CH668598A5

CH668598A5 - Antitumor-antibiotika.

Info

Publication number: CH668598A5
Application number: CH3417/86A
Authority: CH
Inventors: Jerzy Golik
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1985-08-27
Filing date: 1986-08-26
Publication date: 1989-01-13
Also published as: SE9200428L; IT1229176B; BE905332A; DK406086A; ZA865796B; FI863405A0; CA1307256C; SE8603597L; KR870002269A; FR2586686A1; IL79519A0; SG109692G; ATA231786A; IT8621527A0; SE8603597D0; FI83422B; SE469632B; GB2179649A; IE862280L; GB2179649B

Description

BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Antitumor-Antibiotika und ihre Herstellung und Isolierung.

Die erfindungsgemässen Verbindungen sind strukturell noch nicht aufgeklärt worden. In Anbetracht ihrer einheitlichen physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften muss jedoch angenommen werden, dass BBM-1675C und BBM-1675D neue Verbindungen darstellen.

Inder GB-A-2141425, die am 19. Dezember 1984publiziert wurde, wird die Fermentation von Actinomadura verrucosopora Stamm H964-92 (ATCC 39334) oder Actinomadura verrucoso-spora Stamm A1327Y (ATCC 39638) zur Herstellung eines neuen Antitumor-Komplexes, der alsBBM-1675 bezeichnet wurde, offenbar. Zwei biologisch aktive Hauptkomponenten des BBM-1675-Komplexes wurden mit BBM-1675A1 und BBM-1675A2 bezeichnet. Die Strukturen dieser Antibiotika, die ebenfalls als Esperamicin Ai bzw. Esperamicin A2 bekannt sind, sind ebenfalls noch nicht aufgeklärt worden, beide Komponenten zeigen jedoch ausgezeichnete antimikrobielle und Antitumor-Aktivitäten.

Die US-A-4 530 835, erteilt am 23. Mi 1985 an Bunge et al., offenbart die Fermentation eines nicht identifizierten Actinomy-cetes-Isolates WP-444 (ATCC 39363) zur Herstellung der Anti-tumor-Antibiotika, welche als CL-1577A und CL-1577B bezeichnet wurden. Die Strukturen der CL-1577-Antibiotika sind noch nicht aufgeklärt worden, haben jedoch kennzeichnende Charakteristika, welche zeigen, dass CL-1577A und CL-1577B strukturell den BBM-1675-Antibiotika ähnlich sind, insbesondere dem BBM-1675Ai und A2, welche in der GB-A-2141425 beschrieben sind.

R.H. Bunge et al., in J. Antibiotics, 37 (12), 1566-1571 (1984) beschreibt die Fermentation von Actinomadura sp. (ATCC 39363) zur Herstellung eines bioaktiven Komplexes mit den zwei Hauptkomponenten PD114759 undPD 115 028, die isoliert wurden. J.H. Wilton et al., in J. Chem. Soc. Chem. Commun., 919-920 (1985) beschreibt die partielle Strukturaufklärung der AntibiotikaPD 114759undPD 115 028. Die Herstellung, Isolierungund Charakterisierung der PD 114 759 und PD 115 028 Antibiotika scheint mit derjenigen der obgenannten CL-1577A bzw. CL-1577B identisch zu sein.

Die EP-A-95154, die am 30. November 1983 publiziert wurde, offenbart die Fermentation von Actinomadura pulver-aceus sp. nov. Nr. 6049 (ATCC 39100) zur Herstellung der Antitumor-Antibiotika, die als WS 6049-B und WS 6049-B bezeichnet wurden. Die Strukturen der WX 6049-Antibiotika sind noch nicht aufgeklärt worden, die charakterisierenden Eigenschaften, welche für die Antibiotika angegeben werden, zeigen jedoch, dass WS 6049-A und WS 6049-B strukturell den BBM-1675-Antibiotika der GB-A-2141425 und den CL-1577-Antibiotika gemäss US-A-4 530 835 verwandt sind. Die Spektraldaten zeigen jedoch, dass weder WS 6049-A noch WS 6049-B mit irgendeiner der BBM-1675-Komponenten identisch ist. Überdies sind die produzierenden Mikroorganismen, die in der EP-A-95 154 beschrieben sind, klar verschieden von Actinomadura verrucosospora, welche in der GB-A-2141485 verwendet wurden, nämlich in der Farbe ihres aerialenMiyceliums in ISP-Medium Nrn. 2,3 und 4, in ihrer positiven Milchpeptonisierung und ihrer positiven Verwendung von D-Fructose, D-Mannit, Trehalose und Cellulose.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind die neuen Antitumor-Antibiotika, die hier als BBM-1675C und BBM-1675D bezeichnet werden und die ebenfalls als BMY-27305 und BMY-27307 bekannt sind. Diese Substanzen werden durch eine selektive chemische Hydrolyse der bioaktiven Komponenten BBM-1675AX (Esperamicin Aj) oder BBM-1675 A2 (Esperamicin A2) hergestellt, welche selbst durch die Kultivation eines BBM-1675-produzierenden Stammes von Actinomadura verrucosospora hergestellt werden. Die bioaktiven Substanzen BBM-1675C und

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BBM-1675D können durch konventionelle chromatographische Verfahren abgetrennt und gereinigt werden und die beiden Substanzen zeigen ausgezeichnete antimikrobielle und Anti-tumor-Eigenschaften.

Beschreibung der Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von BBM-1675C;

Fig. 2 zeigt das Ultraviolett-Absorptionsspektrum von BBM-1675D;

Fig. 3 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-1675C (KBr, Film);

Fig. 4 zeigt das Infrarot-Absorptionsspektrum von BBM-1675D (KBr, Film);

Fig. 5 zeigt das relative Häufigkeits-Massenspektrum von BBM-1675C;

Fig. 6 zeigt das relative Häufigkeits-Massenspektrum von BBM-1675D;

Fig. 7 zeigt das Protonen-Kernresonanzspektrum von BBM-1675C in CDC13 (360 MHz);

Fig. 8 zeigt das Protonen-Kernresonanzspektrum von BBM-1675D in CDCI3 + 10% CD3OD (360 MHz);

Fig. 9 zeigt das 13C-Kernresonanzspektrum vonBBM-1675C in CDCI3 (90,6 MHz);

Fig. 10A zeigt das 13C-Kernresonanzspektrum (110-220 ppm) von BBM-1675D in CDEC13 + 10% CD3OD (90,6 MHz);

Fig. 10B zeigt das 13C-Kernresonanzspektrum (0-110 ppm) von BBM-1675D in CDC13 + 10% CD3OD (90,6 MHz);

Fig. IIA zeigt das Protonen-Resonanzspektrum der Verbindung 3A (a-Anomer) in CDC13 (360 MHz);

Fig. IIB zeigt das Protonen-Resonanzspektrum der Verbindung 3B (ß-Anomer) in CDC13 (360 MHz).

Die erfindungsgemässen antitumor-aktiven Substanzen mit der Bezeichnung BBM-1675C und BBM-1675D, die ebenfalls als BMY-27305 und BMY-27307 bekannt sind, können durch selektive chemische Hydrolyse der biologisch aktiven Komponenten BBM-1675A! (Esperamicin Ai) oder BBM-1675A2 (Esperamicin A2) hergestellt werden, wobei die letzteren durch Kultivation eines BBM-1675-pröduzierenden Stammes von Actinomadura verrucosospora, vorzugsweise Actinomadura verrucosospora Stamm H964-92 (ATCC 39 334) oder Actinomadura verrucosospora Stamm A3127Y (ATCC 39 638) oder einem Mutanten davon, erhalten werden.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung der Substanz BBM-1675C durch selektive Hydrolyse der bioaktiven Komponenten BBM-1675Ai oder BBM-1675A2. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung der Substanz BBM-1675D durch selektive Hydrolyse der Substanz BBM-1675C, vorzugsweise aus den bioaktiven Komponenten BBM-1675A! oder BBM-1675A2. Die Isolierung und Reinigung von BBM-1675 C und BBM-1675D aus der Reaktionsmischung kann durch konventionelle chromatographische Verfahren durchgeführt werden. Die bioaktiven Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D zeigen eine antimikrobielle Aktivität gegen ein breites Spektrum von Mikroorganismen und zeigen ebenfalls eine Hemmwirkung gegen verschiedene Tumorsysteme bei Mäusen, wie P-388-Leukämie und B16-Melanom. Die erfindungsgemässen Verbindungen können demzufolge als antimikrobielle Mittel oder als Antitumor-Mittel für die Hemmung von Tumoren bei Säugetieren verwendet werden.

Während Zersetzungsstudien zur Strukturaufklärung der Antitumor-Antibiotika BBM-1675Aj (Esperamicin A[) und BBM-1675A2 (EsperamicinA2) wurde eine Mischung der Komponenten hergestellt, welche zur Isolierung und Identifizierung von zwei inaktiven Fragmenten führen, Erfindungen der Formeln 1 bzw. 2. Es wurde jedoch überraschenderweise gefunden, dass die chemische Zersetzung zur stufenweisen Freisetzung von

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zwei bioaktiven Fragmenten, nämlich BBM-1675C und BBM- D, die ein kleines Molekulargewicht aufweisen (etwa 70 bzw. 1675D führte. Es war noch überraschender, dass die zwei ver- 55 % des Molekulargewichts der Ausgangsantibiotika BBM-schiedenen Antibiotika BBM-1675A! und A2 die gleichen bioak- 1675Ai bzw. A2) noch wirksamer sind als BBM-1675A2 und mit tiven Fragmente bildeten, wie dies im Schema 1 dargestellt ist. dem BBM-1675A! als Antitumor und antimikrobielles Mittel

Noch überraschender ist, dass die Fragmente BBM-1675C und 5 vergleichbar sind.

Schema 1

BBM-16 75 A] (Esperamicin A^)

BBM-16 75C■

"7^

BBM-16 75D

BBM-16 75A, (Esperamicin A^)

Die SubstanzenBBM-1675CundBBM-1675D können durch eine selektive chemische Hydrolyse des Antibiotikums BBM-1675Aj, wie in Schema 2 dargestellt, erhalten werden.

Schema 2

BBM-16 75A,

( KG 1248)

ch3oh

BBM-1675C (MG 85 5)

V

BBM-16 75D (MG 695)

och.

Verbindung l( MG 425) (Mischung der et-und ß Anoruere)

h®/ch3oh och.

Verbindung 3 ( MG 192) ( Mischung der a—und ß-Anomere)

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Die Ausgangsverbindung BBM-1675AJ wird gemäss dem Verfahren, das in der GB-A-2141425 (veröffentlicht am 19. Dezember 1984) beschrieben ist, hergestellt. Die bereinigte Komponente BBM-1675A! wird mit einer Mineralsäure oder einer organischen Säure wie Chlorwasserstoff, Schwefelsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure oder dergleichen in einem organischen Lösungsmittel oder in einer Mischung eines inerten wässrig/organischen Lösungsmittels bei einer Temperatur von 0 °C bis zur Rückflusstemperatur des Lösungsmittels hydrolisiert, bis ein wesentlicher Teil des gewünschten BBM-1675C oder BBM-1675D gebildet worden ist. Vorzugsweise wird die Hydrolyse in einem Alkohol mit 1-6 C-Atomen durchgeführt und besonders bevorzugt wird die Alkoholyse in Methanol ausgeführt. Die Reaktionstemperatur ist nicht kritisch, es wird jedoch bevorzugt, die Reaktion bei etwa Zimmertemperatur bis 60 °C und bevorzugt bei 40 °C durchgeführt.

Die selektive Hydrolyse von BBM-1675Ax wird stufenweise durchgeführt, wobei zuerst das Antibiotikum BBM-1675C und das inaktive Fragment der Formel 1 erhalten wird. Anschliessend oder bei fortgesetzter Behandlung unter hydrolysierenden Bedingungen wird eine Mischung der a- und ß-Anomere des Thiozuckers der Formel 3 freigesetzt und das Antibiotikum BBM-1675D wird erhalten. Der Fachmann wird erkennen, dass s die Änderung der Reaktionsbedingungen wie Zeit, Temperatur und Konzentration der Säure die Anteile der produzierenden Antibiotika BBM-1675C und D entsprechend ändern wird. Es ist jedoch erwünscht, den Fortschritt der Reaktion durch Dünnschicht-Chromatographie zu verfolgen, wie dies in den Beispie-io len beschrieben ist.

Wenn nun das Antibiotikum BBM-1675D hergestellt werden soll, wird die selektive Hydrolyse vorzugsweise in einer organischen Säure wie p-Toluolsulfonsäure durchgeführt, wie dies hier beschrieben ist, wobei eine quantitative Ausbeute von BBM-1675D erhalten wird.

Die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D können ebenfalls durch selektive chemische Hydrolyse des Antibiotika BBM-1675A2 erhalten werden, wie dies in Schema 3 dargestellt ist.

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Schema 3

bbm-1675a

ch

( mg 1248)

2 CH3OH

-> bbm-1675c ( mg 85 5)

ch3Ov ch3o

O

3/ ^ O oh

O nh ch,

och.

O-/ ^ 2

och

Verbindung 2 ( MG 425) ( Mischung der et-und ß-Anomere)

I^/ch3OH

V

bbm-1675d ( MG 695)

och.

Verbindung 3, ( MG 192) ^Mischung der et-und ß-An ordere ) '

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Das Ausgangsmaterial BBM-1675 A2 wird gemäss dem Verfahren hergestellt, wie es in der GB-A-2141425 (publiziert am 19. Dezember 1984) beschrieben ist. Die selektive Hydrolyse des gereinigten BBM-1675A2 findet ebenfalls stufenweise statt, wobei zuerst das AntibiotikumBBM-1675Cund das inaktive Fragment der Formel 2 erhalten wird. Die fortgesetzte Behandlung unter hydrolysierenden Bedingungen führt zur Freisetzung einer Mischung der a- oder ß-Anomeren des Thiozuckers der Formel 3 unter Produktion des Antibiotikums BBM-1675D.

Die verwendeten Reaktionsbedingungen für die selektive chemische Hydrolyse von BBM-1675A2 sind im wesentlichen die gleichen wie diejenigen bei der Hydrolyse von BBM-1675Ax, wie oben beschrieben. In einer ähnlichen Weise, wie die Herstellung von BBM-1675D aus BBM-1675Ai, wird, wenn nur die Herstellung von BBM-1675D gewünscht wird, die Hydrolyse von BBM-1675A2 so lange fortgesetzt, bis im wesentlichen alles von BBM-1675A2undBBM-1675CinBBM-1675D umgewandelt ist. Vorzugsweise wird die Hydrolyse mit einer organischen Säure, wie p-Toluolsulfonsäure, durchgeführt.

Die Erkenntnis, dass die gleichen Antibiotika BBM-1675C und D aus zwei verschiedenen Antibiotika BBM-1675Ax und BBM-1675 A2 mit dem gleichen Verlust von zwei inaktiven Fragmenten der Formel 1 bzw. 2 und des Thiozuckers der Formel 3 hergestellt wird, ist ein weiterer Vorteil der vorhegenden Erfindung. Demzufolge ist ein weiterer Erfindungsgegenstand ein selektives Hydrolyseverfahren einer Mischung von BBM-1675Ai und A2 zur Herstellung von BBM-1675C und D, wie dies im Schema 4 dargestellt ist.

Schema 4

BBM-1675Aj + BBM-1675A2 -> BBM-1675C BBM-1675D

Dieser Vorteil wird ersichtlich, wenn man die verhältnsmässi-gen Anteile von BBM-1675Ax und A2 betrachtet, welche verschieden sein können. Die HersteEung von BBM-1675C und D ist demzufolge unabhängig von den relativen Anteilen von BBM-1675 Ax und A2, welche als Ausgangsmaterial im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt werden.

Wie beschrieben führt die Hydrolyse von BBM-1675Ai, A2 und C zu der Freisetzung eines inaktiven Thiozuckerfragmentes. Dieser Thiozucker wurde isoliert, um eine weitere Information der chemischen Struktur von BBM-1675C zu erhalten und demzufolge ebenfalls für BBM-1675Ai und A2. Die Verbindung der Formel 3 wurde als Mischung der a- und ß- Anomere des Thiozuckers ermittelt, dessen Struktur in den Schemen 2 und 3 erläutert ist. Eine weitere Charakterisierung wurde möglich, nachdem die Alkoholyse der a- und ß-Anomere abgetrennt wurden. Die Kernresonanzspektren (360 MHz) der Verbindung 3A (a-Anomer) und der Verbindung 3B (ß-Anomer) ist in den Fig. IIA bzw. IIB dargestellt. Aus einer Analyse der Spektraldaten wurden den Thiozucker-Methylglykosiden der Formel 3 vorläufig die Stereochemie der folgenden Formel zugeschrieben: OH

ch och

Gegenwärtig ist die absolute Stereochemie, d. h. D oderLnoch nicht bestimmt. Auf Basis der vorliegenden Interpretation der Spektraldaten wird demzufolge geschlossen, dass der Thiozucker der Formel 3 (weniger die CH3-Gruppe des anomeren Methoxy, welches während der Methanolyse eingeführt wird) eine Komponente der Struktur des Antibiotikums BBM-1675C ist und somit ebenfalls eine Komponente der Ausgangsantibiotika BBM-1675Ai und A2 ist.

Physikalisch-chemische Eigenschaften von BBM-1675C

Beschreibung: amorpher Feststoff

Ultraviolett-Absorptionsspektrum: vergleiche Fig. 1

Instrument: Hewlett-Packard 8458

Lösungsmittel: Methanol

Konzentration: 0,0155 g/1

Xma^nm) Absorptivitäten

210 21,770

274 9,340

313 sh (Schulter) 4,190

Mit Säure oder Base wurde keine wesentliche Änderung beobachtet.

Infrarot-Absorptionsspektrum: vergleiche Fig. 3 Instrument: Nicolet 5DX FT-IR

Hauptabsorptionsbanden (KBr, Film): 540,740,955,990,1017,

1065,1080,1118,1150, 1250,1305,1325,1340, 1370,1385,1440,1690, 1705,1735,2900,2920, 2930, 2970, 3450 cm"1.

Massenspektrum: vergleiche Fig. 5

Instrument: Finigan 4500 TSQ

Verfahren: Beschuss mit schnellen

Atomen (FAB) Ionisierung

Matrix m/z

Molekülion

Relative Häufigkeit

Glycerin

856

[M+H]+

10%

Glycerin+NaCl

878

[M+Na]+

100%

Dithiotreitol:

Dithioerythrit

(3+1) (w.w)

856

[M+H]+

100%

Instrument: Kratos MS-50

Hohe Auflösungs-FAB (m/z): [M+H]+ = 856,3362 Molekulargewicht: scheinbares MG = 855 (auf Ba sis der vorherigen Massenspektren)

Elementare Zusammensetzung: C36H61B3014S3 (auf Basis der obigen Hochauflösungsdaten) Protonen-Resonanzspektrum: vergleiche Fig. 7 Instrument: WM 360 Bruker

Lösungsmittel: CDC13

!HNMR 360 MHz Ô (ppm): 6,54(lH,dd, J=7,7,7,0); 6,21

(1H, brs); 5,87 (1H, d, J=9,6); 5,78 (lH,dd,J=89,6,1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J=10,3,1,8); 4,61 (lH,d, J=7,7); 4,25 (lH,s); 4,09 (1H, q, J=2,6);3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92-3,53 (10H), 3,45 (1H, dt J=10,3,2,6); 2,48 (3H,s); 2,30 (2H, m);2,13 (1H, m); 2,09 (3H,s), 1,50 (2H,m); 1,37 (3H, d, J=5,9);1,32(3H, d, J=6,3); 1,08 (6H).

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13C Kernresonanz-Spektrum:

Instrument:

Lösungsmittel:

13C NMR 90,6 MHz ô (ppm):

vergleiche Fig. 9 WM 360 Bruker CDCI3

13,7,17,5,19,8,22,3,22,7,

23,5,34,2,35,2,39,5,47,7,

52,7,55,8,56,1,57,7,62,4,

64,7,67,4,69,3,69,8,71,9,

76,1,77,1,77,7,79,7,83,2,

88,4,97,3,99,7,123,4,124,6,

130,1,193,1.

Physikalisch-chemische Eigenschaften von BBM-1675D

Beschreibung:

Ultraviolett-

Absorptionsspektrum:

Instrument:

Lösungsmittel:

Konzentration:

amorpher Feststoff vergleiche Fig. 2 "Hewlett-Packard 8458 Methanol 0,01 g/1

Xmax(nm)

Absorptivitäten

214 274 325

27,000 12,800 5,400

Mit Säure und Base werden keine merklichen Änderungen beobachtet.

Infrarot-Absorptionsspektrum: Instrument:

Haupt-Absorptionsbanden (KBr, Film):

Massenspektrum:

Instrument:

Verfahren:

Matrix:

Molekülion (m/z):

Relative Häufigkeit: Instrument:

Hoch-Auflösung FAB (m/z): Molekulargewicht:

Elementare Zusammensetzung:

Protonen-Resonanzspektrum:

Instrument:

Lösungsmittel:

vergleiche Fig. 8 WM 360 Bruker CDCI3 + 10% CD3OD

13Kernresonanz-Spektrum:

Instrument:

Lösungsmittel:

vergleiche Fig. 10A und 10B WM 360 Bruker CDCI3 + 10% CD3OD

10

13CNMR 90,6MHzô(ppm): 17,5,21,6,22,2,23,0,33,4,39,2, 46,4,52,3,55,8 62,1,67,8,69,8,70,1,71,3,75,8,77,1,78,1,82,4, 83,3,88,2,97,4,99,6,122,6,124,8,130,1,130,8,134,3,148,7, 192,8.

vergleiche Fig. 4

Nicolet 5DX FT-IR

735,755,910,960,1000,1020,

1085,1150,1195,1250,1310,

1335,1365,1385,1445,1510,

1685,1720,1735,2880,2930,

2960, 3400 cm"1.

vergleiche Fig. 6

Finigan 4500 TSQ

Beschuss mit schnellen

Atomen (FAB) Ionisierung

Thioglycerin

[M+H]+ = 696

100%

Kratos MS-50 [M+H]+ = 696,2794 scheinbares MG = 695 (auf Basis der obigen Massen-spektraldaten)

C^HäO^Sj (auf Basis der obigen Hochauflösungsdateri)

Biologische Eigenschaften der Substanzen BBM-1675 Die antimikrobielle Aktivität der Substanzen BBM-1675 wurde flirtine Vielzahl von gram-positiven und gram-negativen 15 Mikroorganismen bestimmt. Die nachstehende Tabelle I gibt die Daten in Form von Resultaten eines antimikrobiellen Scree-nings-Verfahrens wieder, welches die ursprüngliche Komponente BBM-1675Ai und die Substanzen BBM-1675C und BBM-1675D der vorliegenden Erfindung umfasst. Im Screening-Ver-20 fahren wurde jedeTestverbindunginForm einer Lösung mit einer einheitlichen Konzentration von 10 [ig/ml zu dessen Imprägnierung auf einen Papierstreifen, welcher in die Wachstumskultur gegeben wurde und die antibiotische Aktivität wurde gemessen, indem die Wachstumshemmzone neben dem Papierstreifen bestimmt wurde. Wie in Tabelle I dargestellt, zeigten die Substanzen BBM-1675C und D ein breites Spektrum antimikrobiel-ler Aktivität und erwiesen sich als mindestens so wirkungvoll, wie die Komponente BBM-1675Aj ; insbesondere die Substanzen BBM-1675C und D waren wirkungsvoller als Inhibitoren von gram-negativen Organismen.

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Tabelle I

Antimikrobielle Aktivität der BBM-1675-Substanzen

Die Korrelation von [M+H]+und [(M+H)+2]+ der relativen Häufigkeiten mit den entsprechenden berechneten Werten bestätigt die elementare Zusammensetzung aus den Messungen des Hochauflösungs-FAB.

XH NMR 360 MHz ô (ppm): 6,43 (1H, dd, J=4,4,10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5,48 (1H, 6 brs); 4,48 (IH, d, J = 8,1); 4,02 (1H, d, J=2,0); 3,95-3,80; 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,50 (11H, brm); 3,35 (1H, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23-2,12 (2H, m); 1,42 (1H, brdt); 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6); 0,87 (3H, d, J=5,9).

Hemmzone in mm

Test-Mikroorganismus

BBM-

1675A,

1675D

40

Escherichia coli AS 19

22

52

51

Escherichia coli K12

13

36

35

Escherichia coli P1373

12

34

33

Escherichia coli R Azaserine

14

35

34

45 Escherichia coli R Netropsin

11

32

Escherichia coli R Mitomycin C

12

35

34

Escherichia coli R Bleomycin

16

38

36

Escherichia coli R Daunomycin

19

45

44

Escherichia coli R Neomycin

24

53

52

50 Escherichia coli R Sibiromycin

14

32

30

Escherichia coli R Hedamydin

14

30

25

Escherichia coli R Aclacinomycin 15

41

40

Bacillus subtilis ATCC 6633

34

43

41

Klebsiella pneumoniae

17

35

55 Staphylococcus 209 P

32

47

44

Staphylococcus R Actinoleukin

33

35

Staphylococcus R Streptonigrin

37

50

48

Staphylococcus faecalis P1377

30

39

38

Streptococcus aereus Smith P

36

47

45

60 Staphylococcus aureus Smith R

40

55

53

Actinomycin D

Staphyolcoccus aureus Smith R

17

32

31

Aureolinsäure

Acinetobacter

16

33

32

65 Micrococcus luteus

35

57

55

Saccharomyces cerevisiae petite

22

42

43

R = Resistent zum genannten Antibiotikum

668 598 S

Aktivität gegen die Leukämie P-388 Die Tabellen II und III enthalten die Resultate von Laboratoriumstests mit CDFrMäusen, welche intraperitoneal ein Tumo-rinokulum von 106 Aszites-Zellen der Leukämie P-388 implantiert wurde und welche in verschiedenen Dosen von BBM- 5 1675A!, C oder D behandelt wurden. Die Substanzen wurden durch intraperitoneale Injektion verabreicht. Für jede Dosis-menge wurde eine Gruppe von sechs Mäusen verwendet, welche mit einer einzelnen Dosis der Substanz amTag nach der Inokulation behandelt wurde. Eine Gruppe von 10 Kontrollmäusen, die io mit Salzlösungbehandelt wurden, gehörten in jeder Serie von Experimenten ebenfalls dazu. Die Gruppe, die mit BBM-1675Ai behandelt wurde, wurde in Tabelle III als direkter Vergleich eingeschlossen. Es wurde ein 30-Tage-Protokoll geführt, wobei die mittlere Überlebenszeit in Tagen für jede Gruppe von 15 Mäusen bestimmt wurde und die Anzahl der Überlebenden am Ende der 5-Tage-Periode bestimmt wurde. Die Mäuse wurden vor der Behandlung und am Tag vier gewogen. Die Änderung des Gewichts diente als Mass für die Toxizität der Medikamente. Es wurden Mäuse verwendet, die 20 g wogen, und ein Gewichts- 20 verlust bis etwa 2 g wurde nicht als übermässig betrachtet. Die mit dem Vehikulum behandelten Kontrolltiere starben normalerweise innerhalb von 9 Tagen. Die Resultate wurden aus % T/C

bestimmt, dem Verhältnis der mittleren Überlebenszeit der behandelten Gruppe zur mittleren Überlebenszeit, der mit dem Vehikulum behandelten Kontrollgruppe mal 100. Eine Wirkung in Form von % T/C gleich oder grösser als 125 zeigte, dass ein merklicher Antitumor-Effekt erzielt wurde. Die Resultate des Screenings in Tabelle II zeigen das ursprünglich unerwartete Niveau der Antitumor-Aktivität der Substanz BBM-1675C. In Tabelle III sind die Resultate eines direkten Vergleichs von BBM-1675Aj (Esperamicin Aj) und BBM-1675C und BBM-1675D geschildert. Die Daten zeigen, dass BBM-1675C bezüglich Potenz und Antitumor-Wirksamkeit etwa mit BBM-1675Aj vergleichbar ist und dass sie nicht planabhängig ist, während BBM-1675D nur schwach weniger wirksam ist.

Zusätzlich wird in der vorliegenden Erfindung geschildert, dass die SubstanzenBBM-1675CundBBM-1675D ebenfalls als BBM-1675A2 (Esperamicin A2) erhalten werden können. Im Vergleich zu den hier für BBM-1675C und BBM-1675D geschilderten Daten und den Daten, welche in der GB-A-2141425 für BBM-1675A2 geschildert wurden, wurde überraschenderweise gefunden, dass die Substanzen BBM-1675C und D als Anti-tumormittel wirkungsvoller als die Ausgangsverbindung BBM-1675A2 sind, von welcher sie abgeleitet wurden.

Tabelle II

Effekt von BBM-1675C auf P-388-Leukämie (Tag 1 Behandlung)

Dosis, IP

MST

Effekt MST

AWC

Überlebende

Verbindung mg/kg/inj.

Tage

% T/C

g Tag 4

Tag 5

BBM-1675C

3,2

TOX

0/6

0,8

TOX

—

0/6

- 0,2

TOX

—

0/6

0,05

TOX

-1,8

1/6

0,0125

11,0

122

-2,5

5/6

0,003125

13,5

150

-2,5

6/6

Vehikulum

T

9,0

100

0,4

10/10

Tumorinokulum: Wirt:

Auswertung: Effekt: Kriterium:

AWC:

^Jö6"Aszites-Zellen implantiert i.p.

Männliche Mäuse CDFt

MST = Mittlere Überlebenszeit

% T/C = (MST behandelt/BST-Kontrolle) x 100

% T/C > 125 wird als bedeutsame Antitumor-Aktivität betrachtet

Mittlere Gewichtsänderung (behandelt-Kontrolle) in g (am Tag 4)

Tabelle III

Effekt von BBM-1675-Substanzen auf P-388-Leukämie

11

Verbindung BBM-1675A!

J

Dosis, IP

MST

Effekt MST

AWC g

Überlebende

. Behandlungsplan mg/kg/inj.

Tage

% T/C

Tag 4

Tag 5

d.l

0,0512

TOX

0/6

0,0256

TOX

—

0/6

0,0128

TOX

-1,8

3/6

0,0064

15,5

172

-0,3

6/6

0,0032

15,0

167

-0,6

6/6

0,0016

15,5

172

0,6

6/6

0,0008

12,5

139

0,3

6/6

0,0004

12,0

133

1,4

6/6

0,0002

11,0

122

0,8

6/6

0,0001

11,5

128

1,4

6/6

9 668 598

Tabelle III

Effekt von BBM-1675-Substanzen auf P-388-Leukämie

Dosis, IP

MST

Effekt MST

AWC g

Überlebende

Verbindung

Behandlungsplan rag/kg/in j.

Tage

% T/C

Tag 4

Tag 5

BBM-1675C

d.l

0,0256

TOX

0/6

0,0128

TOX

-0,8

3/6

0,0064

11,5

128

-0,3

6/6

0,0032

" 14,5

161

-0,1

6/6

0,0016

10,5

117

0,0

6/6

0,0008

12,0

133

0,3

6/6

0,0004

11,5

128

0,8

6/6

0,0002

11,0 .

122

1,4

6/6

0,0001

11,0

122

0,8

6/6

0,00005

10,5

117

1,3

6/6

BBM-1675D

d.l

0,0256

9,0

100

0,1

6/6

0,0128

11,5

128

0,3

6/6

0,0064

12,5

139

0,3

6/6

0,0032

12,0

133

0,1

6/6

0,0016

11,5

128

0,8

6/6

0,0008

10,0

111

0,2

6/6

0,0004

10,0

111

0,5

6/6

0,0002

9,5

106

1,7

6/6

0,0001

9,5

106

1,7

6/6

0,00005

9,0

100

2,0

6/6

BBM-1675C

d.l-»5

0,0032

16,0

178

-1,3

6/6

0,0016

13,5

150

-1,0

6/6

0,0008

13,5

150

-0,3

6/6

0,0004

12,0

133

-0,4

6/6

0,0002

12,0

133

-0,4

6/6

0,0001

11,0

122

-0,4

5/6

0,00005

11,0

122

0,9

6/6

0,000025

8,5

94

2,2

6/6

0,0000125

8,0

89

2,4

6/6

0,00000625

8,0

89

2,4

6/6

Vehikulum

-

9,0

100

2,4

10/10

Tumorinokulum: 106 Aszites-Zellen implantiert i.p.

Wirt: Weibliche Mäuse CDFi

Auswertung: MST = Mittlere Überlebenszeit

Effekt: % T/C = (MST behandelt/MST-Kontrolle) x 100

Kriterium: % T/C > 125 wurde als bedeutsame Antitumor-Aktivität betrachtet

AWC: Mittlere Gewichtsänderung (behandelt-Kontrolle) in g (am Tag 4)

Aktivität gegen das B16-Melanom

Die Tabelle IV enthält die Resultate der Antitumor-Tests unter Verwendung eines B16-Melanoms, das in Mäusen wuchs. Es wurden BDFrMäuse verwendet und subcutan mit einem Tumorimplantat inokuliert. Es wurde ein 60-Tage-Protokoll verwendet. Gruppen von 10 Mäusen wurden für jede Dosiseinheit getestet und mittlere Überlebenszeit wurde für jede Gruppe bestimmt. Die Kontrolltiere wurden in gleicher Weise wie die Testtiere inokuliert und mit dem Injektionsvehikulum behandelt, wobei sie ohne Wirkstoff eine mittlere Überlebenszeit von 22,5 Tagen aufwiesen. Für jede Dosisstufe wurde ein Testtier mit der Testverbindung an den Tagen 1,5 und 9 durch eine intraperi-50 toneale Injektion behandelt. Eine Wirkung, ausgedrückt in % T/C, die gleich oder grösser als 125 ist, zeigt an, dass ein bedeutsamer Antitumor-Effekt erzielt wurde. Die Resultate in Tabelle IVzeigen, dass in einem direkten Vergleich BBM-1675C ebenfalls wirksam für die Behandlung von Mäusen war, welche 55 ein B16-Melanom aufwiesen und in der Potenz etwa vergleichbar mit BBM-1675Ai war.

Dosis, IP MST

Verbindung mg/kg/inj. Tage

BBM-1675A! 0,0032 37,5

0,0016 37,5

0,0008 38,5

0,0004 37,0

0,0002 34,5

0,0001 32,0

Effekt AWC Überlebende

MST g Tag 10

%T/C Tag 12

167 0,3 10/10

171 1,4 10/10

164 1,8 10/10

153 2,0 10/10

142 1,9 10/10

668 598

10

Effekt

AWC

Überlebende

Dosis, IP

MST

g

Tag 10

Verbindung mg/kg/inj.

Tage

%T/C

Tag 12

BBM-1675C

0,0008

31,5

140

0,6

10/10

0,0004

37,0

164

1,2

10/10

0,0002

31,0

138

0,6

10/10

0,0001

31,5

140

1,0

10/10

0,00005

27,5

122

0,8

10/10

0,000025

25,0

111

0,5

10/10

Vehikulum

-

22,5

100

0,3

10/10

Tumorinokulum: 0,5 ml von einem 10% Brei, IP

Wirt: Weibliche Mäuse BDFi

Auswertung: MST = Mittlere Überlebenszeit

Effekt: % T/C = (MST behandelt/MST-Kontrolle) x 100

Kriterium: % T/C >: 125 wird als bedeutsame Antitumor-Aktivität betrachtet

AWC: Mittlere Gewichtsänderung (behandelt-Kontrolle) in g (am Tag 12)

Wie aus den Daten bezüglich der antimikrobiellen Wirkung gungen kann unter Verwendung von üblichen Dosisbestim-

und der Wirkung auf Mäusetumor ersichtlich, sind BBM-1675C mungstestin Anbetracht der obigen Richtlinien von den Fachleu-

und BBM-1675D somit als Antibiotika nützlich zur therapeuti- ten bestimmt werden.

sehen Behandlung von infektiösen Krankheiten von Säugetieren Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der und anderen Tieren und als Antitumor-Mittel für die therapeuti- 25 Erfindung.

sehe Hemmung des Säugetiertumors.

Die vorliegende Erfindung umfasst ebenfalls pharmazeuti- „ ,T ^

sehe Zusammensetzungen, welche als aktive Komponente BBM- Chemische Herstellung und Isolierung von BBM-1675C und 1675C oder BBM-1675D enthalten. Die Zusammensetzungen BBM-1675D enthalten in der Regel eine antimikrobiell oder tumorhemmend 30 Beispiel 1 wirksame Menge der erfindungsgemässen Wirkstoffe in Kombi- Eine Probe von BBM-1675Aj (50 mg) wurde in 2,5 ml nation mit einem inerten. pharmazeutisch annehmbaren Träger Methanol aufgelöst und mit 2,5 ml 0,1 molarer Chlorwasserstoffoder Verdünnungsmitte!. Solche Zusammensetzungen können lösungin Methanol behandelt. Die Reaktion liess man bei einer ebenfalls andere aktive antimikrobielle oder Antitumor-Mittel Temperatur von etwa 50 °C ablaufen und das Verschwinden des enthalten und können entsprechend der Verabreichungsform in 35 Ausgangsmaterials (ungefähr nach 30 min) wurde alle 5 bis jede beliebige entsprechende pharmazeutische Darreichungs- 10 min durch Dünnschicht-Chromatographie (TLC) auf Silika-form verarbeitet werden. Beispiele solcher Zusammensetzungen gel-Platten (Analtech, 250 Micron, GF) mit Toluol/Aceton (3:2, umfassen feste Zusammensetzungen für die orale Verabrei- v/v) als Elutionsmittel getestet. Nach dem Verbrauch des Aus-chung, wie Tabletten, Kapseln, Pillen, Pulver und Granulen, gangsmaterials wurde die Reaktionsmischung mit einer gesättigflüssige Zusammensetzungen für die orale Verabreichung, wie 40 ten NaHC03-Lösung in Methanol neutralisiert, dann unter redu-Lösungen, Suspensionen, Sirupe oder Elixiere und Zubereitun- ziertem Druck abgedampft, wobei ein trockener Rückstand gen für die parenterale Verabreichung wie sterile, wässrige oder erhalten wurde, der die bioaktiven Fragmente enthielt. Die nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Sie BBM-1675C-Substanz würde aus dem Rückstand durch Flashkönnen ebenfalls von sterilen, festen Zusammensetzungen her- Säulen-Chromatographie chromatographiert, wobei die Säule gestellt werden, welche dann in sterilem Wasser, physiologischer 45 dieMasse2cmi.d. X10 cm aufwies und mit WoelmSilikagel Kochsalzlösung oder anderen sterilen injizierbaren Medien 32-63 Micron Partikelgrösse gepackt war. Die Säule wurde mit unmittelbar vor dem Verbrauch aufgelöst werden. Toluol/Aceton (3:2 v/v) eluiert, wobei 3 ml Fraktionen gesam-

Für die Verwendung als antimikrobielles Mittel wird BBM- melt wurden. Jede Fraktion wurde durch TLC analysiert (Silika-

1675C oder BBM-1675D oder eine pharmazeutische Zusammen- gel mit Toluol/Aceton, 3:2, v/v, als Elutionsmittel) und die TLC-

setzung davon in solcher Weise verabreicht, dass die Konzentra- 50 Flächen wurden mit einer UV-Lichtquelle mit einer Wellenlänge tion des aktiven Bestandteils grösser ist als die minimale Hemm- von 254 nm und einem Cersulfatspray (1 % Cersulfat und 2,5%

konzentrationfür den zu behandelnden Organismus. Für die Molybdänsäure in 10% Schwefelsäure) sichtbar gemacht. Die

Verwendung als Antitumor-Mittel können die optimalen Dosie- Fraktion 6-12 (Rr Wert von BBM-1675C ist 0,28) wurden rangen und Dosierungspläne für BBM-1675C oder BBM-1675D gepoolt und zur Trockenheit eingedampft, wobei 12 mg (35%),

für einen bestimmten SäugetierwirtvomFachmannleichtermit- 55 im wesentlichen reines BBM-1675C erhalten wurde.

telt werden. Es wird jedoch daraufhingewiesen, dass die tatsäch- Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von BM-1675C liehe Dosis von BBM-1675C oder BBM-1675D je nach der sind in der Beschreibung angegeben und die Ultraviolett-, Infrabesonderen, formulierten Zusammensetzung, der Verabrei- rot-, Massen-, H NMR und 13-CNMR-Spektren der Verbindun-chungsart und des besonderen Situs, des Wirtes und des zu gen sind in den Fig. 1, 3,5, 7 bzw. 9 angegeben.

behandelnden Leidens variiert. VieleFaktoren, welche die Wir- 60 kung des Wirkstoffes beeinflussen, müssen in Betracht gezogen werden, einschliesslich Alter, Gewicht, Geschlecht, Diät, Ver- Beispiel 2

abreichungszeit, Verabreichungsweg, Ausscheidungsrate, Beim Ausdehnen der Reaktionszeit des Verfahrens in Bei-

Zustand des Patienten, Medikamentenkombinationen, Reak- spiel 1 nimmt der Anteil BBM-1675C ab und zwei neue Produkte tionsempfindlichkeit und Ernsthaftigkeit des Leidens. Die Ver- 65 erscheinen, die aus Verbindungen 3 (Rf=0,65) und BBM-

abreichung kann kontinuierlich oder periodisch innerhalb der 1675D (Rf bleibt an der Grundlinie) bezeichnet werden (TLC:

maximalen, tolerierten Dosis durchgeführt werden. Der opti- Siliciumdioxid, Toluol/Aceton, 3:2 v/v) und werden mit der Zeit male Anwendungsgrad für einen vorgegebenen Satz von Bedin- vorherrschend.

11

668 598

Die Verbindung BBM-1675D, die üblicherweise die Herstellung von BBM-1675Cbegleitet, wurde so aus den Chromatographiesäulen isoliert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, indem die Säule mit Chloroform/Methanol (5:1, v/v) eluiert wurde. Die zweckmässigen Fraktionen wurden gepoolt und zur Trockenheit abgedampft, wobei 18 mg, im wesentlichen reines BBM-1675D aus der Reaktion, die in Beispiel 1 beschrieben wurde, erhalten wurde.

Die Substanz BBM-1675D zeigt einen Hauptfleck bei Rf = 0,37 bei der Umkehrphasen-Dünnschicht-Chromatographie (Whatman MKQgF, 200 Micron) unter Verwendung von 30% Wasser, Methanol als Elutionsmittel undbei Rf = 0,22 bei der Normalphasen-Silikagel-Dünnschicht-Chromatographie unter Verwendung von Chloroform/Methanol als Elutionsmittel (5:0,5, v/v).

Beispiel 3

Eine wesentliche Verbesserung der Ausbeute von BBM-1675D kann erreicht werden, indem p-Toluolsulfonsäure anstelle von Chlorwasserstoff für die chemische Hydrolyse von BBM-1675 A2 oder BBM-1675Ai verwendet wird, wie dies in den Verfahren der Beispiele 3 bzw. 5 erläutert wird.

Eine Probe von BBM-1675A2 (15,2 mg) wurde mit einer 0,03 molaren Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol (1 ml) bei einer Temperatur von etwa 63 °C während etwa 1 Stunde hydrolysiert. Die Reaktionsmischung wurde dann zur Trockenheit unter reduziertem Druck bei etwa 30 °C abgedampft. Die Substanz BBM-1675D wurde aus dem trockenen Rückstand durch Flash-Säulen-Chromatographie auf einer Säule, die mit Woelm Silikagel (32-63 Micron Partikelgrösse) isoliert. Die Säule wurde mit Chloroform/Methanol (5:0,5, v/v) eluiert und die gesammelten Fraktionen wurden durch TLC (Silikagel mit Chloroform/Methanol, 5:0,5, v/v als Elutionsmittel) analysiert. Die angewandten Chromatographiebedingungen erlaubten die Trennung der Mischung der inaktiven Komponenten 2 und 3 (7 mg) von der bioaktiven Substanz BBM-1675D, die einen Rr Wert von 0,22 aufweist. Die geeigneten Fraktionen wurden gepoolt und zur Trockenheit abgedampft, wobei 8 mg des im wesentlichen reinen BBM-1675D in nahezu quantitativer Ausbeute erhalten wurde.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von BBM-1675D sind in der Beschreibung angegeben und die Ultraviolett-, Infrarot- , Massen-, *H NMR und 13C NMR-Spektren der Verbindung sind in den Fig. 2,4,6,8 bzw. 10A und 10B kombiniert dargestellt.

Beispiel 4

Eine Probe von BBM-1675A2 (40 mg) wurde mit 5 ml einer 0,5 molaren Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol bei etwa 50 °C während etwa2 Stunden behandelt, gemäss dem allgemeinen Verfahren und der Isolierungsmethode, die in Beispiel 1 beschrieben ist. Nach der Neutralisierung mit NaHC03 und Eindampfen zur Trockenheit wurde die Substanz BBM-1675C aus dem Rückstand isoliert, durch Flash-Chromatographie auf einer Säule, die Woelm Silikagel (Partikelgrösse 32-36 Mikron) unter Verwendung von Toluol/Aceton (3:2, v/v) als Elutionsmittel. Die geeigneten Fraktionen wurden gereinigt und zur Trok-

kenheit eingedampft, wobei 8,4mg von im wesentlichen reinen BBM-1675C erhalten wurde, welches mit dem Produkt, das in Beispiel 1 isoliert wurde, identisch war.

Die obige Chromatographiesäule wurde dann mit Chloro-5 form/Methanol (5:0,25, v/v) eluiert und die gesammelten Fraktionen wurden gepoolt und zur Trockenheit eingedampft, wobei BBM-1675D erhalten wurde. Die Substanz BBM-1675D wurde weiter durch eine zusätzliche Flash-Chromatographiesäule mit Silikagel unter Verwendung von Chloroform/Methanol (5:0,5, 10 v/v) als Elutionsmittel gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden kombiniert und zur Trockenheit eingedampft, wobei 6,3 mg von in wesentlichen reinen BBM-1675D erhalten wurde, welches identisch mit dem Produkt war, welches in Beispiel 3 isoliert wurde.

15

Beispiel 5

Eine Probe von BBM-1675Ai (49,3 mg) wurde mit 0,037 M-Lösung von p-Toluolsulfonsäure in Methanol (1,5 ml) bei einer Temperatur von etwa 60 °C bei etwa 1,5 h hydrolysiert. Die 20 Reaktionsmischung wurde unter reduziertem Druck bei etwa 30 °C zur Trockenheit eingedampft, wobei ein Rückstand erhalten wurde, welcher BBM-1675D und die inaktiven Verbindungen 1 und 3 enthielt. Die bioaktive Substanz BBM-1675D wurde 25 durch Flash-Chromatographie isoliert, auf einer Säule, die mit Woelm Silikagel (32-63 Micron Partikelgrösse) gepackt war, unter Verwendung von Chloroform/Methanol (5:0,25, v/v) als Elutionsmittel. Die geeigneten Fraktionen wurden kombiniert und zur Trockenheit eingedampft, wobei 27 mg im wesentlichen reines BBM-1675D erhalten wurde, welches mit dem Produkt

30

gemäss Beispiel 3 identisch war.

Beispiel 6

Eine Probe von BBM-1675C (5,1 mg) wurde mit 0,5 molarer 35 Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol (1 ml) bei 40 bis 50 °C über Nacht hydrolysiert. Nach der Neutralisation mit NaHC03 und Eindampfen zur Trockenheit wurde die bioaktive Substanz BBM-1675D durch Flash-Chromatographie aus dem Rückstand isoliert, auf einer Säule, die mit Woelm Silikagel (32-63 Micron 40 Partikelgrösse) gepackt war und unter Verwendung von Chloroform/Methanol (5:0,25, v/v) als Elutionsmittel. Die geeigneten Fraktionen ergaben im wesentlichen reines BBM-1675D, welches mit dem Produkt gemäss Beispiel 3 identisch war.

45 Beispiel 7

Bei der Wiederholung der Verfahren gemäss den Beispielen 1 und2, jedoch mit der Ausnahme, dass das Startmaterial BBM-1675Âi durch eine äquimolare Menge einer Mischung von BBM-1675 At und BBM-1675A2 ersetzt wurde, erhielt man die Sub-50 stanz BBM-1675C und BBM-1675D.

Beispiel 8

Bei der Wiederholung des allgemeinen Verfahrens gemäss 55 Beispiel 5, jedoch mit der Ausnahme, dass das Ausgangsmaterial BBM-1675Ai durch eine äquimolare Menge einer Mischung, die BBM-1675A! und BBM-1675 A2 enthielt, ersetzt wurde, erhielt man die Substanz BBM-1675D.

M

13 Blatt Zeichnungen

Claims

668 598

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Antitumor-Antibiotikum BBM-1675C in wesentlich reiner Form, welches a) als amorpher Feststoff erscheint;

b) in Methanol, Ethanol, Ethylacetat, Aceton, Tetrahydro-furan und Chloroform löslich ist;

c) bei der Kieselgel-Dünnschicht-Chromatographie im Lösungsmittelsystem Toluol/Aceton im Volumenverhältnis 3:2 einen RrWert von 0,28 aufweist;

d) ein scheinbares Molekulargewicht von 855 aufweist, bestimmt durch hochauflösende FAB-Massenspektroskopie;

e) ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum in Methanollösung aufweist, wie es im wesentlichen in Fig. 1 dargestellt wird und die Absorptionsmaxima und Absorptivitäten bei 210 nm (a = 21,770), 274 nm (a = 9,340) und 313 nm (Schulter) (a=4,190) aufweist, wobei keine wesentlichen Änderungen entstehen,

wenn eine Säure oder Base zugesetzt wird;

f) einlnfrarot-Absorptionsspektrum (KBr, Film) aufweist, wie es im wesentlichen durch Fig. 3 dargestellt wird und die hauptsächlichen Absorptionswerte bei den folgenden Werten in cm'1 aufweist:

540,740,955,990,1017,1065,1080,1118,1150,1250,1305, 1323,1340,1370,1385,1440,1690,1705,1735,2900,2920,2930, 2970 und 3450;

g) ein Niederauflösungs-Massenspektrum aufweist, wie es im wesentlichen in Fig. 5 dargestellt ist und einMolekülion[M+H]+ von 856 aufweist;

h) ein 360 MHz-Protonenkernrersonanzspektrum in CDC13 aufweist, welches im wesentlichen die in Fig. 7 dargestellten folgenden Signale aufweist:

6,54 (1H, dd, J=7,7,7,0); 6,21 (1H, brs); 5,87 (1H, d, J=9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6,1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J=10,3,1,8); 4,61 (1H, d, J=7,7); 4,25 (1H, s); 4,09 (1H, q, J=2,6); 3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92-3,53 (10H); 3,45 (1H, dt, J=10,3,4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (1H, m); 2,69 (1H, dt, J=9,9, 5,2); 2,49 (1H, dd, J=10,3,2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m); 2,13 (1H, m); 2,09 (3H, s); 1,50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3) ; und 1,03 (6H) Teile pro Million von Tetramethyl-silan abwärts;

i) ein 90,6 MHz-Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum in CDC13 aufweist, im wesentlichen wie in Fig. 9 dargestellt und die nachstehenden Signale aufweist:

13,7,17,5,19,8,22,3,22,7,23,5,34,2,35,2,39,5,47,7,52,7, 55,8,56,1,57,7,62,4,64,7,67,4,69,3,69,8,71,9,76,1,77,1, 77,7,79,9,83,2,88,4,97,3,99,7,123,4,124,6,130,1 und 193,1 Teile pro Million Tetramethylsilan abwärts.
2. Antitumor-Antibiotikum BBM-1675D, welches im wesentlichen in reiner Form vorliegt:

a) als amorpher Feststoff vorliegt;

b) in Methanol, Ethanol, Aceton und Tetrahydrofuran löslich ist und in Chloroform schwach löslich ist;

c) mit Dünnschicht-Chromatographie auf Kieselgel einen Rr Wert von 0,22 aufweist, mit dem Lösungsmittelsystem Chloroform/Methanol im Volumenverhältnis 5:0,5 und in der Umkehr-phasen-Kieselgel-Dünnschichtchromatographie einen RrWert von 0,37 aufweist, im Lösungsmittelsystem Methanol/Wasser im Volumenverhältnis 70:30;

d) ein scheinbares Molekulargewicht von 695 aufweist, bestimmt durch Hochauflösungs-FAB-Massenspektroskopie;

e) ein Ultraviolett-Absorptionsspektrum in Methanollösung aufweist, im wesentlichen, wie es in Fig. 2 dargestellt ist und die Ultraviolett-Absorptionsmaxima und Absorptionswerte bei 214 nm (a = 27,000), 274 nm (a = 12,800) und 325 nm (a = 5,400) aufweist, ohne wesentliche Änderung bei Säuren oder Basenzugabe;

f) ein Infrarot-Absorptionsspektrum mit (KBr, Film) aufweist, im wesentlichen wie in Fig. 4 dargestellt und die folgenden Hauptpeaks aufweist:

735,755,910,960,1000,1020,1085,1150,1195,1250,1310, 1335,1365,1385,1445,1510,1685,1720,1735,2880,2930,2960 und 3400 cm"1;

g) ein Niederauflösungs-Massenspektrum aufweist, im wesentlichen wie in Fig. 6 dargestellt, und ein Molekülion [M+H]+ von 696 aufweist;

h) ein360MHz-ProtonenresonanzspektruminCDCl3 +10% CD3OD aufweist, das im wesentlichen in Fig. 8 dargestellt ist und die folgenden Signale aufweist:

6,43 (1H, dd, J=4,4,10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5,48 (1H, 6brs); 4,48 (1H, d, J=8,l); 4,02 (1H, d, J=2,0); 3,95-3,80; 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm); 3,34 (1H, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 (2H, m), 2,38 (3H, s); 2,23-2,12 (3H, d, J=6,6); und 0,87 (3H, d, J=5,9) Teile pro Million von Tetramethylsilan;

i) ein 90,6 MHz Kohlenstoff-13-Kernresonanzspektrum in CDCI3 +10% CD3OD aufweist, das im wesentlichen in Fig. 10 dargestellt ist, und folgende Signale aufweist:

17,5,21,6,22,2,23,0,33,4,39,2,46,4,52,3,55,8,62,1,67,8, 69,8,70,1,71,3,75,8,77,1,78,1,82,4,83,3,88,2,97,4,99,6, 122,6,124,8,130,1,130,8,134,1,148,7 und 192,8Teilepro Million von Tetramethylsilan abwärts.
3. Verfahren zur Herstellung des Antitumor-Antibiotikums BBM-1675C nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass BBM-1675A! oder BBM-1675A2 mit einer Mineralsäure oder einer organischen Säure hydrolisiert wird und das gebildete BBM-1675C aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird.
4. Verfahren zur Herstellung des Antitumor-Antibiotikums BBM-1675D nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass BBM-1675A! oder BBM-1675 A2 mit einer Mineralsäure oder einer organischen Säure hydrolisiert wird und das gebildete BBM-1675D aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird.
5. Verfahren zur Herstellung des Antitumor-Antibiotikums BBM-1675D nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass BBM-1675C mit einer Mineralsäure oder einer organischen Säure hydrolisiert wird und das gebildete BBM-1675D aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird.
6. Verfahren zur Herstellung des Antitumor-Antibiotikums BBM-1675C nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung von BBM-1675Ai und BBM-1675A2 mit einer Mineralsäure oder einer organischen Säure hydrolisiert wird und das gebildete BBM-1675C aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird.
7. Verfahren zur Herstellung des Antitumor-Antibiotikums BBM-1675D nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung von BBM-1675AJ und BBM-1675A2 mit einer Mineralsäure oder einer organischen Säure hydrolisiert wird und das gebildete BBM-1675D aus dem Reaktionsmedium gewonnen wird.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie BBM-1675C nach Anspruch 1 oder BBM-1675D nach Anspruch 2 enthält.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine antimikrobiell wirksame Menge BBM-1675C oder BBM-1675D in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel enthält.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine tumorhemmend wirksame Menge BBM-1675C oder BBM-1675D in Kombination mit einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel enthält.

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