation durchgeführt.

Die Fermentationen wurden durch Zugabe von ΙΟΝ-Schwefelsäure bis auf einen pH von 2,0 und Filtration unter Verwendung einer Filterhilfe zur Entfernung von Mycelien beendet. Die filtrierte Brühe wurde auf pH 7,0 eingestellt, und es wurden 1,56 g Oxalsäure je Gramm Calciumcarbonat, das in dem Medium vorlag, zur Entfernung des Calciums zugegeben. Dieses ließ man über Nacht stehen und die geklärte Brühe wurde dekantiert und über Bio-Rex 70 (schwaches Kationanaustauscher)-Harz in der Natrium⁺-Form unter Verwendung __ von ca. 14 g Harz je Liter Brühe geleitet. Die Säule wurde dann mit destilliertem Wasser gewaschen und mit 2N-Schwefelsäure eluiert. Sämtliche Fraktionen, die eine"ahtlbiotTscfie-Aktlvität zeigten, wurden vereinigt, neutralisiert und unter Vakuum unterhalb 50 C bis zu dem Punkt konzentriert, an dem die Salzkristallisation sichtbar wurde (ca. 1/J> des Volumens). Der pH wurde dann auf 10,5 eingestellt, und es wurden vier Volumina Aceton zur Ausfällung anorganischer Bestandteile, die dann durch Filtration entfernt wurden, zugegeben. Das Filtrat wurde mit 6N-Schwefelsäure auf einen pH von 5,0 eingestellt und unter Vakuum auf annähernd 1/20 des ursprünglichen Volumens konzentriert und abge-

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kühlt. Man sammelte durch Filtration eine weiße kristalline Fraktion, die über 300⁰C schmolz und die sich aufgrund ihrer dünnschicht-chromatographischen Eigenschaften und ihres Infrarotspektrums als identisch mit Streptaminsulfat erwies. Aus zwei 10 1-Fermentationen, die wie vorstehend durchgeführt wurden, wurden insgesamt 0,7 g Streptaminsulfat erhalten, und aus zwei 80 1-Fermentationen wurden bei dieser Stufe insgesamt 21 g Streptaminsulfat gewonnen.

Das Filtrat wurde weiter konzentriert, und es wurden 10 Volumina Methanol hinzugegeben, wobei der erste rohe antibiotische Feststoff erhalten wurde. Aus zwei 10 1-Fermentationen wurden 7 g und aus zwei 80 1-Fermentationen 24 g erhalten.

Zur Identifizierung der antibiotischen Komponenten während der Reinigungsverfahren wurden Werte für die chromatographische Mobilität, die bei der Papierchromatographie und bei der Dünnschichtchromatographie erhalten wurden, für die Gentamicine C\, Cp und Ca und für jede der entsprechenden Aminocyclitol-Analogen, die wie vorstehend hergestellt wurden, bestimmt, wobei die chromatographische Mobilität (nachfolgend als C.M. bezeichnet) ausgedrückt wird durch:

_c μ = Abstand der Komponente vom Ausgangs-punkt— ,_

* " Abstand des Gentamicins C₁ vom Ausgangspunkt.

Die verwendeten Chromatograph!schen Systeme waren die folgenden:

System 1 - Whatman No. 1 Papier, das mit O,95M Sulfat-Bisulfat gesättigt war und in absteigender Weise in 80 #-igera wässrigem Äthanol + 1,5 % NaCl und anschließend bioautographisch unter Verwendung von B. subtilis als Testorganismus entwickelt wurde;

System 2 - Siliciumdioxidgel F 254 Platte, die in einer niedrigen Phase von Chloroform(l):Methanol(l)konzentriertem (28#)Arnmoniumhydroxid-(l) entwickelt wurde. Die Komponenten wurden mit einem Ninhydrin-Spray unter Erhitzen lokalisiert.

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Die C.M.-Werte des überwiegenden Anteils der antibiotischen Komponenten der Erfindung sind im Vergleich zu einem Vergleichs-Gent amicinkomplex sämtlich in bezug auf Gentamicin C^ in Tabelle I angegeben, in der unter den mit Komponente 1, Komponente 2 bzw. Komponente J5 bezeichneten Verbindungen die folgenden Verbindungen zu verstehen sind:

O-^-Deoxy^-C-methyl-^-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-il+ö)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2,5,4,6-tetradeoxy-o6-D-erythro-glueopyranosyl-(l*4)]-D-streptamin;

O-^-Deoxy^-C-methyl-^-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3*^»6-tetradeoxy-0<; -D-erythrogluco ~pyranosyl-(l-*4) ]-D-streptamin; und

O-^-Deoxy-^-C-methyl-^-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-il-fcö)-0-[2,6-diamino-2,5,^,6-tetradeoxy-oa -D-erythro-glucopyranosyl-] -D-streptamin.

	Tabelle I	System 1	CM. System 2
	-■—_——-- CJ.	1	1
Gentamicin	Cl	0,89	0,83
Gentamicin	C2	0,50	0,67
Gentamicin	Cla	0,96	0,92
Komponente	1 (bedeutender)	0,76	0,75
Komponente	2 (weniger be deutend)	0,50	0,61.
Komponente	2 (weniger be deutend)

Aus 10 1-Permentationsgefäßen wurden 7 g roher Peststoff,, der eine antibakterielle Aktivität zeigte, in 200 ml Methanol und 10 ml konzentriertem (28 %) Ammoniumhydroxid suspendiert, und die Mischung wurde ^O Minuten gerührt und filtriert. Dieser Vorgang wurde .weitere zwei Male wiederholt und die Filtrate wurden vereinigt und unter Vakuum unter Erzielung eines blaßgelben Öls mit einem Gewicht von 0,9 g konzentriert. Die "erschöpften

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Salze" ("spent saltsi) waren im wesentlichen frei von antibiotischer Aktivität.

Die ölige Base wurde mit 4 g Siliciumdioxidgel (Davison Grad 923, Korngröße 0,147 - 0,044 mm [100 - 200 mesh]) gemischt und auf eine Siliciumdioxidsäule von 1,8 χ 28 cm gegeben. Die Säule wurde als Aufschlämmung unter Verwendung einer niedrigeren Phase von Isopropylalkohol(l):Chloroform(2):17 #-iges wässriges Ammoniumhydroxid(l) hergestellt. Die Säule wurde mit diesem Lösungsmittel entwickelt, und es wurden 50 ml-Fraktionen gesammelt.

Die Fraktionen 8 und 9 enthielten eine einzige ninhydrin-positive Komponente, die/in form eines blaßgelben Öls beim Entfernen des Lösungsmittels ergab. Das Massenspektrum dieses Materials, das als Komponente 1 bezeichnet wurde, zeigte ein Molekülion und bedeutendere Fragmente mit jeweils 16 Masseneinheiten (d.h. ein Sauerstoffatom), die größer waren als diejenigen von Gentamicin Oa erhaltenen, wie aus dem folgenden hervorgeht:

Bezugs-Gentamicin C₁: M⁺ 477, 420, 360, 350, 347, 322, 3I9, 304 Komponente 1: M⁺ 493, 436, 376, 366, 363, 338, 335, 320.

Dieses Material wurde in sein Sulfatsalz durch Auflösen in Äthanol und Zugabe von wenigen Tropfen Äthanol enthaltender Schwefelsäure übergeführt. Der erhaltene weiße Feststoff wurde gesammelt und unter Erzielung von 22 mg an Komponente Iy 0~3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l+6)-0-[2-amino-6-methyl-aminoö-C-methyl^^^ö-tetradeoxy-oo-D-erythroglucopyranosyl-tl·^) ]-D-streptamin in Form der di-Base*Heptasulfat*Decahydrat^mit einem Fp. von >300°C getrocknet.

Analyse (^C2l^H43^N5°8^2 ^#7H2^S04 *^10H2°

C	27	,22	H	6	,53	N	7	,55	S	12	,09
C	27	,15	H	6	,67	N	7	,79	S	12	,76.

ber.:
gef.:

Die Fraktionen 10 - 13 ergaben eine polarere Ninhydrinkomponente, die als 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l*6)-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-0^<>-D-erythroglucopyranosyl-(l->4) ]-D-streptamin, Komponente 2, die eine

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antibiotische Aktivität zeigte, bestimmt wurde.

Die Fraktionen 15 - 26 ergaben eine dritte polarere Komponente, die eine antibiotische Aktivität zeigte. Das Massenspektrum dieser Komponente zeigte charakteristische Zucker-Maxima, die Gentamicin C₁ bei 129 (Purpurosamin) und I6o (Garosamin) entsprachen und wurde O-^-Deoxy^-C-methyl-J-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l*6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tetradeoxy-o</-D-erythro-glueopyranosyl-(l*4)]-D-streptamin zugeordnet.

Alternativ wurde die neue Komponente 1 wie folgt isoliert: Man löste 0,9 g einer Mischung roher antibiotischer Base, die wie vorstehend erhalten wurde, in 7 ml Wasser und stellte den pH mit IN-Schwefelsäure auf 4,5 ein. Man leitete das Lösungsmittel über ein starkes Anionenaustauscherharz (IM 401) in der OH~*-Form (Maße des Bettes: 0,7 x 10 cm). Die Säule wurde mit Wasser eluiert und das Eluat im Vakuum bei 35°C eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde mit 50 ml der niedrigeren Phase eines Lösungsmittels aus 17 % wässrigem Ammoniumhydroxid:Isopropanol- :Chloroform(1:1:2) behandelte. Das Lösungsmittel wurde dekantiert und unter Vakuum unter Hinterlassen eines öligen Rückstandes mit· einem Gewicht von 140 mg konzentriert. Das Massenspektrum dieses Materials entspricht demjenigen der vorstehenden Fraktionen 8 und 9, d.h. M⁺ 493, 436, 376, 366, 363, 338, 335, 320.

Das Kernresonanzspektrum für die Komponente 1 stimmte ebenfalls mit der vorgeschlagenen Struktur entsprechend O^-Deoxy^-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l-*6)-0-[2-ramino-6-methylamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-o<S -D-erythro-glucopyranosyl-(l*4) ]-D-streptamin überein und ist in Tabelle II angegeben.

	5	,60	Tabelle II	Zuordnung
			Integration	isomere OCHO-Gruppen
5,87,		3,15	2	austauschbares H
5,22	,8		12	MCH3 χ 2
3,09,	,6		6	-CHO χ 6, -CHN χ 5, -CH2O
2,9-4			13	-CH2CH2-
1,9-2		4	CH3C-, CH3CH-
1,72		6

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Alternativ löst man 4 g einer Probe an rohem antibiotischem Salz in 50 ml Wasser und leitet es über ein Anionenaustauscherharz AGlx8 (Harzbett 1 χ 27 cm). Das Antibiotikum wurde mit Wasser eluiert und sämtliche Fraktionen wurden vereinigt und unter Vakuum eingedampft. Man führte ein weiteres Entsalzen des Rückstandes durch Extraktion mit methanolischem Natriumhydroxid durch. Die freigesetzte Base wurde mit 7 g Siliciumdioxidgel gemischt und auf eine Säule von 50 g Siliciumdioxidgel gegeben. Die Säule wurde mit Chloroform:Methanol!konzentriertem (28 %) Ammoniumhydroxid (3:4:2) entwickelt, und es wurden 25 ml-Fraktionen gesammelt. Die ersten Fraktionen ergaben die neue weniger polare Komponente 1, die jedoch mit verschiedenen weniger polaren Verunreinigungen, wie es aus der Dünnschicht-Chromatographie hervorging, vermischt waren. Diese Fraktionen wurden vereint und das Konzentrat auf eine Säule von 50 g Siliciumdioxidgel wie vorstehend gegeben. Diese Säule wurde mit Chloroform!Methanol:konz.(28^)-Ammoniumhydroxid (5:3:1) entwickelt, und es wurden 25 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen 6-12 enthielten die gewünschte Komponente, die frei war von offensichtlichen Verunreinigungen. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde das erhaltene öl in das Sulfat salz in äthanolischer Schwefelsäure wie vorstehend beschrieben unter Erzielung von 0,124 g an Komponente 1 in Form des di-Base Heptasulfat · Decahydrat mit einem Fp. von > 300⁰C wie vorstehend beschrieben übergeführt.

Indem man ein geeignetes Aminocyclitol mit der Mutante Micromonospora purpurea ATCC 31 119 in dem Keimbildungsmedium 2 kultivierte und die Produkte wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben isolierte, wurden die folgenden Verbindungen der Formel I in analoger Weise hergestellt:

Beispiel 2

0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1+6)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-methy1-2,3,4,6-tetradeoxy-OL-D-erythro-glucopyranosyl-(l*4)]-epistreptamin (CM. in Bezug auf Gentamicin C₁: System 1 = 0,59, System 2 = 0,63); 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1^6)-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3i4,6-tetradeoxy-o(/-D-erythro-glucopyranosyl-(l->4) ]-epistreptamin, erhalten unter Verwendung von Epistreptamin an-

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stelle von Streptamin in dem Fermentationsverfahren. Beispiel 3

0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L--arabinopyranosyl-(l-v6)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2,3i^*6-tetradeoxy-₍?c-D-erythro-glucopyranosyl-(l-»4) ]-2,5-dideoxystreptamin (CM. in Bezug auf Gentamicin C^: System 1 = 0,95* System 2 = 0,98); O-jJ-Deoxy-^-C-methyl-^-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-Cl-^o)-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,^,4,6-tetradeoxy-(X;-D-erythro-glucopyranosyl-(l-*4) ]-2,5-dideoxystreptamin (CM. in Bezug auf Gentamicin C₁: System 1 - 0,66, System 2 = 0,73); und 0-j5-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2,6-diamino-2,3*4,6-tetradeoxy-oC'-D-erythro-glucopyranosyl-(l+4) ]-2,5-dideoxystreptamin, erhalten unter Verwendung von Dideoxystreptamin anstelle von Streptamin bei dem Fermentationsverfahren.

Das gleiche O-^-Deoxy^-C-methyl-^-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxyot-D-erythro-glucopyranosyl-(l->4) ]-2,5-dideoxystreptamin und O-J-Deoxy^-C-methyl-^-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-i l->6) 0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-oO-D-erythroglucopyranosyl-(l->4) ]-2,5-dideoxy streptamin, wie vorstehend beschrieben, wurde mit den gleichen CM^-Werten wie vorstehend beschrieben unter Verwendung von 6,7-Diazabicyclo[3,2,l]octan-2,4-diol (exo,exo) anstelle von Streptamin bei dem Fermentationsverfahren erhalten.

Beispiel 4

0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l*6)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2,3,4,6~tetradeoxy-oC-D-erythro-glucopyranosyl-(l44)]-5-jodo-2,5-dideoxystreptamin; 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1+6)-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-<% -D-erythro-glucopyranosyl-(l->4) ]-5-jodo-2,5-dideoxy streptamin; und 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tetradeoxy-o6-D-erythro-glucopyranosyl-(l-»4) ]-5-jodo-2,5-dideoxystreptamin, erhalten unter Verwendung von

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5-Jodo-2,5-dideoxystreptamin anstelle von Streptamin beim Fer mentationsverfahren.

Beispiel ^

0-2-Deoxy-4-C-methy1-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2,3,ⁱti6-tetradeoxy-oC-D-erythro-glucopyranosyl-(l-*4) ]-5-fluoro-2,5-dideoxystreptamin; 0-3-Deoxy-4-C .methyl-j5-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-( 1*6) 0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-0(_i-D-erythro-glucopyranosyl-(l*4)]-5-fluoro-2,5-dideoxystreptamin; und 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1*6)-0-[2,6-diamino-2,j5>4,6-tetradeoxy-oo -D-erythro-glueopyranosyl-il-^) ]-5-fluoro-2,5-dideoxystreptatnin, erhalten unter Verwendung von 5-Fluoro-2,5-dideoxystreptamin anstelle von Streptamin beim Fermentationsverfahren.

Biosynthesen mit M. purpurea ATCC 31 164 A« Einbau von Cyolitolen Beispiel 6

Der Mutantenorganismus M. purpurea ATCC ^l 164 wurde auf N-Z-Amin-Agar-Schrägen (Medium 1) belassen und es wurde ein Ertrag in einer ersten Stufe erhalten, indem man 50 ml eines Keimbildungsmediums (Medium 2) mit einer Schleife der Schräge impfte und 4 Tage auf einem Rotationsschüttler bei 27-28°C inkubieren ließ. Ein 5 #-iger Impfstoff wurde dann auf 500 ml eines Keimbildungsmediums übergeführt und dieses wurde dann 3 Tage wie vorstehend inkubiert. Ein Liter des Ertrags der zweiten Stufe wurde dann verwendet, um 9 1 Produktionsmedium (Medium 5) in Gefäßen, die mit 400 Umdr./Min. gerührt und unter Zufuhr von 5 l/Min, gefilterter Luft gehalten wurden, bei 28-29 C während 48 Stunden zu impfen. Schließlich wurde das Wachstum aus dem Ertrag dieser dritten Stufe verwendet, um 70 1 Produktionsmedium, das 16 g Scyllo-inosose enthielt, zu impfen. Die Fermentation wurde 4 Tage lang unter Rühren mit 400 Umdr./Min. und unter Zufuhr von 0,0425 nr (1,5 cubic feet) je Minute an Luft bei 29-30⁰C durchgeführt.

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CIe Gefäßinhalte wurden mit ΙΟΝ-Schwefelsäure auf einen pH von 2,0 angesäuert und durch eine Filterhilfe filtriert, um Mycelien zu entfernen. Das Piltrat wurde auf einen pH von 6,0 eingestellt und über ein Kationenaustauscherharzbett (Bio-Rex 70, Nafcriumionen-Form, Korngröße 0,290 - O,8j53 mm [20-50 mesh]) von 80 χ cm geleitet. Das Eluat wurde in Bezug auf die antibiotische Aktivität mit Hilfe eines Bio-Versuchs untersucht und erwies sich als gegenüber B. subtilis inaktiv. Die Säule wurde dann mit 2N-Schwefelsäure eluiert, und es wurden 500 ml-Fraktionen gesammelt. Die Fraktionen wurden wie vorstehend gegenüber B. subtilis biο-untersucht und sämtliche Fraktionen, die eine antibiotische Aktivität zeigten, wurden vereint und unter Erzielung eines Endvolumens von 10 1 neutralisiert. Dieses wurde auf ca. 5 1 unter Vakuum konzentriert, der pH wurde mit lON-Nat'riumhydroxid auf 10,5 eingestellt, und es wurden 5 Volumina an Aceton unter kräftigem Rühren zugegeben. Die sich abscheidenden anorganischen Salze wurden durch Filtration entfernt, das Filtrat wurde im Vakuum nach Einstellung des pH mit verdünnter Schwefelsäure auf einen Wert von 7,0 konzentriert. Als das Volumen ca. 4 1 betrug, wurde der pH erneut auf 4,5 eingestellt, und die Probe wurde weiter auf 150 ml konzentriert. Der pH wurde dann auf 10,5 eingestellt, und es wurden 5 Volumina Aceton für eine zusätzliche Entsalzungsstufe wie vorstehend beschrieben zugegeben. Das Filtrat wurde konzentriert, auf einen pH von 4,5 eingestellt und weiter auf 10 ml konzentriert. Bei der Zugabe von 100 ml Methanol wurde ein roher antibiotischer Feststoff mit einem Gewicht von 9 g erhalten, der in 10 ml Wasser gelöst und fünfmal mit 50 ml-Anteilen der niedrigeren Phase eines Lösungsmittels, das sich aus Chloroform(2):Isopropanol(l):17 #-igem Ammoniumhydroxid(l) auf das Volumen bezogen zusammensetzte, extrahiert. Die Extrakte aus zwei dieser Ansätze wurden vereinigt und im Vakuum unter Erzielung eines öligen Rückstandes mit einem Gewicht von 300 mg konzentriert.

Die Probe wurde mit 5 g SIliciumdioxidgel (Korngröße von 0,074 0,147 mm [100-200 mesh]) gemischt und auf eine Säule von 100 g Siliciumdioxidgel (2,5 x 45 cm) gegeben und mit dem vorstehend beschriebenen Chloroform:Isopropanol:Ammoniumhydroxid-Lösungs-

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mittel entwickelt. Die Fraktionen wurden gesammelt, einerdünnchichtchromatographisehen Analyse unterwofen und die ausgewählten Fraktionen wurden vereinigt und im Vakuum unter Erzielung eines blaßgelben Öls mit einem Gewicht von 0,210 g in Form einer Base konzentriert. Diese wurde in das Sulfatsalz unter Erzielung von 0,288 g 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methyl-2,3i^i6-tetradeoxy-o& -D-erythro-glucopyranosyl-(l->4) ]-D-streptamin in Form des bis-Base-Pentasulfat-Tetrahydrats übergeführt.

Analyse C₂₃H₂^N₅Og-2 1/2 H₂SO₂^-2H₃O

ber.: C 52,55 H 6,76 N 9,04 S 10,35

gef.: C 32,49 H 6,91 N 9,36 S 9,75.

Die Identität des Produkts mit der Verbindung der gleichen Bezeichnung, in dem Beispiel 1 als "Komponente 1" bezeichnet, wurde auf die folgende Weise ermittelt:

Zuerst wurden die chromatographischen Mobilitäten in zwei Lösungsmittelsystemen durch dunnschichtchromatographische Analyse als identisch mit den chromatographischen Mobilitäten in den gleichen Systemen der "Komponente 1" bestimmt. Die chromatographischen Mobilitäten der vorstehend identifizierten Verbindung gemäß Beispiel 6 und der "Komponente 1" des Beispiels 1 und von Gentamicin C-, sind in der folgenden Tabelle angegeben.

	Cl	Rf	System 1	System 2	Rf	RfCl*
	1	0,39	RfCl*	0,70	1,00
Gentamicin		0,30	1,00	0,63	0,90
Komponente		0,30	0,77	0,63	0,90
Beispiel 6	0,77

System 1 - Siliciumdioxidgel 60F254, niedrigere Phase von Chloroform(l) :Methanol(l) :j50 $—igem Ammoniumhydroxid(l), die Platte wurde mit Ninhydrin besprüht.

System 2 - Watman No. 1-Papier-Lösungsmittelsystem wie in System Bioautographie unter Verwendung von B. subtilis.

*^Rf^C1 " ^Mobllität in Bezug auf Gentamicin C₁.

6 0 9 8 3 5 / 0 9 A 8

Zweitens zeigte das Massenspektrum einer Probe in Form der freien Base ein molekulares Ion bei 493 und Fragmente bei 477, 476, 463, 457, 436, 418, 405, 401, 383, 376, 366, 363, 344, 335, 321, 3I8, 277, 26I, I60 und 157.

Drittens zeigte das magnetische Kernresonanzspektrum Signale, die zwei NCH-z-Gruppen und einer CEUCH-Gruppe zugeordnet werden konnten und stimmte somit überein mit demjenigen von "Komponente 1".

Viertens wurde eine Probe von 10-20 mg des durch Fermentation wie vorstehend beschrieben in 0,3 ml 6N~Salzsäure in einem 0,5 mm Kapillarrohr erhaltenen Produkts unter Rückflußkochen der 6N-SaIzsäure während 6 Stunden erhitzt. Man ließ die Mischung bei Raumtemperatur zwei Tage stehen und verdünnte dann mit 1,5 ml Äthanol. Die erhaltene klare überstehende Flüssigkeit wurde von dem festen Rückstand dekantiert, und der Feststoff wurde in Wasser gelöst und auf Siliciumdioxidgel-Platten unter Verwendung eines Systems von Chloroform(3):Methanol(4):konz. Ammoniumhydroxid(2) chromatographiert. Man chromatographierte gleichzeitig Vergleichsproben von autentischem Streptamin und Deoxystreptamin. Die Identität des Hydrolyse-Produkts mit Streptamin wurde durch die Identität der chromatographischen Mobilitäten dieser beiden Proben (0,1) im Vergleich zu der chromatographischen Mobilität von Deoxystreptamin (0,2) bestimmt.

Zum weiteren Nachweis dafür, daß das Abbau-Produkt aus der vorstehenden Hydrolyse Streptamin war, wurde eine authentische Probe von Ν,Ν-Diacetylstreptamin-tetraacetat durch Umsetzung von 810 mg Streptaminsulfat mit 50 ml Essigsäure-anhydrid in Gegenwart von 500 ml Natriumacetat hergestellt. Nach einstündigem Rückflußkochen wurde die Mischung auf Raumtemperatur abgekühlt, zur Trockne eingedampft und mit Chloroform/Wasser unter Erzielung von. 440 mg Material mit einem Siedepunkt von 252-256⁰C (schmilzt unter Umkristallisation) und mit einer Zersetzung von 334-336⁰C extrahiert. [Literatur: - schmilzt teilweise bei 250 C unter Übergang in lange Nadeln, schmilzt bei mehr als 300⁰C. Peck et al, J. Am. Chem. Soc. 68, 776 (1946)].

Eine analoge Acetylierung des vorstehend erhaltenen Abbau-Produkts

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mit 5 mg Natriumacetat in 1 ml Essigsäure-anhydrid ergab 5,6 mg Material mit einem Pp. von 250-257°C (schmilzt unter Umkristallis ation) und einer Zersetzung bei 556-559°C. Der Misch-Schmelzpunkt zwischen der bekannten und der Vergleichsprobe war nicht reduziert.

Schließlich wurden dampf-chromatographische Vergleiche zwischen NjN-Diacetylstreptamin-tetraaeetat und der entsprechenden aus dem Abbau-Produkt hergestellten Verbindung mit N,N-Diacetyldeoxystreptamin-triacetat durchgeführt. Das Streptaminderivat und die Abbau-Probe erwiesen sich als identisch (Retentionszeit = 10,6 Minuten), waren jedoch von dem Ν,Ν-Diacetyldeoxystreptamintriacetat verschieden (Retentionszeit = 9,1).

Beispiel 7

Es wurde analog der in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrensweise vorgegangen, wobei 0,50 g pro Liter dl-Epi-inosose-2 [2,5,4,5,6-Pentahydroxycyclohexanon (2,5,4,6-cis) ] in drei 10 1-Ferment at ionen in Medium 5 zusammen mit 0,1 % zugefügtem Phyton in Gegenwart von M. purpurea ATCC 51 164 verwendet wurden. Die Isolation des Produkts wie vorstehend ergab 0,148 g eines öligen Produkts, das sich aufgrund eines Vergleichs seiner chromatographischen Mobilität mit bekannten Proben und aufgrund seines Massenspektrums als identisch mit Gentamicin C₁, nämlich 0-5-Deoxy-4-C-methyl-5-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1+6)-0-[2-amino-6-methylamino)-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-00-D-erythro-glucopyranosyl-(l*4)]-D-2-deoxystraptamin erwies. Das Massenspektrum zeigte ein molekulares Ion bei 477 und größere Fragmente, die identisch waren mit solchen des Gentamicins C-, bei 420, 560, 550, 547, 522, 519, 504, I60 und 157.

Beispiel 8

Es wurde analog der in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrensweise gearbeitet, wobei 0,50 g pro Liter 5,4,5,6-Tetrahydroxycyclohexen (5,5-cis) in drei 10 !-Fermentationen in Medium 5 zusammen mit 0,1 % zugefügtem Phyton in Gegenwart von M. purpurea ATCC 5I 164 verwendet wurden. Die Isolierung des Produkts wie vor-

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stehend beschrieben ergab 0,68 g Material, das sich aufgrund seiner dünnschichtchromatographischen Analyse und seiner chromatographischen Mobilitäten als identisch mit einer Mischung von Gentamicin C*, Cp und C₁ erwies. Überdies wurde eine 2 mg-Probe des Materials auf eine Dünnschichtplatte zusammen mit einer Probe eines im Handel erhältlichen Gentamicins aufgetragen und die Platte mit Chloroform(1):Methanol(1):konz.Ammoniumhydroxid(1) entwickelt. Die erhaltenen drei Banden aus der experimentellen Probe, deren chromatographische Mobiltitätswerte (R_f) identisch waren mit den drei Banden des im Handel erhältlichen Gentamicins^wurden entfernt, mit dem Entwicklungslösungsmittel eluiert und einer Massenspektralanalyse unterworfen. Die Spektren der ersten beiden Banden mit den R^-Werten von 0,37 bzw. 0,29 stimmten überein mit den Massenspektren des Gentamicins C. bzw. Gentamicins C₂, wobei die Massen-Peaks der beiden Proben die folgenden waren:

Gentamicin C₁: M⁺ 477, M⁺ ₊₁ 478, 420, 360, 350, 347, 322, 319,

304, 160, 157.

Gentamicin C₂: M⁺(kein), 420, 350, 346, 333, 322, 305, 3O4,

160, 143.

Die dritte schwächere Bande aus der experimentellen Probe, die einen R^-Wert von 0,22 besaß, ergab bei der Elution eine unzureichende Probe, die keine Massenspektralanalyse gestattete.

Beispiel 9

500 ^ug/ml der in der Herstellung 1 beschriebe!en dl-Deoxyinosose [dl-2,3,4,5-Tetrahydroxy-l-cyclohexanon] wurden mit der Mutante M. purpurea ATCC 31 164 vier Tage in dem Keimbildungsmedium 2 inkubiert und die erhaltene Brühe erwies sich aufgrund der ScheibendiffusionsVersuchsmethode gegenüber B. subtilis als Testorganismus als antibiotisch aktiv. Zusätzlich: zeigte die Dünnschichtchromatographie eines isolierten Rohprodukts aus der Brühe bei der Bioautographie unter Verwendung von B. subtilis als Testorganismus drei antibakterielle Komponenten, die den Gentamicinen C₁, C₂ und C_la bei den R_f-Werten von 0,37, 0,31 bzw. 0,26 in dem in Beispiel 6 beschriebenen System 1 entsprachen.

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Beispiel 10

500 jug pro ml Scyllo-inosose-pentaacetat [2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexanon-pentaacetat (2,4,6-cis)] [Kluyver et al, Rec. trav. chim. Pays-Bas jjj8, 956 (1939)] wurden mit der Mutante M. purpurea ATCC Jl 164 4 Tage in dem Keimbildungsmedium 2 inkubiert, und die erhaltene Brühe, die das Streptamin-Analoge des Gentamicins enthielt, erwies sich aufgrund der Scheibendiffusionsversuchsmethode gegenüber B. subtilis als Testorganismus als antibiotisch aktiv.

Beispiel 11

500 jig/ml dl-Viboquercitol [dl-l,2,5,4,5-Cyclohexanpentol (1,2,4-cis)] [MeCasland et al, J. Am. Chem. Soc. 7|5, 4020 (1953)] wurden mit der Mutante M. purpurea ATCC 31 164 sieben Tage in dem Keimbildungsmedium 2 inkubiert, und die erhaltene Brühe, die das Gentamicin enthielt, erwies sich aufgrund der Scheibendiffusionsversuchsmethode gegenüber B. subtilis als Testorganismus antibiotisch aktiv.

Beispiel 12

Das in Herstellung 3 beschriebene dl-2,3j.4,6-Tetrahydroxy-l-cyclohexanon (2,4,6-cis) wurde vier Tage in dem Keimbildungsmedium 2 mit der Mutante M. purpurea ATCC 31 164 inkubiert, und die erhaltene Brühe, die eine Mischung von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1+6)-0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-o6-D-erythro-glucopyranosyl-(l->4)]-D-5-deoxystreptamin; 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(tnethylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l->-6)-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetra«» deoxy-o6-D-erythro-glucopyranosyl-(l-»'4) ]-D-5-deoxystreptamin; und 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1+6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tetradeoxy-o6-D-erythro-glucopyranosyl-(1+4)]-D-5-deoxystreptamin enthielt, erwies sich aufgrund der Schelbendiffusionsversuchsmethode gegenüber B. subtilis als Testorganismus als antibiotisch aktiv.

Beispiel 13

500 ug/ml des in Herstellung 4 beschriebenen 2,4,5-Trihydroxy-

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cyclohexanon (2,4-cis) wurden mit der Mutante M. purpurea ATCC 31 164 vier Tage in dem Keimbildungsmedium 2 inkubiert, und die erhaltene Brühe, die eine Mischung von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-;3-(methylamino) -ß-?L-arabinopyranosyl-( 1-^6) -0-[2-amino-6-(methylamine) -6 -C -methy 1-2,3,4,ö-tetradeoxy^-D-erythro-glucopyranosyl-(1+²I-) ]-D-2,5-dideoxystreptamin; 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l+6)-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-o6-D-erythro-glucopyranosyl-(l*4)]-D-2,5-dideoxystreptamin; und 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyraiiosyl-(l-*6)-0-[2,6-diamino-2,3j4,6-tetradeoxy-°6-D-erythro-glucopyranosyl-(l-*4) ]-D-2,5-dideoxystreptamin enthielt, erwies sich aufgrund der Scheibendiffusionsversuchsmethode gegenüber B. subtilis als TestOrganismus als antibiotisch aktiv.

B. Einbau von Aminocyclitolen Beispiel 14

Es wurde analog zu der in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrensweise vorgegangen, wobei 0,31 g/l Streptaminsulfat in acht 10 1-Fermentationen, zwei in dem Produktionsmedium 5 zusammen mit 0,1 % zugefügtem Phyton,drei in dem Produktionsmedium 5* in dem das Sojabohnenmehl durch Tryptose und die Stärke durch 3 % Cerelose ersetzt worden waren, und drei in dem Produktionsmedium 5* in dem das Sojabohnenmehl durch Proteöse-pepton und die Stärke durch 3 # Cerelose ersetzt worden waren, in Gegenwart von M. purpurea ATCC 31 164 verwendet wurden. Die Isolierung des Produkts wie vorstehend ergab 2,4 g eines viskosen öligen Rückstandes, der auf Siliciumdioxidgel-Platten Chromatograph!ert wurde, wobei 0,56 g eines blaßgelben Peststoffes, der sich aufgrund der dünnschichtchromatographischen Analyse als mit der in Beispiel 1 beschriebenen "Komponente 1" identisch erwies, nämlich 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1*6)-0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methy1-2,3,4,6-tetradeoxy-oO-D-erythro-glucopyranosyl-(U4)]-D-streptamin, Pp. 119-123°C, und 0,996 g eines blaßgelben Feststoffes, der sich als mit der in Beispiel 1 beschriebenen "Komponente 2" identisch erwies, nämlich 0-3-Deoxy-4-C-methy1-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1>6)-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-öC/-D-erythro-glucopyranosyl-

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(l->4)]-D-streptamin, Pp. 115-H9°C, erhalten wurden.

(0,2 #,H₂0) = + 137,1

Eine 200 mg-Probe der freien Base wurde in das bis-Base*Pentasulfat»Hexahydrat übergeführt, wobei 256 mg der letztgenannten Verbindung mit einem Fp. von 228-230°C erhalten wurden.

Analyse

-2 1/2 H₂SO₄OH₂O

ber.:
gef.:

c 30,85

C 30,45

H 6,73 H 6,53

N 8,99
N 9,03

S 10,29 S 10,14.

Das magnetische Kernresonanzspektrum der Base stimmte auch mit der zugeordneten Struktur überein und kann wie folgt wiedergegeben werden:

_____________ Integration 5,82, 5,94 ^ 1

5,59 1

Zuordnung CiT⁰

- 5.20	13
3,0-4,6	13
3,09	3
1,73	3
1,72	3
1,90-2,5	4
Beispiel 15

NH₂x4, NHxI,

0Hx4

-CHN-X5, -CHO-x6, -CH₂O-CH₃-N CH₃-C CH₃-CH CH₂x2

Es wurde analog zu der in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrensweise vorgegangen, wobei 0,10 g/l 2-Deoxystreptamin ±n einer 10 1-Fermentation in dem Produktionsmedium 5 in Gegenwart von M. purpurea ATCC 31 164 verwendet wurden. Die Isolierung der Produkts wie vorstehend beschrieben ergab 0,51 g eines rohen· Materials, das bei der Chromatographie auf Siliciumdioxidgel als überwiegende Komponente ein Material ergab, das sich aufgrund der Identität der chromatographischen Mobilitäten als identisch mit Gentamicin C* erwies, nämlich 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-

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(methylamino) -ß-L-arabinopyranosyl-( l->6) -0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-00 -D-erythro-glucopyranosyl-i 1+4 )]-D-2-deoxystreptamin.

Beispiel 16

Es wurde analog der in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrensweise vorgegangen, wobei 0,10 g/l 2,5-Dideoxystreptamin in zwei 80 1-Fermentationen und sechs 10 1-Fermentationen in dem Produktionsmedium 5, in dem das Sojabohnenmehl durch 0,5 % Trypton und die Stärke durch 2 % Cerelose ersetzt worden waren, in Gegenwart von M. purpurea ATCC 31 164 verwendet wurden. Die Isolierung des Produkts wie vorstehend beschrieben ergab zwei Rückstände von 0,68 g und 0,13 g, die vereinigt wurden und auf Siliciumdioxidgel-Platten chromatographiert wurden, wobei drei Banden erhalten wurden, deren Massenspektren das Vorliegen der folgenden Verbindungen ergab: Komponente C*: 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(niethylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1*6)-0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methy1-2,3,4,6-tetradeoxy-c(, -D-erythro-glueopyranosyl-( l-*4) -D^^-dideoxystreptamin; Komponente Cp: 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l-^6)-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3*4,6-tetradeoxy-06-D-erythro-glucopyranosyl-(l->-4) ]-D-2,5-dideoxystreptamin; und Komponente C< : 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l->6)-0-[2,6-diamino-2,3i4,6-tetradeoxy-o6 -D-erythro-glucopyranosyl-(l-).4)]-D-2,5-dideoxystreptamin. Die Massenspektren der drei vorstehend angegebenen Komponenten C-, C₂ und C- zeigten die folgenden Massen-Peaks: Komponente C-: M 461, 4o4, 344, 334, 331, 306, 303, 288, I60 und 157. Komponente C₂: M⁺ 447, 404, 334, 330 317, 306, 288, I60 und 143. Komponente C_la: M⁺ 433, M⁺ ₊₁ 434, 4O4, 334, 316, 306, 303, 288, 275, I60 und 129.

Die R^-Werte, betrugen bei der dünnschicht-chromatographischen Analyse auf Siliciumdioxidgel-Platten unter Verwendung der niedrigeren Phase von Chloroform(l):Methanol(l):konz.Ammoniumhydroxid(l) als Entwicklungslösungsmittel 0,43, 0,37 und 0,29, für die Komponenten C-, C' bzw. C., .

Beispiel 17

Es wurde analog der in Beispiel 6 beschriebenen Verfahrensweise

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vorgegangen, wobei 0,50 g/l 2-Amino-l,3,4,5,6-cyclohexanpentol (1,3,5-cis) in drei 10 !-Fermentationen in dem Produktionsmedium 5 gemeinsam mit 0,1 % zugefügtem Phyton in Gegenwart von M. purpurea ATCC Jl 164 verwendet wurden. Die Isolierung des Produkts wie vorstehend beschrieben ergab 214 mg an Material, das sich aufgrund seiner chromatographischen Mobilität und aufgrund seines Massenspektrums als identisch mit der in Beispiel 1 beschriebenen "Komponente 1" erwies, nämlich O-^-Deoxy-^-C-methyl^-Cmethylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l-fr6)-0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-C£ -D-erythro-glucopyranosyl-Cl-^) ]-D-streptamin. Das Massenspektrum zeigte die folgenden Peaks: M⁺ 493, 457, 436, 383, 376, 366, 363, 346, 344, 338, 335, 321, 3I8, 26I, I60 und 157.

Beispiel 18

500 jug/ml 4,6-Bis-(benzylidenamino)-l,3-cyclohexandiol (1,3-cis), beschrieben in Herstellung 2, wurden mit der Mutante M. purpurea ATCC 31 164 vier Tage in dem Keimbildungsmedium 2 inkubiert, und die erhaltene Brühe, die das 2,5-Dideoxystreptamin-Analoge des Gentamicins enthielt, erwies sich aufgrund der Scheibendiffusionsversuchsmethode gegenüber B. subtilis als TestOrganismus als antibiotisch aktiv.

Beispiel 19

500 jig/ml des in Herstellung 7 beschriebenen N-Methyl-2,5-dideoxystreptamin-dihydrochlorids wurden mit der Mutante M. purpurea ATCC 3I 164 vier Tage in dem Keimbildungsmedium 2 inkubiert, und die erhaltene Brühe, die eine Mischung von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino) -ß-L-arabinopyranosyl-( l->6) -0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-oi.-D-erythro-glucopyranosyl-(l->4) ]-D-l-(N-methyl)-2,5-dideoxystreptamin; 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l+6)-0-[2,6-

syl-(l->4) ]-D-l-(N-methyl)-2,5-dideoxystreptamin; und 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino) -ß-L-arabinopyranosyl-( l->6) -0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tetradeoxy-c^-D-erythro-glucopyranosyl-(l-»4) ]-D-l-(N-methyl)-2,5-dideoxystreptamin enthielt, erwies sich aufgrund der Scheibendiffusionsversuchsmethode gegenüber B. subtilis

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als Testorganismus als antibiotisch aktiv. Beispiel 20

500 pg/ral des in Herstellung 8 beschriebenen N-Äthyl-2,5-dideoxystreptamin-dihydrochlorids wurden mit der Mutante M. purpurea ATCC 3I 164 vier Tage in dem Keimbildungsmedium 2 inkubiert, und die erhaltene Brühe, die eine Mischung von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-> (methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1+6)-0-[2-amino-6~(methylamino)-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-c<j-D-erytho-glucopyranosyl-(1*4) ]-D-l-(N-äthyl)-2,5-dideoxystreptamin; O-J-Deoxy^-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyraiiosyl-(l*6)-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3*4,6-tetradeoxy-'^-D-erythro-glucopyranosyl-(l+4) ]-D-l-(N-äthyl)-2,5-dideoxystreptamin; und O-^-Deoxy^-C-methyl-3-(methylajnino)-ß-L-arabinopyranosyl-( 1*6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tetradeoxy-06-D-erythro-glucopyranosyl-(1*4)]-D-l-(N-äthyl)-2,5-dideoxystreptamin enthielt, erwies sich aufgrund der ScheibendiffusionsVersuchsmethode gegenüber B. subtilis als TestOrganismus als antibiotisch aktiv.

Synthese von Amino-hydroxy-niedrig-alkanoyl-Derivaten Beispiel 21

Man kühlte in einem Eisbad eine Lösung von 270 mg (0,54mMol) 'Sös ⁱⁿ Beispiel 1 beschriebenen 0-3-Deoxy-4-C-methy1-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1*6) -ο -[2-amino-6-methylamino-6-C-methy1-2,3,4,6-tetradeoxy-&-D-e:rythro-glucopyranosyl-(l-»>4) ]-D-streptamins (Komponente 1) in 5 ml 50 #-igem wässrigem Tetrahydrofuran auf 5°C und behandelte mit 208 mg (0,59 mMol) N-Hydroxy-succlnimidester der S-(-)-^-(N-Benzyloxycarbonyl)-amino- 06-hydroxybuttersäure (U.S. Patentschrift 3 780 018) und rührte die Mischung 20 Stunden bei 5⁰C. Die Mischung wurde dann im "Vakuum auf 10 ml konzentriert. Man fügte 25 ml ri-Butanol und 10 ml Wasser hinzu und trennte die Schichten. Die wässrige Schicht wurde wiederum mit 10 ml n-Butanol gewaschen. Die vereinigten organischen Schichten wurden eingedampft, wobei ein Rückstand von 513 mg eines rohen Produkts, das zur Seite gestellt wurde, hinterblieb.

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Die wäßrige Schicht wurde zur Trockne eingedampft, wobei 304 eines Rückstandes erhalten wurden, der in 25 ml 50 $-igem wäßrigen Tetrahydrofuran gelöst und mit weiteren 208 mg U-Hydroxysuccin-imidester der S-(-)-J^(F-Benzyloxycarbonyl)-amino-a-hydroxybuttersäure wie vorstehend behandelt wurde. Die Aufarbeitung der Reaktionsmischung ergab weitere 435 mg Rohprodukt, das mit den zuvor erhaltenen 513 mg vereinigt wurde und auf 7 40 χ 20 cm

Siliciumdioxidgelplatten mit einer Dicke von 1 mm chromatografiert wurde. Das System wurde mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28 $) Ammoniumhydroxid (3:1 : 1) (niedrigere Phase) entwickelt. Es waren 7 Durchgänge in diesem Lösungsmittelsystem erforderlich und es wurden nach dem Eluieren der Produktbande,die im Ultravioletten sichtbar war, 229,5 mg einer rohen Mischung der drei monoacylierten Produkte erhalten.

Die Mischung der acylierten Produkte wurde auf 3 40 χ 20 cm Siliciumdioxidgelplatten mit einer Dicke von 1 mm aufgebracht und die Platten wurden 5 mal mit Chloroform : Isopropanol : konzentriertem (28 $) Ammoniumhydroxyd (4 : 1 : 1) (niedrigere Phase)j zweimal mit Chloroform : Isopropanol : konzentriertem (28 $) Ammoniumhydroxid (3:1 : 1) (niedrigere Phase) und 9 mal mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28 $) Ammoniumhydroxid (4:1 : 1) (niedrigere Phase) entwickelt. Es wurden 3 individuelle Banden erhalten, die unter Ultraviolettbestrahlung sichtbar waren und getrennt_?herausgeschnitten und aus dem Siliciumdioxidgel mit Chloroform : Methanol : konzentriertem (28 rf>) Ammoniumhydroxid (1 : 1 : 1) (niedrigere Phase) elu— iert wurden,' wobei 3 Komponenten erhalten wurden: A 90,9 mg; B 59,1 mg; und C 48,5 mg, die die S-(-)-f^(W-Benzyloxycarbonyl)-amino-a-hydroxybuttersäureamidderivate in den 2'-, 1- bzw. 3-Stellungen von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1*6)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-methy1-2,3,4»6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(i*4) ]-D-streptamin waren. Die R~-¥erte für die Komponenten A, B und C waren nach dem 5-maligen Entwickeln auf Siliciumdioxidgel mit einem System,be-

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stehend aus Chloroform : Methanol : konzentriertem (28 $) Ammoniumhydroxid (4:1 : 1) (niedrige Phase) die folgenden:

A - 0,48 B - 0,62 C - 0,70.

56,1 mg Komponente B (T-Amid), gelöst in 25 ml 50 $-igem wäßrigem Äthanol und 20 mg 10 $-iges Palladium auf Aktivkohle wurden in einem Parr-Schüttler bei 3,87 at, (55 psi) während 5 1/2 Stunden geschüttelt, wonach der Katalysator durch Filtration durch eine Filterhilfe entfernt wurde. Die Verdampfung des Lösungsmittels ergab 34,3 mg eines weißen glasartigen Rückstandes, der in 2,5 ml Wasser gelöst und mit 11,4 mg Schwefelsäure in 0,1 ml Wasser behandelt wurde. Die Zugabe von 10 ml Äthanol führte zur Ausfällung von 32 mg 1-[S-(-)-^-Amino-ahydroxybutyryl]-0-3-deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-l-arabinopyranosy1-(1* 6)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1^->4)]-D-streptamin in Form des Pentasulfatsalzes, Fp 230 bis 235⁰C (Zersetzung), Dünnschichtchromatographie:R_f = 0,18 (Siliciumdioxidgel, Chloroform : Methanol : konzentriertes (28 $>) Ammoniumhydroxid :

Standard = 0,73).

Wasser 1 :	4	•	2	: 1,	R-, Gentamicin C	6 2 4	1	Sta
Analyse				C25I	*5Ο°1θΚ	57 N
ber.:		C	27	,67	H 5,	58 R	7	,75
gef.:		C	27	,50	H 5,	7	,42.

Die Komponenten A und C wurden in analoger Weise behandelt. A ergab 27 mg 2^l-[S-(-)-/^t-Amino-a-hydroxy-butyryl]-0-3-deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-I-arabinopyranosyl-(1^6)-0-[2-aminoo-methylamino-e-C-methyl^^^ö-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(i^4})-I⁾-streptamin in Form des Bis-Base ·Tetrasulfat · HeptahydratjFp 237 bis 241⁰C (Zersetzung), Dünnschichtehroma-

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tographie;R_f = 0,33 [Siliciumdioxidgel, Chlorofrom : Methanol : konzentriertes (28 fo) Ammoniumhydroxid : Wasser, 1 : 4 : 2 : 1, R- Gentamicin C. Standard = 0,73]·

Analyse (C₂5H₅₀H₆O₁₀)2.4H₂SO₄-7H₂O

ber.: C 35,16 H 7,20 ff 9,84 gef.: C 35,38 H 7,08 ff 9,49

Die Komponente C ergab 26 mg 3-[S-(-)-^-Amino-oc-hydroxybutyryl]-0-3-deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1"^>"6)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1^4)]-D-streptamin in Form des Bis-Base «Pentasulfat-Trihydrat, Pp 220 bis 230⁰C (Zersetzung), Dünnschichtchromatographie: R_f = 0,30 [Siliciumdioxidgel, Chloroform Methanol : konzentriertes (28 fo) Ammoniumhydroxid : Wasser,

1 : 4 : 2 :	1,	Rf	Gentamicin	5Η5Ο*	H	C1	Standard	H	= 0,
Analyse				64	H	)>2	*5HpS0.·3	9	2°
ber.:		C	34,	35	6,	74 ff	8	,67
gef.:		C	34,		6,	38 ff	,60.

Indem man analog zu der in Beispiel 21 beschriebenen Arbeitsweise vorging und die jeweiligen in den Beispielen 2, 3, 4 und 5 beschriebenen Antibiotica und entweder den N-Hydroxysuccinimidester von S-(-)-^-(N-Benzyloxycarbonyl)amino-a-hydroxybuttersäure-oder den Pentafluorophenylester von K-^enzy1oxycarbonyl)-(S)-isoserin-[(S)-ß-Amino-a-hydroxypropionsäure, beschrieben von Haskell et al., Carbohydrate Research, 28, 273-280, 1973, verwendete, wurden die folgenden Verbindungen der Formel I in analoger Weise hergestellt."

Beispiel 22
1-[(S)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl]-0-3-deoxy-4-C-methyl-3-methyl-

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amino-ß-I-arabinopyranosyl-(1» 6)-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3, 4,6-tetradeoxy-α-D-erythro-glucopyranosy 1- (1 ·*4) ]-epistreptamin und 2'-[(S)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl]-0-3-deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-Ii-arabinopy ranosy 1- (1 ·» 6) -O- [2,6-diamino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(i->-4) ]-epistreptamin.

Beispiel 23

1-[S-(-)-/^:-Amino-a-hydroxy'butyryl]-0-3-deoxy-4-C-metliyl-3-Diethy lamino-ß-1-arabinopyranosy 1- (1 ->■ 6) -0- [ 2,6-diamino-2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1^4)]-2,5-dideoxystrept, amin und 2^l-[S-(-)-^-Amino-a-hydroxy'butyryl]-0-3-deoxy-4-C-methyl-3-metliy lamino-ß-L-arabinopyranosyl- (1 -^6) -0- [2,6-diamino-2,3,4,6-t etrade oxy-a-D-ery thr o-gluc opyranosy 1- (1·* 4) -2, 5-dideoxystreptamin.

Beispiel 24

1-[ (S)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl ]-0-3-deoxy-4-C-metliyl-3-me-r thy lamino-ß-1-arabinopy ranosy 1- (1-^6) -0- [2,6 -diamino-2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(i->4) ]-5-jodo-2, 5-dideoxystreptamin und 2'-[(S)-ß-Amino-a-hydroxypropionyl]-0-3-deoxy-4-C-me thyl-3-methylamino-ß-L-aralDinopyranosyl- (1-> 6) -0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(i->4) ]_5_jodo-2, 5-dideoxystreptamin.

Beispiel 25

1-[S-(-)-)^-Amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-deoxy-4-C-methyl-3-methy lamino-ß-L-arabinopyranosy 1- (1 *6) -0- [2-amino-6-me thylaniino-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1->4j|- 5-fluoro-2,5-dideoxystreptamin und 2^!-[S-(-)-i^-Amino-a-hydroxybutyryl]-O-3-deoxy-4-C-methy1-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosy l-( 1-^6 )-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-me thy 1-2, 3, 4, 6-t etrade oxy-a-D-ery thr o-gluc opyranosy 1-(1> 4 )}-5-fluor 0-2, 5-dideoxystreptamin.

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Antibakterielle Testergebnisse

Das in Beispiel 1 beschriebene und als Komponente 1 bezeichnete 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-J3-I-arabinopyranosyl-(1-?6)- ' O- [2-amino-6-methylamino-6-C-methy 1-2,3,4» 6-tetradeoxy-oc-D-erythro-glucopyranosyl-(i->4)]-D-streptamin wurde im Vergleich mit Gentamicin gegenüber einer Anzahl von Mikroorganismen gemäß dem folgenden Verfahren untersucht.

Man stellte Stammlösungen einer jeden Verbindung, die 200 mcg/ml Base enthielt, in destilliertem Wasser her, wobei man sterilisierte Filter verwendete. Die Kulturen des TestOrganismus ließ man 24 Stunden bei 37°C in 10 ml Rohren von Tryptosephosphat oder einer Mueller-Hinton-Brühe wachsen. Jede Kultur wurde mit der Brühe auf eine optische Dichte von 0,1 auf einem Spectronic-20-Gerät (ca. 10 Zellen/ml) eingestellt. Die eingestellten Kulturen wurden 1 : 500 in der Brühe für die Verwendung als Impfstoff (endgültige Zellen-Konzentration ca. 2 χ 10 Zellen/ml) verdünnt. Die Testverbindungen wurden hinsichtlich ihrer antibakteriellen Aktivität in einer einreihigen Röhrchen-Verdünnungs-

Stamm methode untersucht. Es wurden zweifache/reihenverdünnungen in Brühe aus den Stammlösungen des Mittels durchgeführt und 0,2 ml jeder Konzentration des Mittels wurden in 17 13 x 100 mm-Röhrchen gegeben. Sämtliche Röhrchen wurden mit 0,2 ml der in geeigneter Weise verdünnten Kultur geimpft (endgültige Zellenkonzentration je Rohr 10 Zellen/ml). Nach 16 stündiger Inkubation bei 37 C wurden die minimalen inhibierenden Konzentrationen (niedrigste Konzentration des Mittels, die kein Wachstum zeigt) bestimmt.

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III angegeben. Die Verbindungen wurden bei einer inhibierenden Konzentration von mehr als 100 mcg/ml als inaktiv angesehen.

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Tabelle III Organismus

Staphylococcus aureus Smith Escherichia coli Vogel Escherichia coli W677/HJR66 Escherichia coli JR 35 Escherichia coli JR 76·2 Escherichia coli JR 89 Escherichia coli K12 ML 1629 Enterobacter cloacae A-20960 Klebsiella pneumoniae 39645 Klebsiella pneumoniae A-20636 Proteus mirabilis MG-H-1 Providencia 164
Providencia stuartii A-20894 Pseudomonas aeruginosa MGH-2 Pseudomonas aeruginosa A-20717 Pseudomonas aeruginosa A-20741 Pseudomonas aeruginosa A-20897

min, inhibierende Konzentr,

(mcg/ml) Komponente 1 Gentamicin

0,78 3,13 50

3,13 6,25 50

3,13 1,56 1,56 3,13 6,25

100

100

3,13 12,5

inaktiv 12,5

0,195

3,13 inaktiv

6,25 100 50

1,56 25

0,78 50

1,56 inaktiv 100

0,39 «12,5 inaktiv inaktiv

Kultivierung in Tryptosephosphat-Brühe

Die gleiche in Beispiel 1 beschriebene Komponente 1 0-3-Deoxy-4-C-methy 1-3-methy lamino-ß-L-arabinopyranosyl- (1-=» 6) -0- [2-aminoo-methylamino-o-C-methyl^^^jö-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1-»4)j-JD-streptamin wurde im Vergleich zum Gentamicin komplex (C₁, C₂ und C_1&) und Gentamicin C₁ untersucht und die 1-, 3- und 2^l-[S-(-)-/*-Amino-a-hydroxy--'butyryl]amide der Komponente Ί ,beschrieben in Beispiel 21, und als Komponente 1 (1-HABA), Komponente 2 (3-HABA) bzw. Komponente 1 (2'-HABA) bezeichnet, wurden im Vergleich mit den entsprechenden 1-, 3-

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und 2 '- [S- (-)-j^-Amino-a-hydr oxy bury ryl Jamiden von Gentamicin C₁ (sämtlich in der US-PAtentschrift 3 780 018 beschrieben), die als C₁ (1-HABA), C₁ (3-HABA) bzw. C₁ (2'-HABA) bezeichnet wurden, untersucht. Diese Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV angegeben, in der die TestOrganismen 1, 2, 3, 4, und 6 die Organismen B. subtilis ATCC 663"3, S. aureus Smith, E. coli JR 76.2, Ent. cloacae A-20960, K. pneumoniae A-20636 bzw. PS. aeruginosa A-20897 darstellen.

■x-

	1	Tabelle	o,	39	IV	50	25	4	12,	5	5	25	6
	f0,024		o,	78		50	5	12,	5	25	>100
Verbindung	0,049	2	1,	56		6,	5	o,	78	3,13	>100
Gentamicin °1» C2' °1a	0,098	3,	13		12,		3,	13	6,25	25
Gentamicin C1	0,39	6,	25	TestOrganismus	12,		6,	25	12,5	>100
Komponente 1	0,78	25		3	>100		100		>100	>100
C1 (1-HABA)	3,13	50		100		50		50	> 100
Komponente 1 (1-HABA)	6,25	50		100	25		50	>100
C1 (3-HABA)	6,25	25		50	25		50	>100
Komponente 1 (3-HABA)	1,56						>100
C1 (2'HABA)
Komponente 1 (2'-HABA)

Kultivierung in einer Mueller-Hinton-Brühe

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Claims (28)

1. Patentansprüche

   1A Verbindung der Formel I, worin R. Wasserstoff oder Niedrigalkyl bedeutet, R^ und Rg Wasserstoff bedeuten oder einer der Reste R., R^ und Rg eine w-Arnino-a-hydroxy-niedrig-alkanoylgruppe der Formel

   H₂NCH₂(CH₂)_nCHOHCO-

   worin η O oder 1 ist, und die anderen der Reste R., R-, und Ro Wasserstoff sind, bedeutet, R₂ Viasserstoff oder Hydroxy bedeutet, R₁- Wasserstoff, Hydroxy oder Halogen bedeutet, wobei jedoch, wenn R₂ Viasserstoff ist, Rj- keine Hydroxygruppe in cis-Stellung zu den Aminogruppen in den 1- und 3-Stellungen darstellt und Rg und R„ jeweils Viasserstoff oder Methyl bedeuten.
2. 2.) Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R₁, R^ und Rg jeweils Wasserstoff bedeuten.
3. 3.) Verbindung gemäß Anspruch 1, worin einer der Reste R₁, R~ und Ro eine w-Amino-a-hydroxy-niedrig-alkanoylgruppe der Formel

   (CH₂)_nCHOHCO-

   worin η O oder 1 ist, bedeutet, und wobei die anderen der Reste R₁, R-, und Rg Wasserstoff darstellen.
4. 4.) Verbindung gemäß Anspruch 3, worin R₂ und R₁. jeweils Hydroxy bedeuten.
5. 5·) 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabino-pyranosyl-(1 ·> 6)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-methyl-2,3i4j6-tetradeoxya-D-erythro-glucopyranosyl-(i -* 4) ]-D-streptamin.
6. 6.) 2^T-[S-(-)-vⁱ-Amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-deoxy-4-C-methyl-3 methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1 -» 6)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-meth3'-l-2,3j4,6-tetradeoxy-a-D-erythroglucopyranosyl-(1 -» 4) ] -D-streptamin.

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7. 7·) 1 -[S-(-)-vT-Arnino-a-hydroxybutyryl]-0-5-äeoxy-4-C-methyl-3-methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1 * 6)-0-[2-amino-6-methylamino-6-C-metriyl-2,5i^*6-tetradeo:i:y-a-D-erythroglucopyranosyl-(1 ■» 4) ]-D-streptamin.
8. 8.) Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R₁, FU und Rg jeweils Wasserstoff bedeuten und R₂, R₁-, Rg und R„ die angegebenen Bedeutungen besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium kultiviert, das Kohlenhydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein entsprechendes hinzugefügtes Aminocyclitoi der Formel II, worin R.., Rp, R, und R^ die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen besitzen, und worin R₁ und R, zusätzlich eine Einfachbindung, die zwei Aminostickstoffatome miteinander verbindet, darstellen kann, in Gegenwart eines geeigneten Mutanten-Mikroorganismus enthält, wobei dieser nicht befähigt ist zur Synthese des Aminocyclitols selbst, jedoch befähigt ist, dieses.Aminocyclitol in die Verbindung der Formel I unter den vorstehenden Bedingungen einzubauen, und das Produkt aus dem Kulturmedium isoliert, wobei eine Verbindung der Formel I, worin beide der Reste R₁ und R- Wasserstoff bedeuten, gebildet wird, wenn R₁ und R^, in der Formel II eine Einfachbindung darstellen.
9. 9.) Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm des Mikroorganismus Micromonospora purpurea ATCC 31
10. 10.) \rerfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, worin R₁, R^ und R„ jeweils Wasserstoff bedeuten und R₂, R₁-, Rg urd R₁₇. die angegebenen Bedeutungen besitzen, wobei jedoch R₁-nicht Halogen bedeutet, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Nährmedium kultiviert, das Kohlenhydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein Cyclitol der Formel IHa oder IHb, worin jeweils R Wasserstoff oder Acetyl bedeutet, R ' Oxo oder Hydroxy darstellt und R₂' und R ' jeweils Wasserstoff, Hydroxy oder OR bedeuten _} in Gegenwart eines Stammes eines Mikroorganismus enthält, der nicht befähigt ist

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    zur Biosynthese der Cyclitoleinheit, der jedoch befähigt ist, das Cyclitol in das antibiotische Molekül in Form einer Aminocyelitoleinheit einzubauen.
11. 11.). Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, worin FL, FU und Rg jeweils Wasserstoff bedeuten und R„, Rr, Rg und R- die vorstehend angegebenen Bedeutungen besitzen, wobei jedoch R,- nicht Halogen bedeutet und R.. auch Niedrigalkyl bedeuten kann, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium kultiviert, das Kohlenhydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein Aminocyclitol der Formel Ha oder Hb, worin jeweils Rp' und R ' jeweils Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten und R ' Amino, Niedrigalkylamino oder Hydroxy bedeuten _f in Gegenwart eines Stammes eines Mikroorganismus enthält, der nicht befähigt ist zur Biosynthese der Aminocyclitoleinheit,der jedoch befähigt ist, das Aminocyclitol in das antibiotische Molekül in Form einer Aminocyclitoleinheit einzubauen.
12. 12.) Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm des Mikroorganismus Microspora purpurea ATCC 31 164 ist.
13. 13.) Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, worin einer der Reste R., R^, und Ro eine ω-Amino-a-hydroxyniedrig-alkanoylgruppe darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formel I, die gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12 erhalten wurde, mit einem N-Hydroxy-succinimidester der Formel IV umsetzt, worin η O oder 1 ist und die Benzyloxycarbonylgruppe in dem erhaltenen Produkt einer Hydrogenolyse mit Wasserstoff über einem Katalysator unterwirft.
14. 14.) Verfahren gemäß Anspruch 10 oder den Ansprüchen 10 und 12 zur Herstellung von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1 ->6)-0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methyl-2,3,4_J6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-[1 ->4)j-D-streptamin, wobei das zugefügte Cyclitol Scyllo-inosose ist.

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15. 15·) Verfahren gemäß Anspruch. 10 oder den Ansprüchen 10 und 12 zur Herstellung von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylarnino) -ß-L-arabinopyranosyl- (1-^6) -0-[ 2-amino-6- (methylamino) -6-C-raethyl-2,3j^-jö-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1 -*4) ]-D-5-deoxystreptamin; 0-5-Deoxy-4-C-methyl-5-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1 -$ 6)-0-[2_i6-diamino-6-C-methyl-2,3jⁱf-j6-tetradeoxy-a-d-erythroglucopyranosyl-(1 -^ 4)}-D-5-deoxystreptaminj und 0-3~Deoxy-4- C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1-»6)-0-[2,6-diamino-2,3> ^» 6-tetradeoxy-oc-D-erythroglucopyranosyl-(1-9 4)l-D-5-deoxystreptamin, wobei das zugefügte Cyclitol dl-2,3j4-j6-Tetrahydroxy-1 -cyclohexanon (2,4,6-cis) ist.
16. 16.) Verfahren gemäß Anspruch 10 oder gemäß den Ansprüchen 10 und 12 zur Herstellung von 0-5-Deoxy-4-C-methyl-^-(methylamino) -ß-L-arabinopyranosyl- (1 J^ 6) -0-[2-amino-6- (methylamino) -S-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1 -9 4j-D-2,5-dideoxystreptamin; 0-3-Deoxy-4-C-raethyl-5-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1 -? 6)-Ö-[2,6-diaminp-6-G:-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1 ^. 4)]-D-2₃5~dideoxy- ■ streptamin; und 0-3-Deoxy-4-C-methyl-5-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1-3>β)-0-[2,6-diamino-2,3* ^t 6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1-» 4)-D-2,5-dideoxystreptamin, wobei das zugefügte Cyclitol 2,4,5-Trihydroxycyclohexanon (2,4-cis) ist,
17. 17.) Verfahren gemäß Anspruch 11 oder den Ansprüchen 11 und zur Herstellung von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1 s» 6)-0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methyl-2,3,4_J6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1 ·* 4)]-D-streptamin und 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1->6)-0-[2,6-diamino-6-C-methyl-2,3j 4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1-> 4)]-D-streptamin, wobei das zugefügte Aminocyclitol Streptamin ist.
18. 18.) Verfahren gemäß Anspruch 11 oder den Ansprüchen 11 und zur Herstellung von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1-^6)-0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methyl-

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    dideoxystreptamin; O^-Deoxy^-C-methyl-^- (methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1 -^ 6)-O-[2,6-diamino-6-C-methyl~2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1 -^ 4)j-D-2,5-dideoxystreptamin und 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(1 -^6)-0-[2,6-diamino~2,3*4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1 -ρ- 4) ]-D-2,5-dideoxystreptamin, wobei das zugefügte Aminocyclitol 2,5-Dideoxystreptamin ist.
19. 19.) Verfahren gemäß Anspruch 11 oder den Ansprüchen 11 und 12 zur Herstellung von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1 -fr 6)-0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methyl-2,3,4,6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(i -» 4)}-D-streptamin, wobei das zugefügte Aminocyclitol 2-Amino-1,3*4,5*6-cyclohexanpentol (1,3,5-cis) ist.
20. 20. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 19* dadurch gekennzeichnet, daß man eine erhaltene freie Base in ein Säureadditionssalz derselben überführt.
21. 21.) Verbindung der Formel II, worin R., R_p und R-, jeweils Wasserstoff bedeuten und R₁- Fluor oder Jod ist.
22. 22.) Verfahren zur Herstellung eines Aminocyclitol-Antibiotikums des Typs von Streptamin, Deoxystreptamin oder Dideoxystreptamin, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium kultiviert, das Kohlenhydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle Salze und ein Cyclitol der Klasse 2-R₂ '-5-R₁-^f-3,4,6-Trihydroxy-cyclohexanon oder 2-Rp'-5-Rc'-1*3*4,6-Tetrahydroxycyclohexan, dargestellt durch die Formel IHa oder der Klasse 5-Rr-'-3*4,6-Trihydroxycyclohe:c-2-en, dargestellt durch die Formel IHb, worin jeweils R Waserstoff oder Acetyl bedeutet, R-' Oxo oder Hydroxy ist und Rp' und R₁-' jeweils Wasserstoff, Hydroxy oder OR bedeuten.^ in Gegenwart einer K i kr ο Organismus Mutante enthält, die lediglich befähigt ist zur Biosynthese von Antibiotika vom Typ des Streptamin, Deoxystreptamin oder

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    Dideoxystreptamin in. Gegenwart dieser Cyclitole.
23. 23.) Verfahren gemäß Anspruch 22 zur Herstellung einer Verbindung der Formel I, worin R₁, R_ und Rg jeweils Viasserstoff bedeuten, Rp und R₁- jeweils Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten und Rg und R₇ jeweils Wasserstoff oder Methyl bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Cyclitol der Formel IHa oder IHb, worin R Viasserstoff oder Acetyl ist, R^¹ Oxo oder Hydroxy ist und R₂' und R₁-' jeweils Viasserstoff, Hydroxy oder OR sind und einen Stamm eines Mikroorganismus verwendet, der nicht befähigt ist zur Biosynthese der Cyclitoleinheit, der jedoch befähigt ist, das Cyclitol in das Antibiotikum-Molekül in Form einer Aminocyclitoleinheit einzubauen.
24. 24.) Verfahren gemäß Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm des Mikroorganismus Micromonospora purpurea ATCC 31 164 ist.
25. 25.) Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I,

    worin R-, und R_Q jeweils Wasserstoff bedeuten und R₀ und R_ 3 ö 25

    jeweils Wasserstoff oder Hydroxy bedeuten, Rg und R₇ jeweils Viasserstoff oder Methyl bedeuten und R₁ Viasserstoff oder Niedrigalkyl bedeuten, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Nährmedium kultiviert, das Kohlenhydrate, eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, essentielle. Salze und ein Aminocyclitol der Formel Ilä oder Hb, worin jeweils Rp¹ und R₁-' jeweils Viasserstoff oder Hydroxy bedeuten und R₁' Amino, Niedrigalkylamino oder Hydroxy ist^in Gegenwart von Micromonospora purpurea ATCC 31 164 enthält.
26. 26.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24 zur Herstellung von 0-3-Deoxy-4-C-methyl-3-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(i ■* 6)-0-[2-amino-6-(methylamino)-6-C-methyl-2, 3 j 4, 6-tetradeoxy-cc-D-erythro-glucopyranosyl-(1->4)l-D-2-deoxystreptamin, wobei das zugefügte Cyclitol Epi-inosose-2 ist.
27. 27.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 22 bis 24 zur Herstellung von Gentamicin, wobei das zugefügte Cyclitol

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    (3,5-cis) ist.
28. 28.) Verfahren gemäß Anspruch 25 zur Herstellung von Gentamicin C., 0-3-Deoxy-4-C-methyl-^-(methylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(1^6) -O- [2-amino-6- (methylamino) -6-C-methyl-¹ s2,3i4_J5_>6-tetradeoxy-a-D-erythro-glucopyranosyl-(1 -^ 4)]-D-2-deoxystreptamin, wobei das zugefügte Aminocyclitol 2-Deoxystreptamin ist. ■ . .

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