FR2586686A1 - Nouvelles substances antibiotiques et antitumorales, procede pour leur obtention et isolation; compositions pharmaceutiques les contenant - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENTION CONCERNE DE NOUVELLES SUBSTANCES ANTIBIOTIQUES ET ANTITUMORALES, LEURS PROCEDES D'OBTENTION ET D'ISOLATION AINSI QUE DES COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES LES CONTENANT. SELON L'INVENTION, LES SUBSTANCES BBM-1675C ET BBM-1675D ONT ETE OBTENUES PAR HYDROLYSE CHIMIQUE SELECTIVE DES COMPOSANTS BIOLOGIQUEMENT ACTIFS BBM-1675A (ESPERAMICINE A) OU BBM-1675A (ESPERAMICINE A). L'INVENTION PERMET NOTAMMENT LA REALISATION DE COMPOSITIONS PHARMACEUTIQUES ANTIMICROBIENNES ET ANTITUMORALES.

Description

La présente invention a essentiellement pour objet de nouvelles substances

antibiotiques et antitumorales,

ainsi qu'un procédé pour leuisobtention et isolation.

L'invention vise également les compositions pharma-

ceutiques contenant ces nouvelles substances qui constituent

un agent antimicrobien et antitumoral.

Les composés antitumoraux conformes à la présente invention n'ont pas encore été identifiés en termes de structure. Cependant, au regard de leurs propriétés

physiques, chimiques et biologiques uniques, les antibio-

tiques BBM-1675C et BBM-1675D de i'invention, constituent

des substances nouvelles.

La demande de brevet britannique N 2 141 425, publiée le 19 Décembre 1984, révèle un nouveau complexe antibiotique et antitumoral appelé BBM1675, obtenu par fermentation d'une souche H964-92 (ATCC 39334) Actinomadura verrucosospora ou une souche A1327Y (ATCC 39638) Actinomadura verrucosospora. Deux composants bioactifs majeurs du complexe BBM-1675 décrit dans cette demande ont été désignés BBM-1675A1 et BBM-1675A2. Les structures des antibiotiques BBM-1675A1 et BBM-1675A2, également connus sous le nom d'espéramicine A1 et espéramicine A2, respectivement, n'ont pas été jusqu'à présent élucidées, mais ces deux composants présentent d'excellentes activités

antimicrobienne et antitumorale -

Le brevet américain N 4 530 835, délivré le 23 Juillet 1985 au nom de Bunge et al, révèle un procédé de fermentation d'une souche isolée d'Actinomycete non

identifiée WP-444 (ATCC 39363) pour l'obtention d'anti-

biotiques antitumoraux désignés CL-1577A et CL-1577B.

Les structures des antibiotiques CL-1577 n'ont pas été jusqu'à présent élucidées, mais leurs propriétés caractéris- tiques indiquent que CL1577A et CL-1577B sont simulaires relativement à la structure aux antibiotiques BBM-1675, et en particulier BBM-1675A1 et BBM-1675A2 mentionnés dans la

demande de brevet britannique précitée N 2 141 425.

La publication J. Antibiotics,37(12), 1566-1571 (1984) (R. H. Bunge et al) révèle la fermentation de Actinomadura sp. (ATCC 39363) pour l'obtention d'un complexe biologiquement actif dont les deux composants essentiels

PD 114 759 et PD 115 028 ont été isolés. Dans la pulbica-

tion J. Chem. Soc. Chem. Commun., 919-920 (1985), J. H. Wilton et al, on a décrit la structure partielle élucidée des antibiotiques PD 114 759 et PD 115 028. L'obtention, l'isolation et la caractérisation des antibiotiques PD 114 759 et PD 115 028 apparaissent être identiques à celles des antibiotiques CL-1577A et CL-1577B précités, respectivement. La demande de brevet européen N 95 154, publiée le 30 Novembre 1983 révèle la fermentation d'Actinomadura pulveraceus sp. nov. N 6049 (ATCC 39100) pour l'obtention

d'antibiotiques antitumoraux désignés WS 6049-A et WS 6049-B.

Les structures des antibiotiques WS-6049 n'ont pas été

élucidées jusqu'à présent, mais les propriétés caractéris-

tiques données pour ces antibiotiques indiquent que WS 6049-A et WS 6049B sont proches par leur structure des antibiotiques BBM-1675 révélés par la demande de brevet britannique N 2 141 425 et des antibiotiques CL1577 révélés par le brevet américain N 4 530 835. Les données spectrales montrent, cependant, que ni WS 6049-A ni

WS 6049-B n'est identique à l'un des composants de BBM-1675.

De plus, l'organisme producteur décrit dans la demande de brevet européen N 95 154 peut être clairement différencié de Actinomadura verrucosospora utilisé dans la demande de brevet britannique N 2 141 425 de par la couleur du mycélium aérien sur milieu ISP N 2, 3 et 4, sa peptonisation positive au lait et son utilisation positive de D-fructose,

D-mannitol, tréhalose et cellulose.

L'objet de la présente invention est de fournir de nouvelles substances antibiotiques et antitumorales désignées BBM-1675C et BBM-1675D, également BMY-27305 et BMY-27307, respectivement, lesdites substances étant obtenues par hydrolyse chimique sélective des composants biologiquement actifs BBM-1675A1 (espéramicine A1) ou BBM-1675A2 (espéramicine A2) qui sont eux-mêmes obtenus

par culture d'une souche productrice de BBM-1675 Actino-

madura verrucosospora. Les substances biologiquement actives BBM-1675C et BBM-1675D peuvent être séparées et purifiées par des processus de chromatographie traditionnels et ces deux substances présentent une activité antitumorale

et antimicrobienne excellente.

L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci

apparaîtront plus clairement au cours de la description

explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels: - la figure 1 représente le spectre d'absorption ultraviolet de BBM-1675C, - la figure 2 représente le spectre d'absorption ultraviolet de BBM-1675D, - la figure 3 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-1675C (KBr, film), - la figure 4 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-1675D (KBr, film), la figure 5 représente le spectre de masse de

BBM-1675C,

- la figure 6 représente le spectre de masse de

BBM-1675D,

- la figure 7 représente le spectre de résonance-

magnétique du proton de BBM-1675C dans CDCl3 (360 MHz), - la figure 8 représente le spectre de résonance magnétique du proton de BBM-1675D dans CDCl3 + 10% CD30D (360 MHz), - la figure 9 représente le spectre de résonance magnétique du 13C de BBM-1675C dans CDCl3 ( 90,6 MHz), - la figure 1OA représente le spectre de résonance magnétique du 13C (110-200 ppm) de BBM-1675D dans CDCl3 + 10% CD30D (90,6 MHz), - la figure lOB représente le spectre de résonance magnétique du 13C (0-110 ppm) de BBM1675D dans CDCi3 + 10% CD30D (90,6 MHz), - la figure 11A représente le spectre de résonance magnétique du proton du composé 3A (O<-anomère) dans CDCl3 (360 MHz), et - la figure 118 représente le spectre de résonance magnétique du proton du composé 3B (/3-anomère) dans

CDCl3 (360 MHz).

Comme on l'a vu, la présente invention concerne deux nouvelles substances antibiotiques antitumorales désignées BBM-1675C et BBM-1675D, également désignés BMY-27305 et BMY-27307, respectivement, ces substances étant obtenues par hydrolyse chimique sélective des composants biologiquement actifs BBM-1675A1 (espéramicine A1) ou BBM-1675A2 (espéramicine A2) qui sont eux-mêmes obtenus par culture d'une souche produisant BBM-1675 d'Actinomadura verrucosospora, et préférentiellement d'une souche Actinomaduraverrucosospora H964-92 (ATCC 39334) ou d'une souche Actinomadura verrucosospora A1327Y (ATCC 39638) ou d'un mutant de ces souches. Selon un autre aspect, la présente invention fournit un procédé d'obtention de la substance BBM-1675C par hydrolyse sélective des composants biologiquement actifs BBM-1675A1 ou BBM-1675A2 Selon une autre caractéristique, la présente invention fournit

un procédé de séparation de BBM-1675D par hydrolyse sélec-

tive de la substance BBM-1675C ou, plus préférentiellement, à partir des composants biologiquement actifs BBM-1675A1 ou BBM-1675A2. L'isolation et la purification de BBM-1675C et BBM-1675D du mélange réactionnel peut être accomplie

par des processus de chromatographie traditionnels.

Les substances biologiquement actives BBM-1675C et BBM-1675D présentent une activité antimicrobienne

contre une grande variété de microorganismes et on a égale-

ment montré que ces substances présentent une activité inhibitrice contre des systèmes tumoraux variés de souris, tels que leucémie P-388 et mélanome B16. Les substances nouvellement décrites conformes à la présente invention, par conséquent, peuvent être utilisées comme agents antimicrobiens ou. comme agents antitumoraux pour inhiber

les tumeurs chez les mammifères.

Lors des études de dégradation réalisées pour élucider la structure des antibiotiques antitumoraux BBM-1675A1 (espéramicine A1) et BBM-1675A2 (espéramicine A2), un mélange de composants a ce qui a conduit à l'isolation et l'identification de deux fragments inactifs, composés de formules 1 et 2, respectivement. Cependant, on a découvert de façon surprenante que la dégradation chimique conduisait

à la libération par étape des deux fragments biologique-

ment actifs BBM-1675C et BBM-1675D. De façon encore plus surprenante, on a découvert que les deux antibiotiques différents BBM-1675A1 et BBM- 1675A2 produisaient les mêmes fragments biologiquement actifs comme illustré par le Schéma 1. De façon également surprenante, on a découvert que les fragments de poids moléculaire les plus plus faibles BBM-1675C et BBM-1675D (ayant approximativement 70% et 55% du poids moléculaire des antibiotiques parents BBM-1675A1 et BBM-1675A2, respectivement) étaient plus efficaces en tant qu'agents antimicrobiens et antitumoraux que BBM1675A2 et comparables à BBM-1675A1 Schéma 1

BBM-1675A1

(espéramicine A

BBM-1675C > BBM-1675D

BBM-1675A2

(espéramicine A2 Les substances BBM-1675C et BBM-1675D peuvent être obtenues par hydrolyse chimique sélective de l'antibiotique BBM-1675A1 comme souligne dans le

Schéma 2.

Schéma 2 CH3

BBM-1675A H BBM-1675C

CH30H (poids (poids moléculaire molé c5rula ire 855) + CH3' OCH3

Composé 1 (poids molécu-

laire 425) (mélange des anomères " et /)

H Q/CH3OH

I

BBM-1675D

(poids moléculaire 695)

+ CH3S

OCH3

Composé 3 (poids molécu-

laire 192) (mélange des anomères o< et/f) OCH3 1248) OH Le composé de départ BBM-1675A1 est préparé selon le processus décrit dans la demande de brevet britannique N 2 141 425, publiée le 19 Décembre 1984. Le composant BBM-1675A1 purifié est hydrolysé avec un acide organique ou minéral tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide Ptoluènesulfonique, l'acide benzènesulfonique ou analogue, dans un solvant inerte organique ou mixte aqueux-organique à une température d'environ 0 C à la température de reflux du solvant jusqu'à obtention d'une quantité substantielle des composés souhaités BBM-1675C ou BBM-1675D. D'une façon préférentielle, l'hydrolyse est effectuée dans des solvants d'alcool en C1-C6, et plus préférentiellement, l'alcoolyse est réalisée dans du méthanol. La température de la réaction n'est pas critique, mais on préférera réaliser la réaction à une température comprise entre environ la température ambiante et 60 C,

et de façon préférentielle entre 40 C et 60 C.

L'hydrolyse sélective de BBM-1675A1 est réalisée par étape, avec l'obtention initiale de l'antibiotique BBM-1675C et du fragment inactif de formule 1. Le traitement subséquent ou continu dans des conditions d'hydrolyse conduit à la libération d'un mélange des anomères o et/$

du sucre thio de formule 3 et la production de l'antibio-

tique BBM-1675D. Les gens compétents dans ce domaine

comprendront qu'en faisant varier les conditions réaction-

nelles telles que temps, température et concentration de l'acide, on obtient des quantités relatives variables des

antibiotiques BBM-1675C et BBM-1675D. Ainsi, il est souhai-

table de suivre la réaction par chromatographie sur couche

mince, comme il sera décrit dans les exemples donnés ci-après.

Lorsqu'on souhaite préparer seulement l'antibiotique

BBM-1675D l'hydrolyse sélective est réalisée de façon pré-

férentielle avec un acide organique tel que l'acide p-

toluènesulfonique, comme décrit ci-après, pour obtenir une

quantité importante de BBM-1675D.

Les substances BBM-1675C et BBM-1675D peuvent également être préparées par hydrolyse chimique sélective

de l'antibiotique BBM-1675A2 comme le montre le Schéma 3.

Schéma 3 -

BBM-1675A H BBM-1675C

(poids CH3 (poids moléculaire moléculaire

1248) 855)

CH30 + CH30 OCH3

Composé 2 (poids molécu-

laire 425) (mélange des anomères < et/) H /CH30H

BBM-1675D

(poids moléculaire 695)

+ CH3S

OCH3 OH

Composé 3 (poids molécu-

laire 192) (mélange des anomères of et /) Le composé de départ BBM-1675A2 est préparé

selon le processus décrit dans la demande de brevet britan-

nique NI 2 141 425, publiée le 19 Décembre 1984. L'hydrolyse sélective de BBM-1675A2 est réalisée de façon similaire par étape, avec l'obtention initiale de l'antibiotique BBM-1675C et du fragment inactif de formule 2. Le traitement continu sous des conditions d'hydrolyse conduit à la libération d'un mélange des anomères < et A du sucre thio

de formule 3 et l'obtention de l'antibiotique BBM-1675D.

Les conditions de réaction utilisées pour l'hydro-

lyse chimique sélective de BBM-1675A2 sont pratiquement identiques à celles utilisées pour l'hydrolyse de BBM-1675A1 décrite précédemment. D'une façon similaire à l'obtention de BBM-1675D à partir de BBM-1675A1, lorsqu'on souhaite obtenir uniquement l'antibiotique BBM-1675D, l'hydrolyse de BBM-1675A2 est réalisée jusqu'à convertir sensiblement totalement BBM-1675A2 et BBM-1675C en BBM-1675D. D'une façon préférentielle, l'hydrolyse est réalisée dans un

acide organique tel que l'acide p-toluènesulfonique.

La découverte comme décrit ci-après, que les mêmes antibiotiques BBM1675C et BBM-1675D sont produits à partir des deux antibiotiques différents BBM-1675A1 et

BBM-1675A2 avec la libération concomitante de deux frag-

ments inactifs de formules 1 et 2, respectivement et du

"thio-sucre" de formule 3, fournit un avantage supplémen-

taire à la présente invention. En conséquence, selon un autre aspect de la présente invention, on a prévu un procédé pour l'hydrolyse sélective d'un mélange de BBM-1675A1 et BBM-1675A2 pour obtenir BBM-1675C et BBM- 1675D comme illustré par le Schéma 4 Schéma 4

BBM-1675A1 + BBM-1675A2 --BBM-1675C BBM-1675D

Cet avantage devient apparent, si l'on considère le fait que les quantités relatives de BBM-1675A1 et BBM-1675A2 produites dans le procédé par fermentation sont sujettes à des variations. L'obtention de BBM-1675C et BBM-1675D est par conséquent indépendante des quantités relatives de BBM-1675A1 et BBM-1675A2 utilisés comme

produit de départ dans la présente invention.

Comme décrit ci-après, l'hydrolyse des antibiotiques BBM-1675A1, BBM1675A2 et BBM-1675C conduit à la libération d'un fragment de thio-sucre inactif. Ce sucre thio a été isolé afin d'obtenir d'autres informations sur la structure chimique de l'antibiotique BBM-1675C et, par conséquent, des antibiotiques BBM-1675A1 et BBM-1675A2. Le composé de formule 3 a été identifié comme étant un mélange des anomères t et;23 d'un sucre thio présentant la formule illustrée aux Schémas 2 et 3. D'autres caractérisations ont été rendues possibles lorsque les produits de l'alcoolyse, les anomères " et,2, sont séparés. Les spectres de résonance magnétique du proton (360 MHz) du composé 3A (anomère 0) et du composé 3B (anomère/_) sont représentés aux figures lIA et 11B, respectivement. A partir d'une analyse de ces données spectrales, on suppose que les sucres méthyl glycosides de formule 3 présentent la stéréochimie relative la formule OH

CH3 CH3

CH3 S Actuellement, la stéréochimie absolue, i.e. D ou L, n'a-pas encore été déterminée. En conséquence, en se basant sur l'interprétation actuelle des données spectrales, on peut conclure que le sucre thio de formule 3 (moins le groupe CH3 du composé anomère méthoxy qui est incorporé pendant la méthanolyse) est un composant de la structure de l'antibiotique BBM-1675C et de plus, est un composant de la structure des antibiotiques de départ BBM-1675A1 et BBM-1675A2 Propriétés physico- chimiques de BBM-1675C

Description: solide amorphe

Spectre d'absorption ultraviolet: Voir figure 1 Spectromètre: HewlettPackard 8458 Solvant: méthanol 0 Concentration: 0,0155 g/l -max (nm) -max313 (épaulement) avec un Spectre Spectre Pouvoir absorbant

21.770

9.340 4.190 Aucun changement significatif n'est observé

acide ou une base.

d'absorption infrarouge: Voir figure 3 Instrument: Nicolet 5DX FT-IR Bandesd'absorption principales(KBr, film):

540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118,

1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385,

1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930,

2970, 3450 cm1 de masse: Voir fiqure 5 Spectromètre Procédé : Finigan 4500 TSQ

: ionisation par bombarde-

ment d' atomes accélérés (FAB) Ion Abondance Matrice m/z moléculaire relative glycérol 856 [M+H1+ 100% glycérol + NaCl 878 LM+Na]+ 100% dithiothréitol: dithioérythritol 856 [M+H + 100% (3:1) (poids/poids) Instrument: Kratos MS-50 FAB Haute résolution (m/z): [M+H+ = 856,3362 Poids moléculaire: poids moléculaire apparent = 855 (basé sur les données spectrales de masse décrites ci-dessus) Composition élémentaire: C36H61N3014S3 (basée sur les données haute résolution précitées) Spectre de résonance magnétique du proton: Voir figure 7 Instrument: WM 360 Bruker Solvant: CDCl3 RMN 1H 360 MHz S (ppm) 6,54 (1H, dd, J=7,7, 7,0); 6, 21 (1H, brs); 5,87 (1H, d, J=9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6, 1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J=10,3, 1,8); 4,61 (1H, d, J=7,7); 4,25 (1H, s) ; 4,09 (1H, q, J=2,6); 3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92-3,53 (1OH), 3,45 (1H, dt, J=10,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (1H, m); 2,69 (1H, dt, J=9,9, 5,2); 2, 49 (1H, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m); 2,13 (1H, m); 2,09 (3H, s); 1,50 (2H, m); 1,37 (3H, d,

J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); 1,08 (6H).

Spectre de résonance magnétique du carbone 13: Voir figure 9 Instrument: WM 360 Bruker Solvant: CDCl3 RMN 13C 90,6 MHz î (ppm)

13,7, 17,5, 19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 35,2, 39,5,

47,7, 52,7, 55,8, 56,1, 57,7, 62,4, 64,7, 67,4, 69,3,

69,8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7, 79,7, 83,2, 88,4, 97,3,

99,7, 123,4, 124,6, 130,1, 193,1.

Propriétés physico-chimiques de BBM-1675D

Description: solide amorphe

Spectre d'absorption ultraviolet: Voir figure 2 Spectromètre: HewlettPackard 8458 Solvant: méthanol Concentration: 0,01 g/i Xmax (nm) aptitudes d'absorption

214 27.000

274 12.800

325 5.400

Aucun changement significatif n'est observé avec

un acide ou une base.

Spectre d'absorption infrarouge: Voir figure 4 - Instrument: Nicolet 5DX FT-IR Bandesd'absorption principales(KBr, film):

735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195,

1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685,

-1 1720, 1735, 2880, 2930, 2960, 3400 cm1 Spectre de masse: Voir figure 6 Instrument: Finigan 4500 TSQ

Procédé: ionisation par bombarde-

ment d'atomes accélérés (FAB) Matrice: thioglycérol Ion moléculaire (m/z) : [M+H]+ = 696 Abondance relative: 100% Instrument: Kratos MS-50 FAB haute résolution (m/z): [M+HI+ = 696,2794 Poids moléculaire: poids moléculaire apparent = 695 (basé sur les données spectrales de masse précitées) Composition élémentaire: C29H49N3012S2 (basée sur les données de haute résolution précitées) La corrélation des abondances relatives CM+ H] et [(M+H)+2]+ vis-à-vis des valeurs calculées confirme la composition élémentaire dérivée

des mesures FAB-haute résolution.

Spectre de résonance magnétique du proton: Voir figure 8 Instrument: WM 360 Bruker Solvant: CDC13 + 10% CD30D RMN H 360 MHz (ppm): 6,43 (1H, dd, J=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5, 48 (1H, 6 brs); 4,48 (1H, d, J=8,1); 4,02 (1H, d, J=2,0); 3,95-3,80 ( fond du solvant); 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm); 3,35 (1H, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23-2,12 (2H, m); 1,42 (1H, brdt); 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6); 0,87

(3H, d, J=5,9).

Spectre de résonance magnétique du carbone 13: Voir figures lOA et lOB Instrument Solvant :' WM 360-Bruker : CDC1i3 + 10% C030D RMN 13C 90,6 MHz S (ppm):

17,5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8,

62,1, 67,8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4,

83,3, 88,2, 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8,

134,3, 148,7, 192,8.

Propriétés biologiques des substances BBM-1675 L'activité antimicrobienne des substances BBM-1675

a été déterminée pour une variété de microorganismes gram-

positifs et gram-négatifs. Le Tableau 1 ci-dessous fournit les données sous forme des résultats d'un processus de criblage antimicrobien comprenant le composé parent BBM-1675A1 et les substances BBM-1675C et BBM-1675D de la présente invention. Dans le processus de criblage, chaque composé testé,présentant une concentration uniforme

de 10 pg/ml d'une solution imprégnée sur une bande de -

papier,a été placé dans un milieu de culture, et la mesure de l'activité antibiotique est donnée par la zone résultante d'inhibition de la bande de papier. Comme montré dans le Tableau 1, les substances BBM-1675C et BBM-1675D présentent une large gamme d'activité antimicrobienne et sont au moins aussi efficaces que le composé BBM-1675A1; et en particulier, les substances BBM-1675C et BBM-1675D sont

plus efficaces comme inhibiteurs d'organismes gram-

négatifs.

TABLEAU 1

ACTIVITE ANTIMICROBIENNE DES SUBSTANCES BBM-1675

Microorganisme testé Escherichia coli AS 19 Escherichia coli K 12 Escherichia coli P 1373 Escherichia coli R Azasérine Escherichia coli R Nétropsine Escherichia coli R Mitomycine Escherichia coli R Bléomycine Escherichia coli R Daunomycine Escherichia coli R Néomycine Escherichia coli R Sibiromycine Escherichia coli R Hédamycine Escherichia coli R Aclacinomycine Bacillus subtilis ATCC 6633 Klebsiella pneumoniae Staphylococcus 209 P Staphylococcus R Actinoleucine Staphylococcus R Streptonigrin Staphylococcus faecalis P1377 Streptococcus aureus Smith P Staphylococcus aureus Smith R Actinomycine D Staphylococcus aureus Smith R Acide auréolique Acinetobacter Micrococcus luteus Saccharomyces cerevisiae petite Zone d'inhibition, mm

BBM-1675A1 BBM-1675C BBM-1675D

22 52 51

13 36 35

12 34 33

14 35 34

11 32 32

12 35 34

16 38 36

19 45 44

24 53 52

14 32 30

14 30 25

41 40

34 43 41

17 35 35

32 47 44

33 35 33

37 50 48

39 38

36 47 45

55 53

R = résistant à l'antibiotique concerné.

Activité contre la leucémie P-388 Les Tableaux II et III contiennent les résultats d'essaisen laboratoire sur des souris CDF1 implantées de façon intrapéritonéale d'un inoculum de tumeur de 106 cellules d'ascites de leucémie P-388, et traités avec des doses variées de BBM-1675A1, C ou D. Les substances ont été administrées par injection intrapéritonéale. Des groupes de six souris ont été utilisés pour chaque quantité dosée, et ont été traités par une dose unique de la substance le jour après inoculation. Un groupe de dix souris étalons traitées par une solution saline a été inclus dans chaque série d'expériences. Le groupe traité par BBM-1675A1, dans le

Tableau III, a été utilisé pour une comparaison directe.

Un protocole sur 30 jours a été employé et le temps moyen de survie en jours a été déterminé pour chaque groupe de souris ainsi que le nombre de survivants à la fin de périodes de jours. Les souris ont été pesées avant traitement et également un jour sur quatre. Les valeurs de variation de poids ont été utilisées comme mesure de la toxicité du médicament. Des souris pesant chacune 20 grammes ont été utilisées, et une perte en poids supérieure à environ 2 grammes n'était pas considérée comme excessive. Les animaux

étalons traités sont morts durant les neuf premiers jours.

Les résultats ont été déterminés relativement au pourcentage T/C qui est le rapport du temps moyen de survie du groupe traité au temps moyen de survie du groupe étalon traité par le véhicule rapporté à 100. Un pourcentage T/C égal

ou supérieur à 125 indique qu'un effet antitumoral signifi-

catif a été obtenu. Les résultats du criblage dans le Tableau II montrent le niveau initial non attendu d'activité antitumorale de la substance BBM1675C. Dans le Tableau III, on a reporté les résultats d'une comparaison directe de BBM-1675A1 (espéramicine A1) et des substances BBM-1675C et BBM-1675D. Les données suggèrent que BBM-1675C est à peu près comparable à BBM-1675A1 en ce qui concerne son efficacité potentielle et antitumorale, tandis que BBM-1675D

est seulement légèrement moins efficace.

De plus, conformément à la présente invention, les mêmes substances BBM1675C et BBM-1675D peuvent également être obtenues à partir du composant BBM-1675A2 (espérami- cine A2). En comparant les données reportées ici pour BBM-1675C et BBM-1675D et les données reportées dans la demande de brevet britannique publiée N 2 141 425 pour le composant BBM-1675A2, on a découvert de façon surprenante que les substances BBM-1675C et BBM- 1675D sont plus efficaces en tant qu'agents antitumoraux que le composant parent

BBM-1675A2 dont il dérive.

TABLEAU II

EFFET DE BBM-1675C SUR LA LEUCEMIE P-388

( Traitement journalier) Effet AWC Survivants Dose, IP MST MST gm Composé mg/kg/inj. jours % T/C jour 4 jour 5

BBM-1675C 3,2 TOX TOX - 0/6

0,8 TOX TOX - 0/6

0,2 TOX TOX - 0/6

0,05 TOX TOX -1,8 1/6

0,0125 11,0 122 -2,5 5/6

0,003125 13,5 150 -2,5 6/6

Véhicule - 9,0 100 0,4 10/10 Inoculum de tumeur: 106 cellules d'ascites implantées de façon intrapéritonéale (i.p.) Hôte: souris mâlesCDF1 Evaluation: MST = temps moyen de survie Effet: T/C (%) =(MST traité/MST échantillon) x 100 Critère: T/C % >, 125 est considéré comme une activité antitumorale significative AWC:variation moyenne de poids (traitééchantillon) en grammes (au-4è jour)

TABLEAU III

EFFET DES SUBSTANCES BBM-1675 SUR LA LEUCEMIE P-388

Inventaire du Composé traitement Dose, IP mg/kg/inj.

BBM-1675A1

BBM-1675C

d. 1 d. 1

0,0512

0,0256

0,0128

0,0064

0,0032

0,0016

0,0008

0,0004

0,0002

0,0001

0,0256

0,0128

0, 0064

0,0032

0,0016

0,0008

0,0004

0,0002

0, 0001

0,00005

TOX TOX TOX ,5 ,0 ,5 12,5 12,0 11,0 11,5 TOX TOX 11,5 14,5 ,5 12,0 11,5 11,0 11,0 ,5 TOX TOX TOX TOX TOX

- 0/6

- 0/6

-1,8 3/6

-0,3 6/6

-0,6 6/6

0,6 6/6

0,3 6/6

*1,4 6/6

0,8 6/6

1,4 6/6

-0,8 -0,3 -0,1 0,0 0,3 0,8 1,4 0,8 1,3 0/6 3/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 MST jours Effet MST % T/C AWC gm Jour 4 Sur- vivants Jour 5 I... TABLEAU III (suite) Composé

BBM-1675D

Inventaire du traitement d. 1 Dose, IP mg/kg/inj.

0,0256

0,0128

0, 0064

0,0032

0,0016

0,0008

0,0004

0,0002

0, 0001

0,00005

Effet

MST MST

jours % T/C 9,0 11, 5 12, 5 12,0 11,5 ,0 ,0 9,5 9,5 9,0

BBM-1675C

d. 1 5 0,0032

0,0016

0,0008

0,0004

0,0002

0,0001

0,00005

0,000025

0,0000125

0,00000625

Véhicule

9,0 100 2,4

Inoculum de tumeur: 106 cellules d'ascites implantées de façon péritonéale (i.p.) Hôte: souris femelles CDF1 Evaluation: MST = temps moyen de survie Effet: T/C (%) =(MST traité/MST échantillon) x 100 Critère: T/C % y/ 125 est considéré comme une activité antitumorale significative AWC: variation moyenne de poids (traité-échantillon) en grammes (au 4ème jour) AWC gm Jour 4 0, 1 0,3 0,3 0,1 0,8 0,2 0,5 1,7 1,7 2,0 Sur- vivants

Jour 5-

6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 16,0 13,5 13,5 12,0 12,0 11,0 11,0 8,5 8,0 8,0 -1,3 -1,0 -0,3 -0,4 -0,4 -0,4 0,9 2,2 2,4 2,4 6/6 6/6 6/6 6/6 6/6 /6 6/6 6/6 6/6 6/6 /10 Activité contre le mélanome B16 Le Tableau IV contient les résultats d'essais antitumoraux utilisant la croissance du mélanome B16 chez la souris. Des souris BDF1 ont été utilisées et inoculées de façon sous-cutanée avec un implant de tumeur. Un protocole sur 60 jours a été utilisé. Des groupes de dix souris ont été utilisés pour chaque quantité de dosage testée, et le temps moyen de survie pour chaque groupe a été déterminé. Des animaux de crontrôle inoculés de la même façon que les animaux testés ont été traités avec un véhicule d'injection sans médicament, et présentaient un taux moyen de survie de 22,5 jours. Pour chaque niveau de dosage, les animaux testés ont été traités avec le composé testé les

jours 1, 5 et 9 par injection intrapéritonéale. Un pour-

centage T/C égal ou supérieur à 125 indique qu'un effet antitumoral significatif est obtenu. Les résultats du Tableau IV montrent par une comparaison directe que BBM-1675C était également efficace dans le traitement des souris portant un mélanome B16 et est pratiquement comparable

à BBM-1675A1.

TABLEAU IV

EFFET DES SUBSTANCES BBM-1675 SUR MELANOME B16

(Traitements réalisés les jours 1, et 9) Composé

BBM-1675A1

Dose, IP mg/kg/inj.

0,0032

0,0016

0,0008

0,0004

0,0002

0,0001

MST jours 37,5 37,5 38,5 37,0 34,5 32,0 Effet MST % T/C AWC gm Jour 12 0, 3 0,3 - 1,4 1,8 2,0 1,9. Survivants

Jour 10.

/10 /10 /10 /10 /10 /10

BBM-1675C

Véhicule

0,0008

0,0004

0,0002

0,0001

0,00005

0,000025

Inoculum de tumeur: 0,5 ml d'un Hôte: souris femelles BDF1 brei à 10%, IP Evaluation: MST = temps moyen de survie Effet: T/C (%) = (MST traité/MST échantillon) x 100 Critère: T/C % 5, 125 est considéré comme une activité antitumorale significative AWC: variation moyenne de poids (traitééchantillon)

en grammes (au 12ème jour).

31,5 37,0 31,0 31,5 27,5 ,0 0,6 1,2 0,6 1,0 0,8 0,5 0,3 /10 /10 /10 /10 /10 /10 /10 22,5 Comme l'indiquent les données antimicrobiennes et tumorales chez la souris précitées, BBM-1675C et BBM-1675D sont ainsi utiles comme antibiotiques dans le traitement thérapeutique des mammifères et d'autres animaux souffrant d'infections et également comme agents antitumoraux pour inhiber de façon thérapeutique la croissance des tumeurs

chez les mammifères.

Aussi, la présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant une quantité efficace antimicrobienne ou antitumorale de BBM-1675C ou BBM-1675D et un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable inerte. De telles compositions peuvent également contenir d'autres agents antimicrobiens ou antitumoraux et peuvent être réalisés sous toute forme pharmaceutique appropriée selon la voie choisie d'administration. Des exemples de telles compositions comprennent des compositions solides pour administration orale telles que cachets, capsules, pillules, poudres et granules, des compositions liquides pour administration orale telles que des solutions ou suspensions, sirops ou élixirs et des préparations pour administration parentérale telles que solutions aqueuses ou non aqueuses stériles, suspensions ou émulsions. Ils peuvent être également réalisés sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes dans de l'eau stérile, une solution saline physiologique ou d'autres milieux injectables stériles immédiatement avant utilisation. Pour une utilisation comme agent antimicrobien, BBM-1675C ou BBM-1675D, ou une composition pharmaceutique les contenant est administré de façon que la concentration de la substance active soit supérieure à la concentration

inhibitrice minimum pour l'organisme particulier à traiter.

Pour l'utilisation comme agent antitumoral, les doses et régimes optimum de BBM-1675C ou BBM-1675D pour un hâte donné peuvent être facilement établis pour ceux qui sont compétents dans le domaine. On comprendra, bien entendu, que la dose réelle de BBM-16755C ou BBM-16750 à utiliser variera selon la composition particulière formulée, le mode d'application et les sites particuliers, ainsi que l'hâte et la maladie à traiter. De nombreux facteurs qui modifient l'action du médicament devront être pris en considération, parmi lesquels l'âge, le poids, le sexe, le régime, le temps d'administration, le mode d'administration, le taux d'excrétion, l'état du patient, la combinaison de différents médicaments, la sensibilité aux réactions et la gravité de la maladie. L'administration peut être réalisée de façon continue ou de façon périodique dans la plage maximum tolérée. Les taux d'application optimum pour un jeu de conditions donné peuvent être déterminés par ceux qui sont compétents dans la matière, en utilisant des tests de détermination des doses traditionnels à la lumière des

lignes directrices données ici.

Les exemples suivants sont donnés pour illustrer la

présente invention, sans en limiter la portée.

Préparation chimique et isolation de BBM-1675C et BBM-1675D

EXEMPLE 1

Un échantillon de BBM-1675A1 (50 mg) a été dissous dans 2,5 ml de méthanol et traité avec 2,5 ml d'une solution 0,1 molaire de chlorure d'hydrogène dans du méthanol. La réaction a été réalisée à une température d'environ 50 C, et la consommation du matériau de départ (approximativement minutes) a été suivie toutes les 5 à 10 minutes par chromatographie sur couche mince (TLC) sur des plaques de gel de silice (Analtech, 250 microns, GF) avec un mélange de toluène:acétone (3:2, volume/volume) comme solvant d'élution. Lorsque le matériau de départ a été consommé, le mélange réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée de NaHCO3 dans du méthanol, puis évaporé sous pression réduite pour conduire à un résidu sec contenant les fragments biologiquement actifs. La substance BBM-1675C a été isolée du résidu par chromatographie flash sur colonne, sur une colonne de 2 cm (diamètre intérieur) x 10 cm emplie de gel de silice Woelm (taille de particule 32-63 microns). La colonne a été éluée par un mélange toluène:acétone (3:2,

volume/volume) en récupérant des fractions de 3ml.

Chaque fraction a été analysée par chromatographie sur couche mince Lgel de silice avec toluène:acétone (3:2, volume/volume) comme éluanti, et les taches ont été visualisées avec une source de lumière UV de 154 nm et une vaporisation de sulfate cérique (1% en sulfate cérique et

2,5% d'acide molybolique dans 10% d'acide sulfurique).

Les fractions 6-12 (valeur Rf pour BBM-1675C = 0,28) ont été mises en commun et évaporées jusqu'à siccité pour

donner 12 mg (35%) de BBM-1675C sensiblement pur.

Les propriétésphysico-chimiques de BBM-1675C ont été données précédemment et les spectres UV, infrarouge, de masse, RMN du proton et RMN du carbone 13 du composé

apparaissent aux figures 1, 3, 5, 7 et 9, respectivement.

EXEMPLE 2

Lorsque le temps de réaction du processus de l'Exemple 1 est étendu, la quantité de BBM-1675C décroit, etdeuxnouveaux produits dénommés composé 3 (Rf= 0,65) et

BBM-1675D (Rf identique à la ligne de base) E[chromato-

graphie sur couche mince: silice, toluène-acétone (3:2, volume/volume)] apparaissent et deviennent d'autant plus

importants que le temps s'écoule.

Le composé BBM-1675D qui accompagne la production de BBM-1675C a été isolé par la colonne de chromatographie décrite à l'Exemple 1 par élution avec un mélange chloroforme:méthanol (5:1, volume/volume). Les fractions appropriées ont mises en commun et évaporées jusqu'à siccité pour conduire à 18 mg de BBM-1675D substantiellement pur à

partir de la réaction décrite à l'Exemple 1.

La substance BBM-1675D présente une tache majeure à Rf = 0,37 dans la chromatographie sur couchemince en phase inverse (Whatman MKC18F, 200 microns) en utilisant 30% d'eau dans du méthanol comme éluant et Rf = 0, 22 par chromatographie sur couche mince sur gel de silice en phase normale en utilisant un mélange chloroforme:méthanol (5:0,

volume/volume) comme éluant.

EXEMPLE 3

On peut obtenir une amélioration sensible du rende-

ment en BBM-1675D en utilisant l'acide p-toluènesulfonique au lieu du chlorure d'hydrogène dans l'hydrolyse chimique de BBM-1675A2 ou BBM1675A1, comme le montrent les processus

des Exemples 3 et 5, respectivement.

Un échantillon de BBM-1675A2 (15,2 mg) a été

hydrolysé avec une solution 0,03 molaire d'acide p-toluène-

sulfonique dans du méthanol (1 ml) à une température d'en-

viron 63 C pendant environ une heure. Le mélange réaction-

nel a été ensuite évaporé jusqu'à siccité sous pression réduite à 30 C. La substance BBM-1675D a été isolée du résidu sec par chromatographie flash sur colonne, sur une colonne emplie de gel de silice Woelm (taille de particule 32-63 microns). La colonne a été éluée avec un mélange chloroforme:méthanol (5:0,5, volume/volume), et les fractions récupérées ont été analysées par chromatographie en couche mince |gel de silice avec chloroforme:méthanol (5:0,5, volume/volume) comme éluant. Les conditions de chromatographie utilisées ont permis la séparation du mélange des deux composés inactifs 2 et 3 (7 mg) de la substance biologiquement active BBM1675D présentant une valeur Rf de 0,22. Les fractions appropriées ont été mises en commun et évaporées jusqu'à siccité pour obtenir 8 mg de BBM1675D sensiblement pur en un rendement pratiquement quantitatif. Les propriétés physico-chimiques de BBM-1675D ont été données et les spectres ultraviolet, infrarouge, de masse,

RMN du proton et RMN du carbone 13 de ce composé apparais-

sent aux figures 2, 4, 6, 8 et 10A et lOB, respectivement.

EXEMPLE 4

Un échantillon de BBM-1675A2 (40 mg) a été traité avec 5 mi d'une solution 0,5 molaire de chlorure d'hydrogène dans du méthanol à environ 50 C pendant environ 2 heures selon le processus général et le procédé d'isolation décrits dans l'Exemple 1. Après neutralisation par NaHCO3 et évaporation jusqu'à siccité, la substance BBM-1675C a été isolée du résidu par chromatographie sur colonne, sur une colonne emplie de gel de silice Woelm (taille de particule 32-63 microns) en utilisant un mélange toluène: acétone (3:2, volume/volume) comme éluant. Les fractions appropriées ont combinées et évaporées jusqu'à siccité pour donner 8,4 mg de BBM-1675C sensiblement pur qui est

un produit identique à celui isolé dans l'Exemple 1.

La colonne chromatographique précitée a été ensuite éluée avec un mélange chloroforme:méthanol (5:0,25, volume/ volume) et les fractions collectées ont été mises en commun

et évaporées jusqu'à siccité pour conduire à BBM-1675D.

La substance BBM-1675D a été ensuite purifiée au moyen d'une colonne de chromatographie flash avec du gel de silice en utilisant un mélange chloroforme:méthanol

(5:0,5, volume/volume) comme éluant. Les fractions appro-

priées ont été combinées et évaporées jusqu'à siccité pour donner 6,3 mg de BBM-1675D pratiquement pur qui est un

produit identique à celui isolé dans l'Exemple 3.

EXEMPLE 5

Un échantillon de BBM-1675A1 (49,3 mg) a été

hydrolysé avec une solution 0,037 molaire d'acide p-

toluènesulfonique dans du méthanol (1,5 mi) à une tempéra-

ture d'environ 60 C pendant environ 1,5 heure. Le mélange de réaction a été évaporé jusqu'à siccité sous pression réduite à environ 30 C pour donner un résidu contenant du BBM-1675D et les composés inactifs 1 et 3. La substance biologiquement active BBM-1675D a été isolée du résidu par chromatographie flash sur colonne, sur une colonne

emplie de gel de silice Woelm (taille de particule 32-63 mi-

crons) utilisant un mélange chloroforme:méthanol (5:0,25, volume/volume) comme éluant. Les fractions appropriées ont été combinées et évaporées jusqu'à siccité pour donner 27 mg de BBM-1675D pratiquement pur qui est un produit

identique à celui isolé dans l'Exemple 3.

EXEMPLE 6

Un échantillon de BBM-1675C (5,1 mg) a été hydrolysé avec une solution 0, 5 molaire de chlorure d'hydrogène dans

du méthanol (1 ml) à-environ 40 à 50 C pendant une nuit.

Après neutralisation par NaHC03 et évaporation jusqu'à siccité, la substance biologiquement active BBM-1675D a été isolée du résidu par chromatographie flash sur colonne, sur une colonne emplie de gel de silice Woelm (taille de particule 32-63 microns) en utilisant un mélange

chloroforme:méthanol (5:0,25, volume/volume) comme éluant.

Les fractions appropriées ont conduit au BBM-1675D prati-

quement pur qui est un produit identique à celui isolé

dans l'Exemple 3.

EXEMPLE 7

Lorsque le processus général des Exemples 1 et 2 est répété, à l'exception du fait que le matériau de départ BBM-1675A1 est remplacé par une quantité équimolaire d'un mélange contenant BBM-1675A1 et BBM-1675A2, on produit

les substances BBM-1675C et BBM-1675D.

EXEMPLE 8

Lorsque le processus général de l'Exemple 5 est répété en utilisant une quantité.équimolaire d'un mélange contenant BBM-1675A1 et BBM-1675A2 comme matériau de départ à la place de BBM-1675A1, on produit ainsi la substance

BBM-1675D.

On notera que BBM-1675 C est soluble dans le méthanol,l'éthanol,

l'acétate d'éthyle, l'acétone, le tétrahydofuranne et le chloroforme.

BBM 1675 D est soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone et le tétra-

hydrofuranne et faiblement soluble dans le chloroforme.

Claims (10)

R E V E N D I C A TI 0 N S

1.- Antibiotique et antitumoral constitué par une substance sensiblement pure, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une substance dénommée BBM-1675C qui: (a) est un solide amorphe; (b) est soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétate d'éthyle, l'acétone, le tétrahydrofuranne et le chloroforme; (c) présente par chromatographie sur couche mince sur gel de silice une valeur Rf de 0,28 avec pour solvant le mélange toluène:acétone (3:2, volume/volume); (d) présente un poids moléculaire apparent de 855 déterminé par spectroscopie de masse par bombardement d'atomes accélérés en haute résolution; (e) présente un spectre d'absorption ultraviolet dans une solution de méthanol tel que représenté à la figure 1, et présentant les maxima d'absorption et les aptitudes d'absorption à 210 nm (a = 21.770); 274 nm (a = 9.340) et 313 nm (épaulement) (a = 4.190) sans changement significatif par addition d'acide ou de base); (f) présente un spectre d'absorption infrarouge (KBr, film) tel que représenté à la figure 3 et présentant les pics d'absorption principaux à

540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118,

1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385,

1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2030,

2970, et 3450 cm1; (g) présente un spectre de masse à faible résolution tel que représenté à la figure 5, présentant un [M+H]+ de 856; (h) présente un spectre de résonance magnétique du proton à 360 MHz dans CDCl3 tel que représenté à la figure 7 et présentant des signaux à 6,54 (1H, dd, J=7,7, 7,0); 6,21 (1H, brs); 5,87 (1H, d, J=9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6, 1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J=10,3, 1,8); 4,61 (1H, d, J=7,7); 4,25 (1H, s); 4,09 (1H, q, J=2,6); 3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92-3, 53 (1OH); 3,45 (1H, dt, J=10,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (1H, m); 2,69 (1H, dt, J=9,9, 5,2); 2,49 (1H, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m); 2,13 (1H, m); 2,09 (3H, s); 1,50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); et 1,08 (6H) parties par million à partir du tétraméthylsilane; (i) présente un spectre de résonance magnétique du carbone 13 à 90,6 MHz dans CDCl3 tel que représenté à la figure 9 et présentant des signaux à 13,7, 17,5, 19,8,

22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 35,2, 39,5, 47,7, 52,7, 55,8, 56,1,

57,7, 62,4, 64,7, 67,4, 69,3, 69,8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7,

79,7, 83,2, 88,4; 97,3, 99,7, 123,4, 124,6, 130,1 et 193,1

parties par million à partir du tétraméthylsilane.

2.- Antibiotique et antitumoral sous forme pratique-

ment pure, caractérisé en ce qu'il s'agit de la substance BBM-1675D qui: (a) est un solide amorphe; (b) est soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone et le tétrahydrofuranne, et faiblement soluble dans le chloroforme; (c) présente par chromatographie sur couche mince sur gel de silice une valeur Rf de 0,22 avec comme solvant un mélange chloroforme:méthanol (5:0,5, volume/volume) et présente en chromatographie sur couche mince sur gel de silice en phase inverse une valeur Rf de 0,37 avec comme solvant un mélange méthanol:eau (70:30, volume/volume); (d) présente un poids moléculaire apparent de 695 déterminé par spectroscopie de masse par bombardement d'atomes accélérés en haute résolution; (e) présente un spectre d'absorption ultraviolet dans une solution de méthanol tel que représenté à la figure 2, et présentant les maxima d'absorption en ultraviolet et pouvoirs absorbants (a) suivantes à 214 nm (a = 27.000), à 274 nm (a = 12.800), et à 325 nm (a = 5.400) sans changement significatif par addition d'acide ou base; (f) présente un spectre d'absorption infrarouge (KBr, film) tel que représenté à la figure 4 et montrant des pics d'absorption principaux à

735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195

1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685,

1720, 1735, 2880, 2930, 2960, et 3400 cm-1; (g) présente un spectre de masse en basse résolution tel que représenté à la figure 6 et présentant un M+H + de 696; (h) présente un spectre de résonance magnétique du proton à 360 MHz dans CDCl3 + 10% CD30D tel que représenté à la la figure 8 et présentant les signaux à 6,43 (1H, dd, J=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5, 81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5,48 (1H, 6brs); 4,48 (1H, d, J=8, 1); 4,02 (1H, d, J=2,0); 3,95-3,80 ( fond desolvant); 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm); 3,35 (1H, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66-2, 55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23-2,12 (2H, m); 1,42, brdt); 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6) et 0,87 (3H, d, J=5,9) parties par million à partir du tétraméthylsilane; (i) présente un spectre de résonance magnétique du carbone 13 à 90,6 MHz dans CDCl3 + 10% CD30D tel que représenté aux figures 1OA et lOB et présentant des signaux à

17,5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8, 62,1,

67,8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4, 83,3, 88,2

97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8, 134,3, 148,7 et

192,8 parties par million à partir du tétraméthylsilane.

3.- Procédé d'obtention de l'antibiotique antitumoral BBM-1675C, défini à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse de BBM1675A1 ou BBM-1675A2 par un acide minéral ou organique jusqu'à formation d'une quantité de BBM-1675C, puis la récupération de BBM-1675C

dans le milieu réactionnel.

4.- Procédé d'obtention de l'antibiotique antitumoral BBM-1675D selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse de la substance BBM-1675A1 ou B8M-1675A2 avec un acide minéral ou organique jusqu'à obtenir une quantité substantielle de BBM-1675D et ensuite

à récupérer BBM-1675D du milieu réactionnel.

5.- Procédé d'obtention de l'antibiotique anti-

tumoral BBM-1675D selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse de la substance BBM-1675C selon la revendication 1 avec un acide minéral ou organique jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle de BBM-1675D et la récupération de BBM-1675D du milieu réactionnel.

6.- Procédé d'obtention de l'antibiotique anti-

tumoral BBM-1675C, tel que défini à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse d'un mélange de BBM-1675A1 et BBM-1675A2 avec un acide minéral ou organique jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle de BBM-1675C et la récupération de BBM-1675C du milieu réactionnel.

7.- Procédé d'obtention de l'antibiotique anti-

tumoral BBM-1675D tel que défini à la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse d'un mélange de BBM-1675A1 et BBM-1675A2 avec un acide organique ou minéral jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle de BBM-1675D, puis la récupération de BBM-1675D du milieu

réactionnel.

8.- Composition pharmaceutique antimicrobienne, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de BBM-1675C tel que défini à la revendication 1 avec un

diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.

9.- Composition pharmaceutique entimicrobienne, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de BBM-1675D tel que défini à la revendication 2 avec

un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.

10.- Composition pharmaceutique antitumorale, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de BBM-1675C ou BBM-1675D avec un diluant ou véhicule

pharmaceutiquement acceptable.