AT392971B - Verfahren zur herstellung neuer antitumor-antibiotika - Google Patents

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Description

AT 392 971B
Die Erfindung betrifft in erster Linie ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikums BBM-1675C aus den bekannten antibiotisch wirksamen Substanzen BBM-1675Aj und/oder BBM-1675Ä2.
Bei Abänderungen des Verfahrens kann auch das Antitumor-Antibiotikum BBM-1675D entstehen, dessen Herstellung ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist
Die Struktur dieser Antitumor-Antibiotika ist bis jetzt noch nicht restlos aufgeklärt. Aufgrund ihrer einzigartigen physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften handelt es sich bei den Antitumor-Antibiotika BBM-1675C und BBM-1675D um neue Substanzen.
Die GB-PS 2 141 425 beschreibt die Fermentierung von Actmomadura verrucosospora Stamm H964-92 (ATCC 39334) oder Actmomadura verrucosospora Stamm A1327Y (ATCC 39638) zur Herstellung eines neuen Antitumor-Antibiotikum-Komplexes mit der Bezeichnung BBM-1675. Zwei hauptsächlich bioaktive Komponenten des dort beschriebenen BBM-1675-Komplexes werden als BBM-1675Aj und BBM-1675A2 bezeichnet Die Strukturen der BBM-1675Aj und BBM-1675A2 Antibiotika, die auch als Esperamicin Aj bzw. Esparamicin A2 bezeichnet werden, sind nocht nicht aufgeklärt, jedoch zeigen beide Komponenten hervorragende antimikrobielle und Antitumor-Aktivität
In der DE-OS 34 18 023 wird eine Säurehydrolyse von BBM-1675Aj beschrieben, die aber - offenbar wegen einer zu hohen Säurekonzentration - die Entstehung einer wertvollen antibiotisch und antitumor-wirkenden Substanz nicht erkennen ließ.
In der US-PS 4 530 835 ist die Fermentierung eines nicht identifizierten Actinomycetes-Isolats WP-444 (ATCC 39363) zur Herstellung von Antitumor-Antibiotika mit der Bezeichnung CL-1577A und CL-1577B beschrieben. Die Strukturen der CL-1577-Antibiotika sind noch nicht aufgeklärt aber charakteristische Eigenschaften dieser Antibiotika zeigen, daß CL-1577A und CL-1577B in der Struktur den BBM-1675-Antibiotika und insbesondere BBM-1675Aj und A2 da GB-PS 2141425 ähnlich sind.
In Journal Antibiotics, 37(12), 1566-1571 (1984) beschreiben R. H. Bunge et al. die Fermentierung von Actinomadura sp. (ATCC 19363) um einen bioaktiven Komplex zu gewinnen, aus dem zwei Hauptbestandteile, PD 114,759 und PD 115,028 isoliert wurden. In J. Chem. Soc. Chem. Commun., 919-920 (1985) beschreiben J. H. Wilton et al. die teilweise Strukturaufklärung der Antibiotika PD 114,759 und PD 115,028. Die Herstellung, Isolierung und Charakterisierung der Antibiotika PD 114,759 und PD 115,028 scheint gleich zu sein wie bei den oben erwähnten Antibiotika CL-1577A bzw. CL-1577B.
Die am 30. November 1983 veröffentlichte EP-A 95 154 beschreibt die Fermentierung von Actinomadura pulveraceus sp. nov. Nr. 6049 (ATCC 39100) zur Herstellung von Antitumor-Antibiotika mit der Bezeichnung WS 6049-A und WS 6049-B. Die Struktur der Antibiotika WS 6049 ist noch nicht aufgeklärt, die charakterisierenden Eigenschaften dieser Antibiotika zeigen jedoch, daß WS 6049-A und WS 6049-B in der Struktur den Antibiotika BBM-1675 der GB-PS 2141425 und den Antibiotika CL-1577 der US-PS 4 530 835 verwandt sind. Spektraldaten zeigen jedoch, daß weder WS 6049-A noch WS 6049-B identisch mit einem BBM-1675-Bestandteil ist. Der in der europäischen Patentanmeldung 95 154 beschriebene produzierende Organismus kann jedoch klar unterschieden werden von Actinomadura verrucosospora, des Verfahrens nach der britischen Patentanmeldung 2,141,425 und zwar in Bezug auf die Farbe seines Lufimycels auf ISP-Medium Nr. 2, 3 und 4 und seiner positiven Milchpeptonisierung und seiner positiven Verwertung auf D-Fructose, D-Mannit, Trehalose und Zellulose.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikums BBM-1675C ist dadurch gekennzeichnet, daß die antibiotisch wirksamen Substanzen BBM-1675A} (Esperamicin A^) oder BBM-1675A2 (Esperamicin A2) oder eine Mischung beider mit 0,05 - 0,5 molarer alkoholischer Salzsäure bei einer Temperatur bis zu 50-60 °C bis zum DSC (dünnschichtchromatographisch) überwachten Verschwinden der Ausgangssubstanz hydrolysiert werden und daß die Reaktionsmasse mit Bikarbonat neutralisiert und aus dem Reaktionsprodukt das BBM-1675C durch präparative Chromatographie isoliert wird.
Die Ausgangssubstanzen können ihrerseits hergestellt werden durch Kultivieren eines BBM-1675 produzierenden Stammes von Actinomadura verrucosospora.
In einer ersten Abänderung dieses Verfahrens kann das neue Antitumor-Antibiotikum BBM-1675D erfindungsgemäß dadurch hergestellt werden, daß die antibiotisch wirksamen Substanzen BBM-1675Aj oder BBM-1675A2 oder eine Mischung beider mit 0,05 - 0,5 molarer alkoholischer Salzsäure oder mit 0,03 bis 0,04 molarer p-Toluolsulfonsäure über das DSC-überwachte Verschwinden der Ausgangssubstanz hinaus hydrolysiert werden und daß die Reaktionsmasse mit Bikarbonat neutralisiert und aus dem Reaktionsprodukt das BBM-1675D durch präparative Chromatographie isoliert wird.
In einer zweiten Abänderung des oben genannten Verfahrens kann das neue Antitumor-Antibiotikum BBM-1675D erfmdungsgemäß dadurch hergestellt werden, daß das nach dem ursprünglichen Verfahren gewonnene BBM-1675C mit 0,05 - 0,5 molarer alkoholischer Salzsäure oder mit 0,03 - 0,04 molarer p-Toluolsulfonsäure bis zum DSC-überwachten Verschwinden der Ausgangssubstanz hydrolysiert, die Reaktionsmasse mit Bikarbonat neutralisiert und aus dem Reaktionsprodukt das BBM-1675D durch präparative Chromatographie isoliert wird.
Die bioaktiven Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D können durch herkömmliche chromatographische -2-
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Verfahren gereinigt werden. Beide Substanzen zeigen hervorragende antimikrobielle Aktivität und Antitumor-Aktivität. Weitere Merkmale und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung in Verbindung mit der Zeichnung und den Unteransprüchen. S In der Zeichnung zeigen 10 15 20 25 30 35 40 45
Fig. 1 das Ultraviolett-Absorptions-Spektrum von BBM-1675C Fig. 2 das Ultraviolett-Absorptions-Spektrum von BBM-1675D Fig. 3 das Infiarot-Absoiptions-Spektrum vom BBM-1675C (KBr, Film) Fig. 4 das Mrarot-Absorptions-Spektrum von BBM-1675D (KBr, Film) Fig. 5 das relative Abundanz-Massenspektrum von BBM-1675C Fig. 6 das relative Abundanz-Massenspektrum von BBM-1675D Fig. 7 das protonenmagnetische Resonanzspektrum von BBM-1675C in CDCI3 (360 MHz) Fig. 8 das protonenmagnetische Resonanzspektrum von BBM-1675D in CDCI3 +10 % CD3OD (360 MHz) Fig. 9 das magnetische Resonanzspektrum von BBM1675C in CDCI3 (90,6 MHz) Fig. 10A das magnetische Resonanzspektrum (110-200 ppm) von BBM-1675D in CDG3 +10 % CD3OD (90,6 MHz) Fig. 10B das magnetische Resonanzspektrum (0-110 ppm) von BBM-1675D in CDCI3 +10 % CD3OD (90,6 MHz) Fig. 11A das protonenmagnetische Resonanzspektrum von Verbindung 3A (oc-Anomer) in CDCI3 (360 MHz) und Fig. 11B das protonenmagnetische Resonanzspektrum von Verbindung 3B (ß-Anomer) in CDCI3 (360 MHz). Die neuen Antitumor-Antibiotika mit der Bezeichnung BBM-1675C und D werden auch als BMY-27305 bzw. BMY-27307 bezeichnet. Als BBM-1675-produzierender Stamm von Aktinomadura verrucosospora wird insbesondere Aktinomadura verrucosospora Stamm H964-92 (ATCC 39334) oder Aktinomadura verrucosospora Stamm A1327Y (ATCC 39638), eine Mutante davon, verwendet. Die bioaktiven Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D zeigen antimikrobielle Aktivität gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen und haben auch schon gezeigt, daß sie inhibitorische Wirksamkeit gegenüber verschiedenen Mäuse-Tumorsystemen besitzen, wie P-388 Leukämie und B16 Melanome. Die neuen hier beschriebenen Substanzen können deshalb sowohl als antimikrobielle Mittel als auch als Antitumor-Mittel zum Inhibieren von Tumoren bei Säugern verwendet werden. Im Laufe der Durchführung von Abbaustudien zur Klärung der Struktur der Antitumor-Antibiotika BBM-1675Aj (Esperamicin Aj) und BBM-1675A2 (Esperamicin A2) wurde eine Mischung von Komponenten hergestellt, welche zur Isolation und Identifizierung von zwei inaktiven Fragmenten führte, nämlich den Verbindungen der im Folgenden genannten Formeln 1 und 2. Überraschenderweise wurde gefunden, daß der chemische Abbau zur stufenweisen Freisetzung von zwei bioaktiven Fragmenten BBM-1675C und BBM-1675D führte. Noch überraschender war, daß die beiden verschiedenen Antibiotika BBM-1675Aj und A2 dieselben bioaktiven Fragmente bildeten, wie im Schema 1 dargestellt ist Besonders überraschend ist daß die Fragmente BBM-1675C und BBM-1675D mit geringerem Molekulargewicht (sie haben etwa 70 % bzw. 55 % des Molekulargewichts der Ausgangsantibiotika BBM-1675Aj bzw. A2) als Antitumormittel und antimikrobielle Mittel wirksamer als BBM-1675A2 und vergleichbar mit BBM-1675Aj sind. Schema 1 50
>BBM-1675D B8M-1675A2
(Esperamicin A^l -3- 55
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Die Herstellung der Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D durch selektive chemische Hydrolyse des Antibiotikum BBM-1675Aj ist im folgenden Schema 2 dargestellt
Sghsroa.2
°C»3 iß ΒΒΜ-1675Λ —— ' > BBM-1675C + (M.G. 1248) 3 (M.G. 855)
Verbindung 1 ( M.G. 425) (Mischung von cx. und ß Anomeren)
CHgOH +
°C»3 Ψ BBM-1675D (M.G. 695)
Verbindung 3 (M.G. 192) (Mischung von o«. und ß, Anomeren) -4-
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Die Ausgangsverbindung BBM-l675Aj wird nach dem in der GB-PS 2,141,425 beschriebenen Verfahren hergestellt. Das gereinigte BBM-1675Aj wird mit einer Mineralsäure oder organischen Säure wie
Chlorwasserstoff, Schwefelsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure und der gleichen in einem organischen oder gemischten wäßrig/organischen inerten Lösungsmittel bei einer Temperatur von ca. 0 °C bis Rückflußtemperatur des Lösungsmittels hydrolisiert, bis eine wesentliche Menge des gewünschten BBM-1675C oder BBM-1675D produziert ist. Die Hydrolyse wird vorzugsweise in C j-Cg-Alkohollösungsmitteln durchgeführt, wobei eine Alkoholyse in Methanol besonders bevorzugt ist. Die Temperatur der Reaktion ist nicht kritisch, doch wird die Reaktion vorzugsweise bei ungefähr Umgebungstemperatur bis 60 °C insbesondere zwischen ca. 40 und 60 °C durchgeführt.
Die selektive Hydrolyse von BBM-1675Aj schreitet stufenweise mit der anfänglichen Prokution des BBM-1675C-Andbiotikums und des inaktiven Fragmentes der Formel 1 fort. Nachfolgende oder kontinuierliche Behandlung unter Hydrolisierungsbedingungen führt zur Freisetzung einer Mischung von α und ß Anomeren des Thiozuckers nach Formel 3 und zur Bildung des Antibiotikums BBM-1675D. Es ist für den Fachmann verständlich, daß eine Änderung der Reaktionsbedingungen wie Zeit, Temperatur und Säurekonzentration eine Variation der relativen Mengen der Antibiotika BBM-1675C und BBM-1675D zur Folge hat Es ist deshalb wünschenswert, den Fortschritt der Reaktion durch Dünnschicht-Chromatographie wie in den nachfolgenden Beispielen beschrieben, zu verfolgen.
Wenn es erwünscht ist, nur das Antibiotikum BBM-1675D herzustellen, dann wird die selektive Hydrolyse vorzugsweise mit einer organischen Säure wie p-Toluolsulfonsäure durchgeführt, wie hier beschrieben, um eine quantitative Menge an BBM-1675D zu erhalten.
Die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D können auch durch selektive chemische Hydrolyse des Antibiotikums BBM-1675A2 hergestellt werden, wie im Schema 3 dargestellt
Schema 3 ΒΒΜ-1675Λ ( M.G.124B)
>BBM-16 75C + ( M.G. 055)
OCH 3 Verbindung 2 (M.G. 425) (Mischung von ^ und ß Anomeren)
Ψ BEM-1675D (M.G. 695) +
OII Verbindung 3 (M.G.192) »Mischung von oc und ß Anomeren) -5-
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Die Ausgangsverbindung BBM-1675A2 wird nach dem in der GB-PS 2,141,425 beschriebenen Verfahren hergestellt. Die selektive Hydrolyse des gereinigten BBM-1675A2 schreitet gleichfalls schrittweise fort mit der anfänglichen Produktion des Antibiotikums BBM-1675C und des inaktiven Fragmentes der Formel 2. Fortgesetzte Behandlung unter Hydrolisierungsbedingungen führt zur Freisetzung einer Mischung von α und ß Anomeren des Thiozuckers nach Formel 3 und der Bildung des Antibiotikums BBM-1675D.
Die Reaktionsbedingungen, die für die selektive chemische Hydrolyse von BBM-1675A2 angewendet werden, sind im wesentlichen die gleichen wie die für die oben beschriebene Hydrolyse von BBM-1675Aj angewendeten.
In ähnlicher Weise wie bei der Herstellung von BBM-1675D aus BBM-1675Aj wird auch hier die Hydrolyse von BBM-1675A2 durchgeführt bis im wesentlichen das gesamte BBM-1675A2 und BBM-1675C in BBM-1675D umgewandelt ist, wenn es bevorzugt ist, nur das BBM-l675D-Antibiotikum herzustellen. Besonders bevorzugt wird die Hydrolyse mit einer organischen Säure wie p-Toluölsulfonsäure durchgeführt Da gefunden wurde, daß dieselben Antibiotika BBM-1675C bzw. BBM-1675D aus zwei verschiedenen Antibiotika BBM-1675A} und BBM-1675A2 unter gleichzeitigem Verlust von zwei inaktiven Fragmenten der
Formeln 1 bzw. 2 und des Thiozuckers der Formel 3 hergestellt werden können, ergibt sich ein zusätzlicher Vorteil für die Erfindung. Dementsprechend kann nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung das Verfahren zur Herstellung von BBM-1675C und BBM-1675D wie im Schema 4 illustriert auch durch selektive Hydrolyse einer Mischung vom BBM-1675Aj und Aj durchgeführt werden.
Schema 4
BBM-1675AJ + BBM-1675A2-> BBM-1675C-> BBM-1675D
Dieser Vorteil wird offensichtlich, wenn man bedenkt, daß die relativen Mengen von BBM-1675A j und A2, die in dem Fermentierungsprozeß gebildet werden, Variationen unterliegen. Die Produktion von BBM-1675C und BBM-1675D ist demgegenüber unabhängig von den relativen Mengen von BBM-1675Aj und A2, die als
Ausgangsmaterial gemäß der Erfindung verwendet werden.
Wie oben beschrieben, führt die Hydrolyse der Antibiotika BBM-1675AJ, BBM-1675A2 und BBM-1675C zu der Freisetzung eines inaktiven Thiozuckerfragmentes. Dieser Thiozucker wurde isoliert, um eine weitere Information über die chemische Struktur von BBM-1675C und damit der Antibiotika BBM-1675Aj und A2 zu erhalten. Die Verbindung nach Formel 3 wurde identifiziert als eine Mischung von α und ß Anomeren eines Thiozuckers, der die in den Schemata 2 und 3 beschriebene Struktur hat. Eine weitere Charakterisierung war nach Isolation der Produkte der Alkoholyse, der α und ß Anomere möglich. Protonenmagnetische Resonanzspektren (360 MHz) der Verbindung 3A (α-Anomer) und der Verbindung 3B (ß-Anomer) sind in den Fig. 11A bzw. 11B gezeigt. Aus einer Analyse der Spektraldaten wurden die Thiozucker-Methylglycoside nach Formel 3 versuchsweise der relativen Stereochemie der nachfolgenden Formel zugeordnet. OH ch3s
och3
Derzeit ist die absolute Stereochemie, d. h. D oder L noch nicht bestimmt Aufgrund der derzeitigen Interpretation der Spektraldaten wird dementsprechend gefolgert, daß der Thiozucker nach Formel 3 (verringert um die CH3-Gruppe des anomerischen Methoxy, welche während der Methanolyse eingeführt wurde) eine
Komponente in der Struktur des Antibiotikums BBM-1675C ist und dariiberhinaus auch eine Komponente in der Struktur der Ausgangsantibiotika BBM-1675A j und A2 ist -6-
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Es wurden die physiochemischen Eigenschaften von BBM-1675C untersucht: Beschreibung: amorpher Feststoff Löslichkeit in Methanol, Ethanol, Ethyl-Acetat, Aceton, Tetrahydrofuran und Chloroform;
Ultraviolett Absorptionsspektrum : vgl. Fig. 1
Instrument : Hewlett-Packard 8458 Lösungsmittel : Methanol
Konzentration : 0,0155 g/1
Absorptionsvermögen 21770 9340 4190 210 274 313 sh (Schulter)
Keine wesentliche Änderung wurde mit Säure oder Base beobachtet
Silicageldünnschicht-Chromatographie: Rf 0,28 mit dem Lösungsmittelsystem Toluol: Aceton (3:2, vol/vol);
Infrarot-Absorptionsspektrum: siehe Fig. 3
Instrument: Nicolet 5DX FT-IR Hauptabsorptionsbanden (KBr, Film): 540, 740, 955, 990,1017,1065,1080,1118,1150,1250,1305,1325,1340,1370, 1385,1440,1690,1705,1735,2900,2920,2930,2970,3450 cm'1
Massenspektrum: siehe Fig. 5
Instrument : Finigan 4500 TSQ
Methode : schnelle Atombombardierungs(FAB)-Ionisation
Molekular Relativ
Matrix m/z Ion Abundanz Glyzerin 856 [M + HQ + 100% Glyzerin + NaCl 878 [M + Na]+ 100% Dithiothreitol: Dithioerythritol 856 [M + EQ + 100% (3:1) (Gew: Gew)
Instrument : Kratos MS-50
Hohe Auflösung FAB (m/z) : [Μ + H]+ = 856.3362
Molekulargewicht: scheinbares Molekulargewichts 855 (bezogen auf die oben beschriebenen Massenspektraldaten)
Elementarzusammensetzung: CjgHgjNgOp^Sß (bezogen auf die oben beschriebenen Hochauflösungsdaten)
Protonenmagnetisches Resonanzspektrum: siehe Fig. 7
Instrument : WM 360 Broker Lösungsmittel : CDCI3 -7-
AT 392 971B XH NMR 360 MHz δ (ppm): 6.54 (1H, dd, J = 7.7,7.0); 6.21 (1H, brs); 5.87 (1H, d, J = 9.6); 5.78 (1H, dd, J = 9.6,1.5); 5.66 (1H, brd, J = 2.9); 4.94 (1H, dd, J = 10.3,1.8); 4.61 (1H, d, J = 7.7); 4.25 (1H, s); 4.09 (1H, q, J = 2.6); 3.97 (1H, t, J » 9.6); 3.92-3.53 (10H), 3.45 (1H, dt, J = 10.3,4.0); 3.37 (3H, s); 2.77 (1H, m); 2.69 (1H, dt, J = 9.9,5.2); 2.49 (1H, dd, J = 10.3,2.6); 2.48 (3H, s); 2.30 (2H, m); 2.13 (1H, m); 2.09 (3H, s); 1.50 (2H, m); 1.37 (3H, d, J = 5.9); 1.32 (3H, d, J = 6.3); 1.08 (6H). [Abfeld (downfield) ans Tetramethylsilan] 13C Magnetisches Resonanzspektrum : siehe Fig. 9
Instrument : WM 360 Broker Lösungsmittel : CDCI3 13C NMR 90.6 MHz δ (ppm): 13.7, 17.5, 19.8, 22.3, 22.7, 23.5, 34.2, 35.2, 39.5,47.7, 52.7, 55.8, 56.1, 57.7, 62.4, 64.7, 67.4, 69.3, 69.8,71.9,76.1,77.1,77.7,79.7,83.2, 88.4,97.3,99.7,123.4,124.6,130.1,193.1. [Abfeld (downfield) aus Tetramethylsilan]
Die physiochemischen Eigenschaften von BBM-1675D wurden untersucht:
Beschreibung: amorpher Feststoff Löslichkeit in Methanol, Ethanol, Aceton und Tetrahydrofuran und schwach löslich in Chloroform;
Ultraviolettes Absorptionsspektrum : siehe Fig. 2
Instrument : Hewlett-Packard 8458 Lösungsmittel : Methanol
Konzentration : 0,01 g/1
Xmax (nm) 214 274 325
Keine signifikante Änderung wurde mit Säure oder Base beobachtet. Siücagel-Dünnschicht-Chromatographie:
Rf 0,22 mit dem Lösungsmittelsystem Chloroform:Methanol (5:0,5, vol/vol).
Umkehrphasen-Silicagel-Dünnschicht-Chromatographie Rf 0,37 mit dem Lösungsmittelsystem Methanol: Wasser (70:30, vol/vol);
Infrarot-Absorptionsspektrum: siehe Fig. 4
Instrument : Nicolet 5DX FT-IR Hauptabsorptionsbanden (KBr, Film) 735, 755, 910, 960,1000,1020,1085,1150,1195,1250,1310,1335,1365,1385,1445,1510, 1685,1720,1735,2880,2930,2960,3400 cm'1
Massenspektrum : siehe Fig. 6
Instrument : Finigan 4500 TSQ
Methode : schnelle Atombeschuß (FAB)-Ionisation
Matrix : Thioglyzerin
Molekularion (m/z) : [M + H] + = 696
Relative Abundanz : 100%
Instrument : Kratos MS-50
Hochauflösungs FAB (m/z): [Μ + H]+ = 696.2794 -8-
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Molekulargewicht: scheinbares Molekulargewicht=695 (bezogen auf die oben beschriebenen Massenspektraldaten)
Elementaizusammensetzung: (bezogen auf die oben beschriebenen Hochauflösungsdaten)
Die Korrelation von [Μ + H] + und [(Μ + H) + 2] + relativen Abundanzen zu ihren berechneten Werten bestätigt die aus den Hochauflösungs-FAB-Messungen abgeleiteten Elementarzusanunensetzungen.
Protonenmagnetisches Resonanzspektrum: siehe Fig. 8
Instrument : WM 360 Bruker
Lösungsmittel : CDCI3 + 10 % CD3OD *H NMR 360 MHz δ (ppm): 6.43 (1H, dd, J=4.4,10.3); 6.13 (1H, s); 5.81 (1H, d, J=8.8); 5.70 (1H, d, J=8.8); 5.48 (1H, 6 brs); 4.48 (1H, d, J=8.1); 4.02 (1H, d, J=2.0); 3.95-3.80 (solvent background); 3.77 (1H, t, J=9.0); 3.70-3.40 (11H, brm); 3.35 (1H, m); 3.28 (3H, s); 3.22 (3H, brs); 2.66-2.55 (2H, m); 2.38 (3H, s); 2.23-2.12 (2H, m); 1.42 (1H. brdt); 1.22 (3H, d, J=5.9); 0.94 (3H, d, J=6.6); 0.87 (3H, d, J=5.9). [Abfeld (downfield) aus Tetramethylsilan] *3C magnetisches Resonanzspektrum: siehe Fig. 10A und 10B Instrument : WM 360 Bruker
Lösungsmittel : CDCI3 + 10 % CD3OD 13C NMR 90.6 MHz δ (ppm): 17.5, 21.6, 22.2, 23.0, 33.4, 39.2, 46.4, 52.3, 55.8, 62.1, 67.8, 69.8, 70.1, 71.3, 75.8, 77.1, 78.1, 82.4, 83.3, 88.2,97.4,99.6,122.6,124.8,130.1,130.8,134.3,148.7,192.8. [Abfeld (downfield) aus Tetramethylsilan]
Nachfolgend werden die biologischen Eigenschaften da* BBM-1675-Substanzen geschildert Die antimikrobielle Aktivität der BBM-1675-Substanzen wurde gegenüber ein«: Anzahl von gram-positiven und gram-negativen Mikroorganismen bestimmt. Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt Daten in der Form der Ergebnisse eines antimikrobiellen screening Verfahrens, das die Muttersubstanz BBM-1675Aj und die erfindungsgemäßen Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D umfaßte. Bei dem Screening-Verfahren wurde jede Testsubstanz in Form eines Papierstreifens, der mit einer einheitlichen Konzentration von 10 μg/ml Lösung imprägniert wurde, auf die Wachstumskultur gegeben. Das Maß der antibiotischen Aktivität ist die sich aus dem Papierstreifen ergebende Inhibitionszone. Wie in Tabelle 1 gezeigt, zeigten die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D ein breites Spektrum antimikrobieller Aktivität, welche mindestens so groß war wie die von BBM-1675Aj. Die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D waren insbesondere aktiver als Inhibitoren gegen gram-negative Organismen.
Tabelle I
Antimikrobielle Aktivität von BBM-1675 Substanzen
Inhibitionszone, mm
Test Microorganismus BBM-1675Ä! BBM-1675C BBM-1675D Escherichia coli AS 19 22 52 51 Escherichia coli K12 13 36 35 Escherichia coli P1373 12 34 33 Escherichia coli R Azaserine 14 35 34 Escherichia coli R Netropsin 11 32 32 Escherichia coli R Mitomycin C 12 35 34 Escherichia coli R Bleomvcin 16 38 36 Escherichia coli R Daunomycin 19 45 44 Escherichia coli R Neomycin 24 53 52 -9-
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Tabelle I (Fortsetzung)
Antimikrobielle Aktivität von BBM-1675 Substanzen
Inhibitionszone, mm
TestMicroorganismus BBM-1675Aj BBM-1675C BBM-1675D
Escherichia coli R Sibiromycin Escherichia coli R Hedamvcin Escherichia coli R Aclacinomycin Bacillus subtilis ATCC 6633 . Klebsiella pneumoniae Staphylococcus 209 P Staphvlococcus R Actinoleukin Staphylococcus R Streptonigrin
Staphvlococcus aureus Smith R Actinomycin D Staphvlococcus aureus Smith R Aureolsäure (Mitramycin) Acinetobacter Saccharomyces cerevisiae petite 14 32 30 14 30 25 15 41 40 34 43 41 17 35 35 32 47 44 33 35 33 37 50 48 30 39 38 36 47 45 40 55 53 17 32 31 16 33 32 35 57 55 22 42 43 R = resistent gegenüber genanntem Antibiotikum Die Aktivität gegen P-388 Leukämie wurde untersucht:
Die Tabellen II und ΙΠ enthalten die Ergebnisse von Labortests mit CDFj-Mäusen, denen intraperitoneal ein
Tumor Inokulum von 10^ Asziteszellen von P-388 Leukämie eingepflanzt und die mit verschiedenen Dosen von BBM-1675A}, C oder D behandelt wurden. Die Substanzen wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht.
Gruppen von 6 Mäusen wurden für jede Dosismenge verwendet Sie wurden mit einer Einzeldosis der Substanz einen Tag nach der Inokulation behandelt. Eine Gruppe von 10 mit Kochsalzlösung (Träger) behandelten Kontrollmäusen wurde in jede Serie von Experimenten mit einbezogen. Die mit BBM-1675A behandelte Gruppe in Tabelle ΙΠ wurde in den direkten Vergleich mit einbezogen. Ein 30-tägiges Protokoll wurde geführt. Notiert wurde die für jede Mäusegruppe bestimmte mittlere Überlebenszeit in Tagen und die Anzahl an Überlebenden am Ende der 5-Tages-Periode. Die Mäuse wurden vor der Behandlung gewogen und wiederum an Tag 4. Die Gewichtsänderung wurde genommen als ein Maß für die Toxizität der Probe. Es wurden jeweils Mäuse mit 20 g Gewicht verwendet, und ein Gewichtsverlust bis zu annähernd 2 g wurde nicht als übermäßig angesehen. Die mit dem Träger behandelten Kontrolltiere starben normalerweise innerhalb von 9 Tagen. Die Ergebnisse wurden berechnet in Ausdrücken von % T/C, das ist das Verhältnis der mittleren Überlebenszeit der behandelten Gruppe zu der mittleren Lebenszeit der mit dem Träger behandelten Kontrollgruppe x 100. Ein Effekt ausgedrückt in % T/C = 125 zeigt, daß ein signifikanter Antitumoreffekt erreicht wurde. Die Screeningergebnisse nach Tabelle II zeigen den anfänglich unerwarteten Spiegel von Antitumor-Aktivität der BBM-1675C-Substanz. In Tabelle III sind die Ergebnisse eines direkten Vergleichs von BBM-1675A^ (Esperamicin Aj) und der Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D wiedergegeben. Die Daten lassen erkennen, daß BBM-1675C ungefähr vergleichbar ist mit BBM-1675Aj in Bezug auf Stärke und Antitumorwirksamkeit und daß es nicht veräbreichungsabhängig ist, während BBM-1675D nur geringfügig weniger wirksam ist.
Weiterhin ist bereits darauf hingewiesen worden, daß gern, der Erfindung dieselben Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D auch aus der Komponente BBM-1675A2 (Esperamicin A2) gewonnen werden können. Im Vergleich zu den berichteten Daten für BBM-1675C und BBM-1675D und die Daten, die in der GB-PS 2,141,425 für BBM-1675A2 angegeben sind, wurde überraschenderweise gefunden, daß die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D als Antitumor-Mittel wirksamer sind als die Muttersubstanz BBM-1675A2, aus der sie abgeleitet sind. -10-
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Tabelle Π
Wiikung von BBM-1675C auf P-388 Leukämie (Behandlung am Tag 1)
Verbindung Dosis, IP mg/kg/inj. MST Tage Wirkung MST %T/C AWC g Tag 4 BBM-1675C 3.2 TOX TOX . 0.8 TOX TOX - 0.2 TOX TOX - 0.05 TOX TOX -1.8 0.0125 11.0 122 -2.5 0.003125 13.5 150 -2.5 Träger . 9.0 100 0.3
Tumor Inoculum: 10^ Asziteszellen i.p. implantiert
Wirt: CDFj männliche Mäuse
Auswertung: MST = mittlere Überlebenszeit
Wirkung: % T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle) x 100
Kriterien: % T/C > 125 wird als signifikante Antitumor-Aktivität erachtet AWC: mittlere Gewichtsänderung (behandelte Kontrolle) in Gramm (an Tag 4)
IabeHe.ni
Wirkung von BBM-1675-Substanzen auf P-388 Leukämie
Verbindung Behandlung Verabreichung Dosis, IP mg/kg/inj. MST Tage Effekt MST %T/C BBM-1675AJ Tag 1 0.0512 TOX TOX 0.0256 TOX TOX 0.0128 TOX TOX 0.0064 15.5 172 0.0032 15.0 167 0.0016 15.5 172 0.0008 12.5 139 0.0004 12.0 133 0.0002 11.0 122 0.0001 11.5 128 BBM-1675C Tag 1 0.0256 TOX TOX 0.0128 TOX TOX 0.0064 11.5 128 0.0032 14.5 161 0.0016 10.5 117 0.0008 12.0 133 0.0004 11.5 128 0.0002 11.0 122 0.0001 11.0 122 0.00005 10.5 117 BBM-1675D Tag 1 0.0256 9.0 100 0.0128 11.5 128 0.0064 12.5 139 11-
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Tabelle ΠΙ (Fortsetzung
Wirkung von BBM-1675-Substanzen auf P-388 Leukämie
Verbindung Behandlung Verabreichung Dosis, IP mg/kg/inj. MST Tage Effekt MST %T/C AMC g Tag 4 Überlebende Tag 5 BBM-1675D Tag 1 0.0032 12.0 133 0.1 6/6 0.0016 11.5 128 0.8 6/6 0.0008 10.0 111 0 2 6/6 0.0004 10.0 111 0.5 6/6 i 0.0002 9.5 106 1.7 6/6 0.0001 9.5 106 1.7 6/6 0.00005 9.0 100 2.0 6/6 BBM-1675C Tag 1-5 0.0032 16.0 178 -1.3 6/6 0.0016 13.5 150 -1.0 6/6 0.0008 13.5 150 -0.3 6/6 0.0004 12.0 133 -0.4 6/6 0.0002 12.0 133 -0.4 6/6 0.0001 11.0 122 -0.4 5/6 0.00005 11.0 122 0.9 6/6 0.000025 8.5 94 22 6/6 0.0000125 8.0 89 2.4 6/6 0.00000625 8.0 89 2.4 6/6 Träger - 9.0 100 2.4 10/10
Tumor Inoculum: 10^ Asziteszellen i.p. implantiert
Wirt: CDFj weibliche Mäuse
Auswertung: MST = mittlere Überlebenszeit
Wirkung: % T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle) x 100
Kriterien: % T/C > 125 wird als signifikante Antitumor-Aktivität erachtet AWC: mittlere Gewichtsänderung (behandelt - Kontrolle) in Gramm (an Tag 4)
Die Aktivität gegen B16 Melanom wurde untersucht:
Tabelle IV enthält die Ergebnisse von Antitumor-Tests unter Verwendung von B16 Melanom, das in Mäusen gewachsen ist. BDFj-Mäusen wurde das Tumorimplantat subkutan inokuliert. Ein 60-Tage-Protokoll wurde verwendet Gruppen von 10 Mäusen wurde für jede Dosismenge getestet Die mittlere Überlebenszeit für jede Gruppe wurde bestimmt. Kontrolltiere, die in der gleichen Weise wie die Testtiere inokuliert wurden und mit dem Injektionsträger ohne die Droge behandelt wurden, zeigten eine mittlere Überlebenszeit von 22,5 Tagen. Für jeden Dosisspiegel wurden die Testtiere mit der Testverbindung an den Tagen 1,5 und 9 durch intraperitoneale Injektion behandelt. Ein Effekt ausgedrückt in % T/C > 125 zeigt einen signifikanten Antitumor-Effekt an. Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß in einem direkten Vergleich BBM-1675 C ebenfalls wirksam in der Behandlung von B16 Melanom-tragende Mäusen ist und daß die Potenz ungefähr vergleichbar der von BBM-1675A! ist. -12-
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Tabelle IV
Effekt von BBM-1675-Substanzen auf B16 Melanom (Behandlungen an Tag 1,5 und 9)
Verbindung Dosis, IP mg/kg/Inj. MST Tage Effekt MST %T/C AWC g Tag 12 Überlebende Tag 10 BBM-1675Aj 0.0032 37.5 167 0.3 10/10 0.0016 37.5 167 0.3 10/10 0.0008 38.5 171 1.4 10/10 0.0004 37.0 164 1.8 10/10 0.0002 34.5 153 2.0 10/10 0.0001 32.0 142 1.9 10/10 BBM-1675C 0.0008 31.5 140 0.6 10/10 0.0004 37.0 164 1.2 10/10 0.0002 31.0 138 0.6 10/10 0.0001 31.5 140 1.0 10/10 0.00005 27.5 122 0.8 10/10 0.000025 25.0 111 0.5 10/10 Träger - 22.5 100 0.3 10/10
Tumor Inokulum: 0.5 ml eines 10%-igen Breis
Wirt: BDFj weibliche Mäuse
Auswertung: MST = mittlere Überlebenszeit
Effekt: % T/C = (MST behandelt/MST Kontrolle) x 100
Kriterium: % T/C > 125 wird als signifikante Antitumor-Aktivität erachtet AWC: mittlere Gewichtsänderung (behandelt - Kontrolle) in Gramm (an Tag 12)
Wie sich aus den obigen antimikrobiellen und Mäusetumor-Daten ergibt, sind BBM-1675C und BBM-1675D wertvoll als Antibiotika in der therapeutischen Behandlung von Säugern und anderen Tieren bei infektiösen Krankheiten und auch als Antitumor-Mittel für die therapeutische Inhibierung des Wachstums von Säugertumoren.
Es besteht daher die Möglichkeit zur therapeutischen Behandlung eines tierischen Wirts, der durch eine mikrobielle Infektion oder einen malignen Tumor beeinträchtig ist, in dem dem Wirt eine wirksame antimikrobielle oder tumorinhibierende Dosis von BBM-1675C oder BBM-1675D oder eine pharamazeutische Zusammensetzung derselben verabreicht wird.
Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen enthalten eine wirksame antimikrobielle oder tumorinhibierende Menge an BBM-1675C oder BBM-1674D in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptierbaren Träger oder Verdünnungsmittel. Solche Zusammensetzungen können auch andere aktive antimikrobiellen oder Antitumor-Mittel enthalten und können in jeder pharmazeutischen Form auf bereitet sein, die für die gewünschte Verabreichungsform geeignet ist Beispiele für solche Zusammensetzungen umfassen feste Zusammensetzungen für die orale Verabreichung wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granulate, flüssige Zusammensetzungen für die orale Verabreichung wie Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixire, und Präparationen für die parenterale Verabreichung wie sterile wäßrige oder nichtwäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie können auch in der Form von sterilen festen Zusammensetzungen, welche in sterilem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder einem anderen sterilen Injektionsmedium kurz vor der Anwendung aufgelöst werden, hergestellt sein. Für die Verwendung als antimikrobielles Mittel wird das BBM-1675C oder BBM-1675D oder eine pharmazeutische Zusammensetzung daraus so verabreicht, daß die Konzentration des aktiven Bestandteils größer ist als die minimale Inhibitions-Konzentration für den jeweiligen zu behandelnden Organismus. Für die Verwendung als Antitumormittel kann die optimale Dosierung und Handhabung von BBM-1675C oder BBM-1675D für einen gegebenen Säugerwirt vom Fachmann leicht sichergestellt werden. Dabei ist es verständlich, daß die tatsächlich verwendete Dosis von BBM-1675C oder BBM-1675D in Abhängigkeit von der jeweiligen formulierten Zusammensetzung, der Art der Verabreichung und dem jeweiligen Situs, Wirt und der zu behandelnden Krankheit variiert. Weitere Faktoren, die die Wirkung des Mittels beeinflussen können, sind in -13-
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Betracht zu ziehen, wie Alter, Gewicht, Geschlecht, Diät, Verabreichungszeit, Verabreichungsweg, Ausscheidungsrate, Kondition des Patienten, Arzneimittelkombinationen, reaktive Sensitivitäten und Schwere der Krankheit. Die Verabreichung kann kontinuierlich oder periodisch innerhalb der maximal tolerierten Dosis erfolgen. Optimale Verabreichungsraten für gegebene Bedingungen kann der Fachmann anhand herkömmlicher Tests zur Bestimmung der Dosis im Zusammenhang mit den obigen Richtlinien sicherstellen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung von bevorzugten Ausführungsformen für die Herstellung von BBM-1675C und BBM-1675D.
Beispiel 1
Eine Probe von BBM-1675Aj (50 mg) wurde in 2,5 ml Methanol gelöst und mit 2,5 ml einer 0,1 molaren Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol behandelt Man ließ die Reaktion bei einer Temperatur von ca. 50 °C fortschreiten und überwachte das Verschwinden des Ausgangsmaterials (annähernd 30 min.), in dem man alle 5-10 min. eine Dünnschichtchromatographie (TLQ auf Silicagelplatten (Analtech, 250 micron, GF) mit Toluol zu Aceton (3:2, vol/vol) als Elutionsmittel durchführte. Nachdem das Ausgangsmaterial verbraucht war, wurde die Reaktionsmischung mit einer gesättigten Lösung von NaHCC^ in Methanol neutralisiert und dann unter vermindertem Druck eingedampft, wobei ein trockener, die bioaktiven Fragmente enthaltender Rückstand erhalten wurde. Die Substanz BBM-1675C wurde aus dem Rückstand durch schnelle Säulenchromatographie auf einer 2 cm (Durchmesser) mal 10 cm Säule, die mit Woelm Silicagel (32-63 micrometer Teilchengröße) gepackt war, isoliert. Die Säule wurde mit Toluol:Aceton (3:2, vol/vol) eluiert, wobei 3 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Jede Fraktion wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) [Silicagel mit Toluol:Aceton (3:2, vol/vol) als Eluiermittel] analysiert, und die Flecken der Dünnschichtchromatographie wurden mit einer UV-Lichtquelle von 254 μιη und einem Cersulfat-Spray (1 % Cersulfat und 2,5 % Molybdänsäure in 10 % Schwefelsäure) sichtbar gemacht. Fraktionen 6-12 (Rj-Wert für BBM-1675C ist 0.28) wurden zusammengefaßt und zur Trockne eingedampft, wobei 12 mg (35 %) im wesentlichen eines BBM-1675C erhalten wurden.
Die physikochemischen Eigenschaften von BBM-1675C sind in der vorhergehenden Beschreibung aufgefühlt, und die Ultraviolett-, Infirarot-, Massen-, *H NMR- und ^C NMR-Spektren der Verbindung sind in den Fig. 1, 3,5,7 und 9 dargestellt.
Beispiel 2
Wird die Reaktionsdauer des Verfahrens nach Beispiel 1 ausgedehnt, dann nimmt die Menge an BBM-1675C ab und zwei neue Produkte, bezeichnet als Verbindung 3 (Rf= 0.65) und BBM-1675D (Rf bleibt an der Basislinie) [ILC: Silica, Toluol: Aceton (3:2, vol/vol)], erscheinen und nehmen im Lauf der Zeit in der Menge zu.
Verbindung BBM-1675D, welche normalerweise die Herstellung von BBM-1675C begleitet, wurde aus der im Beispiel 1 beschriebenen Chromatographiesäule isoliert, indem die Säule mit Chlorofom:Methanol (5:1, vol/vol) eluiert wurde. Die richtigen Fraktionen wurden zusammengefaßt und zur Trockne eingedampft, wobei 18 mg im wesentlichen reines BBM-1675D nach dem in Beispiel beschriebenen Verfahren erhalten wurden.
Die Substanz BBM-1675D zeigt einen Hauptfleck bei Rf= 0.37 in der Umkehrphasen-Dünnschichtchromatographie (Whatman MKT^gF, 200 Mikrometer) unter Verwendung von 30 % Wasser in Methanol als Eluiermittel und bei Rf = 0.22 in Normalphasen-Dünnschichtchromatographie (TLC) unter Verwendung von Chloroform:Methanol (5:0.5, vol/vol) als Eluiermittel.
Beispiel 3
Eine wesendiche Verbesserung der Ausbeute von BBM-1675D kann erzielt werden unter Verwendung von p-Toluolsulfonsäure anstelle von Chlorwasserstoff bei der chemischen Hydrolyse von BBM-1675A2 oder BBM-1675Aj, wie dies in den Verfahrensweisen der Beispiele 3 bzw. 5 erläutert ist.
Eine Probe von BBM-1675A2 (15,2 mg) wurde mit einer 0.03 molaren Lösung von p-Toluolsulfonsäure in
Methanol (1 ml) bei einer Temperatur von ca. 360 °C während ca. 1 Stunde hydrolisiert. Die Reaktionsmischung wurde dann unter vermindertem Druck bei ca. 30 °C zur Trockne eingedampft. Die Substanz BBM-1675D wurde aus dem trocknen Rückstand durch schnelle Säulenchromatographie auf einer mit Woelm Silicagel (32-63 Mikrometer Teilchengröße) isoliert Die Säule wurde mit Chloroform:Methanol (5:0.5, vol/vol) eluiert und die gesammelten Fraktionen wurden durch Dünnschichtchromatographie [(Silicagel mit Chloroform:Methanol (5:0.5, vol/vol) als Eluiermittel] analysiert. Die angewendeten Bedingungen der Chromatographie erlaubten die Abtrennung der Mischung der inaktiven Verbindungen 2 und 3 (7 mg) von der bioaktiven Substanz BBM-1675D, welche einen Rf-Wert von 0.22 hatte. Die richtigen Fraktionen wurden zusammengefaßt und zur Trockne eingedampft, wobei 8 mg im wesentlichen reines BBM-1675D in nahezu quantitativer Ausbeute «halten wurden.
Die physikochemischen Eigenschaften von BBM-1675D sind in der Beschreibung erwähnt, und die -14-
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Ultraviolett-, Infrarot-, Massen-, NMR- und NMR-Spektren der Verbindung sind in den Figuren 2,4,6, 8 bzw. 10A und 10B dargestellt.
Beispiele
Eine Probe von BBM-1675A2 (40 mg) wurde mit 5 ml einer 0.5 molaren Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol bei ca. 50 °C während ca. 2 Stunden nach der allgemeinen Verfahrensweise und Isolationsmethode nach Beispiel 1 behandelt Nach der Neutralisierung mit NaHCOß und Eindampfen zur Trockne wurde die BBM-1675C-Substanz aus dem Rückstand durch schnelle Säulenchromatographie auf einer Säule, die mit Woelm Silicagel (32-63 mikrometer Teilchengröße) gepackt war unter Verwendung von Toluol: Aceton (3:2, vol/vol) als Eluiermittel isoliert Die richtigen Fraktionen wurden kombiniert und zur Trockne eingedampft, wobei 8,4 mg im wesentlichen reines BBM-1675C erhalten wurden, welches identisch mit dem im Beispiel 1 erhaltenen Produkt ist
Die obige Chromatographiesäule wurde dann mit Chloroform:Methanol (5:0.25, vol/vol) eluiert und die gesammelten Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft wobei BBM-1675D erhalten wurde. Die Substanz BBM-1675D wurde weiter gareinigt durch eine zusätzliche Schnellchromatographiesäule mit Silicagel unter Verwendung von Chloroform:Methanol (5:0.5, vol/vol) als Eluiermittel. Die richtigen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft wobei 6,3 mg im wesentlichen reines BBM-1675D erhalten wurde, welches identisch mit dem Produkt nach Beispiel 3 ist
Beispiel 5
Eine Probe BBM-1675Aj (49,3 mg) wurde mit einer 0.037 M-Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol (1,5 ml) bei einer Temperatur von ca. 60 °C während ca. 1,5 Stunden hydrolisiert. Die Reaktionsmischung wurde zur Trockne unter vermindertem Druck bei ca. 30 °C eingedampft, wobei ein Rückstand erhalten wurde, welcher BBM-1675D und die inaktiven Verbindungen 1 und 3 enthielt Die bioaktive Substanz BBM-1675D wurde aus dem Rückstand durch schnelle Säulenchromatographie auf einer Säule, welche mit Woelm Silicagel (32-63 mikrometer Teilchengröße) gepackt war, unter Verwendung von Chloroform:Methanol (5:0,25, vol/vol) als Eluiermittel isoliert Die richtigen Fraktionen wurden vereinigt und zur Trockne eingedampft wobei 27 mg im wesentlichen reines BBM-1675D erhalten wurden, welches identisch ist mit dem im Beispiel 3 isolierten Produkt
Beispiel 6
Eine Probe von BBM-1675C (5,1 mg) wurde mit einer 0.5 molaren Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol (1 ml) bei ca. 40-50 °C über Nacht hydrolisiert Nach Neutralisation mit NaHCOß und Eindampfen zur
Trockne wurde die bioaktive Substanz BBM-1675D aus dem Rückstand durch schnelle Säulenchromathographie auf einer Säule, die mit Woelm Silicagel (32-63 mikrometer Teilchengröße) gepackt war, unter Verwendung von Chloroform:Methanol (5:0.5, vol/vol) als Eluiermittel isoliert. Die richtigen Fraktionen ergaben im wesentlichen reines BBM-1675D, welches mit dem im Beispiel 3 isolierten Produkt identisch ist.
Beispiel 7
Wird die allgemeine Verfahrensweise der Beispiele 1 und 2 wiederholt mit der Ausnahme, daß das Ausgangsmaterial BBM-1675Aj durch eine equimolare Menge einer Mischung aus BBM-1675Aj und BBM-1675A2 ersetzt wird, dann werden die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D ebenfalls gebildet
Beispiel 8
Wenn die allgemeine Verfahrensweise nach Beispiel 5 wiederholt wird, mit der Ausnahme, daß das Ausgangsmaterial BBM-1675Aj durch eine equimolare Menge einer Mischung aus BBM-1675Aj und BBM-1675A2 ersetzt wird, dann wird ebenfalls die Substanz BBM-1675D gebildet -15-

Claims (4)

  1. AT 392 971B PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikums BBM-1657C, dadurch gekennzeichnet, daß die antibiotisch wirksamen Substanzen BBM-1675Aj oder BBM-1675A2 oder eine Mischung beider mit 0,05 bis 0,5 molarer alkoholischer Salzsäure bei einer Temperatur bis zu 50 bis 60 °C bis zum DSC (dünnschichtchromatographisch) überwachten Verschwinden der Ausgangssubstanz hydrolysiert werden und daß die Reaktionsmasse mit Bikarbonat neutralisiert und aus dem Reaktionsprodukt das BBM-1675C durch präparative Chromatographie isoliert wird. i
  2. 2. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikums BBM-1675D, dadurch gekennzeichnet, daß die antibiotisch wirksamen Substanzen BBM-1675Aj oder BBM-1675A2 oder eine Mischung beider mit 0,05 bis 0,5 molarer alkoholischer Salzsäure oder mit 0,03 bis 0,04 molarer p-Toluolsulfonsäure über das DSC-überwachte Verschwinden der Ausgangssubstanz hinaus hydrolysiert werden und daß die Reaktionsmasse mit Bikarbonat neutralisiert und aus dem Reaktionsprodukt das BBM-1675D durch präparative Chromatographie isoliert wird.
  3. 3. Abänderung des Verfahrens nach Anspruch 1 zur Herstellung des neuen Antitumor-Antibiotikums BBM-1675D, dadurch gekennzeichnet, daß das nach dem Verfahren von Anspruch 1 gewonnene BBM-1675C mit 0,05 bis 0,5 molarer alkoholischer Salzsäure oder mit 0,03 bis 0,04 molarer p-Toluolsulfonsäure bis zum DSC-überwachten Verschwinden der Ausgangssubstanz hydrolysiert, die Reaktionsmasse mit Bikarbonat neutralisiert und aus dem Reaktionsprodukt das BBM-1675D Auch präparative Chromatographie isoliert wird.
  4. 4. Verwendung der gemäß den vorstehenden Ansprüchen 1 bis 3 hergestellten Antitumor-Antibiotika BBM-1675C und/oder D zur Herstellung einer tumorinhibierenden bzw. antimikrobiellen pharmazeutischen Zusammensetzung. Hiezu 13 Blatt Zeichnungen -16-
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