SE469632B

SE469632B - Nya antitumoerantibiotika

Info

Publication number: SE469632B
Application number: SE8603597A
Authority: SE
Inventors: J Golik
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1985-08-27
Filing date: 1986-08-26
Publication date: 1993-08-09
Also published as: GR862160B; DK170671B1; LU86562A1; NL8602165A; IE59204B1; FI863405A; FR2586686A1; SG109692G; IT1229176B; BE905332A; ES2002728A6; PT83261A; CA1307256C; FR2586686B1; IT8621527A0; AU6175186A; FI83422C; SE9200428D0; JPS62116589A; HK793A

Description

20 25 30 35 _2- 469 632 R.H. Bunge et al avslöjar i J. Antibiotics, 37(12), 1566-1571 (1984) jäsning av Actinomadura sp. (ATCC 39363) för fram- ställning av ett bioaktivt komplex, från vilket två huvud- komponenter, PD 114 759 och PD 115 028, isolerades. I Q¿ Chem. Soc. Chem. Commun., 919-920 (1985) beskriver J.H.

Wilton et al. en partiell struktur för de antibiotiska fö- reningarna PD 114 759 och PD 115 028. Framställningen, iso- leringen och karaktäriseringen av de antibiotiska föreningar- na PD 114 759 och PD 115 028 synes vara identiska med mot- svarande för ovannämnda antibiotika CL-1577A respektive CL- 1577B.

Europapatentansökan nr 95 154, som publicerades den 30 no- vamær 1983, avslöjar jäsning av Actinomadura pulveraceus för framställning av antitumörala antibiotika med beteck- ningarna WS 6049-A och WS 6049-B. Strukturerna för dessa WS 6049-antibiotika har ännu icke fastställts men de karak- täristika som ges för dessa antibiotika visar att WS 6049-A och WS 6049-B till strukturen är besläktade med de BBM- 1675-antibiotika som beskrivs i brittiska patentansökan 2 141 425 och de CL-1577-antibiotika som beskrivs i ameri- kanska patentet 4 530 835. Spektraldata visar emellertid att varken WS 6049-A eller WS 6049-B är identisk med någon av BBM-1675-komponenterna. Vidare kan den producerande or- ganism som beskrives i europapatentansökningen 95 154 klart särskiljas från den Actinomadura verrucosospora som använ- desi den brittiska patentansökningen 2 141 425 vad gäller ﬁﬁgpn på dessa luftmycelium på ISP-medium nr 2, 3 och 4, vad gäller dess positiva mjölkpeptonisering och dess posi- tiva utnyttjande av D-fruktos, D-mannitol, trehalos och cellulosa.

Sammanfattning av uppfinningen.

Enligt föreliggande uppfinning tillhandahålles nya anti- tumörala och antibiotiska substanser, som i föreliggande sammanhang betecknas BBM-1675C och BBM-1675D och även är 10 15 20 25 30 35 "ß" 469 62,2 kända som BMY-27305 respektive BMY-27307, varvid nämnda substanser framställes genom selektiv kemisk hydrolys av de bioaktiva komponenterna BBM-1675A1 (esperamicin A1) eller BBM-1675A2 (esperamicin A2), vilka i sin tur fram- ställes genom att man odlar en BBM-1675-producerande stam av Actinomadura verrucosospora. De bioaktiva substanserna BBM-l675C och BBM-l675D kan separeras och renas medelst kon- ventionella kromatografiska förfaranden och båda substan- serna uppvisar utmärkt antimikrobiell och antitumöral akti- vitet.

Beskrivning av ritningarna.

FIG. 1 visar ultraviolett-absorptionsspektrumet för BBM- l675C.

FIG. 2 visar ultraviolett-absorptionsspektrumet för BBM- 1675D.

FIG. 3 visar infraröd-absorptionsspektrumet för BBM-1675C (Kßr, film).

FIG. 4 visar infraröd-absorptionsspektrumet för BBM-l675D (KBr, film).

FIG. 5 visar det relativa masspektrumet för BBM-16750.

FIG. 6 visar det relativa masspektrumet för BBM-l675D.

FIG. 7 visar protonmagnetresonansspektrumet för BBM-1675C i CDCI3 (360 MHz).

FIG. 8 visar protonmagnetresonansspektrumet för BBM-l675D i CDCl3 + 10% CD3OD (360 MHz).

FIG. 9 visar 13C-magnetresonansspektrumet för BBM-1675C 1 cDc13 (90,6 MHz). 10 15 20 25 30 35 469 652 ö" FIG. 10A visar 13C-magnetresonansspektrumet (110-200 ppm) för BBM-l675D i CDCl3 + 10% CD3OD (90,6 MHz).

FIG. 10B visar 136-magnetresonansspektrumet (O-110 ppm) för BBM-l675D i CDCl + 10% CD OD (90,6 MHz). 3 3 FIG. 11A visar protonmagnetresonansspektrumet för före- ningen 3A (K-anomer) i CDCl3 (360 MHz).

FIG. llB visar protonmagnetresonansspektrumet för före- ningen 3B Qß-anomer) i CDCl3 (360 MHz).

Detaljerad beskrivning av uppfinningen.

Denna uppfinning avser två nya antitumörala och antibio- tiska substanser, som i föreliggande sammanhang betecknas BBM-16750 och BBM-l675D och som även är kända som BMY-27305 respektive BMY-27307, varvid nämnda substanser framställes garmlselektiv kemisk hydrolys av de bioaktiva komponenterna BBM-l675Al (esperamicin Al) eller BBM-1675A2 (esperamicin A2), vilka i sin tur framställes genom att man odlar en BBM-l675- producerande stam av Actinomadura verrucososopora, i synner- het Actinomadura verrucosospora-stammen H964-92 (ATCC 39 334) eller Actinomadura verrucosospora-stammen Al327Y (ATCC 39638) eller en mutant därav. Enligt en annan aspekt tillhandahåller föreliggande uppfinning ett förfarande för framställning av substansen BBM-l675C genom selektiv hydro- lys av de bioaktiva komponenterna BBM-l675A1 eller BBM-1675A2.

Enligt en ytterligare aspekt tillhandahåller föreliggande uppfinning ett förfarande för framställning av BBM-l675D genom selektiv hydrolys av substansen BBM-l675C eller, vil- ket är mera föredraget, utgående från de bioaktiva komponen- terna BBM-l675A1 eller BBM-l675A2. Isoleringen och reningen av BBM-l675C och BBM-l675D från reaktionsblandningen kan åstadkommas medelst konventionella kromatografiska förfa- randen.

De bioaktiva substanserna BBM-l675C och BBM-l675D uppvisar 10 15 20 25 30 35 "S" 469 632 antimikrobiell aktivitet mot ett brett spektrum av mikro- organismer och har även visat sig uppvisa inhiberande akti- vitet med avseende på olika mustumörsystem såsom leukemi P-388 och melanom B16. De nya substanserna enligt förelig- gande uppfinning kan därför användas som antimikrobiella medel eller som antitumörmedel för inhibition av däggdjurs- CLIIIIÖIEI.

Under loppet av de nedbrytningsförsök som har gjorts i syfte att fastställa strukturen för de antitumörala och antibiotiska föreningarna BBM-1675A1 (esperamicin A1) och BBM-l675A2 (esperamicin A2) erhölls en blandning av kompo- nenter, som ledde till isolering och identifiering av två inaktiva fragment, nämligen föreningarna med formlerna I respektive II. Det var emellertid överraskande att finna att den kemiska nedbrytningen ledde till stegvis frigöring av två bioaktiva fragment BBM-1675C och BBM-l675D. Vad som var mera ñöverraskande var att de två olika antibiotiska substan- serna BBM-l675A1 och A2 gav samma tﬁoáuiva fragment, såsom åskådliggöres i reaktionsschema l nedan. Ännu mer överras- kande var det faktum att de lågmolekylära fragmenten BBM- l675C och D (med ungefär 70 respektive 55% av molekylvikten hos de antibiotiska moderföreningarna BBM-l675A1 och A2) visade sig vara mera effektiva än BBM-l675A2 och jämförbara med BBM-l675A1 som antitumörala och antimikrobiella medel.

Reaktionsschema 1.

BBM-l675A1 (esperamicin A1) BBM-l675C'-------å BBM-1675D BBM-1675A2 (esperamicin A2) 469 652 "ö" Substanserna BBM-1675C och BBM-l67SD kan framställas genom selektiv kemisk hydrolys av antibiotikumet BBM-1675A1 så- som skisseras i reaktionsschema 2.

Reaktionsschema 2. e ßBM-wvsil-H-»BBM-lsßc + CH3OH (molvikt 1248) (molvikt 855) _ oca3 Förening 1 (molvikt 425) (En blandning av aë ochlß- anomerer) HQ/CH3OH / \ CH3 BBM-1675D t 0 (molvikt 695) + C335 QCH3 OH Förening 3 (molvikt 192) (En blandning av aë och lß- anomerer) 10 l5 20 25 30 35 7 469 632 Utgångsföreningen BBM-l675A1 framställes medelst ett för- farande som beskrives i den brittiska patentansökningen 2 141 425, publicerad den 19 december l984. Den renade BBM- l675Al-komponenten hydrolyseras med en mineralsyra eller organisk syra, såsom klorvätesyra, svavelsyra, p-toluensul- fonsyra, bensensulfonsyra eller liknande, i ett organiskt eller blandat vattenhaltigt-organiskt inert lösningsmedel vid en temperatur av från cirka OOC till lösningsmedlets återflödestemperatur till dess en väsentlig mängd av den önskade föreningen BBM-l675C eller BBM-1675D har erhållits.

Företrädesvis utföres hydrolysen i C1-C6-alkohollösnings- medel och i synnerhet utföres aﬂﬁﬂmlysen i metanol. Reak- tionstemperaturen är icke kritisk men det är föredraget att utföra reaktionen vid en temperatur från ungefär omgiv- ningens temperatur till 60°C och i synnerhet från cirka 4o°_ti11 6o°c.

Den selektiva hydrolysen av BBM-l675A1 sker stegvis med initiell bildning av antibiotikumet BBM-l675C och det in- aktiva fragmentet med formeln 1. Därpå följande eller fort- satt behandling under hydrolyserande betingelser leder till frigörandet av en blandning av AP ochjß-anomerer av tio- sockret med formeln 3 och bildning av antibiotikumet BBM-l675D. Det torde inses av fackmannen att variation av reaktionsbetingelserna, såsom tiden, temperaturen och syra- koncentrationen, ger varierande relativa mängder av de antibiotiska substanserna BBM-l675C och D. Det är således önskvärt att övervaka reaktionsförloppet medelst tunnskikts- kromatografi såsom beskrives i exemplen nedan.

Närdetärtmänärt att endast framställa antibiotikumet BBM- l675D utföres den selektiva hydrolysen företrädesvis med en organisk syra, såsom p-toluensulfonsyra, såsom beskri- ves nedan för erhållande av en kvantitativ mängd av BBM- l675D.

Substanserna BBM-16750 och BBM-l675D kan även framställas genom selektiv kemisk hydrolys av antibiotikumet BBM-l675A2 _3_ 469 632 såsom skisseras i reaktionsschema 3.

Reaktionsschema 3 .

I OH V.

H69 C330 BBM-1675A2-Eš-öñ-9 BBM-16750 + 0 . 3 . (molvikt 1248) (molvikt 855) CHBO NH O caz f>°ﬂ= Förening 2 (molvikt 425) (En blandning av Oá- och IE- anomerer) HQ/CH3OH C33 \/ O BBM-l675D + CHBS 0CH3 (molvikt 695) OH Förening 3 (molvikt 192) (En blandning av OC- och ß- anomerer) 10 15 20 25 30 35 “9' 469 652 Utgångsföreningen BBM-l675A2 framställes medelst det för- farande som beskrivs i brittiska patentansökningen 2 141 425, som publicerades den 19 december 1984. Den selektiva hyd- rolysen av renad BBM-l675A2 sker likaledes på ett stegvist sätt med initiell bildning av antibiotikumet BBM-16756 och det inaktiva fragmentet med formeln II. Fortsatt behandling under hydrolyserande betingelser leder till frigöring av en blandning av M? och,ß-anomererna av tiosockret med for- meln 3 och bildning av antibiotikumet med BBM-1675D.

De reaktionsbetingelser som användes för den selektiva ke- miska hydrolysen av BBM-l675A2 är i huvudsak de samma som användes för hydrolys av BBM-l675A1, såsom beskrivits ovan.

När det är föredraget att endast framställa antibiotikumet BBM-167SD utföres, på ett sätt liknande framställningen av BBM-l675D utgående från BBM-l675A1, hydrolysen av BBM-1675A2 till dess i huvudsak all BBM-l675A2 och BBM-1675C har om- vandlats till BBM-l675D. I synnerhet utföres hydrolysen med en organisk syra såsom p-toluensulfonsyra.

Ovan beskrivna upptäckt att samma antibiotika BBM-l675C och D bildas utgående från två olika antibiotika BBM-l675A1 och BBM-l675A2 med åtföljande förlust av två inaktiva fragment med formlerna I respektive 2. och tiosockret med formeln 3_ tillhandahåller en ytterligare fördel med föreliggande upp- finning. Följaktligen tillhandahållas enligt en ytterligare aspekt av föreliggande uppfinning ett förfarande för selek- tiv hydrolys av en blandning av BBM-l675A1 och A2 för fram- ställning av BBM-l675C och D såsom åskådliggöres i reak- tionsschema 4.

Reaktionsschema 4.

BBM-l675A + BBM-1675A2---åBBM-16750'*---9BBM-1675D l Denna fördel blir uppenbar när man beaktar att de relativa mängder av BBM-l675Al och A2 som bildas vid jäsningsproces- sen är underkastade variationer. Produktionen av BBM-l675C 10 15 20 25 30 35 469 632 "lo" och D är därför oberoende av de relativa mängderna av BBM- 1675A1 religgande uppfinning. och A2 som utnyttjas som utgångsmaterial enligt fö- Sâsom beskrivits ovan resulterar hydrolysen av de antibio- tiska föreningarna BBM-1675A1, A2 och C i frigörandet av ett inaktivt tiosockerfragment. Nämnda tiosocker har iso- lerats för att ge ytterligare information om den kemiska strukturen av antibiotikumet BBM-1675C och följaktligen för de antibiotiska föreningarna BBM-l675A1 och A2. Föreningen med formeln 3 har identifierats som en blandning av us och ß-anomerer av ett tiosocker, som har den struktur som visas i reaktionsschema 2 och 3. Ytterligare karaktärisering har möjliggjorts när produkterna vid alkoholysen, ar och f-ano- mererna, har separerats. Protonmagnetresonansspektrumet (360 MHz) för föreningen 3A (Kranomer) och föreningen 3B (ß-anomer) visas i figurerna llA respektive 11B. Genom en analys av spektraldata har tiosockermetylglykosiderna med formeln 3 preliminärt tillskrivits den relativa stereo- kemin med formeln OH CH CH S För närvarande har den absoluta stereokemin, dvs. D eller L, ännu ej bestämts. Följaktligen har på basis av förelig- gande tolkning av spektraldata den slutsatsen dragits att tiosockret med formeln 3 (minus den CH3-grupp från den anomera metoxi som införlivas under metanolysen) är en kom- ponent i strukturen hos antibiotikumet BBM-l67SC och vidare är en komponent i strukturen hos de antibiotiska utgångs- föreningarna BBM-l675A1 och A2. 'u 10 15 20 25 30 35 V '.r»_-.....-...-_n^_ ._-a¿....-»..»-....-_ '..4w..@....../.. .fu-ß ._ _, .-.,-- 'W 469 632 Fysikalisk-kemiska egenskaper hos BBM-l675C Beskrivning: amorft fast material Ultraviolett absorptionsspektrum: Se FIG. 1 Instrument Hewlett-Packard 8458 Lösningsmedel : metanol Koncentration : 0,0155 g/1 iLmaX (nm) absorgtiviteter 210 21,770 274 9.340 313 sk (skuldra) 4.190 Ingen signifikant ändring observeras med syra eller bas.

Infrarödabsorptionsspektrum Se FIG. 3 Instrument Nicolet 5DX FT-IR Huvudabsorptionsband (KBr, film): 540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118, 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930, 2970, 3450 @m"1.

Masspektrum Se FIG. 5 Instrument Finigan 4500 TSQ Metod : jonisering genom snabbt atmﬂmmbardemang (FAB) Matris m/z Molekyljon Relativ förekomst glycerol 856 [M+H]+ 100% glycerol + NaCl 878 [M+Na7+ 100% ditiotreitol:ditioerytritol 856 [M+H¶+ 100% (viktförhållande 3:1) 10 15 20 25 30 35 469 632 "M" Instrument Kratos MS-50 Högupplösnings- FAB (m/z) [M+:»;7* = sseßsez Molekylviktzskenbar MV = 855 (baserat på ovan beskrivna masspektraldata) Elementärsammansättning: C36H61N301¿S3 (baserat på ovan beskrivna högupplösningsdata) Protonmagnetresonansspektrum: Se FIG. 7 Instrument: WM 360 Bruker Lösn.medel: CDC13 111 NMR 360 MHz 6 (pmm 6,54 (1H, dd, J=7,7, 7,0); 6,21 (IH, brs); 5,87 (IH, d, J=9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6, 1,5); 5,66 (IH, brd, J=2,9); 4,94 (1H, da, J=1o,3, 1,8), 4,61 (m, <1, J=7,7); 4,25 (IH, s); 4,09 (IH, q, J=2,6); 3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92-3,53 (10H), 3,45 (IH, dt, J=10,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (lH, m); 2,69 (1H, dt, J=9,9, 5,2); 2,49 (IH, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m); 2,13 (IH, m); 2,09 (3H, s); 1,50 (ZH, m); 1,37 (3H, d, J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); 1,08 (6H). 13 C-magnetresonansspektrum : Se FIG. 9 Instrument : WM 360 Bruker Lösn.medel : CDCI3 mc NMR 90,6 MHz 6 (ppmh 13,7, 17,5 19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 35,2, 39,5, 47,7, 52,7, 55,8, 56,1, 57,7, 62,4 64,7, 67,4, 69,3, 69,8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7, 79,7, 83,2 88,4, 97,3, 99,7, 123,4, 124,6, 130,1, 193,1. 10 15 20 25 30 35 _13- 469 632 Fysikalisk-kemiska egenskaper hos BBM-1675D Beskrivning: amorft fast material Ultraviolett absorptionsspektrum: Se FIG. 2 Instrument Hewlett-Packard 8458 Lösningsmedel : metanol Koncentration : 0,01 g/1 ¿maX(nm) absorptiviteter 214 27.000 274 12.800 325 5.400 Ingen signifikant ändring observeras med syra eller bas.

Infrarödabsorptionsspektrum Masspektrum Instrument Se FIG. 4 Nicolet 5DX FT-IR Huvudabsorptionsband (KBr, film): 735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195, 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 1720, 1735, 2880, 2930, 2960, 3400 6m'1.

Instrument Metod Matris .

M olekyljon (m/ z) : Relativ förekomst : Instrument Hög upplösning FAB (m/z) Molkylvikt: skenbar MW = 695 (baserat på ovan beskrivna masspektraldata) Se FIG. 6 Finigan 4500 TSQ jonisering genom snabbt atombombardemang (FAB) tioglycerol [M+H]+ = 696 100% Kratos MS-50 ¿M+ny*= 696,2794 10 15 20 25 30 35 469 632 "u" Elementärsammansättning: C29H49N3012S2 (baserat på ovan beskrivna högupplösningsdata) Korrelation av relativa förekomsterna av [M+H]+ och [(M+H)+2]+ till deras beräknade värden bekräftar den elementärsammansättning som är härledd från högupplösnings-FAB-mät- ningarna.

Se FIG. 8 Instrument: WM 360 Bruker Lösn.medel: CDCI3 + 10% CD30D H NMR 360 MHz 5(ppm): 6,43 (lH, ad, J=4,4, 1o,3); 6,13 (lH, s); 5,81 (in, d, J=8,8); 5,70 (lH, d, J=8,8); 5,48 (lH, 6 brs); 4,48 (lH, d, J=8,1); 4,02 (lH, d, J=2,0); 3,95-3,80 (lös- ningsmedelsbakgrund); 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm); 3,35 (lH, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 (ZH, m); 2,38 (3H, S); 2,23-2,12 (ZH, m); 1,42 (lH, brdw; 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (SH, d, J=6,6); 0,87 (3H, d, J=5,9).

PIOtOI1ﬂ18gI1etIêSOIlaIlSSPêktICHID.I 1 13 se FIG. 10A och 1013 Instrument WM 360 Bruker Lösn.medel : CDCl3 + 10% CD3OD C-magnetresonansspektrum BC NMR 90,6 MHz 6 (ppm)= 17,5 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8, 62,1, 67,8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4, 83,3, 88,2, 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8, 134,3, 148,7, 192,8.

Biologiska egenskaper hos BBM-1675-substanserna.

Den antimikrobiella aktiviteten hos BBM-1675-substanserna bestämdes för en mångfald grampositiva och gramnegativa mikroorganismer. Tabell 1 nedan ger data i form av resul- taten av ett antimikrobiellt screening-förfarande inne- 10 "IS" 469 652 fattande moderkomponenten BBM-1675A1 och substanserna BBM- 1675C och BBM-l675D enligt föreliggande uppfinning. Vid screening-förfarandet applicerades varje testförening i en enhetlig koncentration av 10 pg/ml lösning och impregnerad på en pappersremsa på tillväxtkulturen och måttet på den antibiotiska aktiviteten är den erhållna inhibitionszonen på pappersremsan. Såsom visas i tabell 1 visade substanser- na BBM-16750 och D ett brett antimikrobiellt aktivitetsspek- trum, som var minst lika effektivt som för BBM-l675A1-kom- ponenten; i synnerhet var substanserna BBM-l675C och D mera effektiva som inhibitorer av gramnegativa organismer. _16- TABELL I.

ANTIMIKROBIELL AKTIVITET HOS BBM-1675-SUBSTANSER Inhibitionszon, mm Testmikroorganism BBM-1675A1 BBM-16750 BBM-1675Q Escherichia 5211 AS 19 22 52 51 Escherichia coli K 12 13 36 35 Escherichia coli P 1373 12 34 33 Escherichia coli R Azaserine 14 35 34 Escherichia coli R Netropsin 11 32 32 Escherichia coli R Mitomycin C 12 35 34 Escherichia 231; R Bleomycin 16 38 36 Escherichia 321; R Daunomycin 19 45 44 Escherichia coli R Neomycin 24 53 52 Escherichia E91; R Sibir0mYCiﬂ 14 32 30 Escherichia ggli R HedamYCiﬂ 14 30 25 Escherichia E21; R AClaCiﬂ0mYCiﬂ 15 41 40 Bacillus subtilis ATCC 6633 34 43 41 Klebsiella pneumoniae 17 35 35 Staphzlococcus 209 P 32 47 44 Staphylococcus R Actinoleukin 33 35 33 Staphílococcus R Streptonigrin 37 50 48 Staphylococcus faecalis P1377 30 39 38 Streptococcus aureus Smith P 36 47 45 Staphylococcus aureus Smith R 40 55 53 Actinomycin D Staphylococcus aureus Smith R 17 32 31 Aureolsyra Acinetobacter 16 33 32 Micrococcus luteus 35 57 55 Saccaromyces cerevisiae petite 22 42 43 R = Resistent mot nämnda antibiotikum. 10 15 20 25 30 35 '”' 469 652 Aktivitet mot leukemi P-388.

Tabellerna II och III innehåller resultaten av laboratorie- försök med CDF -möss med intraperitonealt implanterat tumör- inokulat om 10% askitesceller av leukemi P-388 och behand- lade med olika doser av BBM-l675A1, C eller D. Substanser- na administrerades medelst intraperitoneal injektion. Grup- per om sex möss användes på varje doseringsnivå och de be- handlades med en enda dos av substansen dagen efter tumör- inympningen. En grupp om tio saltlösningsbehandlade kontroll- möss införlivades med varje försöksserie. Den BBM-1675A1- behandlade gruppen enligt tabell III har införlivats som direkt jämförelse. Ett 30-dagars protokoll användes, var- vid medelöverlevnadstiden i dagar bestämdes för varje grupp av möss och antalet överlevande vid slutet av den 5 dagar långa perioden noterades. Mössen vägdes före behandling och ånyo på dag 4. Viktändringen togs som ett mått på läkemed- lets toxicitet. Möss med en vikt av 20 g vardera användes och en viktförlust av upp till ca 2 g beaktades ej. De ve- hikelbehandlade kontrolldjuren dog vanligen inom 9 dagar.

Resultaten bestämdes uttryckt i % B/K, som är förhållandet mellan överlevnadstiden för den behandlade gruppen och me- delöverlevnadstiden för den vehikelbehandlade kontrollgrup- pen, multiplicerat med 100. Ett värde på % B/K lika med eller större än 125 antyder att en signifikant antitumörverkan har uppnåtts. Screening-resultaten i tabell II visar den initiellt oväntade antitumöraktivitetsnivån hos BBM-1675C- substansen. I tabell III ges resultaten av en direkt jäm- förelse mellan substanserna BBM-l675A1 (esperamicin A1) och BBM-l675C och BBM-l675D. Data antyder att BBM-l675C är ungefär jämförbar med BBM-1675Al vad gäller potens och och antitumöreffektivitet och att den icke är beroende av doseringsschemat, medan substansen BBM-l675D är endast nå- got mindre effektiv.

Vidare har det ovan angivits att samma substanser BBM-l675C och BBM-l675D även kan erhållas utgående från BBM-l675A2 (esperamicin A2)-komponenten. I jämförelse med data rappor- 10 15 20 25 30 469 632 43' terade i denna ansökan för BBM-l675C och BBM-l675D och de data som anges i den publicerade brittiska patentansökningen 2 141 425 för komponenten BBM-l675A2, har det överraskande visat sig att substanserna BBM-l675C och D är mera effek- tiva som antitumörmedel än den moderkomponent BBM-l675A2 från vilken de härrör.

TABELL 11 EFFEKT Av BBM-16750 PÅ P-388 LEUKEM1 (Behandling på dag 1) Effekt MVÄ Dos, IP MÖT MÖT g Överlevande Förening mg/kg/inj. dagar % B/K dag 4 dag 5 BBM-167sc 3,2 Tax mox - o/6 0,8 Iox Iox - 0/6 0,2 Iox Iox - o/6 0,05 TOX TOX -1,8 1/6 0,0125 11,0 122 -2,5 5/6 0,003125 13,5 150 -2,5 6/6 Vehikel - 9,0 100 0,4 10/10 Tumörinokulat: 106 askitesceller implanterade i.p.

Värddjur: CDF1-hanmöss Utvärdering: MÖI = medelöverlevnadstid Effekt: % B/ K =(MÉ5_T'_'för behandlad grupp/bíÖT för kontrollgrhpp) x 100 Kriterier:% B/K 2 125 anses innebär signifikant antitumör- aktivitet MVÄ: medelviktändring (behandlad grupp/kontrollgrupp) i g (på dag 4). "lg" 469 632 TABELL III EFFEKT AV BBM-1675 SUBSTANSER PÃ P-388 LEUKEMI Effekt MVÄ Överle Behandlings- Dos, IP MÖT MOT g vande Förening schema mg/kg/inj. dagar % B/K Dag 4 Dag 5 BBM-1675A1 d. 1 _ 0,0512 TOX TOX - 0/6 0,0256 Iox Tox - 0/6 0,o128 TOX TOX -1,8 3/6 0,0064 15,5 172 -0,3 6/6 0,0032 15,0 167 -0,6 6/6 0,0016 15,5 172 0,6 6/6 0,0008 12,5 139 0,3 6/6 0,0004 12,0 133 1,4 6/6 0,0002 11,0 122 0,8 6/6 0,0001 11,5 120 1,4 6/6 BBM-16750 d. 1 0,o256 TOX IOX - 0/6 0,012s Iox rox -0,8 3/6 0,0064 11,5 128 -0,3 6/6 0,0032 14,5 161 -0,1 6/6 0,0016 10,5 117 0,0 6/6 0,0008 12,0 133 0,3 6/6 0,0004 11,5 128 0,8 6/6 0,0002 11,0 122 1,4 6/6 0,0001 11,0 122 0,8 6/6 0,00005 10,5 117 1,3 6/6 BBM-1675D d. 1 0,0256 9,0 100 0,1 6/6 0,0128 11,5 128 0,3 6/6 0,0064 12,5 139 0,3 6/6 0,0032 12,0 133 0,1 6/6 0,0016 11,5 128 0,8 6/6 0,0008 10,0 111 0,2 6/6 0,0004 10,0 111 0,5 6/6 0,0002 9,5 106 1,7 6/6 0,0001 9,5 106 1,7 6/6 0,0000s 9,0 100 2,0 6/6 10 15 20 25 30 35 469 632 "zo" TABELL III (forts.) Effekt MVÄ Överle- Behandlings- Dos, IP MÖT MÖT g vande Förening schema mg/kg/inj. dagar Z B/K Dag 4 Dag 5 BBM-16750 d. 1-es 0,0032 16,0 178 -1,3 6/6 0,0016 13,5 150 -1,0 6/6 0,000s 13,5 150 -0,3 6/6 0,0004 12,0 133 -0,4 6/6 0,0002 12,0 133 -0,4 6/6 0,0001 11,0 122 -0,4 5/6 0,0000s 11,0 122 0,9 6/6 0,0000z5 8,5 94 2,2 6/6 0,000012s 8,0 89 2,4 6/6 0,0000062s 8,0 89 2,4 6/6 vehikel - 9,0 100 2,4 10/10 Tumörinokulat: 106 askitesceller implanterade i.p.

Värddjur: CDF1-honmöss Utvärdering: MÖT = medelöverlevnadstid Effekt: % B/K = (MÖT för behandlad grupp/MÖT för kontroll- grupp) x 100 Kriterier: % B/K 2 125 anses innebär signifikant antitumör- aktivitet MVÄ: medelviktändring (behandlad grupp/kontrollgrupp) i g (på dag 4).

Aktivitet mot melanom B16 Tabell IV innehåller resultaten av antitumörförsök under användning av melanon B16 som har fått växa hos möss. BDF1- möss användes och inympning av tumörimplantatet skedde sub- kutant. Ett 60-dagars protokoll användes. Grupper om tio möss användes på varje doseringsnivå och medelöverlevnadstiden för varje grupp bestämdes. Kontrolldjur, som hade ympats 10 "Zl" 469 632 på samma sätt som försöksdjuren och behandlats med injek- tionsvehikeln och icke något läkemedel, uppvisade en medel- överlevnadstid av 22,5 dagar. På varje doseringsnivå be- handlades försöksdjuren med testföreningen på dagarna 1, 5 och 9 genom intraperitoneal injektion. En effekt uttryckt som % B/K lika med eller större än 125 antyder att en.sigf nifikant antitumöreffekt har uppnåtts. Resultaten i tabell IV visar att vid en direkt jämförelse BBM-1675C även var effektiv vid behandling av möss med melanom B16 och var un- gefärligen jämförbar med BBM-l675A1 i potens. 10 15 20 25 30 469 632 _22- TABELL IV EFFEKT AV BBM-1675-SUBSTANSER PÅ B16 MELANOM (Behandling dagarna 1, 5 och 9) Effekt MVÄ Dos, IP MÖT MÖT g överlevande Förening mg/kg/inj. dagar % B/K Dag 12 Dag 10 BBM-1675Al 0,0032 37,5 167 0,3 10/10 0,0016 37,5 167 0,3 10/10 0,0008 38,5 171 1,4 10/10 0,0004 37,0 164 1,8 10/10 0,0002 34,5 153 2,0 10/10 0,0001 32,0 142 1,9 10/10 BBM-1675C 0,0008 31,5 140 0,6 10/10 0,0004 37,0 164 1,2 10/10 0,0002 31,0 138 0,6 10/10 0,0001 31,5 140 1,0 10/10 0,00005 27,5 122 0,8 10/10 0,000025 25,0 111 0,5 10/10 Vehikel - 22,5 100 0,3 10/10 Tumörinokulatz 0,5 ml av en 10% gröt, IP Värddjur: BDF1-honmöss Utvärdering: MÖT = medelöverlevnadstid Effekt: % B/K = (MÖT hos behandlad grupp/MÖT hos kontroll- MVÄ: medelviktändring (behandlad grupp/kontrollgrupp) i g grupp) x 100 Kriterier: % B/K 2 125 anses innebära signifikant anti- tumöraktivitet (på dag 12). 10 15 20 25 30 35 ' 43" 469 632 Såsom visas av ovan angivna antimikrobiella data och mus- tumördata är BBM-1675C och BBM-l675D användbara som anti- biotika vid terapeutisk behandling av däggdjur och andra djur för infektionssjukdomar och även som antitumörmedel för att terapeutiskt inhibera tillväxten av däggdjurstu- mörer.

Föreliggande uppfinning tillhandahåller därför även ett sätt att terapeutiskt behandla ett värddjur, som har an- gripits av en mikrobiell infektion eller av en malign tumör, vilket sätt innebär att man till värddjuret administrerar en effektiv antimikrobiell eller tumörinhiberande dos av BBM-l67SC eller BBM-1675D eller en farmaceutisk beredning därav.

Föreliggande uppfinning avser även en farmaceutisk bered- ning, vilken innehåller en effektiv antimikrobiell eller tumörinhiberande mängd av BBM-l675C eller BBM-l675D i kombination med en inert farmaceutiskt godtagbar bärare eller utspädningsmedel. Dylika beredningar kan även inne- hålla andra aktiva antimikrobiella eller antitumörala me- del och kan framställas i varje farmaceutisk form som är lämplig för det avsedda administreringssättet. Exempel på dylika beredningar innefattar fasta beredningar för oral administrering såsom tabletter, kapslar, piller, pulver och granulat, flytande beredningar för oral administre- ring såsom lösningar, suspensioner, siraper eller tinktu- rer och mixturer och preparat för parenteral administre- ring såsom sterila vattenhaltiga eller vattenfria lös- ningar, suspensioner eller emulsioner. De kan även fram- ställas i form av sterila fasta beredningar, som kan upp- lösas i sterilt vatten, fysiologisk saltlösning eller något annat sterilt injicerbart medium omedelbart för använd- ning.

För användning som antimikrobiellt medel administreras BBM-l675C eller BBM-l675D eller en farmaceutisk bered- ning därav så att koncentrationen av den aktiva bestånds- 10 15 20 25 30 35 469 632 "24" delen blir större än den minsta inhiberande koncentratio- nen för den speciella organism ifråga som behandlas. För användning som antitumörmedel kan optimala doseringar och doseringsscheman för BBM-l675C eller BBM-l675D för ett gi- vet värddäggdjur lätt fastställas av fackmannen. Det torde givetvis inses att den aktuella dosen av BBM-l675C eller BBM-1675D varierar beroende på den speciella beredningen ifråga, administreringssättet och vilket värddjur och sjuk- dom som behandlas och det speciella sjukdomsstället ifråga.

Många faktorer, som modifierar verkningar av läkemedlet, får tas i beaktande innefattande ålder, vikt, kön, diet, administreringstid, administreringssätt, utsöndringshastig- het, patientens tillstånd, läkemedelskombinationer, reak- tionssensibiliteter och sjukdomens svårighetsgrad. Admi- nistreringen kan utföras kontinuerligt eller periodiskt inom den maximalt tolererade dosen. Optimal administrering för en given uppsättning av betingelser kan fastställas av fackmannen under användning av konventionella doseringsbe- stämningstest mot bakgrund av ovan angivna riktlinjer.

Uppfinningen åskådliggöres närmare medelst följande utfö- ringsexempel.

Kemisk framställning och isolering av BBM-l675C och BBM- 1675D.

Exempel l.

Ett prov av 50 mg BBM-l675A1 upplöstes i 2,5 ml metanol och behandlades med 2,5 ml av en 0,1 molär lösning av klorväte i metanol. Reaktionen fick fortgå vid en temperatur av cirka SOOC och försvinnandet av utgångsmaterialet (tog ca 30 minuter) övervakades var 5 till 10 minut medelst tunn- skiktskromatografi (TLC) på silikagelplattor (Analtech, 250 mikron, GF) med toluenzaceton i volymförhållandet 3:2 som elueringslösningsmedel. Efter det att utgângsmaterialet hade förbrukats neutraliserades reaktionsblandningen med en mättad lösning av natriumvätekarbonat i metanol och indun- 10 15 20 25 30 35 _25- 469 632 stades därefter under reducerat tryck för erhållande av en torr återstod, som innehöll de bioaktiva fragmenten.

BBM-1675C-substansen isolerades från återstoden genom snabbkolonnkromatografering på en kolonn med en inre dia- meter av 2 cm och en längd av 10 cm och packad med Woelm silikagel (med partikelstorleken 32-63 mikron). Kolonnen eluerades med toluenzaceton i volymförhållandet 3:2 och man tillvaratog fraktioner om 3 ml. Varje fraktion analy- serades medelst TLC (silikagel med toluenzaceton i volym- förhållandet 3:2 som elueringsmedel) och TLC-fläckarna vi- sualiserades med en ultraviolettljuskälla med våglängden 254 nm och en ceriumsulfatspray (l% ceriumsulfat och 2,5% molybdensyra i 10% svavelsyra). Fraktionerna 6-12 (Rf-värdet för BBM-16750 är 0,28) poolades och indunstades till torr- het, varvid man erhöll 12 mg (35%) av i huvudsak ren BBM- l675C.

De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos BBM-l675C framgår av beskrivningen och ultraviolettspektrumet, infraröd- spektrumet, masspektrumet, IH-NMR-spektrumet och 13C-NMR- spektrumet för föreningen framgår av figurerna 1, 3, 5, 7 respektive 9.

Exempel 2.

När reaktionstiden för förfarandet i exempel 1 förlängs minskar mängden BBM-l675C och två nya produkter, som be- tecknas förening 3 (Rf = 0,65) och BBM-l675D (Rf förblir på baslinjen) (TLC: kiseldioxid, toluenzaceton i volymför- hållandet 3:2) uppträder och blir mera dominerande med ti- den.

Föreningen BBM-l675D, som vanligen åtföljer bildningen av BBM-16750, isolerades från den kromatografiska kolonn som beskrivs i exempel l genom eluering av kolonnen med klor- formzmetanol i volymförhållandet 5:1. De lämpliga frak- tionerna ifråga poolades och indunstades till torrhet, varvid man erhöll 18 mg av i huvudsak ren BBM-l675D från 10 15 20 25 30 35 _26- 469 632 den i exempel l beskrivna reaktionen.

BBM-l675D-substansen uppvisar en huvudfläck vid Rf = 0,37 vid reverserad fas-TLC (Whatman MKC18F, 200 mikron) under användning av 30% vatten i metanol som elueringsmedel och Rf kloroformzmetanol i volymförhållandet 5:O,5 som eluerings- = 0,22 vid normalfas-silikagel-TLC under användning av medel.

Exempel 3.

En väsentlig förbättring i utbytet av BBM-1675D kan uppnås genom användning av p-toluensulfonsyra i stället för klor- väte vid den kemiska hydrolysen av EBM-l675A2 eller BBM- l67SAl, såsom åskådliggöres av förfarandena enligt exemplen 3 respektive 5 nedan.

Ett prov av 15,2 mg BBM-l675A2 hydrolyserades med en 0,03 molär lösning av p-toluensulfonsyra i metanol (1 ml) vid en temperatur av cirka 6300 under cirka l timme. Reaktions- blandningen indunstades därefter till torrhet under redu- cerat tryck vid cirka 30°C. BBM-l675D-substansen isolera- des från den torra återstoden genom snabbkolonnkromatografe- ring på en kolonn packad med Woelm silikagel (partikelstor- lek 32-63 mikron). Kolonnen eluerades med kloroformzmetanol i volymförhållandet 5:0,5 och de tillvaratagna fraktionerna analyserades med TLC (silikagel med kloroformzmetanol i volymförhållandet 510,5 som elueringsmedel). De använda kromatograferingsbetingelserna medgav separation av bland- ningen av inaktiva föreningar 2 och 3 (7 mg) från den bio- aktiva substansen BBM-l675D, som har ett Rf-värde av 0,22.

De lämpliga fraktionerna ifråga poolades och indunstades till torrhet, varvid man erhöll 8 mg av i huvudsak ren BBM- l675D i nära nog kvantitativt utbyte.

De fysikalisk-kemiska egenskaperna hos BBM-l675D framgår av beskrivningen och ultraviolett-, infraröd-, mass-, 1H-NMR- 13 och C-NMR-spektra för föreningen framgår av figurerna 2, 4, 6, 8 respektive lOA och lOB i kombination. 10 15 20 25 30 35 _27- 469 652 Exempel 4.

Ett prov av 40 mg BBM-l675A2 behandlades med 5 ml av en 0,5 molär lösning av väteklorid i metanol vid ungefär 50°C under cirka 2 timmar medelst det allmänna förfarandet och isoleringsmetoden i exempel 1. Efter neutralisation med nat- riumvätekarbonat och indunstning till torrhet isolerades BBM- 16750-substansen från återstoden genom snabbkolonnkromato- grafering på en kolonn packad med Woelm silikagel (partikel- storlek 32-63 mikron) under användning av toluenzaceton i volymförhållandet 3:2 som elueringsmedel. De lämpliga frak- tionerna ifråga kombinerades och indunstades till torrhet, varvid man erhöll 8,4 mg av i huvudsak ren BBM-l675C, som är identisk med den i exempel 1 isolerade produkten.

Kromatograferingskolonnen enligt ovan eluerades därefter med kloroformzmetanol i volymförhâllandet 5:0,25 och de till- varatagna fraktionerna poolades och indunstades till torr- het för erhållande av BBM-l675D. BBM-l675D-substansen rena- des ytterligare medelst ytterligare en snabbkromatografe- ringskolonn med silikagel under användning av kloroform: metanol i volymförhållandet 5:O,5 som elueringsmedel. De lämpliga fraktionerna ifråga kombinerades och indunstades till torrhet, varvid man erhöll 6,3 mg av i huvudsak ren BBM-1675D, som är identisk med den i exempel 3 isolerade produkten.

Exempel 5.

Ett prov av 49,3 mg BBM-1675A1 hydrolyserades med en 0,037 M lösning av p-toluensulfonsyra i 1,5 ml metanol vid en temperatur av cirka 60°C under cirka 1,5 timmar. Reaktions- blandningen indunstades till torrhet under reducerat tryck vid cirka 30°C för erhållande av en återstod, som innehål- ler BBM-l675D och de inaktiva föreningarna l och 3. Den bioaktiva BBM-l675D-substansen isolerades från återstoden genom snabbkolonnkromatografering på en kolonn packad med Woelm-silikagel (partikelstorlek 32-63 mikron) under använd- 10 l5 20 25 30 469 652 _23- ning av kloroformzmetanol i volymförhållandet 5:O,25 som elueringsmedel. De lämpliga fraktionerna ifråga kombine- rades och indunstades till torrhet för erhållande av 27 mg av i huvudsak ren BBM-l675D, som är identisk med den pro- dukt som isolerades i exempel 3.

Exempel 6.

Ett prov av 5,1 mg BBM-1675C hydrolyserades med en 0,5 molär lösning av väteklorid i l ml metanol vid ungefär 40-SOOC över natten. Efter neutralisation med natriumvätekarbonat och indunstning till torrhet isolerades den bioaktiva BBM- l675D-substansen från återstoden genom snabbkolonnkromato- grafering på en kolonn packad med Woelm silikagel (parti- kelstorlek 32-63 mikron) under utnyttjande av kloroform: metanol i volymförhållandet S:O,2S som elueringsmedel. De lämpliga fraktionerna ifråga gav i huvudsak ren BBM-l675D, som är identisk med den i exempel 3 isolerade produkten.

Exempel 7.

När det allmänna förfarandet enligt exemplen 1 och 2 upp- repas men med den skillnaden att utgångsmaterialet BBM-l675Al ersättes med en ekvimolär mängd av en blandning innehål- lande BBM-l675A1 och BBM-l675A2, erhålles substanserna BBM-1675C och BBM-l675D.

Exempel 8.

När det allmänna förfarandet enligt exempel 5 upprepades men med den skillnaden att utgångsmaterialet BBM-l675Al er- sättes med en ekvimolär mängd av en blandning innehållande BBM-l675A1 och BBM-1675A2, erhålles substansen BBM-l675D.

Claims

10 15 203 25 30 35 29 469 632 PATENTKRAV

1. Den antitumörala och antibiotiska föreningen BBM-1675D som i väsentligen ren form; (a) uppträder som ett amorft fast material; (b) (c) är löslig i metanol, etanol, aceton och tetrahydrofuran och ringa löslig i kloroform; vid silikagel-tunnskiktskromatografering'uppvisar ett Rf-värde av 0,22 med lösningsmedelssystemet kloroform: metanol i volymförhållandet 5105 och vid reverserad fas- « silikagel-tunnskiktskromatografering uppvisar ett Rf- . värde av 0,37 med lösningsmedelssystemet metanolzvatten (d) (e) (f) (s) (h) i volymförhållandet 70:30; har en skenbar molekylvikt av 695 vid bestämning medelst högupplösnings-FAB-masspektroskopi; har ett ultraviolettabsorptionsspektrum i metanollös- ning i huvudsak såsom visas«i fig. 2 med ultraviolett- absorptionsmaxima och absorptiviteter vid 214 nm (a = 27.000), 274 nm (a = 12.800) och 325 nm (a = 5.400) utan någon signifikant ändring vid tillsats av syra eller bas; har ett infrarödabsorptionsspektrum (KBr, film) i huvud- sak såsom visasi.fig. 4 med huvudabsorptionstoppar vid 735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1035, 1150, 1195, 1250, 1310, 1335, 1365, 1335, 1445, 1510, 1685, 1720, 1735, zaao, 2930, 2960 och 3400 6m'1; har ett lågupplösningsmasspektrum_i huvudsak såsom vi- sas i fig. 6 med en moleky1jon_[M+H]+ av 696; har ett 360 MHz protonmagnetresonansspektrum i CDCl3 + 10% CD30D i huvudsak såsom visas i fig. 8 med signaler vid 10 15 20 25 30 35 30 469 652 6,43 (1H, dd, J=4,4, 10,3), 6,13 (1H, s); 5,81 (lH, d, J=8,8); 5,70 (IH, d, J=8,8); 5,48 (lH, 6 brs); 4,48 (1H, d, J=8,l); 4,02 (1H, d, J=2,0); 3,95-3,80 (lösningsmedels- bakgrund); 3,77 (IH, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm); 3,35 (IH, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 -(zH, m), 2,38 (3H, s); 2,23-2,12 (211, m), 1,42 (m, bmw; 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6) och 0,87 (3H, d, J=5,9) ppm nedfällt som tetrametylsilan; (i) har ett 90,6 MHz kol-13-magnetresonansspektrum i CDCl3 + 10% CD30D i huvudsak-såsom visas i fig. 10 (l0A + l0B) med signaler vid , 17,5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8, 62,1, 67,8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4, 83,3, 88,2, 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8, 134,3, 148,7 och 192,8 ppm nedfällt som tetrametylsilan.

2. Förfarande för framställning av den antitumörala och antibiotiska föreningen BBM-1675D enligt krav 1, k ä n - n e t e c k n a t därav, att man hydrolyserar BBM-1675A1 eller BBM-1675A2 med en mineralsyra eller organisk syra till dess en väsentlig mängd BBM-1675D har bildats och där- efter utvinner BBM-1675D från reaktionsmediet.

3. Förfarande för framställning av den antitumörala och antibiotiska föreningen BBM-1675D.en1igt krav lf k ä n - n e t e c k n a t därav, att man hydrolyserar EBM-1675C med en mineralsyra eller organisk syra till dess en väsent- lig mängd BBM-1675D har bildats och därefter utvinner BBM- 1675D från reaktionsmediet.

4. Förfarande för framställning av den antitumörala och antibiotiska föreningen BBM-1675D enligt krav 1, k ä n - n e t e c k n a t därav, att man hydrolyserar en bland- ning av BBM-l675Al och BBM-1675A2 med en mineralsyra eller organisk syra till dess en väsentlig mängd BBM-1675D har bildats och därefter utvinner EBM-1675D från reaktionsmediet. 10 31 469 652

5. Farmaceutisk beredning innefattande en effektiv anti- mikrobiell mängd av BBM-l675D enligt krav 1 i kombination med en farmaceutisk bärare eller utspädningsmedel.

6. Farmaceutisk beredning innefattande en effektiv tumör- inhiberande mängd av BBM-l675D enligt krav 1 i kombination med en farmaceutisk bärare eller utspädningsmedel.