CH647247A5

CH647247A5 - Composes antibiotiques-antitumoraux et leurs procedes de production.

Info

Publication number: CH647247A5
Application number: CH2570/80A
Authority: CH
Inventors: Hideo Koshiyama; Fumihide Sakai; Hiroaki Ohkuma
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1979-04-02
Filing date: 1980-04-01
Publication date: 1985-01-15
Also published as: ES8104411A1; YU41700B; FR2452930B1; IE49191B1; JPH0341157B2; NO155780C; IL59746A0; NO800967L; JPS6365679B2; PH16970A; JPS55162752A; JPH0341475B2; IE800598L; AU5700280A; GR66663B; DE3012565A1; GB2050384A; LU82318A1; ATA180380A; SE441930B

Description

La présente invention concerne des composés antibiotiques/antitumoraux nouveaux, un procédé par fermentation pour la production d'un complexe antitumoral/antibiotique qui renferme ces com-65 posés, de le recueillir et de le diviser en composants doués d'activité biologique et un médicament comprenant un de ces composés.

D'après les informations spectrales annexées et les propriétés physico-chimiques dont on dispose, le complexe antitumoral/anti

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biotique de la présente invention se montre apparenté par sa structure au groupe d'antibiotiques de la quinoxaline tels que l'échinomy-cine (Dell et collaborateurs, «J. Am. Chem. Soc.», 97, 2497 (1975), les quinomycines (Shoji et collaborateurs, «J. Antibiotics», 14 A, 335 (1961) et la triostine C («The Merck Index», 9e édition, 9399). Toutefois, le complexe antitumoral/antibiotique se différencie des antibiotiques précités par les aspects suivants:

1. Le complexe de l'invention et ses composants contiennent comme chromophore un noyau de quinoléine au lieu d'un noyau de quinoxaline comme dans le groupe d'antibiotiques de l'actinoleu-kine.

2. Le complexe de l'invention et ses composants ne renferment pas de soufre, en contraste avec la présence d'un pont disulfure ou thioacétal que l'on rencontre dans la structure des antibiotiques du type de l'actinoleukine.

3. Le complexe de l'invention et ses composants déploient une activité antimicrobienne relativement faible, comparativement aux actinoleukines qui sont de puissants antibiotiques antibactériens.

La présente invention englobe les composés antitumoraux/antibiotiques BBM-928 A-D qui sont définis dans les revendications 1, 5, 7 et 9. Ces composés sont renfermés dans un complexe qui est préparé selon l'invention par culture d'une souche productrice de BBM-928 d'un actinomycète (ATCC 31 491) ou d'un mutant de cet actinomycète dans un milieu nutritif aqueux, dans des conditions aérobies en immersion. Le complexe BBM-928 obtenu renferme au moins six composants donnés d'activité biologique, notamment les composants A, B, C, D, E et F. Le complexe BBM-928 peut être recueilli du milieu de culture et divisé en ses composants par techniques de distribution à contre-courant et de Chromatographie.

Les formes préférées des composés selon l'invention sont leurs formes diluées, la forme de concentrés véritables et la forme purifiée.

Sur les dessins annexés:

la fig. 1 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-928 A dans le bromure de potassium;

la fig. 2 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-928B dans le bromure de potassium;

la fig. 3 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-928C dans le bromure de potassium;

la fig. 4 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-928D dans le bromure de potassium;

la fig. 5 représente le spectre de résonance magnétique des protons de BBM-928A en solution dans du deutérochloroforme en présence de TMS comme étalon interne, la détermination étant effectuée au moyen d'un spectromètre RMN à une fréquence de 90 MHz;

la fig. 6 représente le spectre de résonance magnétique des protons de BBM-928B en solution dans du deutérochloroforme en présence de TMS comme étalon interne, la détermination étant effectuée au moyen d'un spectromètre RMN à une fréquence de. 90 MHz;

la fig. 7 représente le spectre de résonance magnétique des protons de BBM-928C en solution dans du deutérochloroforme en présence de TMS comme étalon interne, la détermination étant effectuée au moyen d'un spectromètre RMN à une fréquence de 90 MHz, et la fig. 8 représente le spectre de résonance magnétique des protons de BBM-928D en solution dans du deutérochloroforme en présence de TMS comme étalon interne, la détermination étant effectuée au moyen d'un spectromètre RMN à une fréquence de 90 MHz.

Sur les fig. 1 à 4, les nombres d'ondes sont exprimés en cm-1, les longueurs d'onde sont exprimées en micromètres et la transmission est exprimée par un pourcentage.

On considère que le complexe BBM-928 peut être apparenté par sa structure au groupe d'antibiotiques de l'actinoleukine, et il est obtenu par fermentation d'une souche d'actinomycète portant le N° G455-101 dans la collection de cultures Bristol-Banyu. Le microorganisme a été isolé d'un échantillon de sol recueilli aux îles Philippines et a été déposé chez American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Etats-Unis le 23 février 1979, sous la référence ATCC 31491.

Le nouveau complexe antitumoral/antibiotique obtenu par le procédé de la présente invention renferme au moins six composants appelés BBM-928 A, B, C, D, E et F. Les composants A, B, C et D du complexe BBM-928 ont été isolés sous la forme cristalline et les structures chimiques des composants A, B et C ont été identifiées. Le complexe et ses composants individuels sont doués de propriétés antibactériennes et antitumorales. En ce qui concerne l'activité antibactérienne, le complexe et ses composants individuels sont utiles comme suppléments nutritionnels dans l'alimentation des animaux et comme agents thérapeutiques dans le traitement d'infections bactériennes chez les mammifères. En outre, les antibiotiques sont utiles au nettoyage et à la stérilisation de la verrerie de laboratoire et des instruments chirurgicaux et peuvent être utilisés conjointement avec des savons, des détergents et des solutions de lavage, à des fins hygiéniques. En ce qui concerne les effets antitumoraux, le complexe et ses composants individuels sont particulièrement utiles contre diverses tumeurs implantées par voie intrapéritonéale chez la souris.

Souche spécifique d'actinomycète G455-101

On donne ci-après une description générale du micro-organisme que l'on apprécie pour la production du complexe antibiotique/antitumoral BBM-928. On a effectué des observations des caractéristiques culturales, physiologiques et morphologiques de l'organisme conformément aux méthodes taxonomiques classiques [voir, par exemple, Shirling et collaborateurs, «Int. J. Syst. Bacteriol.», 16, 313 (1966) et Lechevalier et collaborateurs, «Biol. Actinomycetes Related Org.», 11, 78 (1976)].

Micromorphologie

La souche G455-101 forme à la fois un mycélium dans le substrat et un mycélium aérien, et le mycélium dans le substrat est bien développé, allongé et ramifié (largeur 0,5-0,8 |im). On n'observe pas de fragmentation distincte du mycélium du substrat. Contrairement aux espèces ordinaires de Streptomyces, la souche G455-101 ne porte qu'un mycélium aérien court ou rudimentaire ou ne forme pas du tout de mycélium dans certains milieux gélosés. Des chaînes de spores courtes ou longues sont produites dans le mycélium aérien, ces chaînes comportant chacune 2 à 50 spores ovales (la plupart comprennent 5 à 20 spores). Les chaînes de spores sont rectilignes, sinuées ou en forme de boucle. Les spores ont une forme sphérique (0,3-0,4 |im), ovale ou cylindrique (0,3 x 1,5-3,0 |im) et leur surface est lisse. Des spores sont souvent séparées par des hyphes vides. Une vésicule amorphe ressemblant à un sporange'qui enveloppe une chaîne de spores courte et enroulée s'observe occasionnellement sur le mycélium aérien.

Composition de la paroi des cellules et sucres contenus dans la cellule entière

La paroi cellulaire de la souche G455-101 contient de l'acide mésodiaminopimélique, mais ne renferme pas de glycine. L'hydroly-sat de cellules entières révèle la présence de glucose, de mannose et de madurose (3-0-méthyl-D-galactose). Les données mentionnées ci-dessus concernant la composition de parois cellulaires et les sucres de la cellule entière indiquent que la souche G455-101 est un actinomycète dont la paroi cellulaire appartient au type HIB.

Caractéristiques culturales et physiologiques

La souche G455-101 croît abondamment, elle forme un mycélium aérien rose ou rose grisâtre et elle produit un pigment rougeâtre insoluble dans l'eau dans les milieux géolésés riches du pont de vue nutritionnel, par exemple la gélose à l'extrait de levure et à l'extrait de malt et la gélose à la farine d'avoine. Toutefois, dans la gélose contenant des sels minéraux et de l'amidon, la gélose contenant du glycérol et de l'asparagine et la gélose à la tyrosine, cette souche a une croissance médiocre, elle forme un mycélium aérien rudimen-

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10

15

20

25

30

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45

50

55

60

65

5

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taire blanc ou beige et elle produit une petite quantité d'un pigment rougeâtre. Elle ne produit pas de pigment mélanoïde dans la gélose à la peptone, à la levure et au fer et dans la gélose à la tyrosine. Elle réduit les nitrates en nitrites. Elle se développe abondamment à 28, 37 et 45° C, mais ne se développe pas à 10 ou à 50° C. Les pentoses et les hexoses sont convenablement utilisés par cette souche. Les caractéristiques culturales et physiologiques de la souche G455-101 sont produites, respectivement, sur les tableaux I et II. L'utilisation des sources de carbone est indiquée sur le tableau III.

Tableau I

Caractéristiques culturales de la souche G455-101 *

1. Gélose de Czapek c**

croissance nulle ou rare

(gélose au saccharose

R

rose foncé

et au nitrate)

A

blanc à rose pâle

D

néant

2. Bouillon à la tryp-

croissance modérée,

tone et à l'extrait de

floconneux, sédimenté

levure (ISP N° 1)

et non pigmenté

3. Gélose à l'extrait de

C

abondant levure et à l'extrait de

R

rouge foncé à brun rougeâtre malt (ISP N° 2)

A

abondant, rose grisâtre à rose

violacé

D

néant

4. Gélose à la farine

C

abondant d'avoine (ISP N° 3)

R

rouge jaunâtre vif

A

modéré, rose

D

jaune grisâtre

5. Gélose aux sels miné

C

médiocre raux et à l'amidon

R

brun jaunâtre clair à rouge

(ISP N° 4)

foncé

A

rare, blanc à beige

D

néant

6. Gélose au glycérol et

C

médiocre

à l'asparagine (ISP

R

rose jaunâtre à brun rougeâtre

N° 5)

A

rare, blanc

D

néant

7. Gélose à la peptone,

C

médiocre, plissée

à l'extrait de levure et

R

orangé rougeâtre vif au fer (ISP N° 6)

À

néant

D

orangé jaunâtre clair

8. Gélose à la tyrosine

C

médiocre

(ISP N° 7)

R

rouge foncé

A

rare, blanc

D

néant

9. Gélose au glucose et

C

médiocre aux sels d'ammonium

R

brun rougeâtre

A

rare, gris clair

D

néant

10. Gélose de Bennett

C

modérée

R

brun rougeâtre

A

limité, rose grisâtre

D

néant

* Observées après incubation à 37°C pendant 3 semaines.

** Abréviations: C = croissance, R = couleur au revers du mycélium du substrat, A = mycélium aérien, D = pigment diffusible.

Tableau II

Caractéristiques physiologiques de la souche G45S-101

Test

Réponse

Méthode et milieu

Nitrite «- nitrate positive

Milieu inorganique: bouil

lon de Czapek au saccharose

et au nitrate

Nitrate <- nitrate positive

Milieu organique: 0,5%

d'extrait de levure, 1,0% de

glucose, 0,5% de KN03,

0,1% de CaC03

Hydrolyse de la faiblement

Milieu gélosé de Luedemann caséine en milieu positive

gélosé

Coagulation du positive

lait écrémé

Liquéfaction de négative

Gélatine à 15% dans un la gélatine

bouillon à la tryptone et à

l'extrait de levure (milieu

ISP N° 1)

Production de positive

Addition de 0,1% de L-

H2S à partir de

cystéine au bouillon à la

L-cystéine

tryptone et à l'extrait de

levure (milieu ISP N° 1) plus

gélose. La présence de H2S

est détectée au moyen d'une

bandelette de papier impré

gnée d'une solution aqueuse

à 10% d'acétate de plomb

Formation de négative

Gélose à la peptone, à la mélanoïde

levure et au fer (ISP N° 6) et

gélose à la tyrosine (ISP

N° 7)

Réaction à la positive

Solution aqueuse de H202

catalase

Réaction à l'oxy-

positive

Réactif de Kovac dase

Température de croissance

Gélose de Bennett croissance abondante à

28, 37 et

45° C. Crois

sance médio

cre à 20° C.

Pas de crois

sance à 10°C

et à 50°C

Il y a lieu de remarquer que la production des composés selon l'invention n'est pas limitée à la souche spécifique particulière d'actinomycète G455-101 définie par les caractéristiques de croissance et les caractéristiques microscopiques données ci-dessus. On peut aussi utiliser des souches ou des mutants produits à partir de l'organisme décrit ci-dessus par des moyens classiques connus de l'homme de l'art, tels qu'une irradiation par les rayons X, une irradiation par les rayons ultraviolets, l'action de la moutarde à l'azote, l'exposition à des phages, etc., c'est-à-dire des mutants qui sont capables de produire le complexe BBM-928 ou des composants individuels de ce complexe.

Préparation du complexe antitumorali antibiotique BBM-928

Le procédé de la présente invention pour la production du complexe antitumoral/antibiotique BBM-928 consiste à cultiver par fermentation la souche d'actinomycète G455-101 dans une solution

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

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6

Tableau III

Utilisation des sources de carbone par la souche G455-101

PG

Lm

1. Glycérol

+ +

+

2. D(—)-arabinose

+

3. L(+)-arabinose

+

4. D-xylose

+ +

+

5. D-ribose

+ +

+

6. L-rhamnose

+ +

+

7. D-glucose

+

8. D-galactose

+ +

+

9. D-fructose

+ +

+

10. D-mannose

+ +

+

11. L(—)-sorbose

—

-

12. Saccharose

-

13. Lactose

• +

-

14. Cellobiose

+

15. Mélibiose

—, ±

—

16. Tréhalose

+

17. Raffinose

—

18. D(+)-mélézitose

-

19. Amidon soluble

+

-

20. Dulcitol

—

-

21. Inositol

+

—

22. D-mannitol

+ +

+

23. D-sorbitol

—

24. Salicine

—

25. Cellulose

+

26. Chitine

+

27. Kératine

+

Milieu de base PG: milieu inorganique de Pridham-Gottlieb, additionné de 0,1% d'extrait de levure.

Milieu de- base Lm: milieu organique de Luede-mann.

Incubation pendant 2 semaines à 37° C.

aqueuse contenant une source de carbone assimilable et une source d'azote assimilable dans des conditions aérobies en immersion, jusqu'à ce qu'une activité antitumorale/antibiotique appréciable ait été conférée à ladite solution. Des procédés classiques de fermentation sont utilisés pour cultiver la souche d'actinomycète G455-101. Les milieux qui sont utiles pour la production des agents antibiotique/antitumoraux de la présente invention comprennent une source assimilable de carbone telle que l'amidon, le glucose, la dex-trine, le maltose, le lactose, le saccharose, le fructose, le mannose, les mélasses,le glycérol, etc. Le milieu nutritif doit également contenir une source assimilable d'azote telle qu'une protéine, un hydrolysat de protéine, des polypeptides, des aminoacides, un extrait soluble de maïs, la caséine, l'urée, etc., de même que des sels minéraux nutritifs qui introduisent des anions et des cations inorganiques tels que potassium, sodium, ammonium, calcium, sulfate, carbonate, phosphate, chlorure, nitrate, etc.

On peut utiliser, dans la production du complexe BBM-928, toute température favorable à une croissance satisfaisante de l'organisme. Des températures allant d'environ 20 à 45° C conviennent, et la température appréciée pour optimiser la croissance de l'organisme se situe dans l'intervalle de 28 à 34° C, la plage de températures de 30 à 32° C étant très appréciée. La production maximale du complexe BBM-928 est généralement obtenue en une période d'environ 4 à 6 d. Des procédés classiques sont utilisés dans la période de fermentation. Par exemple, la préparation en petites quantités est avantageusement effectuée dans des fioles agitées par secousses, ou par des cultures en surface. La préparation en grandes quantités est de préférence effectuée dans des conditions de culture aérobie en immersion, dans des cuves stériles. Dans le cas de la fermentation en cuve, un inoculum végétatif est tout d'abord produit dans un bouillon nu- " tritif par inoculation de la culture en bouillon avec des spores de l'organisme, de manière à produire une culture d'ensemencement jeune et active qui est ensuite transférée dans des conditions aseptiques dans le milieu contenu dans la cuve de fermentation. Une aération peut être produite dans des cuves et des bouteilles par injection d'air stérile à travers ou sur la surface du milieu en cours de fermentation, l'agitation étant poursuivie dans les cuves au moyen d'un agitateur mécanique. Des agents s'opposant à la formation de mousse tels qu'une huile siliconée, l'huile de soja et l'huile de lard, peuvent être ajoutés, le cas échéant.

Les taux d'antibiotique dans le bouillon de fermentation ou dans les extraits de complexe BBM-928 peuvent être déterminés par l'épreuve de diffusion en gélose utilisant des disques de papier, le mi-cro-organisme d'essai étant Sarcina lutea et la gélose nutritive étant utilisée comme milieu d'épreuve. Le pH est ajusté à 9,0 pour obtenir la sensibilité optimale du milieu d'épreuve que l'on utilise pour déterminer la puissance optimale du bouillon.

Le complexe BBM-928 est isolé du bouillon de fermentation par des moyens classiques, par exemple par des méthodes d'extraction au solvant. La purification est avantageusement effectuée par des méthodes prêparatives de distribution à contre-courant et de Chromatographie, comme décrit en détail dans les exemples 2 et 3, pour obtenir les composants A, B, C, D, E et F du complexe BBM-928.

Propriétés physico-chimiques des composants A, B, C et D du complexe BBM-928 de l'exemple 3

Les composants individuels du complexe BBM-928 ont des caractéristiques similaires de solubilité et de réactions colorées. Par exemple, ils sont très solubles dans le chloroforme et le chlorure de méthylène, légèrement solubles dans le benzène, l'éthanol, le méthanol et le n-butanol et insolubles dans l'eau et dans le n-hexane. Des réactions positives sont obtenues avec le chlorure ferrique et le réactif d'Ehrlich et des réactions négatives sont obtenues avec le réactif de Tollens, le réactif de Sakaguchi et la ninhydrine.

Les propriétés physico-chimiques caractéristiques des composants de BBM-928 de l'exemple 3 sont reproduites sur le tableau IV.

Tableau IV

Propriétés physico-chimiques des composants A, B, C et D du complexe BBM-928

BBM-928

A

B

C

D

Point de fusion (°C)

246-248

214-217

244-248

224-227

[a]g (c = 1, CHC13)

-27°

1

û

-91°

-13°

Analyse (valeurs

trouvées) C

53,19

50,14

51,77

50,75

H

5,40

5,29

5,25

N

12,92

12,34

13,55

12,58

O (par différence)

28,49

32,23

29,39

31,42

Xmas. en nm (E^)

dans EtOH

235 (586)

235 (570)

235 (638)

235 (55)

264(415)

264 (400)

264(442)

264 (380)

345 (165)

354 (163)

345 (173)

345 (155)

dans EtOH/HCl

234(610)

234 (556)

234 (650)

234 (565)

264(410)

264 (446)

264 (442)

264 (405)

345 (165)

349 (188)

345 (173)

345 (165)

dans EtOH/NaOH

230 (564)

230 (530)

230 (580)

230 (650)

256 (763)

256 (775)

256 (704)

256 (930)

330 (180)

330(116)

330(117)

330 (140)

383 (170)

383(122)

383 (122)

383 (145)

Poids moléculaire

(osométrie, dans

CHCI3)

1450

—

1470

—

5

10

is

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

7

647247

Le spectre infrarouge et le spectre de résonance magnétique nucléaire des composants A, B, C et D sont reproduits, respectivement, sur les fig. 1 à 4 et sur les fig. 5 à 8 des dessins annexés. Les spectres de résonance magnétique nucléaire de BBM-928A (fig. 5), BBM-928B (fig. 6) et BBM-928C (fig. 7) sont très semblables entre eux, la seule différence résidant dans la présence des groupes acétyle dans les composants A (8:2,03 ppm, 2 Eq molaires) et B (5:2,05 ppm, 1 Eq molaire), mais non dans C. Par acétylation à l'anhydride acétique dans la pyridine, 2, 3 et 4 molaires de groupe acétyle Eq ont été introduits, respectivement, dans les composants A, B et C du complexe BBM-928. Les trois produits d'acétylation ainsi obtenus présentent des propriétés identiques en ce qui concerne la Chromatographie sur couche mince et les spectres UV, IR et RMN, ce qui indique que le composant A de BBM-928 est un dérivé monoacétylé du composant BBM-928B et un dérivé diacétylé du composant BBM-928C.

L'hydrolyse acide du composant BBM-928A donne cinq fragments (I, II, III, IV et V) absorbant la lumière ultraviolette, solubles dans le n-butanol et cinq substances hydrosolubles (NPS-1, 2, 3, 4 et

5) positives à la ninhydrine. Ces dernières substances ont été séparées par Chromatographie sur Dowex 50 x 4 et identifiées comme étant les aminoaciodes suivants:

Les cinq fragments absorbant la lumière ultraviolette indiqués ci-20 dessus sont représentés par les formules suivantes:

5

Composés

Rf (S-123)*

Identification

NPS-1

0,72

P-Hydroxy-N-méthylvaline (HM-Val)

NPS-2

0,49

Glycine (Gly)

10

NPS-3

0,46

Sérine (Ser)

NPS-4

0,45

Sarcosine (Sar)

NPS-5

0,23

Non identifié

* Chromatographie sur couche mince, plaque de gel de silice. 15 S-123: acétate d'ammonium à 10% / méthanol / solution d'ammoniac à 10% (9:10:1)

ch^oh c0-mî-ch-c02h

Fragment I

Spectre de masse: m/e 306 (M+)

ch,

I 5

hh oh o-co-ch-c(ch3)2

ce-

co-ïïh-ch-co2h

Fragment II

C20H25N3O8

Spectre de masse: m/e 377 (m+ — 58) K;°H: 229, 234, 261, 345 nm

CH3O

n c0-(nps-5)

Fragment III

CX0H: 230, 235, 262, 345 nm co2h

Fragment IV C10H7NO4

Spectre de masse: m/e 205 (M+) C?": 228, 260, 354 nm h,c ch,

3\/ 3

c-0h i

0-c0-ch-n-c0-chpnh I 1

CH9 CH,

I

N C0-NH-CH-C02ïï

ch,

Fragment V

C23H30N4O9

C?H: 230, 235, 262, 345 nm

647247

8

Lors de l'hydrolyse acide (HCl 6N), les fragments I, II, III et V donnent les produits de dégradation suivants:

Fragment

Conditions de l'hydrolyse

Tube fermé, 110°C, 20 h

Reflux, 110° C, 3 h

I

IV, Ser

II

IV, Ser, HM-Val

I, HM-Val

III

IV

—

V

—

I, HM-Val, Sar

— CO-t-Ser^X-Kîljr^Sar-^HM-Val

Fragment VI

Par traitement du fragment VI avec l'acide chlorhydrique déci-.normal à 110° C pendant 1 h, on obtient le fragment VII plus le composé HM-Val.

•OR,

normal à 37°C pendant 40 h donne le fragment IX plus le fragment I.

X - Gly -» Sar

Fragment IX

Le groupe X non identifié répond à la formule moléculaire C5H6N202 (sous la forme peptidique) d'après la micro-analyse du fragment IX et d'autres fragments peptidiques contenant (X) et l'analyse spectrale dont les résultats sont récapitulés ci-après.

Ser = sérine.

HM-Val = p-hydroxy-N-méthylvaline.

Sar = sarcosine.

L'hydrolyse basique de BBM-928A ou BBM-928C avec l'hy-droxyde de sodium décinormal à 25° C pendant 3 h donne un fragment VI (les abréviations Ser, HM-Val et Sar ont les définitions données ci-dessus, Gly désigne la glycine et le symbole X représente un groupe non identifié).

^ CO-^Ser-'-X-Mjly-'-Sar

Fragment VII

Le traitement du fragment VI avec de l'hydroxyde de sodium décinormal à 37° C pendant 40 h donne le fragment VIII plus le fragment I.

X - Gly - Sar - HM-Val

Fragment VIII

Le traitement du fragment VII avec l'hydroxyde de sodium dèci-

O-1

CO+Ser+N—

C-Hjly-Sar+'HM-Val t ° o i

I " i

HM-Val-t-S ar-f-Gly^-C v !

V—M "«-Ser+CO

20

Résonnance magnétique des noyaux de 13C

Résonance magnétique des protons

Attribution

30,14 (t)

61,4 (d)ï 61,7 (d) j"

140,7 (d) 171 (s)

2,36 ppm (2H, m) 4,2-4,5 (2H, m) 6,76 (1H, t)

-CH2-

2 x -CHf

^(O ou N) —CH=N— —CO— (amide)

-OH NH

Conformément aux données spectrales obtenues pour les fragments VIII et IX et au spectre de résonance magnétique des protons à 360 MHz du composé Ap du complexe BBM-928 de l'exemple 4, la 30 portion aminoacide X non identifiée semble être le mieux représentée par la structure de tétrahydropyridazine suivante:

35

O

(X)

D'après les résultats des essais de dégradation décrits ci-dessus, les données spectrales, la micro-analyse et les déterminations de poids moléculaires, on considère que les structures suivantes représentent le mieux les composants A, B et C du complexe BBM-928 :

OCH„

Ser = sérine Gly = glycine Sar = sarcosine

HM-Val = P-hydroxy-N-méthylvaline

Ri

R2

BBM-928 A

Ac

BBM-928 B

Ac

H

BBM-928 C

H

Activité antimicrobienne

L'activité antimicrobienne des composants de BBM-928 a été déterminée vis-à-vis de diverses espèces de bactéries et de champignons par la méthode de dilution en série dans de la gélose nutritive à un pH égal à 7, au moyen de l'appareil de multi-inoculation de Steer. On normalise la grandeur de l'inoculum de manière à utiliser une aliquote de 0,0025 ml d'organismes d'essai contenant environ 60 104 cellules/ml pour toutes les bactéries et tous les champignons, excepté les bactéries acidorésistantes, pour lesquelles on utilise une suspension de 106 cellules/ml. Les concentrations inhibitrices minimales déterminées après incubation pendant environ 18 h à 37° C sont indiquées sur le tableau V. Comme le montre ce tableau, les 65 composants du complexe BBM-928 sont modérément à faiblement actifs contre des bactéries Gram positives et des bactéries acidorésistantes, mais pratiquement inactifs contre des bactéries Gram négatives et des champignons.

9

647247

L'activité d'induction du prophage dans une bactérie lysogène composants A, B et C du complexe BBM-928 jusqu'à une concen-(IBL) a été déterminée pour les composants du complexe BBM-928. tration de 100 ng/ml.

Aucune activité IBL appréciable n'a été observée dans le cas des

Tableau V

Activité antimicrobienne in vitro des composants de BBM-928 contre des bactéries aérobies

Code BBRI

Organisme d'essai

Composants de BBM-928 (concentration inhibitrice minimale en ng/ml)

A

B

C

D

E

F

Sa-1

5. aureus 209P

12,5

25

50

100

25

Sp-1

S. pyogenes S-23

6,3

12,5

25

50

12,5

Sl-1

S. lutea PCI 1001

6,3

12,5

50

25

Mf-1

M.flavus D12

12,5

25

50

100

25

Cr-1

C. yerosis 53K-1

25

50

>100

50

Bs-1

B. subtilis PCI 219

25

100

25

Bg-1

B. megaterium D2

25

50

100

25

Ba-3

B. anthracis A9504

6,3

12,5

25

50

12,5

M6-1

M. smegmatis 607 D87

25

100

25

Mp-1

M. phlei D88

12,5

50

12,5

Ec-1

E.coli NIHJ

>100

Kp-1

K. pneumoniae D-l 1

>100

Pa-3

P. aeruginosa A9930

>100

Pv-1

P. vulgaris A9436

>100

Pm-1

P. mirabilis A9554

>100

Pg-1

P. morganii A9553

>100

Sm-1

S. marcescens A20019

>100

AU

A.faecalis ATCC 8750

>100

Ca-1

C. arbicans IAM 4888

>100

Cn-3

C. neoformans

100

>100

100

>100

Activité antitumorale

Des essais comparatifs entre les composants A, B, C et D du complexe BBM-928 et la mitomycine C, du point de vue de l'activité antitumorale, ont été effectués pour les tumeurs à implantation intrapéritonéale suivantes: leucémie P388, leucémie L1210, méla-nome B16, carcinome de Lewis Lung (LL) et ascite du sarcome 180 (S180). Les solutions d'essai des composants de BBM-928 dans du chlorure de sodium à 0,9% contenant 10% de diméthylsulfoxyde, et de mitomycine C dans du chlorure de sodium à 0,9% ont été administrées une fois par jour selon des programmes posologiques allant d'un traitement unique d'une seule journée à des traitements quotidiens multiples. En faisant varier la posologie, on détermine la dose efficace minimale (DEM) qui donne un temps moyen de survie des animaux traités au moins 1,5 fois supérieur au temps moyen de survie d'un groupe témoin. Ce niveau d'activité est considéré comme étant un indice d'une activité antitumorale importante. Les résultats sont reproduits sur le tableau VI qui indique également les rapports calculés d'activité démontrant que le composant A du complexe BBM-928 est notablement plus actif que ne l'est la mitomycine C, la supériorité de ce composant allant d'un facteur 10 à 300 selon la souche tumorale et la posologie. Les valeurs intrapéritonéales de DL50 des composants A, B, C et D du complexe BBM-928 et de la mitomycine C, déterminées par la méthode de Van der Waerden, «Arch. Expt. Path. Pharmak.», 195, 389 (1940), sont également indiquées sur le tableau VI.

Tableau VI

Activité antitumorale et toxicité des composants A, B, C et D 45 du complexe BBM-928 et de la mitomycine C

50

Dose efficace minimale (DEM, mg/kg/d)

DL50, voie intrapéritonéale (mg/kg/d)

P388

L1210

B16

LL

S180

Traitement"

BBM-9289A

0,003

>0,1

0,003

0,03

0,003

0,13

BBM-928B

0,1

—

0,18

55

BBM-928C

0,81

BBM-928D

0,003

—

0,083

Mitomycine C

0,1

3

1

0,3

9,3

Traitementb

60

BBM-928A

0,001

0,003

0,0001

0,013

Mitomycine C

0,1

0,3

1,4

Rapport d'activité (BBM-928A/mitomycine C

Traitement*

30

—

300

10

100

65

Traitement

100

" Un seul traitement le premier jour. b Traitements quotidiens du jour 1 au jour 9.

647247

10

Exemple 1:

Production du complexe de BBM-928

Fermentation sur gélose

On utilise.une culture inclinée sur gélose bien développée de l'espèce G455-101 d'actinomycète pour inoculer un milieu végétatif contenant 2% d'amidon soluble, 1 % de glucose, 0,5% de Pharma-media, 0,5% d'extrait de levure, 0,5% d'amine NZ (type A) et 0,1% de CaC03, le pH étant ajusté à 7,2 avant la stérilisation. On fait incuber la culture d'ensemencement à 32° C pendant 72 h sur une se-coueuse rotative (250 tr/min) et on transfère 5 ml de la culture dans une fiole d'Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml de milieu de fermentation renfermant 2% d'amidon soluble, 1 % de Pharmamedia, 0,003% de ZnS04-7H20 et 0,4% de CaC03. La production du complexe BBM-928 atteint son maximum au bout d'environ 5 d de culture sous agitation par secousses.

Fermentation en cuve

On agite par secousses pendant 4 d une culture d'ensemencement dans des fioles d'Erlenmeyer, et on les inocule à 100 1 de milieu de germination composé de 2,0% de farine d'avoine (Quaker Products, Australie), 0,5% de glucose, 0,2% de levure sèche, 0,0008% de MnCl2-4H20, 0,0007% de CuS04-7H20, 0,0002% deZnS04-7H20 et 0,0001% de FeS04-7H20 dans un fermentateur à cuve d'ensemencement de 2001 que l'on agite à 200 tr/min à 30°C pendant 54 h. Une portion de 15 1 de la culture d'ensemencement est ensuite inoculée à 1701 de milieu de fermentation contenant 2,0% d'amidon soluble, 1,0% de milieu Pharmamedia, 0,003% de ZnS04-7H20 et 0,4% de CaC03 dans un fermentateur à cuve de 4001 que l'on fait fonctionner à 30° C à 200 tr/min à une vitesse d'aération de 1501/min. Le pH du bouillon s'élève graduellement à mesure que la fermentation progresse et il atteint 8,4-8,5 après 100-120 h; à ce moment, la puissance maximale de l'antibiotique est atteinte pour une concentration de 30 jxg/ml.

Exemple 2:

Isolement du complexe BBM-928 par extraction au solvant

Le bouillon récolté (170 1, pH 8,5) obtenu dans l'exemple 1 est filtré avec un agent de clarification. On détecte une activité tant dans le gâteau mycélien que dans le filtrat. Le gâteau mycélien est extrait deux fois avec un mélange de solvants formé d'acétone et de méthanol (1:1, deux fois 301). Les extraits sont rassemblés et évaporés sous pression réduite en donnant un concentré aqueux qui est extrait au n-butanol. Le filtrat du bouillon est extrait deux fois avec 401 de n-butanol à chaque fois. Par concentration sous pression réduite des extraits n-butanoliques rassemblés et lyophilisation du résidu, on obtient 21,4 g d'une substance solide brute. D'après l'analyse par Chromatographie sur couche mince, cette substance consiste en un complexe renfermant trois composants principaux A, B et C, et trois composants secondaires D, E et F, dont les valeurs de Rf sont indiquées sur le tableau VII.

Tableau VII

Chromatographie sur couche mince de gel de silice des composants du complexe BBM-928

Valeurs de Rf*

Système N-l 18**

Système N-l 03***

BBM-928A

0,71

0,48

BBM-928B

0,53

0,26

BBM-928C

0,27

0,07

BBM-928D

0,73

0,53

BBM-928E

0,56

0,34

BBM-928F

0,39

0,17

* Détection par l'analyseur à rayons ultraviolets (Shimadzu CS-

910) à 345 nm.

** n-Butanol / méthanol / eau (63:27:10).

*** Xylène / méthyléthylcétone / méthanol (5:5:1).

Exemple 3:

Purification du complexe BBM-928

Le complexe brut de l'exemple 2 est purifié au moyen d'un appareil de distribution préparative à contre-courant (Mitamura, 100 ml/tube) au moyen d'un système de solvants comprenant du tétrachlorure de carbone, du chloroforme, du méthanol et de l'eau dans la proportion de 5:2:5:1. Après 50 transferts, les contenus des tubes Nos 5 à 20 sont rassemblés et concentrés en donnant 4,4 g d'une poudre de couleur jaune pâle contenant les composants A, B, D, E et F. On dissout le mélange dans un faible volume de chloroforme et on charge la solution sur une colonne de gel de silice C-200 (500 ml) préalablement traitée à l'acétate d'éthyle. La colonne est développée avec de l'acétate d'éthyle renfermant une quantité croissante de méthanol (2-5% volume à volume) et les fractions sont contrôlées par détermination de la densité optique à 345 nm. Le composant D secondaire est élué le premier avec de l'acétate d'éthyle et il est suivi du composant A. Les composants E, B et F sont ensuite élués dans cet ordre à une concentration au méthanol de 3%. Chaque fraction contenant le composant désiré est évaporée sous pression réduite et le résidu est cristallisé dans un mélange de chloroforme et de méthanol. De même, la préparation brute du composant C est obtenue à partir du contenu des tubes Nos 21 à 35 résultant du partage à contre-courant décrit ci-dessus. La purification du composant C est effectuée par Chromatographie sur gel de silice et cristallisation dans un mélange de chloroforme et de méthanol. Les rendements des composants A, B, C, D, E et F ont les valeurs respectives suivantes: 988, 420, 848,130,119 et 114mg.

Exemple 4:

Purification subséquente du composant A du complexe BBM-928 de l'exemple 3

L'épreuve chromatographique sur couche mince du composant BBM-928A de l'exemple 3 (effectuée en utilisant un système formé de méthanol à 10% dans le toluène) indique que l'échantillon n'est pas entièrement homogène, du fait qu'il renferme une matière additionnelle qui passe jsute avant lecomposant BBM-928A. Les étapes suivantes ont été mises en œuvre pour effectuer la purification:

1) On effectue la Chromatographie de l'échantillon sur gel de silice en utilisant un gradient linéaire allant du chloroforme à un mélange méthanol/chloroforme à 6% de méthanol. Les fractions éluées entre les proportions de 2,4 et 3,3% de méthanol dans le mélange méthanol/chloroforme (contenant le composant BBM-928A plus une certaine quantité d'impureté) sont réunies en vue de l'opération suivante.

2) On engendre un gradient concave en utilisant trois récipients dont les deux premiers contiennent un mélange de méthanol et de toluène à 2% de méthanol et dont le troisième contient un mélange de méthanol et de toluène à 6% de méthanol. Les fractions rassemblées au terme de la première étape de Chromatographie sur colonne de gel de silice donnent, d'après ce gradient, un composant secondaire qui est élué le premier et qui est suivi de près par le composant BBM-928A purifié (appelé ci-après composant BBM-928Ap).

Le poids moléculaire du composant BBM-928Ap, déterminé d'après la méthode spectrométrique de masse par désorption dans un champ, est égal à 1427, ce qui correspond à la formule brute C64H78Ni4024 (poids moléculaire 1427, 417).

Analyse élémentaire (échantillons séchés à 100"C pendant 18 h)

pour C64H78NI4024:

Calculé: C 53,85 H 5,51 N 13,74 O 26,90%»

Trouvé: C 52,47 H 5,48 N 13,81 O 28,24% b a Par différence.

b Moyenne de trois mesures.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

r

4 feuilles dessins

Claims

647247

1 0 HM-Val->-S ar-KJly-C

C-HJly+S ar-'HH-Val

0 J'

OCH.

dans laquelle Ser est la sérine, Gly est la glycine, Sar est la sarcosine et HM-Val est la p-hydroxy-N-méthylvaline.

1, caractérisé en ce que la portion aminoacide X a la formule brute C5H6N202 sous la forme peptidique.

1) à l'état dissous dans le deutérochloroforme, il donne un spectre de résonance magnétique des protons correspondant à la représentation donnée sur la fig. 5.

1. Le composé antibiotique/antitumoral BÌ5M-928A qui présente les caractéristiques suivantes:

a) il est soluble dans le chloroforme et le chlorure de méthylène, légèrement soluble dans le benzène, l'éthanol, le méthanol et le n-butanol et sensiblement insoluble dans l'eau et le n-hexane;

b) il donne une réaction positive avec le réactif au chlorure ferri-que et le réactif d'Ehrlich et une réaction négative avec le réactif de Tollens, le réactif de Sakaguchi et le réactif à la ninhydrine;

c) il est un agent antitumoral efficace contre la leucémie P388, la leucémie L1210, le mélanome B16, le carcinome de Lewis-Lung et l'ascite du sarcome 180 par implantation intrapéritonéale chez la souris;

d) il a un point de fusion de 246-248°C;

e) il a une rotation spécifique [a]^ égale à 27° (c = 1, CHC13);

f) il a un poids moléculaire de 1427;

g) il contient approximativement, d'après l'analyse élémentaire, 52,47% de carbone, 5,48% d'hydrogène, 13,81% d'azote et 28,24% d'oxygène;

h) il présente, dans l'analyse par Chromatographie sur couche mince de gel de silice, une valeur de Rf de 0,71 avec le mélange de solvants formé de n-butanol, de méthanol et d'eau dans la proportion de 63:27:10 et une valeur de Rf de 0,48 avec le mélange de solvants formé de xylène, de méthyléthylcétone et de méthanol dans la proportion de 5:5:1 ;

i) il donne, par hydrolyse acide, des substances hydrosolubles positives à la ninhydrine comprenant la P-hydroxy-N-méthylvaline, la glycine, la sérine et la sarcosine;

■ CO-*-Ser-"X-Kîly-^Sar+HM-Val

Fragment VI

dans laquelle Ser est la sérine, Gly est la glycine, Sar est la sarcosine, HM-Val est la P-hydroxy-N-méthylvaline et le symbole X représente une portion aminoacide;

k)il a un spectre d'absorption infrarouge dans le bromure de potassium correspondant à la représentation donnée sur la fig. 1, et

2, caractérisé en ce que la portion aminoacide X sous la forme peptidique est le radical tétrahydropyridazine de formule:

0

ri

G—

OH

. 30

2. Le composé antibiotique/antitumoral suivant la revendication

2

REVENDICATIONS

j) il donne, par hydrolyse basique, un fragment VI de formule:

3

647247

dans laquelle Ser est la sérine, Gly est la glycine, Sar est la sarcosine, HM-Val est la p-hydroxy-N-méthylvaline et est un groupe acétyle.

3. Le composé antibiotique/antitumoral suivant la revendication

4. Le composé antibiotique/antitumoral suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'il correspond à la structure:

rv

OR

CO+Ser+N (

I C-Kîly+Sar+HM-Val

0 » « L

+ n 0 *

T 0 .< 0

HM-Va^Sar^-Gly-K] |

") Ser+CO

dans laquelle Ser est'la sérine, Gly est la glycine, Sar est la sarcosine, HM-Val est la P-hydroxy-N-méthylvaline et Rj et R2 sont des groupes acétyle.

5. Le composé antitumoral/antibiotique BBM-928B ayant un chromophore de quinoléine et donnant, par hydrolyse acide, des composants hydrosolubles comprenant la sérine, la glycine, la sarcosine et la P-hydroxy-N-méthylvaline, qui a, sous sa forme essentiellement pure, les caractéristiques suivantes:

b) il donne une réaction positive avec le réactif au chlorure ferri-que et le réactif d'Ehrlich et une réaction négative avec les réactifs de Tollens et de Sakaguchi et le réactif à la ninhydrine;

c) il est un agent antitumoral efficace contre la leucémie P388 implantée par voie intrapéritonéale chez la souris;

d) il a un point de fusion de 214-217°C;

e) il a une rotation spécifique [a]fj de — 74° (c=1, CHC13);

f) il renferme approximativement, d'après l'analyse élémentaire, 45 50,14% de carbone, 5,29% d'hydrogène, 12,34% d'azote et 32,23%

d'oxygène;

g) il présente dans la Chromatographie sur couche mince de gel de silice une valeur de Rf de 0,53 avec le mélange de solvants n-buta-

. nol/méthanol/eau dans la proportion de 63:27:10 et une valeur de 50 Rf de 0,26 avec le mélange de solvants formé de xylène, de méthyléthylcétone et de méthanol dans la proportion de 5:5:1 ;

h) il a un spectre d'absorption infrarouge dans le bromure de potassium correspondant à la représentation de la fig. 2, et i) il donne, à l'état dissous dans le deutérochloroforme, un 55 spectre de résonance magnétique des protons correspondant à la courbe de la fig. 6.

6. Le composé suivant la revendication 5, ayant la structure:

HM-Val-^-SarKJljn-C

C-Hîly+Sar-HJM-Val 0 i HO

o v#*

■ Serico

0CH_

7. Le composé antitumoral/antibiotique BBM-928C ayant un chromophore de quinoléine et donnant, par hydrolyse acide, des composants hydrosoluble comprenant la sérine, la glycine, la sarcosine et la P-hydroxy-N-méthylvaline, qui présente sous sa forme essentiellement pure les caractéristiques suivantes:

a) il est soluble dans le chloroforme et le chlorure de méthylène, légèrement soluble dans le benzène, l'éthanol, le méthanol et le n-butanol et sensiblement insoluble dans l'eau et dans le n-hexane;

b) il donne une réaction positive avec le réactif au chlorure ferri-que et le réactif d'Ehrlich et une réaction négative avec le réactif de Tollens et de Sakaguchi et le réactif à la ninhydrine;

c) il est un agent antitumoral efficace contre la leucémie P388, la leucémie L1210, le mélanome B16, le carcinome de Lewis-Lung et les tumeurs d'ascite du sarcome 180 implantées par voie intrapéritonéale chez la souris;

d) il a un point de fusion de 244-248°C;

e) il a une rotation spécifique [a]ff de — 91° (c= 1, CHC13);

0 il a un poids moléculaire approximatif de 1470;

g) il contient approximativement d'après l'analyse élémentaire 51,77% de carbone, 5,29% d'hydrogène, 13,55% d'azote et 29,39% d'oxygène;

h) il présente dans la Chromatographie sur couche mince de gel de silice une valeur de Rf de 0,27 avec un mélange de solvants formé de n-butanol, de méthanol et d'eau dans la proportion de 63:27:10 et une valeur de Rf de 0,07 avec le mélange de solvants formé de xylène, de méthyléthylcétone et de méthanol dans la proportion de 5:5:1;

i) il a un spectre d'absorption infrarouge dans le bromure de potassium correspondant à la courbe de la fig. 3, et j) il donne, à l'état dissous dans le deutérochloroforme, un spectre de résonance magnétique des protons correspondant à la courbe de la fig. 7.

8. Le composé suivant la revendication 7, correspondant à la structure:

0

9. Le composé antitumoral/antibiotique BBM-928D présentant les caractéristiques suivantes:

c) il est un agent antitumoral efficace contre la leucémie P388 à implantation intrapéritonéale chez la souris;

d) il a un point de fusion de 224 à 227°C;

e) il a une rotation spécifique [a]^ de —13° (c= 1, CHC13);

f) il contient approximativement d'après l'analyse élémentaire, 50,75% de carbone, 5,25% d'hydrogène, 12,58% d'azote et 31,42% d'oxygène;

g) il présente dans la Chromatographie sur couche mince de gel de silice une valeur de Rf de 0,73 avec le mélange de solvants formé de n-butanol, de méthanol et d'eau dans la proportion de 63:27:10 et une valeur de Rf de 0,53 dans le mélange de solvants formé de xylène, de méthyléthylcétone et de méthanol dans la proportion de 5:5:1;

h) il a un spectre infrarouge dans le bromure de potassium correspondant à la courbe de la fig. 4, et i) il donne, à l'état dissous dans le deutérochloroforme, un spectre de résonance magnétique des protons correspondant à la courbe de la fig. 8.

10. Procédé de production par fermentation du complexe antitumoral/antibiotique BBM-928, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une souche d'actinomycètes ayant les caractéristiques de la souche ATCC 31491 dans une solution aqueuse contenant une source de carbone assimilable et une source d'azote assimilable dans des conditions aérobies en immersion jusqu'à ce que le complexe BBM-928 produit confère une activité antitumorale/antibiotique appréciable à ladite solution.

-Ser-KIO

11. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape de séparation du complexe BBM-928

35 du milieu de culture.

12. Procédé suivant la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comporte en outre une étape de division du complexe BBM-928 en composants A, B, C, D, E et F qui ont les valeurs suivantes de Rf dans la Chromatographie sur couche mince de gel de silice:

40

50

Valeurs Rf

n-Butanol/méthanol/

Xylène/méthyléthyl-

eau (63:27:10)

cétone/méthanol (5:5:1)

BBM-928A

0,71

0,48

BBM-928B

0,53

0,26

BBM-928C

0,27

0,07

BBM-928D

0,73

0,53

BBM-928E

0,56

0,34

BBM-928F

0,39

0,17

13. Médicament, caractérisé en ce qu'il comprend, en tant que 55 principe actif, un composé antitumoral/antibiotique suivant l'une des revendications 1 à 9.