CH618214A5 - Process for the preparation of aminocyclitol antibiotics - Google Patents

Description

Cette invention concerne un procédé de préparation d'antibiotiques aminocyclitol du type streptamine, déoxystreptamine ou didéoxystreptamine, et en particulier des composés de formule

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4

HO

CH3HH

-CH-

OH

dans laquelle R!, R3 et R8 représentent un atome d'hydrogène, 40 ou bien l'un de R1; R3 et R8 représente un groupement œ-amino-a-hydroxy-alcanoyle inférieur de formule

H2NCH2(CH2)„CHOHCO-

dans laquelle n est égal à 0 ou à 1, les autres groupements Rl5 R3 et R8 étant des atomes d'hydrogène; R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy; R5 représente un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy et R6 et R7 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle.

On prépare des composés de formule I où Rb R3 et R8 sont des atomes d'hydrogène, par la méthode décrite dans le brevet des E. U. A. N° 3 669 838 de Shier et al. Cette méthode consiste à cultiver un milieu nutritif contenant des glucides, une source d'azote assimilable, des sels essentiels et un dérivé d'ami-nocyclitol ajouté de formule:

50

55

. . .II

65

dans laquelle Rb R2, R3 et Rs ont les significations données ci-dessus, et où R[ et R3 peuvent en plus représenter une liaison simple réunissant les deux atomes d'azote des groupements amine, en présence d'un micro-organisme mutant approprié, ledit micro-organisme mutant étant incapable de synthétiser ledit aminocyclitol lui-même mais pouvant incorporer ledit aminocyclitol dans le composé de formule I, particulièrement un mutant de Micromonospora purpurea désigné par Micromo-nospora purpurea ATCC 31 119 et à séparer le produit du milieu de culture. On produit les composés de formule I dans laquelle Rx et R3 sont tous deux un atome d'hydrogène quand on utilise l'aminocyclitol de formule II où Rt et R3 représentent une liaison simple. Selon le mode opératoire décrit par Shier et al., la nature du mutant est telle qu'il est incapable de synthétiser la sous-unité aminocyclitol à partir d'un milieu nutritif pour ainsi produire l'antibiotique, mais qu'il peut incorporer cette dernière dans un antibiotique quand on ajoute de l'aminocyclitol au milieu nutritif.

En outre, des études effectuées avec des composés marqués par des radio-éléments ont montré que les cyclitols non azotés sont des précurseurs biogénétiques probables des aminocyclitols du type représenté par la formule II, comme la streptamine et la désoxystreptamine [Rinehart et al., J. Am. Chem. Soc. 96, 2263-2265 (1974), Walker et al., Biochem. 8,763-770 (1969) ; Demain et al., Bacteriol. Rev. 34,1-19 (1970)]. Néanmoins, bien que l'on sache que les aminocyclitols peuvent être introduits dans les antibiotiques du type aminocyclitol soit par culture d'un milieu nutritif, ne contenant pas la sous-unité amino-

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cyclitol telle quelle, et en présence d'un micro-organisme approprié [par exemple incorporation de la désoxystreptamine dans la néomycine selon Waksman et al., Science 109, 305—307 (1949)] soit par culture d'un milieu nutritif contenant une sous-unité aminocyclitol en présence d'un micro-organisme mutant qui est incapable de biosynthétiser l'aminocyclitol tel quel, mais qui est capable d'incorporer l'aminocyclitol dans l'antibiotique [par exemple, l'incorporation de la streptamine ou de I'épistrept— amine dans les antibiotiques du type hybrimicine décrits par Shier et Rinehart, dans le brevet des E. U. A. N° 3 669 838 délivré le 13 juin 1972] comme décrit précédemment, l'incorporation directe de cyclitol dans les antibiotiques du type aminocyclitol n'a pas été obtenue jusqu'à présent. En fait, les efforts pour introduire soit le myo-inositol, précurseur biogénétique probable de la streptamine, ou un éther monométhylique de l'hexahy-droxycyclohexane (québrachitol) dans les antibiotiques du type aminocyclitol en utilisant la méthode de Rinehart et Shier, n'ont rencontré aucun succès [Testa et al., J. Antibiotics 27,917—921 (1974)].

Ainsi, un procédé qui permettrait d'utiliser des cyclitols, au lieu des aminocyclitols, pour l'incorporation dans des antibiotiques du type aminocyclitol à l'aide de micro-organismes mutants en utilisant le méthode de Rinehart et Shier, constituerait un progrès très important dans le domaine des antibiotiques d'aminocyclitol, carie procédé permettrait, par un choix judicieux du micro-organisme et de la sous-unité cyclitol, un certain degré d'«adaptation» biogénétique de la molécule antibiotique résultante. En outre, comme les aminocyclitols sont toujours beaucoup plus coûteux que les cyclitols non aminés, on pourrait obtenir une réduction importante du prix des produits finals. (Par exemple, la streptamine coûte à l'heure actuelle environ 1 dollar par gramme, alors que son précurseur biogénétique probable, le scyllo -inosose, peut être obtenu avec un rendement d'environ 80% par oxydation par fermentation du myo-inositol, qui coûte seulement environ 0,02 dollar par gramme à l'heure actuelle).

On a trouvé de manière surprenante, que des aminocyclitols antibiotiques du type streptamine, désoxystreptamine ou didés-oxystreptamine, comprenant ceux qui ont la structure générale de formule I ci-dessus, peuvent être produits en cultivant un 4(1 milieu nutritif contenant des glucides, une source d'azote assimilable, des sels essentiels et un cyclitol choisi dans la catégorie des 2-R2'-5-R5-3,4,6-trihydroxycyclohexanones ou des 2-R2(-5-R5'-l,3,4,6-tétrahydroxycyclohexanes représentés par la formule: 45

50

ou de la catégorie des 5-Rs'-l ,4,6-trihydroxycyclohex-2-ènes représentés par la formule:

... Illb

30

35

...Illa;

OR

55

où, dans chaque cas, R est un atome d'hydrogène ou un groupement acétyle; R3' est un groupement oxo (= O) ou hydroxy; et R2' et R5' sont chacun un atome d'hydrogène, un groupement hydroxy ou OR, en présence de mutants d'organismes qui sont incapables de biosynthétiser l'unité cyclitol, mais qui sont capables d'incorporer l'unité cyclitol dans la molécule d'antibiotique sous forme d'une unité aminocyclitol.

Des aminocyclitols antibiotiques types que l'on peut obtenir par le présent procédé, et les organismes dont on utilise les mutants pour les produire, sont représentés par les types suivants:

Antibiotiques Micro-organisme

Hybrimicine Streptomyces fradiae gentamicine Micromonospora purpurea et Micromonospora echinospora tobramicine Streptomyces tenebrarius ribostamicine Streptomyces ribosidificus sisomicine Micromonospora inyoensis kenamicine Streptomyces kanamyceticus butirosine Bacillus circulans

On peut utiliser le procédé précédent pour préparer des antibiotiques du type gentamicine de formule I ci-dessus où R6 et R7 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle; R2 et Rs représentent chacun un atome d'hydrogène ou groupement hydroxy; Rb R3 et R8 représentent un atome d'hydrogène; en cultivant un milieu nutritif contenant des glucides, une source d'azote assimilable, des sels essentiels et un cyclitol de formule Illa ou Illb ci-dessus. Une souche particulière pour exécuter le procédé ci-dessus est M. purpurea ATCC 31 164.

Les composés de formule I, où l'un des groupements Rt, R3 et R8 représente un groupement co-amino-a-hydroxy-alcanoyle inférieur, sont préparés par le procédé décrit par Konishi et al dans le brevet des E. U. A. N° 3 780 018, qui consiste à faire réagir le composé de formule I où chacun des groupements R1; R3 et R8 est un atome d'hydrogène, avec un ester de N-hydroxy-succinimide de formule:

-o

II

,CHo0-C-NHCHo (CH~) CHOHCO-O-N 2 2 . 2 n

...IV

O

618 214 6

où n a la signification donnée précédemment. Puis on peut l'un des groupements R,, R3 et R8 est le groupement to-(N-

soumettre le mélange résultant des composés de formule I où benzyloxy-carbonyl)amino-a-hydroxy-alcanoyIe inférieur:

,CH20-C-NHCH2 (CII2) nCHOHCO-

les deux autres étant des atomes d'hydrogène, à l'hydrogènolyse Illb et par la correspondance entre les valeurs calculées et du groupement benzyloxycarbonyle par l'hydrogène sur un ca- trouvées pour leurs analyses élémentaires.

talyseur.

Les exemples spécifiques suivants sont représentatifs de la

Comme indiqué précédemment, quand on utilise comme fa?on de P^parer les composés et de la façon de mettre en substance de départ dans la réaction d'acylation un composé de °euvre le Procédé de rinventl0n> sans que l'invention soit formule I où chacun des groupements Rls R3 et R8 est un atome limitée à ces exemples.

d'hydrogène, on obtient un mélange des trois mono-amides isomères possibles dans lesquels l'un des atomes d'hydrogène " Préparation des nouveaux intermédiaires des groupements amine, R1; R3 et R8, est remplacé par le réparation 1

groupementco-(N-benzyloxycarbonyl)amino-a-hydroxy-alca- On soumet!edJ-v.boquerc.tol [dI-l,2,3A5-cyclohexane-

noyle inférieur. Quand on désire une caractérisation et une 1° (1'2't^)]i and £t aL'L Am" Chef Soc"

étude séparées de ces produits, ils doivent évidemment être „ 4020 <1953>] (°'4° r"ole)a une oxydation microbiologique par séDarés l'un de l'autre ' Acetobacter suboxydans en utilisant le mode opératoire décrit

On peut effectuer la réaction d'acylation en faisant réagir Par Premale, Helv. Chim. Acta 33,1594-1596 (1950). Au des quantités équivalents, en moles, du composé de formule I et boulllon reflt£;nt' °n aJoute 5 S d acétate de Plomb dans 60 ml de l'ester de N-hydroxysucdnimide, de préférence à une tempé- d eau' °"f,l!tre la s0^101\sur un adjuvant defiltration et on fait rature de -10° C, à +10° C, et dans une solution aqueuse d'un w Pasf"le flltrat,sur 180 g de resine Dowex 50-124. On concen-solvant organique inerte, par exemple le tétrahydrofuranne, le tre 1 eluat >;esultant f "n d e"vlrorn 15!? mi>on Ie d| ,ue,

dioxanne, l'éther diméthylique de l'éthylèneglycol, le diméthyl- avfc un volume eSal d ethano1 et°n le r1efroidlJt °,nJrecueille la acétamide, le diméthylformamide, l'éther diméthylique du pro- substance qui se séparé, et I on obtient 15,1 g dedl-desoxy-pylèneglycol etc inosose [dl-2,3,4,5-tetrahydroxy-l-cyclohexanone (2,4-cis)], p.

On peut effectuer l'hydrogènolyse du groupement benzyl- „ f" 221-222° C. Une concentration plus poussée du filtrat prove-oxycarbonyle sur un catalyseur de palladium sur charbon dans ' nant de la Prière recolte fournit trois recolles supplementai-un solvant sur un catalyseur de palladium sur charbon dans un res représentant au total 28,7 g, p. f. 220-221 C.

solvant organique miscible à l'eau inerte, par exemple le métha-nol, l'éthanol, le dioxanne, le tétrahydrofuranne, l'éther dimé- Préparation 2

thylique de l'éthylèneglycol, l'éther diméthylique du propylène- 40 On réduit avec de l'hydrogène sur 6 g d'oxyde de platine glycol, etc. avec une pression d'hydrogène initiale d'environ 3,8 atmosphè-

Les esters de N-hydroxysuccinimide de formule IV forment res une solution de 9,5 g (0,053 mole) de dl-épi-inosose [Poster-une catégorie de composés qui est connue de manière générale. nak Helv. Chim. Acta 19,1333 (1936)] dans 300 ml d'acide On a essayé les composés de formule I dans un essai chlorhydrique 0,1N. On recueille le produit par filtration du classique antibactérien avec dilution en série, et on a trouvé 4S mélange réactionnel, concentration du filtrat à siccité et recris-qu'ils possèdent une activité antibactérienne, en particulier vis- tallisation du résidu dans le méthanol aqueux. On obtient ainsi à-vis des organismes résistant à la gentamicine. Les composés je dl-épi-quercitol, p. f. 214-215° C.

sont ainsi utiles comme agents antibactériens. On soumet ce dernier à une oxydation microbiologique par

Les composés de formule I sont essentiellement destinés à Acetobacter suboxydans en utilisant le mode opératoire décrit une administration orale, locale ou parentérale et peuvent être 50 par Posternak indiqué ci-dessus dans la préparation 1, et l'on préparés, pour leur utilisation, à l'aide d'un support pharmaceu- sépare le produit comme décrit dans la préparation 1, et on le tique par mise en suspension, soit sous forme d'une base libre recristallise dans l'éthanol, ce qui donne la dl-2,3,4,6-tétrahy-soit sous forme des sels d'addition d'acide non toxiques, phar- dro-l-cyclohexanone (2,4,6-cis), p. f. 175-177° C. maceutiquement acceptables, dans un support inerte comme le polyéthylène ïlycol, soit par mise sous forme de comprimés ou 55 Préparation 3

encapsulage f our l'administration orale, seuls ou avec des adju- A une solution de 22,5 g (0,11 mole) d'acide 3-chloroper-vants appropriés, ou bien ils peuvent être introduits dans des benzoïque dans 150 ml de dichlorure de méthylène, on ajoute crèmes ou des gelées classiques pour une application locale. 11,4 g (0,1 mole) de 4-cyclohexène-1 a,2ß-dioI [McCasland et

Les structures moléculaires des composés de l'invention ont al., J. Org. Chem. 28, 898 (1963)], et on agite la solution été attribuées sur la base de l'étude de leurs caractéristiques w) résultante en refroidissant et en maintenant la température au chromatogra ohiques déterminées par Chromatographie sur cou- dessous de 30° C. On agite le mélange pendant 1 heure, on le che mince (C CM), leur spectre de résonance magnétique dilue avec 150 ml d'éther diéthylique, on l'agite pendant 3

nucléaire (R /IN) et leur spectre de masse ; par dégradation en heures supplémentaires, puis on le dilue avec 150 ml d'eau. On composés co inus ; par comparaison des produits préparés par sépare le produit de la couche organique d'une manière classi-fermentatior avec le mutant M. purpurea ATCC 31 119 en 65 que, ce qui donne 9,1 g de substance brute que l'on recristallise utilisant les aminocyclitols de formules II comme substrats, avec dans un mélange d'éthanol et d'éther, et l'on obtient deux les produits préparés par fermentation avec le mutant M. purpu- récoltes totalisant 4,75 g de 4,5-öpoxycyclohexane-la,2ß-diol, rea ATCC 31 164 en utilisant les cyclitols de formules Illa ou p. f. 80° C et 70-75° C.

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On traite une solution de 6,63 g (0,051 mole) de ce dernier dans 20 ml de diméthylsulfoxyde, par 0,06 ml du complexe trifluorure de bore-éther éthylique. On chauffe la solution résultante sur un bain de vapeur pendant environ 20 heures, on ajoute 0,03 ml supplémentaire du complexe trifluorure de bore-éther éthylique, et on chasse le solvant sous vide. On traite le résidu par 50 ml d'éthanol, on sépare le solide résultant et on concentre le filtrat à siccité, ce qui donne 7,75 g d'une huile brun-rougeâtre dont on Chromatographie 1,1g sur des plaques de gel de silice en éluant avec du tétrahydrofuranne, et l'on i obtient 550 mg de 2,4,5-trihydroxycyclohexanone (2,4-cis)dont le spectre de masse présente des pics à 144 et 145 et dont le spectre infrarouge présente une bande d'absorption forte à 1723 cm-1.

Processus de mutation

Dans les modes opératoires suivants, on utilise divers milieux constitués comme suit:

Milieu 1: N—Z Amine Glucose Amidon soluble Extrait de levure N-Z-Amine-Type A (Difco) CaC03 Gélose

Milieu 2: Milieu de germination (dans l'eau distillée)

Extrait de boeuf Tryptone Dextrose Amidon soluble Extrait de levure CaC03

Milieu 3: Soja-glucose Farine de soja Dextrose (Cerelose)

CaC03

Milieu 4: TGE (extrait trypticase-glucose) Extrait trypticase-glucose Trypticase-peptone Glucose Gélose

Milieu 5: Milieu de production Extrait de boeuf Extrait de levure Farine de soja Maltose Amidon Casamino-acide CaC02 CoCl2 • 6H20

Milieu 6: Gélose d'essai de streptomycine Extrait de boeuf Extrait de levure Peptone Gélose g/l 10 20 5 5 1 15

15

0,3% 0,5% 0,1% 2,4% 0,5% 0,4%3

g/l 30 40

l41

g/l 5,0 3,0 1,0 4

15,0

0,3% 0,5%5" 0,5% 0,1% 2,4% 0,1% 0,4% 1 mg/litre

55

g/l

1,5 6

3,0 6,0 15,0

On obtient l'organisme Micromonospora purpurea du Department of Agriculture des Etats-Unis sous le N° NRRL 2953 et on le maintient sur des cultures de gélose inclinées N-Z amine (Milieu 1). On effectue des fermentations en immersion dans des ballons contenant le milieu de germination 2 pendant 4 jours à 37° C sur un agitateur rotatif. A partir des semences de cette première étape, on transfère un inoculum à 10% dans le milieu de germination (milieu 2) et l'on continue la fermenta-i tion comme ci-dessus à 28° C pendant 7 jours.

Pour établir l'aptitude de l'organisme à biosynthétiser la gentamicine en l'absence de désoxystreptamine ajoutée, on effectue une fermentation de troisième étape en utilisant un inoculum à 5% dans un fermenteur de 10 litres dans un milieu i de soja et de glucose (milieu 3) à 28° C, en agitant à 200 tours par minute et en insufflant 2 litres d'air filtré par minute. Après 6 jours, on acidifie le contenu du réservoir à pH 2,2 avec de l'acide sulfurique 6N, on filtre et on neutralise une portion de 500 ml avec de l'hydroxyde d'ammonium et on la fait passer sur une résine échangeuse d'ions IRC 50 (forme Na+). Puis on rince la colonne avec de l'eau et on l'élue avec de l'acide sulfurique 2N. En suivant le mode opératoire décrit dans le brevet des E. U. A. N° 3 091 772, on isole un échantillon de 300 mg de gentamicine brute, que l'on trouve être biologiquement active et qui contient trois composants similaires à la gentamicine Cj, C2 et Cla par examen en CCM.

Dans le but d'obtenir un mutant de l'organisme, on cultive les cultures de bouillon dans le milieu 2 (37° C pendant 3 jours) et l'on récolte les cellules résultantes par centrifugation, on les lave et on les remet en suspension dans la solution saline tamponnée. On traite cette suspension par l'agent mutagène, la N-méthyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidine. On cultive sur plaque de milieu 4 des échantillons de la culture mutagénisée à 37° C jusqu'à ce que l'on voit des colonies (généralement environ une semaine). Les colonies sont transplantées sur deux séries de plaques (milieu 4) dont une série est recouverte d'une suspension de spores de B. subtilis. Après incubation à 37° C pendant 18 à 20 heures, les «transplantations» qui ne présentent aucune zone d'inhibition sur la plaque à B. subtilis sont transférées de la plaque originale (pas de B. subtilis) à des cultures sur gélose inclinées de milieu 1 et on les fait incuber jusqu'à ce que l'on voit une croissance totale.

Ces mutants non producteurs potentiels sont ensuite mis en présence de désoxystreptamine dans un essai de stimulation de la biosynthèse antibiotique, comme suit. Des cultures mères des mutants potentiels sont déposées sous forme de stries à la surface de plaques de milieu 4 et on les fait incuber à 37° C jusqu'à ce qu'on voit la croissance (environ 3 à 4 jours). Puis on plonge des disques de papier filtre dans une solution de désoxystreptamine (500 ng/ml) et on les place au-dessus des stries de culture. Après incubation pendant 24 heures, on inocule la surface de la plaque avec B. subtilis en utilisant la technique de couverture par une couche, et on continue l'incubation pendant 18 à 20 heures supplémentaires. Les isolats présentant des zones d'inhibition autour du disque sont désignés comme étant des mutants de désoxystreptamine. Un de ces mutants, appelé mutant VIB et déposé à American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20 852, sous le nom de Micromonospora purpurea ATCC 31 119, est utilisé dans la production des antibiotiques du type gentamicine comme décrit ci-dessous.

Ce dernier organisme est ensuite lui-même soumis au même mode opératoire de mutation que celui décrit ci-dessus, et l'on cultive sur plaque des échantillons de la culture mutagénisée, sur le milieu 4, à 37° C jusqu'à ce que l'on voit des colonies (environ une semaine). On transplante les colonies sur deux séries de plaques contenant de la gélose d'essai de streptomycine (milieu 6).

Une des séries sert de plaque originale pour la récupération ultérieure alors que la seconde série contient 25 |xg/ml de sulfate de streptamine et une suspension de spores de B. subtilis, formant une couche supérieure, comme organisme d'épreuve.

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On fait incuber ces plaques à 37° C pendant 24 heures et on les examine pour rechercher des zones d'inhibition. Celles présentant les plus larges zones sont transférées de la plaque originale sur des cultures sur gélose inclinées de N-Z amine (milieu 1) et on les fait incuber pendant une semaine à 37° C.

Les mutants incorporant les taux inférieurs de sulfate de streptamine sont ensuite testés avec la streptamine et le scyllo-inosose à 500 |xg/ml comme base. On transfère les culturëi mères dans des flacons contenant le milieu 2 plus les intermédiaires précédents et on les fait incuber à 37° C sur un agitateur rotatif pendant 7 jours. On détermine périodiquement l'activité antibiotique dans les flacons par la méthode d'essai de diffusion avec disques en utilisant B. subtilis comme organisme d'essai. Les isolats présentant des zones d'inhibition autour du disque sont désignés comme des mutants de streptamine ou de scyllo-inosose. Un tel mutant, appelé mutant VIB-3P et déposé dès le 11 juillet 1975 à la American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Md. 20 851, sous le nom de Micro-monospora purpurea ATCC 31 164, est utilisé pour la production des aminocyclitols antibiotiques du type streptamine, désoxystreptamine et diséxoxystreptamine comme décrit ci-des-sous.

obtient un solide antibiotique brut pesant 9 g, que l'on dissout dans 10 ml d'eau et que l'on extrait avec 5 portions de 50 ml de la partie inférieure d'un solvant composé, en volume, de chloroforme (2), d'isopropanol (1) et d'hydroxyde d'ammonium à s 17% (1). On réunit les extraits provenant de deux telles opérations et on les concentre sous vide, ce qui donne un résidu huileux pesant 300 mg.

On mélange l'échantillon avec 5 g de gel de silice (74—149 |() microns) et on les introduit dans une colonne de 100 g de gel de silice (2,5 X 45 cm) et on développe avec le solvant chlorofor-me:isopropanol:hydroxyde d'ammonium décrit ci-dessus. On recueille les fractions, on les soumet à une analyse en CCM, et l'on réunit les fractions choisies et on les concentre sous vide |5 jusqu'à une huile jaune pâle pesant 0,210 g sous forme de la base. On la transforme en sulfate et l'on obtient 0,288 g de 0-3-désoxy-4- C-méthyl-3-(mithylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l-^6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétra-désoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl- (l-± 4)]-D-streptamine ,, sous forme de la di-base pentasulfatée et tétrahydratée.

Biosynthèses avec M. purpurea ATCC 31164 Analyse, Calculée pour C21H43N508 • 272 H2S04 • 2H20:

A. Incorporation des cyclitols 25 C 32,55; H 6,76; N9,04; S 10,35

Trouvée C32,49; H6,91; N9,36; S 9,75

Exemple 1

On conserve des cultures de l'organisme mutant, M. purpu- La similarity structurelle à la gentamicine C! est établie rea ATCC 31 164, sur de la gélose inclinée de N-Z amine comme suit:

{milieu 1), et l'on prépare une semence de premier stade en Les mobilités chromatographiques du composé identifié ci-

inoculant la valeur d'une anse de repiquage provenant de la dessus et appelé exemple 1 et de la gentamicine C sont données culture inclinée dans 50 ml de milieu de germination (milieu 2) dans le tableau suivant.

et on laisse incuber pendant 4 jours sous un agitateur rotatif à

27—28° C. Puis on transfère un inoculum à 5 % dans 500 ml de Système 1 Système 2 milieu de germination, et on le fait incuber pendant 3 jours 35 Rf RfC,* R{ RfQ* comme ci-dessus. On utilise 1 litre de cette semence de seconde Gentamicine Cj 0,39 1,00 0,70 1,00 étape pour inoculer 9 litres de milieu de production (milieu 5) Exemple 1 0,30 0,77 0,63 0,90 dans des réservoirs agités à 400 tours par minute dans lesquels on insuffle de l'air filtré à raison de 5 litres par minute, à Système 1 - gel de silice 60F254, phase inférieure du

28-29° C pendant 48 heures. On utilise enfin la culture prove- 40 mélange chloroforme (l):méthanoI (l):hydroxyde d'ammonium nant de cette semence de troisième étape pour inoculer 70 litres à 30 % (1), plaque pulvérisée avec de la ninhydrine.

de milieu de production contenant 16 g de scyllo-inosose. On Système 2 - papier Whatman N° 1 - le système de solvant effectue la fermentation pendant 4 jours, en agitant à 400 tours est le même que le système 1 - bio-autographe utilisant R par minute et en aérant à raison de 42 litres par minute, à subtilis.

20-30° C. 45 *RfCj - mobilité par rapport à la gentamicine Ci.

On acidifie le contenu du réservoir jusqu'à pH 2,0 avec de Deuxièmement, le spectre de masse d'un échantillon, sous l'acide sulfurique 10N et on le filtre sur un adjuvant de filtration forme de la base libre, présente un ion moléculaire à 493, et des pour éliminer le mycélium. On ajuste le pH du filtrat à 6,0 et on fragments à 477,476,463,457,436,418,405,401,383,376, le fait passer sur un lit de résine échangeuse de cations de 366,363,344,335,321,318,277,261,160 et 157.

8 X 50 cm (Bio-Rex 70, forme Na+, 297-840 microns).On véri- 50 Troisièmement, le spectre de résonance magnétique fie l'activité antibiotique de l'éluat par bio-essai et on trouve nucléaire présente des signaux attribuables à deux groupements qu'il est inactif vis-à-vis de B. subtilis. Puis on élue la colonne NCH3.

avec l'acide sulfurique 2N et l'on recueille des fractions de Quatrièmement, on chauffe un échantillon de 10-20 mg du

500 ml. On fait des bir essais des fractions comme ci-dessus vis- produit obtenu par fermentation comme décrit ci-dessus, dans à-vis de B. subtilis, et l'on réunit toutes les fractions présentant 55 0,3 ml d'acide chlorhydrique 6N dans un tube capillaire de une activité antibiotique et on les neutralise pour obtenir un 0,5 ml, dans l'acide chlorhydrique 6N à reflux pendant 6 heures, volume final de 10 litres. On concentre à environ 5 litres sous On laisse le mélange reposer à la température ambiante pendant vide, on ajuste le pH à 10,5 avec de l'hydroxyde de sodium 10N, 2 jours, puis on le dilue avec 1,5 ml d'éthanol. On décante le et l'on ajoute 5 volumes d'acétone avec une agitation vigou- liquide surnageant limpide résultant du résidu solide, et on reuse. On élimine par filtration les sels minéraux qui se sont dissout le solide dans l'eau et on le Chromatographie sur des séparés, et l'on concentre le filtrat sous vide après ajustement du plaques de gel de silice en utilisant un système chloroforme pH à 7,0 à l'aide d'acide sulfurique dilué. Quand le volume est (3):méthanol (4):hydroxyde d'ammonium concentré (2). On d'environ 4 litres, on ajuste de nouveau le pH à 4,5, et l'on Chromatographie simultanément des échantillons comparatifs concentre encore l'échantillon à 150 ml. Puis on ajuste le pH à de streptamine et de désoxystreptamine authentiques. On mon-10,5, et l'on ajoute 5 volumes d'acétone pour une étape supplé- ,l5 tre l'identité du produit d'hydrolyse avec la streptamine par mentaire d'élimination des sels. l'identité des mobilités chromatographiques pour les deux

On concentre le filtrat, on ajuste le pH à 4,5 et on concentre échantillons (0,1) par rapport à la mobilité chromatographique le filtrat encore à 10 ml. Par addition de 100 ml de méthanol, on de la désoxystreptamine (0,2).

9

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Comme autre preuve que le produit de dégradation de l'hydrolyse précédente est la streptamine, on prépare un échantillon authentique de tétra-acétate de N,N-diacéthylstreptamine en faisant réagir 810 mg de sulfate de streptamine avec 50 ml d'anhydride acétique en présence de 500 mg d'acétate de sodium. Après chauffage à reflux pendant 1 heure, on refroidit le mélange à la température ambiante, on l'évaporé à siccité et on l'extrait avec un mélange chloroforme-eau, ce qui donne 440 mg de substance ayant un point de fusion de 252-256° C (fond avec recristallisation), qui se décompose à 334-336° C [La littérature donne: fusion partielle à 250° C avec transition en longues aiguilles, fond à une température supérieure à 300° C, Peck et al. J. Am. Chem. Soc. 68,776 (1946)].

Une acétylation similaire du produit de dégradation obtenu ci-dessus avec 5 mg d'acétate de sodium dans 1 ml d'anhydride acétique fournit 5,6 g matériau ayant un point de fusion de 250-257° C (fond avec recristallisation) et se décomposant à 336-339° C. Le point de fusion d'un mélange de l'échantillon connu de l'échantillon de référence n'est pas abaissé.

Enfin, des comparaisons par Chromatographie en phase gazeuse entre le tétra-acétate de N,N-diacétylstreptamine et le composé correspondant préparé à partir du produit de dégradation sont effectuées ainsi qu'avec le tri-acétate de N,N-diacétyl-désoxystreptamine. On montre que le dérivé de streptamine et l'échantillon obtenus par dégradation sont identiques (temps de rétention, T. R. = 10,6 minutes) mais qu'ils sont différents du tri-acétate de N,N-diacétyldésoxystreptamine (T. R. = 9,1).

Exemple 2

En suivant un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple 1, mais en utilisant 0,50 g par litre de dl-épi-inosose-2[2,3,4,5,6-pentahydroxycycIohexanone (2,3,4,6-cis)] dans trois fermentations de 10 litres dans le milieu 5 plus 0,1 % de phytone ajoutée, en présence de M. purpurea ATCC 31 164, et séparation du produit comme précédemment, on obtient 0,148 g d'un produit huileux qui, par comparaison de sa mobilité chromatographique avec des échantillons connus et à l'aide de son spectre de masse, se révèle être identique à la gentamicine Ci, c'est-à-dire la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthyl-amino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l-^>6)-0-[2-amino-6-(mithyl-amino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopy-ranosyl- (1—* 4)]-D-2-désoxystreptamine. Le spectre de masse présente un ion moléculaire à 477 et des fragments principaux identiques à ceux de la gentamicine C! à 420,360,350,347, 322,319,304,160 et 157.

Exemple 3

En suivant un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple 1 ci-dessus en utilisant 0,50 g par litre de 3,4,5,6-tétrahydroxycyclohexène (3,5-cis) dans trois fermentations de 10 litres dans le milieu 5 plus 0,1 % de phytone ajoutée, en présence de M. purpurea ATCC 31 164, et séparation du produit comme ci-dessus, on obtient 0,68 g de substance dont l'analyse par CCM et les mobilités chromatographiques montrent qu'elle est identique au mélange de gentamicine Cu C2 et Cla. En outre, on dépose un échantillon de 2 mg de substance sur une plaque de CCM ainsi qu'un échantillon de gentamicine commerciale, et l'on développe la plaque avec le mélange chloroforme (l):méthanol (l):hydroxyde d'ammonium concentré (1). On enlève les trois bandes résultantes de l'échantillon expérimental dont les valeurs de mobilité chromatographique (Rf) correspondent de manière identique aux trois bandes de la gentamicine commerciale, on les élue avec le solvant de développement et on leur fait subir une analyse par spectre de masse. Le spectre des deux premières bandes ayant des valeurs Rt de 0,37 et 0,29 respectivement, sont compatibles avec les spectres de masse de la gentamicine Q et de la gentamicine C2 respectivement, les pics principaux pour les deux échantillons étant les suivants:

Gentamicine Ct: M+477, M+ +1 478,420,360, 350, 347, 322,319,304,160,157.

s Gentamicine C2: M+ (aucun), 420, 350,346, 333,322, 305, 304,160,143.

La troisième bande plus faible de l'échantillon expérimental, ayant un Rf de 0,22, fournit par élution un échantillon insuffisant pour permettre une analyse par spectre de masse.

ni

Exemple 4

On fait incuber le dl-désoxyinosose [dI-2,3,4,5-tétrahy-droxy-l-cyclohexanone] (500 ng/ml) décrit ci-dessus dans la préparation 1, avec le mutant M. purpurea ATCC 31 164 u pendant 4 jours dans le milieu de germination 2, et on trouve que le bouillon résultant est actif sur le plan antibiotique par la méthode d'essai de diffusion avec disques vis-à-vis de B. subtilis utilisé comme organisme d'essai. En outre, une CCM d'un isolât brut du bouillon montre, par bio-autographe utilisant B. subtilis 2o comme organisme d'essai, trois composants antibactériens correspondants aux gentamicines C], C2 et Cla à des Rf de 0,37, 0,31 et 0,26 respectivement dans le système 1 décrit dans l'exemple 1 précédent.

25 Exemple 5

On fait incuber du penta-acétate de scyllo-inosose[penta-acétate de 2,3,4,5,6-pentahydroxycyclohexanone (2,4,6-cis)] [Kluyver et al., Ree. trav. chim. Pays-Bas 58,956 (1939)] (500 fig/ml) avec le mutant M. purpurea ATCC 31 164 pendant .ni 4 jours dans le milieu de germination 2 et l'on trouve que le bouillon résultant contenant l'homologue de streptamine de la gentamicine est actif sur le plan antibiotique, en utilisant la méthode d'essai de diffusion avec disques, vis-à-vis de B. subtilis comme organisme d'essai.

35

Exemple 6

On fait incuber du dl-viboquercitol [dl-1,2,3,4,5-cyclohexa-nepentol (1,2,4-cis)] [McCasland et al., J. Am. Chem. Soc. 75, 4020 (1953)] (500 jig/ml) avec le mutant M. purpurea ATCC 4« 31 164 pendant 7 jours dans le milieu de germination 2, et l'on trouve que le bouillon résultant contenant de la gentamicine est actif sur le plan antibiotique, en utilisant la méthode d'essai de diffusion avec disques, vis-à-vis de B. subtilis comme organisme d'essai.

45

Exemple 7

On fait incuberladI-2,3,4,6-tétrahydroxy-l-cyclohexanone (2,4,6-cis) décrite ci-dessus dans la préparation 2, avec le mutant M. purpurea ATCC 31 164 pendant 4 jours dans le 50 milieu de germination 2, et on trouve que le bouillon résultant contenant un mélange de la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthyl-amino) -ß- L-arabinopyranosyl- (7—» 6)-0-[2-amino-6- (méthyl-amino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopy-ranosyl-(1^>4)]-D-5-désoxystreptamine; la 0-3-désoxy-4-C-55 methyl-3-(mithylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopy-ranosyl-(l—>4)]-D-5-désoxystreptamine; et la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3 - (méthylamino)-ß- L-arabinopyranosyl- (l-^ó)-O-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyrano-60 syl~( 1-^4)]-D-5-désoxystreptamine est actif sur le plan antibiotique, par la méthode d'essai de diffusion avec disques, vis-à-vis de B. subtilis comme organisme d'essai.

Exemple 8

65 On fait incuber la 2,4,5-trihydroxycyclohexanone (2,4-cis) (500 (ig/ml) décrite ci-dessus dans la préparation 4, avec le mutant M. purpurea ATCC 31 164, pendant 4 jours dans le milieu de germination 2, et on trouve que le bouillon résultant

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10

contenant un mélange de la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthyl-amino)-fi-L-arabinopyranosyl-(I—>6)-0-[2-amino-6-(méthyl-amino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopy-ranosyl-(/—» 4)]-D-2,5-didésoxystreptamine; la 0-3-désoxy-4-C-mithyl-3-(mäthylamino)-ß-L-arabinopyranosyl- (l-*6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glu-capyranosyl- (l—*4)]-D-2,5-didésoxystreptamine; et la 0-3-désoxy-4- C-méthyl-3-(méthylamino) -ß-L-arabinopyranosyl-(1^6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-gluco-pyranosyl- ( /—» 4)]-D-2,5-didésoxystreptamine est actif sur le plan antibiotique, par la méthode d'essai de diffusion avec disques, vis-à-vis de B. subtilis comme organisme d'essai.

Synthèse des dérivés à substituant Amino-hydroxy-alcanoyle inférieur

Exemple 9

On refroidit à 5° C dans un bain de glace, une solution de 270 mg (0,54 mmol) de 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthyl-amino-ß-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-méthyI-amino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopy-ranosyl-(l—»4)]-D-streptamine, décrite ci-dessus dans l'exemple 1 (composant 1), dissous dans 5 ml de tétrahydrofuranne aqueux à 50%, et on la traite par 208 mg (0,59 mmole) de l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide S-(-)-y-(N-benzyl-oxycarbonyl)-amino-a-hydroxybutyrique (brevet des E. U. A. N° 3 780 018 de Konishi et al.), et on agite le mélange à 5° C pendant 20 heures. Puis on concentre le mélange à 10 ml sous vide. On ajoute 25 ml de n-butanol et 10 ml d'eau, et l'on sépare les couches. On lave de nouveau la couche aqueuse avec 10 ml de n-butanol. On évapore les couches organiques réunies, ce qui laisse un résidu de 513 mg de produit brut que l'on laisse de côté.

On évapore la couche aqueuse à siccité, ce qui donne 304 mg d'un résidu que l'on dissout dans 25 ml de tétrahydrofuranne aqueux à 50 % et que l'on traite par 208 mg supplémentaires de l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide S-(-)-y-(N-benzyloxycarbonyI)-amino-a-hydroxybutyrique comme précédemment. Le traitement du mélange réactionnel fournit 435 mg supplémentaires du produit brut que l'on réunit aux 513 mg préalablement obtenus et on les Chromatographie sur 7 plaques de gel de silice 40 X 20 cm d'une épaisseur de 1 mm. On développe le système avec la phase inférieure du mélange chlorofor-me:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré à 28% (3:1:1). Sept passages dans ce système de solvant sont nécessaires, et après avoir élué la bande du produit qui est visible à l'ultra-violet, on obtient 229,5 mg d'un produit brut des trois produits monoacylès.

On dépose le mélange des produits acylés sur trois plaques de gel de silice de 40 X 20 cm et 1 mm d'épaisseur et on développe les plaques 5 fois avec la phase inférieure du mélange chloroforme:isopropanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28 %) (4:1:1), deux fois avec la phase inférieure du mélange chloroforme:isopropanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28 %) (3:1:1 ) et 9 fois avec la phase inférieure du mélange chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (4:1:1). On obtient 3 bandes distrincts visibles sous un rayonnement ultra-violet que l'on découpe séparément et que l'on élue du gel de silice avec la phase inférieure du mélange chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) (1:1:1), ce qui fournit trois composants: A, 90,9 mg;B, 59,1 mg; et C, 48,5 mg, qui sont les dérivés amide de l'acide S-(-)"Y~(N-benzyloxycarbonyl)-amino-a-hydroxybutyriqueen positions 2', 1 et 3 respectivement de la Ó-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-p-L-arabinopyranosyl-(l-*6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-»4)]-D-streptamine. Les valeurs Rf pour les composants A, B et C, quand on développe 5 fois sur gel de silice avec la phase inférieure du système chloroforme: méthanokhydroxyde d'ammonium concentré (28%) (4:1:1), sont:

; A — 0,48 B —0,62 C-0,70

On agite le composant B (1-amide, 56,1 mg) dissous dans 25 ml d'éthanol aqueux à 50% et 20 mg de palladium-sur-10 charbon à 10%, dans un agitateur de Parr à 3,75 atmosphères pendant 5,5 heures, après quoi on élimine le catalyseur par filtration sur un adjuvant de filtration. L'évaporation du solvant fournit 34,3 mg d'un verre blanc que l'on dissot dans 2,5 ml d'eau et que l'on traite par 11,4 mg d'acide sulfurique dans u 0,1 ml d'eau. L'addition de 10 ml d'éthanol fait précipiter la 1-[S-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-mithylamino-ß-L-arabinopyranosyl-(l-^6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradêsoxy-a-D-érythro-glu-copyranosyl-(l^>4)]-D-streptamine sous forme du pentasulfate 2o (32 mg), p. f. 230-235° C avec décomposition ; CCM, Rf = 0,18 (gel de silice, chloroforme:méthynol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%):eau, 1:4:2:1 ;

Rf de référence de la gentamicine Q = 0,73).

Analyse, calculée pour C25H50O10N6 • 5H2S04:

C 27,67; H 5,57; N7,75

Trouvée C 27,50; H 5,58; N7,42.

1(1 On traite de la même manière les composants A et C. A fournit 47 mg de 2'-[S-(-)-y-amino-dhydroxy-butyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3méthylamino-fi-L-arabinopyranosyl-(l-+6)-0-[2-amino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-éry-thro-glucopyranosyl- (/—>4)]-D-streptamine sous forme de la di-jj base tétrasulfatée et heptahydratée, p. f. 237—241° C avec décomposition; CCM, Rf = 0,33 [gel de silice, chloroforme:mé-thanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%):eau, 1:4:2:1 ; Rf de référence de la gentamicine Cj = 0,73].

Analyse, calculée pour (C25H50N6O10)2 • 4H2S04 • 7H20:

C 35,16; H 7,20; N9,84

Trouvée C 35,38; H 7,08; N9,49

45 Le composant C fournit 26 mg de 3-[S-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino^-L-arabinopyranosyl-(l-^6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l-*4)]-D-streptamine sous forme de la di-base pentasulfatée et 50 trihydratée, p. f. 220-230° C avec décomposition; CCM, Rf = 0,30 [gel de silice, chloroforme:méthanol:hydroxyde d'ammonium concentré (28%) :eau, 1:4:2:1; Rf de référence de la gentamicine Cj — 0,73].

55

Analyse, calculée pour (C25H5oN6010)2 • 5H2S04 • 3H20:

C 34,64; H 6,74; N9,67

Trouvée C 34,35; H 6,38; N8,60.

60 En procédant d'une manière similaire à celle décrite dans l'exemple 9 en utilisant respectivement les antibiotiques décrits dans les exemples 2,7 et 8 et l'ester de N-hydroxysuccinimide de l'acide S-(-)-v-(N-benzyloxycarbonyl)amino-a-hydroxybu-tyrique ou l'ester pentafluorophénylique de la N-(benzyloxycar-65 bonyl)-(S)-isosérine[acide (S)-ß-amino-a-hydroxypropionique, décrit par Haskell et al., Carbohydrate Research, 28,273-280 (1973)], on prépare de la même manière les composés suivants de formule I

11

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Exemple IO

l-[(S)-ß-amino-a-hydroxypropionyl]-0-3-disoxy-4-C-méthyl-3-mäthylamino-ß-L-arabinopyranosyl- (1—» 6)-0-2-amino-6-[méthylamino]-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(/—>4j-2-désoxoystreptamine et 2' «_ [(S) ]-ß-amino-a-hydroxypropionyl/- 0-3-désoxy-4- C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabinopyranosyl-(l-^>6)-()-]2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl- ( 1—> 4)]-2-désoxystreptamine

Exemple 11

l-[S-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabinopyranosyl-(l-^>6)-0-]2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(/—> 4)-2,5-didésoxystreptamine et 2'-[S-(-)-y-amino-a-hy-droxybutyryl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabinopyranosyl-(l—> 6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l—>4)]-2,5-didésoxystreptamine.

Exemple 12

1 -[(S)-ß-amino-a-hydroxypropionyl}-0-3-désoxy-4- C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabinopyranosyl- (1-^6)- 0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(1^> 4)]-5-désoxystreptamine et 2' -[(S)-ß-amino-a-hydroxypro-pionyl]-0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-fi-L-arabino-pyranosyl-(l—>6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl- (1-^4)]-5-désoxystreptamine.

Resultats des essais antibacteriens

On teste la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-méthylamino-P-L-arabinopyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(1—>4)]-D-streptamine décrite ci-dessus dans l'exemple et appelée composant 1 en la comparant à la gentamicine vis-à-vis d'un certain nombre de micro-organismes selon le mode opératoire suivant.

On prépare des solutions mères de chaque composé contenant 200 g/ml de base, dans de l'eau distillée et on les stérilise par filtration. On cultive pendant 24 heures à 37° C des cultures des micro-organismes d'essai dans des tubes de 10 ml de phos-phate-tryptose ou bouillon de Mueller-Hinton. On ajuste chaque culture avec du bouillon jusqu'à une densité optique de 0,1 sur un spectronic 20 (environ 108 cellules/ml). On dilue les cultures ajustées à raison de 1:500 dans le bouillon pour les utiliser comme inoculum (concentration finale en cellules d'environ 2 X105 cellules/ml). On teste l'activité antibactérienne des composés d'essai par une méthode de dilution en tube en une seule série. On prépare des dilutions originales en double dilution en série dans du bouillon à partir des solutions mères de médicaments, et l'on place 0,2 ml de chaque concentration de médicaments dans 17 tubes de 13 X100 ml. On inocule tous les tubes avec 0,2 ml de la culture diluée appropriée (concentration finale de cellules par tube = 105 cellules/ml). On détermine les concentrations inhibitrices minimales (plus faibles concentrations en médicaments ne présentant pas de croissance visible) après une incubation de 16 heures à 37° C.

Les résultats sont donnés dans le tableau III ci-dessous. On considère les composés inactifs à des concentrations inhibitrices supérieures à 100 (Xg/ml.

Tableau III*

a Organisme

Staphylococcus aureus Smith Escherichia coli Vogel Escherichia coli W677/HJR66 m Escherichia coli JR 35 Escherichia coli JR 76.2 Escherichia coli JR89 Escherichia coli K12 ML1629 Enterobacter cloacae A-20960 15 Klebsiella pneumoniae 39645 Klebsiella pneumoniae A-20636 Proteus mirabilis MGH-1 Providencia 164 •

Providencia stuartii A-20894 a» Pseudomonas aeruginosa MGH-2 Pseudomonas aeruginosa A-20717 Pseudomonas aeruginosa A-20741 Pseudomonas aeruginosa A-20897

Concentration inhibitrice minimale ((ig/ml)

Composant I 0,78

3,13 50 3,13 6,25 50 3,13 1,56 1,56 3,13 6,25 100 100 3,13 12,5 Inactif 12,5

Gentamicine 0,195 3,13 inactive 6,25 100 50

1,56 25 0,78 50 1,56 Inactive 100 0,39 ^ 12,5 Inactive Inactive

25 *Cultivé dans le bouillon tryptose-phosphate.

On fait un essai de comparaison de ce même composant 1 décrit ci-dessus dans l'exemple 1, la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-m€thylamino-ß-L-arabinopyranosyI-(l—>6)-0-[2-amino-6-méthylamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-3o glucopyranosyl-(l->4)]-D-streptamine, avec le complexe de gentamicine (Q, C2 et Cla) et la gentamicine C,, et l'on fait un essai de comparaison entre les 1-, 3- et 2'-[S-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryljamides du composant 1, décrits ci-dessus dans l'exemple 9, et appelés respectivement composé 1 (1-HABA), 35 composant 2 (3-HABA) et composant 1 (2'-HABA), et les 1-, 3-, et 2'-[S-(-)-y-amino-a-hydroxybutyryl]amides correspondants de la gentamicine C, (tous décrits par Konishi et al. dans le brevet des E. U. A. N° 3780 018 délivré le 18 décembre 1973) et appelés respectivement Q (1-HABA), C] (3-HABA) 4o et C| (2'-HABA). Les résultats sont donnés dans le tableau IV ci-dessous où les organismes d'essai 1,2,3,4,4 et 5 désignent respectivement B. subtilis ATCC 6633, S. aureus Smith, E. coli JR 76.2, Ent. cloacae A-20960, K. pneumorrae A-20636 et Ps. aeruginosa A-20897.

45

Tableau IV*

50

60

Organismes d'essai

Composé 1

2

3

4

5

6

Gentamicine

C„ C2, Cla «0,024

0,39

50

12,5

25

>100

Gentamine C! 0,049

0,78

50

12,5

25

>100

Composant I 0,098

1,56

6,25

0,78

3,13

25

Ct (1-HABA) 0,39

3,13

12,5

3,13

6,25 >100

Composant I

(1-HABA) 0,78

6,25

12,5

6,25

12,5

>100

C, (3-HABA) 3,13

25

>100

100

>100

>100

Composant I

(3-HABA) 6,25

50

100

50

50

>100

Cj (2'-H AB A) 6,25

50

100

25

50

>100

Composant I

(2'-HABA) 1,56

25

50

25

50

>100

""Cultivé dans le bouillon Mueller-Hinton.

C

Claims (10)

1. 618 214

   2

   REVENDICATIONS 1. Procédé de préparation d'un aminocyclitol antibiotique du type streptamine, désoxystreptamine ou didésoxvstrepta-mine, caractérisé en ce qu'on cultive un milieu nutritif comprenant des glucides, une source d'azote assimilable, des sels essentiels et un cyclitol de la catégorie des 2-R2'-5-Rs'-3,4,6-trihy-droxy-cyclohexanones ou 2-R2'-5-R5'-l,3,4,6-tétrahydroxy-cyclohexanes représentés par la formule Illa où R est un atome d'hydrogène ou un groupement acétyle ; R3' est un groupement oxo (= O) ou hydroxy ; et R2' et R5' sont chacun un atome d'hydrogène, un groupement hydroxy ou OR ou de la catégorie des 5-R5'-3,4,6-trihydroxycyclohex-2-ènes représentés par la formule Illb
2. ...Illb

   DR

   , 5 où R est un atome d'hydrogène ou un groupement acétyle ; et R5' est un atome d'hydrogène, un groupement hydroxy ou OR, en présence d'un micro-organisme mutant qui est incapable de biosynthétiser l'unité cyclitol, mais qui est capable d'incorporer l'unité cyclitol dans la molécule d'antibiotique sous forme d'une unité aminocyclitol et, si désiré, on transforme la base libre obtenue en un de ses sels d'addition acide.
3. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la souche de micro-organisme est Micromonospora purpu-rea ATCC31 164.

   ,5 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2 pour la préparation d'un composé répondant à la formule I

   618 214

   dans laquelle

   R], R3 et R8 représentent chacun un atome d'hydrogène, et R2 et R5 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement hydroxy, R6 et R7 représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupement méthyle, caractérisé par le fait que l'on utilise un cyclitol de formule Illa
4. .. .Illa;

   JOR

   où R est un atome d'hydrogène ou un groupement acétyle ; R3' est un groupement oxo (= O) ou hydroxy; et R2' et R5' sont chacun un atome d'hydrogène, un groupement hydroxy ou OR

   ou un cyclitol de la catégorie des 5-R5'-3,4,6-trihydroxy-cyclo-hex-2-ènes représentés par la formule Illb

   Illb

   OR

   .15

   où, R est un atome d'hydrogène ou un groupement acétyle ; et R5' est un atome d'hydrogène, un groupement hydroxy ou OR.
5. 4. Procédé selon la revendication 1 ou 2 pour la préparation de la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-p-L-arabino-pyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-

   2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-gIucopyranosyl-(l—>4)]-D-streptanine, caractérisé par le fait que le cyclitol ajouté est le scyllo-inosose.
6. 5. Procédé selon la revendication 1 ou 2 pour la préparation de la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-P-L-arabino-pyranosyI-(l—>6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l—>4)]-D-5-désoxystreptamine ; la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthyl-

   i amino)-ß-L-arabinopyranosyl)-(l—»6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythrogIucopyranosyl-(l-»4)]-D-5-désoxystreptamine; ou la O-3-désoxy -4-C-méthyl-3-(méthylamino)-P-L-arabinopyranosyl-(l^>6)-0-[2,6-diamino-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythrogIucypyranosyl-(1—>4)]-D-5-désoxystreptamine, caractérisé par le fait que le cyclitol ajouté est la dl-2,3,4,6-tétrahydroxy-l-cyclohexa-none(2,4,6-cis).
7. 6. Procédé selon la revendication 1 ou 2 pour la préparation de la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-P-L-arabino-pyranosyl-(l—>6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-cc-D-érythro-glucopyranosyl-(l—>4)]-D-2,5-didésoxystreptamine; la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(möthylamino)-ß-L-arabinopyranosyl-(l^»6)-0-[2,6-diamino-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(1—>4)]-D-2,5-didésoxystreptamine, caractérisé en ce que le méthyl-3-(méthylamino)-3-L-arabinopyranosyI-(l—^-O-j^.ó-diamino^S^.ó-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(1—>4)]-D-2,5-diésoxystreptamine, caractérisé en ce que le cyclitol ajouté est la 2,4,5-trihydroxycyclohexanone (2,4-cis).
8. 7. Procédé selon la revendication 1 ou 2, pour la préparation de la 0-3-désoxy-4-C-méthyl-3-(méthylamino)-p-L-arabino-pyranosyl-(l—»6)-0-[2-amino-6-(méthylamino)-6-C-méthyl-2,3,4,6-tétradésoxy-a-D-érythro-glucopyranosyl-(l—>4)]-D-2-désoxystreptamine, caractérisé en ce que le cyclitol ajouté est le dl-épi-inosose-2.
9. 8. Procédé pour la préparation d'un composé de la formule I de la revendication 3, formule dans laquelle un des radicaux R,, R3 et Rg désigne un groupement a>-amino-a-hydroxy-alcanoyle inférieur, caractérisé en ce qu'un exécute le procédé selon la revendication 1 et l'on fait réagir un composé obtenu avec un ester de N-hydroxy-succinimide ayant la formule IV

   O

   II

   CH~0-C-NHCHo (CH-) CHOHCO-O-N <£ 2 2. n
10. ...TV

    dans laquelle n est égal à zéro ou 1 et que l'on soumet le groupement benzyloxycarbonyle dans le produit résultant à l'hydrogènolyse par l'hydrogène sur un catalyseur.