LU86562A1

LU86562A1 - Nouvelles substances antibiotiques et antitumorales,procede pour leur otbention et isolation;compositions pharmaceutiques les contenant

Info

Publication number: LU86562A1
Application number: LU86562A
Authority: LU
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1985-08-27
Filing date: 1986-08-26
Publication date: 1987-03-06
Also published as: GR862160B; DK170671B1; NL8602165A; IE59204B1; FI863405A; FR2586686A1; SE469632B; SG109692G; IT1229176B; BE905332A; ES2002728A6; PT83261A; CA1307256C; FR2586686B1; IT8621527A0; AU6175186A; FI83422C; SE9200428D0; JPS62116589A; HK793A

Description

v,

La présente invention a essentiellement pour objet de nouvelles substances antibiotiques et antitumorales, ainsi qu'un procédé pour leurs obtention et isolation.

L'invention vise également les compositions pharma-5 ceutiques contenant ces nouvelles substances qui constituent un agent antimicrobien et antitumoral.

Les composés antitumoraux conformes à la présente invention n'ont pas encore été" identifiés en termes de structure. Cependant, au regard de leurs propriétés 10 physiq ues, chimiques et biologiques uniques, les antibio tiques BBM-1675C et BBM-1675D de l'invention, constituent des substances nouvelles.

La demande de brevet britannique N° 2 141 425, publiée le 19 Décembre 1984, révèle un nouveau complexe 15 antibiotique et antitumoral appelé BBM-1675, obtenu par fermentation d'une souche H964-92 (ATCC 39334) Actinomadura verrucosospora ou une souche A1327Y (ATCC 39638)

Actinomadura verrucosospora. Deux composants bioactifs majeurs du complexe BBM-1675 décrit dans cette demande 20 ont été désignés BBM-1675A^ et BBM-1675A2 . Les structures des antibiotiques BBM-1675A^ et BBM-1675A2. également connus sous le nom d'espéramicine A^ et espéramicine A2, respectivement, n'ont pas été jusqu'à présent élucidées, mais ces deux composants présentent d'excellentes activités 25 antimicrobienne et antitumorale .

Le brevet américain N° 4 530 835, délivré le 23 Juillet 1985 au nom de Bunge et al, révèle un procédé 2 de fermentation d'une souche isolée d'Actinomycète non identifiée WP-444 (ATCC 39363) pour l'obtention d'antibiotiques antitumoraux désignés CL-1577A et CL-1577B. y Les structures des antibiotiques CL-1577 n'ont pas été 5 jusqu'à présent élucidées , mais leurs propriétés caractéristiques indiquent que CL-1577A et CL-1577B sont simulaires relativement à la structure aux antibiotiques BBM-1675, et en particulier BBM-1675A^ et BBM-1675A2 mentionnés dans la demande de brevet britannique précitée N° 2 141 425.

10 La publication J. Antibiotics,37(12), 1566-1571 (1984) (R. H. Bunge et al) révèle la fermentation de Actinomadura sp. (ATCC 39363) pour l'obtention d'un complexe biologiquement actif dont les deux composants essentiels PD 114 759 et PD 115 028 ont été isolés . Dans la pulbica-15 tion J_. Chem. Soc. Chem, Commun. , 919-920 (1985), J. H. Wilton et al, on a décrit la structure partielle élucidée des antibiotiques PD 114 759 et PD 115 028. L'obtention, l'isolation et la caractérisation des antibiotiques PD 114 759 et PD 115 028 apparaissent être identiques à 20 celles des antibiotiques CL-1577A et CL-1577B précités, respectivement.

La demande de brevet européen N° 95 154, publiée le 30 Novembre 1983 révèle la fermentation d'Actinomadura pulveraceus sp. nov. N° 6049 (ATCC 39100) pour l'obtention 25 d'antibiotiques antitumoraux désignés WS 6049-A et WS 6049-B. Les structures des antibiotiques WS-6049 n'ont pas été élucidées jusqu'à présent , mais les propriétés caractéristiques données pour ces antibiotiques indiquent que WS 6049-A et WS 6049-B sont proches par leur structure des 30 antibiotiques BBM-1675 révélés par la demande de brevet britannique N° 2 141 425 et des antibiotiques CL-1577 révélés par le brevet américain N° 4 530 835. Les données spectrales montrent, cependant, que ni WS 6049-A ni WS 6049-B n'est identique à l'un des composants de BBM-1675. 35 De plus, l'organisme producteur décrit dans la demande de 3 brevet européen N° 95 154 peut être clairement différencié de Actinomadura verrucosospora utilisé dans la demande de brevet britannique N° 2 141 425 de par la couleur du mycélium - aérien sur milieu ISP N° 2, 3 et 4 , sa peptonisation 5 positive au lait et son utilisation positive de D-fructose, D-mannitol,·tréhalose et cellulose.

L'objet de la présente invention est de fournir de nouvelles substances antibiotiques et antitumorales désignées BBM-1675C et BBM-1675D, également BMY-27305 et 10 BMY-27307, respectivement , lesdites substances étant obtenues par hydrolyse chimique sélective des composants biologiquement actifs BBM-1675A^ (espéramicine A^) ou BBM-1675A2 (espéramicine Ag) qui sont eux-mêmes obtenus par culture d'une souche productrice de BBM-1675 Actino-15 madura verrucosospora. Les substances biologiquement actives BBM-1675C et BBM-1675D peuvent être séparées et purifiées par des processus de chromatographie traditionnels et ces deux substances présentent une activité antitumorale et antimicrobienne excellente.

20 L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la description explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple 25 illustrant plusieurs modes de réalisation de l'invention et dans lesquels : - la figure 1 représente le spectre d'absorption ultraviolet de BBM-1675C, - la figure 2 représente le spectre d'absorption 30 ultraviolet de BBM-1675D, - la figure 3 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-1675C (KBr, film), - la figure 4 représente le spectre d'absorption infrarouge de BBM-1675D (KBr, film), 35 - la figure 5 représente le spectre de masse de 4 BBM-1675C, - la figure 6 représente le spectre de masse de BBM-1675D, “ - la figure 7 représente le spectre de résonance 5 magnétique du proton de BBM-1675C dans CDCl^ (360 MHz), - la figure 8 représente le spectre de résonance magnétique du proton de BBM-1675D dans CDClg + 10% CD^OD (360 MHz), - la figure 9 représente le spectre de résonance 10 magnétique du 13C de BBM-1675C dans CDClg ( 90,6 MHz), - la figure 10A représente le spectre de résonance 13 magnétique du C (110-200 ppm) de BBM-1675D dans CDC13 + 10% CDgOD (90,6 MHz), - la figure 10B représente le spectre de résonance 13 15 magnétique du C (0-110 ppm) de BBM-1675D dans CDC13 + 10% CDgOD (90,6 MHz), - la figure 11A représente le spectre de résonance magnétique du proton du composé 3A (-anomère) dans CDClg (360 MHz), et 20 - la figure 11B représente le spectre de résonance magnétique du proton du composé 3B (yG-anomère) dans CDC13 (360 MHz).

Comme on l'a vu, la présente invention concerne deux nouvelles substances antibiotiques antitumorales 25 désignées BBM-1675C et BBM-1675D, également désignés BMY-27305 et BMY-27307, respectivement, ces substances étant obtenues par hydrolyse chimique sélective des composants biologiquement actifs BBM-1675A1 (espéramicine A^) ou BBM-1675A3 (espéramicine Ag) qui sont eux-mêmes obtenus 30 par culture d'une souche produisant BBM-1675 d'Actinomadura verrucosospora, et préférentiellement d'une souche

Actinomadura verrucosospora H964-92 (ATCC 39334) ou d'une souche Actinomadura verrucosospora A1327Y (ATCC 39638) ou d'un mutant de ces souches. Selon un autre aspect, la 35 présente invention fournit un procédé d'obtention de la 5 substance BBM-1675C par hydrolyse sélective des composants biologiquement actifs BBM-1675A1 ou BBM-1675A2 . Selon une autre caractéristique, la présente invention fournit - un procédé de séparation de BBM-1675D par hydrolyse sélec- 5 tive de la substance BBM-1675C ou, plus préférentiellement, à partir des composants biologiquement actifs BBM-1675A^ ou BBM-1675A2 . L'isolation et la purification de BBM-1675C et BBM-1675D du mélange réactionnel peut être accomplie par des processus de chromatographie traditionnels.

10 Les substances biologiquement actives BBM-1675C

et BBM-1675D présentent une activité antimicrobienne contre une grande variété de microorganismes et on a également montré que ces substances présentent une activité inhibitrice contre des systèmes tumoraux variés de souris, 15 tels que leucémie P-388 et mélanome B16. Les substances nouvellement décrites conformes à la présente invention, par conséquent, peuvent être utilisées comme agents antimicrobiens ou comme agents antitumoraux pour inhiber les tumeurs chez les mammifères.

20 Lors des études de dégradation réalisées pour élucider la structure des antibiotiques antitumoraux BBM-1675A^ (espéramicine A^) et BBM-1675A2 (espéramicine Ag), un mélange de composants a ce qui a conduit à l'isolation et l'identification de deux fragments inactifs, composés 25 de formules 1 et 2, respectivement. Cependant, on a découvert de façon surprenante que la dégradation chimique conduisait c à la libération par étape des deux fragments biologique ment actifs BBM-1675C et BBM-1675D. De façon encore plus surprenante, on a découvert que les deux antibiotiques 30 différents BBM-1675A^ et BBM-1675A2 produisaient les mêmes fragments biologiquement actifs comme illustré par le Schéma 1. De façon également surprenante, on a découvert que les fragments de poids moléculaire les plus plus faibles BBM-1675C et BBM-1675D (ayant approximativement 70% et 55% 35 du poids moléculaire des antibiotiques parents BBM-1675A^ et 6 BBM-1675Ä2 , respectivement) étaient plus efficaces en tant qu’agents antimicrobiens et antitumoraux que BBM-1675A2 et comparables à BBM-1675A^ .

Schéma 1 5 BBM-1675A1^ (espéramicine A^) 10

BBM-1675C-►BBM-1675D

BBM-1675A2^ (espéramicine A2

Les substances BBM-1675C et BBM-1675D peuvent 20 être obtenues par hydrolyse chimique sélective de l'antibiotique BBM-1675A^ comme souligne dans le Schéma 2.

7

Schéma 2 och3 H0 q h Θ CH3° VOv^n BBM-1675A.;—_—* BBM-1675C + 10 1 CH3OH (poids

(poids moléculaire CHgO' NH

moléculaire 855.) I rH

1248) 2 och3

Composé 1 (poids molécu-laire 425) (mélange des anomeres o{ et ß >

H©/CH30H

* ^3 V—o BBM-1675D + CH„S —( V''QChL· (poids J \ / 3 moléculaire \-' e95) à,

Composé 3 (poids moléculaire 192) (mélange des anomeres o( et/3 ) 8

Le composé de départ BBM-1675A^ est préparé selon le processus décrit dans la demande de brevet britannique N° 2 141 425, publiée le 19 Décembre 1984. Le composant BBM-1675A^ purifié est hydrolyse avec un acide organique 5 ou minéral tel que l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide p-toluènesulfonique, l'acide benzènesulfonique

ou analogue, dans un solvant inerte organique ou mixte aqueux-organique à une température d'environ 0°C à la température de reflux du solvant jusqu'à obtention d'une 10 quantité substantielle des composés souhaités BBM-1675C

ou BBM-1675D. D'une façon préférentielle, l'hydrolyse est effectuée dans des solvants d'alcool en C^-Cg , et plus préférentiellement, l'alcoolyse est réalisée dans du méthanol. La température de la réaction n'est pas critique, 15 mais on préférera réaliser la réaction à une température comprise entre environ la température ambiante et 60°C, et de façon préférentielle entre 40°C et 60°C.

L'hydrolyse sélective de BBM-1675A^ est réalisée par étape , avec l'obtention initiale de l'antibiotique 20 BBM-1675C et du fragment inactif de formule 1. Le traitement subséquent ou continu dans des conditions d'hydrolyse conduit à la libération d'un mélange des anomeres o{ et/3 du sucre thio de formule 3 et la production de l'antibiotique BBM-1675D. Les gens compétents dans ce domaine 25 comprendront qu'en faisant varier les conditions réactionnelles telles que temps, température et concentration de l'acide, on obtient des quantités relatives variables des antibiotiques BBM-1675C et BBM-1675D. Ainsi, il est souhaitable de suivre la réaction par chromatographie sur couche 30 mince, comme il sera décrit dans les exemples donnés ci-après.

Lorsqu'on souhaite préparer seulement l'antibiotique BBM-1675D l'hydrolyse sélective est réalisée de façon préférentielle avec un acide organique tel que l'acide p-toluènesulfonique, comme décrit ci-après , pour obtenir une 35 quantité importante de BBM-1675D.

9

Les substances BBM-1675C et BBM-1675D peuvent également être préparées par hydrolyse chimique sélective de l'antibiotique BBM-1675A2 comme le montre le Schéma 3. Schéma 3 CH3^^0^7~OCH3 h© CHs°''ΤτλΎ'^0 BBM-1675A2— -^BBM- 1675C + fj (poids 3 (poids

moléculaire .moléculaire J I

1248) 855) · 0CH3

Composé 2 (poids moléculaire 425) (mélange des anomères o< et /¾ )

H©/CH30H

: CH3

* j^Y

BBM-1675D + CH3S-\ Y* OCHg (poids \_/ moléculaire /

695) OH

Composé 3 (poids moléculaire 192) (mélange des anomères c* et fi ) 10

Le composé de départ BBM-1675A2 est préparé selon le processus décrit dans la demande de brevet britannique N° 2 141 425, publiée le 19 Décembre 1984. L'hydrolyse * sélective de BBM-1675A2 est réalisée de façon similaire 5 par étape , avec l'obtention initiale de l'antibiotique BBM-1675.C. et du fragment inactif de formule 2. Le traitement continu sous des conditions d'hydrolyse conduit à la libération d'un mélange des anomères et /3, du sucre thio de formule 3 et l'obtention de l'antibiotique BBM-1675D.

10 Les conditions de réaction utilisées pour l'hydro lyse chimique sélective de BBM-1675A2 sont pratiquement identiques à celles utilisées pour l'hydrolyse de BBM-1675A^ décrite précédemment. D'une façon similaire à l'obtention de BBM-1675D à partir de BBM-1675A^, lorsqu'on souhaite 15 obtenir uniquement l'antibiotique BBM-1675D, l'hydrolyse de BBM-1675A2 est réalisée jusqu'à convertir sensiblement totalement BBM-1675A2 et BBM-1675C en BBM-1675D. D'une façon préférentielle, l'hydrolyse est réalisée dans un acide organique tel que l'acide p-toluènesulfonique.

20 La découverte comme décrit ci-après, que les mêmes

antibiotiques BBM-1675C et BBM-1675D sont produits à partir des deux antibiotiques différents BBM-1675A^ et BBM-1675A2 avec la libération concomitante de deux fragments inactifs de formules 1 et 2, respectivement et du 25 "thio-sucre" de formule 3, fournit un avantage supplémentaire à la présente invention. En conséquence, selon un autre aspect de la présente invention, on a prévu un procédé pour l'hydrolyse sélective d'un mélange de î BBM-1675A1 et BBM-1675A2 pour obtenir BBM-1675C et BBM-1675D

30 comme illustré par le Schéma 4 » Schéma 4

BBM-1675A1 + BBM-1675A2-ψ BBM-1675C-► BBM-1675D

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Cet avantage devient apparent, si l'on considère le fait que les quantités relatives de BBM-1675A^ et BBM-1675Ä2 produites dans le procédé par fermentation sont - sujettes à des variations. L'obtention de BBM-1675C et 5 BBM-1675D est par conséquent indépendante des quantités relatives de BBM-1675À^ et BBM-1675A2 utilisés comme produit de départ dans la présente invention.

Comme décrit ci-après, l'hydrolyse des antibiotiques BBM-1675A^ , BBM-1675A2 et BBM-1675C conduit à la libération 10 d'un fragment de thio-sucre inactif. Ce sucre thio a été isolé afin d'obtenir d'autres informations sur la structure chimique de l'antibiotique BBM-1675C et, par conséquent, des antibiotiques BBM-1675A^ et BBM-1675A2· Le composé de formule 3 a été identifié comme étant un mélange des 15 anomères oc et fi d'un sucre thio présentant la formule illustrée aux Schémas 2 et 3. D'autres caractérisations ont été rendues possibles lorsque les produits de l'alcoolyse, les anomères 0( et fl , sont séparés. Les spectres de résonance magnétique du proton (360 MHz) du composé 3A 20 (anomère ) et du composé 3B (anomère^Q ) sont représentés aux figures 11A et 11B, respectivement. A partir d'une analyse de ces données spectrales, on suppose que les sucres méthyl glycosides de formule 3 présentent la stéréochimie relative la formule 25

OH

cv 30 Actuellement, la stéréochimie absolue, i.e. D ou L, n'a pas encore été déterminée. En conséquence, en se basant sur l'interprétation actuelle des données spectrales, on peut conclure que le sucre thio de formule 3 (moins le groupe CH3 du composé anomère méthoxy qui est incorporé 12 pendant la méthanolyse) est un composant de la structure de l'antibiotique BBM-1675C et de plus, est un composant de la structure des antibiotiques de départ BBM-1675A^ et BBM-1675A2 .

5 Propriétés physico-chimiques de BBM-1675C

Description·: solide amorphe

Spectre d'absorption ultraviolet : Voir figure 1

Spectromètre : Hewlett-Packard 8458

Solvant : méthanol 10 Concentration : 0,0155 g/1 X (nm) Pouvoir absorbant

Hnax—- - 210 21.770 214 9.340 15 313 (épaulement) 4.190

Aucun changement significatif n'est observé avec un acide ou une base. .

Spectre d'absorption infrarouge : Voir figure 3

Instrument : Nicolet 5DX FT-IR

20 Bandesd'absorption principales(KBr, film) : 540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118, 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930, 2970, 3450 cm"1 .

25 Spectre de masse : Voir figure 5

Spectromètre : Finigan 4500 TSQ

Procédé : ionisation par bombarde ment d' atomes accélérés (FAB) 13 M . Ion Abondance - ro/z moléculaire relative glycérol 856 Cm+h]+ 100% glycérol + NaCl 878 j^M+Na]| + 100% dithiothréitol: 5 dithioérythritol 856 £m+HA + 100% ' (3:1) (poids/poids)

Instrument : Kratos MS-50 FAB Haute résolution (m/z) : [M+h3+ = 856,3362 10 Poids moléculaire : poids moléculaire apparent = 855 (basé sur les données spectrales de masse décrites ci-dessus)

Composition élémentaire : OggHg^NgO^Sg (basée sur les données haute résolution précitées)

Spectre de résonance magnétique du proton : Voir figure 7 15 Instrument : WM 360 Bruker

Solvant : CDClg RMN. 1H 360 MHz S (ppm) : 6,54 (1H, dd, J = 7,7, 7,0); 6,21 (1H, brs) ; 5,87 (1H, d, J = 9,6); 5,78 (1H, dd, J = 9,6, 1,5); 5,66 (1H, brd, 20 J = 2,9) ; 4,94 (1H, dd, J = 10,3, 1,8); 4,61 (1H, d, J=7,7); 4,25 (1H, s); 4,09 (1H, q, J=2,6); 3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92-3,53 (10H), 3,45 (1H, dt, J=10,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (1H, m); 2,69 (1H, dt, J = 9,9, 5,2); 2,49 (1H, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m); 25 2,13 (1H, m); 2,09 (3H, s); 1,50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J = 5,9) ; 1,32 (3H, d, J=6,3); 1,08 (6H).

Spectre de résonance magnétique du carbone 13 : Voir figure 9

Instrument : WM 360 Bruker 30 Solvant : CDClg RMN 13C 90,6 MHz Γ (ppm) : 13,7, 17,5, 19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 35,2, 39,5, 14 47.7, 52,7, 55,8, 56,1, 57,7, 62,4, 64,7, 67,4, 69,3, 69.8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7, 79,7, 83,2, 88,4, 97,3, 99,7, 123,4, 124,6, 130,1, 193,1.

Propriétés physico-chimiques de BBM-1675D 5 Description : solide amorphe ~ Spectre d'absorption ultraviolet : Voir figure 2

Spectromètre : Hewlett-Packard 8458

Solvant : méthanol

Concentration : 0,01 g/1 10 (nm) aptitudes d'absorption ΓΠ α X 1 - -—— — — 214 27.000 274 12.800 325 5.400

Aucun changement significatif n'est observé avec 15 un acide ou une base.

Spectre d'absorption infrarouge : Voir figure 4

Instrument : Nicolet 5DX FT-IR

Bandesd'absorption principales(KBr, film): 735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195, 20 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 1720, 1735, 2880, 2930, 2960, 3400 cm-1 .

Spectre de masse : Voir figure 6

Instrument : Finigan 4500 TSQ

Procédé : ionisation par bombarde- 25 ment d'atomes accélérés (FAB)

Matrice : thioglycérol • Ion moléculaire (m/z) : [m+h]+ = 696

Abondance relative : 100% 30 Instrument : Kratos MS-50 FAB haute résolution (m/z) : [m+h}+ = 696,2794

Poids moléculaire : poids moléculaire apparent = 695 (basé sur les données spectrales de masse précitées) 15

Composition élémentaire : ^29H49^331232 (basée sur les données de haute résolution précitées)

La corrélation des abondances relatives Cm+h] et £(M+H)+2 3+ vis-à-vis des valeurs calculées 5 confirme la composition élémentaire dérivée - des mesures FAB-haute résolution.

Spectre de résonance magnétique du proton: Voir figure 8

Instrument : WM 360 Bruker

Solvant : CDCl« + 10% CD„0D

10 JJ

RMN h 360 MHz S (ppm) : 6,43 (1H, dd, J=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5,48 (1H, 6 brs) ; 4,48 (1H, d, J=8,1); 4,02 (1H, d, J=2,0); 3,95-3,80 ( fond du solvant ); 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm); 15 3,35 (1H, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23-2,12 (2H, m); 1,42 (1H, brdt); 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6); 0,87 (3H, d, J=5,9).

Spectre de résonance magnétique

20 du carbone 13 : Voir figures 10A et 10B

Instrument : WM 360 Bruker

Solvant : CDClg + 10% CDgOD

RMN 13C 90,6 MHz $ (ppm): 17,5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8, 25 62,1, 67,8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4, 83.3, 88,2, 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8, 134.3, 148,7, 192,8.

" Propriétés biologiques des substances BBM-1675 30 L'activité antimicrobienne des substances BBM-1675 a été déterminée pour une variété de microorganismes gram-positifs et gram-négatifs. Le Tableau 1 ci-dessous fournit les données sous forme des résultats d'un processus de criblage antimicrobien comprenant le composé parent 35 BBM-1675A! et les substances BBM-1675C et BBM-1675D de 16 la présente invention. Dans le processus de criblage, chaque composé testé,présentant une concentration uniforme de 10 jjg/ml d'une solution imprégnée sur une bande de papier,a été placé dans un milieu de culture, et la mesure 5 de l'activité antibiotique est donnée par la zone résultante d'inhibition de la bande de papier. Comme montré dans le Tableau 1, les substances BBM-1675C et BBM-1675D présentent une large gamme d'activité antimicrobienne et sont au moins aussi efficaces que le composé BBM-1675A^ ; et en 10 particulier, les substances BBM-1675C et BBM-1675D sont plus efficaces comme inhibiteurs d'organismes gram-négatifs.

17 TABLEAU 1 ACTIVITE ANTIMICRQBIENNE DES SUBSTANCES BBM-1675

Zone d'inhibition, mm

Microorganisme testé BBM-1675A^ BBM-1675C BBM-1675D

Escherichia coli AS 19 22 52 51

Escherichia coli K 12 13 36 35

Escherichia coli P 1373 12 34 33

Escherichia coli R Azasérine 14 35 34

Escherichia coli R Nétropsine 11 32 32

Escherichia coli R Mitomycine 12 35 34

Escherichia coli R Bléomycine 16 38 36

Escherichia coli R Daunomycine 19 45 44

Escherichia coli R Néomycine 24 53 52

Escherichia coli R Sibiromycine 14 32 30

Escherichia coli R Hédamycine 14 30 25

Escherichia coli R Aclacinomycine 15 41 40

Bacillus subtilis ATCC 6633 34 43 41

Klebsiella pneumoniae 17 35 35

Staphylococcus 209 P 32 47 44

Staphylococcus R Actinoleucine 33 35 33

Staphylococcus R Streptonigrin 37 50 48

Staphylococcus faecalis P1377 30 39 38

Streptococcus aureus Smith P 36 47 45

Staphylococcus aureus Smith R 40 55 53

Actinomycine D

Staphylococcus aureus Smith R 17 32 31

Acide auréolique

Acinetobacter 16 33 32

Micrococcus luteus 35 57 55

Saccharomyces cerevisiae petite 22 42 43 R = résistant à l'antibiotique concerné, 18

Activité contre la leucémie P-388 Les Tableaux II et III contiennent les résultats d'essaisen laboratoire sur des souris CDF1 implantées de façon -* g intrapéritonéale d'un inoculum de tumeur de 10 cellules 5 d'ascites de leucémie P-388, et traités avec des doses variées de BBM-1675A1 , C ou D. Les substances ont été administrées par injection intrapéritonéale. Des groupes de six souris ont été utilisés pour chaque quantité dosée, et ont été traités par une dose unique de la substance le jour 10 après inoculation. Un groupe de dix souris étalons traitées par une solution saline a été inclus dans chaque série d'expériences. Le groupe traité par BBM-1675A^, dans le Tableau III, a été utilisé pour une comparaison directe.

Un protocole sur 30 jours a été employé et le temps moyen de 15 survie en jours a été déterminé pour chaque groupe de souris ainsi que le nombre de survivants à la fin de périodes de 5 jours. Les souris ont été pesées avant traitement et - également un jour sur quatre. Les valeurs de variation de poids ont été utilisées comme mesure de la toxicité du 20 médicament. Des souris pesant chacune 20 grammes ont été utilisées, et une perte en poids supérieure à environ 2 grammes n'était pas considérée comme excessive. Les animaux étalons traités sont morts durant les neuf premiers jours.

Les résultats ont été déterminés relativement au pourcentage 25 T/C qui est le rapport du temps moyen de survie du groupe traité au temps moyen de survie du groupe étalon traité par le véhicule rapporté à 100 . Un pourcentage T/C égal ou supérieur à 125 indique qu'un effet antitumoral significatif a été obtenu. Les résultats du criblage dans le 30 Tableau II montrent le niveau initial non attendu d'activité antitumorale de la substance BBM-1675C. Dans le Tableau III, on a reporté les résultats d'une comparaison directe de BBM-1675A1 (espéramicine A^) et des substances BBM-1675C et BBM-1675D. Les données suggèrent que BBM-1675C est à 35 peu près comparable à BBM-1G75A^ en ce qui concerne son 19 efficacité potentielle et antitumorale, tandis que BBM-1675D est seulement légèrement moins efficace.

De plus, conformément à la présente invention, les mêmes substances BBM-1675C et BBM-1675D peuvent également 5 être obtenues à partir du composant BBM-1675A2 (espérami-cine A2). En comparant les données reportées ici pour BBM-1675C et BBM-1675D et les données reportées dans la demande de brevet britannique publiée N° 2 141 425 pour le composant BBM-1675A2 , on a découvert de façon surprenante 10 que les substances BBM-1675C et BBM-1675D sont plus efficaces en tant qu'agents antitumoraux que le composant parent BBM-1675A2 dont il dérive.

TABLEAU II

EFFET DE BBM-1675C SUR LA LEUCEMIE P-388 15 ( Traitement journalier)

Effet AWC Survivants

Dose, IP MST MST 9m

Composé mg/kg/inj, jours % T/C jour 4 jour 5 20 BBM-1675C 3,2 TOX TOX - 0/6 0,8 TOX TOX - 0/6 0,2 TOX TOX - 0/6 0,05 TOX TOX -1,8 1/6 0,0125 11,0 122 -2,5 5/6 25 0,003125 13,5 150 -2,5 6/6 Véhicule - 9,0 100 0,4 10/10 6

Inoculum de tumeur : 10 cellules d'ascites implantées 30 de façon intrapéritonéale (i.p.) Hôte : souris mâlesCDF1

Evaluation : MST = temps moyen de survie

Effet : T/C (%) =(MST traité/MST échantillon) x 100

Critère : T/C % ^ 125 est considéré comme une activité 35 antitumorale significative AWC: variation moyenne de poids (traité-échantillon) en grammes (au 4è jour)

TABLEAU III

20 EFFET DES SUBSTANCES BBM-1675 SUR LA LEUCEMIE P-388

Tnwonfaî Effet AWC SUT- inventaire du Dose, IP MST MST gro vivants

Composé traitement mg/kg/inj. jours % T/C Jour 4 Jour 5 BBM-1675A1 d. 1 0,0512 TOX TOX - 0/6 0,0256 TOX TOX - 0/6 0,0128 TOX TOX -1,8 3/6 0,0064 15,5 172 -0,3 6/6 0,0032 15,0 167 -0,6 6/6 0,0016 15,5 172 0,6 6/6 0,0008 12,5 139 0,3 6/6 0,0004 12,0 133 1,4 6/6 0,0002 11,0 122 0,8 6/6 0,0001 11,5 128 1,4 6/6 BBM-1675C d. 1 0,0256 TOX TOX - 0/6 0,0128 TOX TOX -0,8 3/6 0,0064 11,5 128 -0,3 6/6 0,0032 14,5 161 -0,1 6/6 0,0016 10,5 117 0,0 6/6 0,0008 12,0 133 0,3 6/6 0,0004 11,5 128 0,8 6/6 0,0002 11,0 122 1,4 6/6 0,0001 11,0 122 0,8 6/6 0,00005 10,5 117 1,3 6/6 TABLEAU III (suite) 21

Inventaire Effet AWC Sur- du Dose, IP MST MST gm vivants

Composé traitement mg/kg/inj. jours % T/C Jour 4 Jour 5 BBM-1675D d. 1 0,0256 9,0 100 0,1 6/6 v 0,0128 11,5 128 0,3 6/6 0,0064 12,5 139 0,3 6/6 0,0032 12,0 133 0,1 6/6 0,0016 11,5 128 0,8 6/6 0,0008 10,0 111 0,2 6/6 0,0004 10,0 111 0,5 6/6 0,0002 9,5 106 1,7 6/6 0,0001 9,5 106 1,7 6/6 0,00005 9,0 100 2,0 6/6 BBM-1675C d. 1 5 0,0032 16,0 178 -1,3 6/6 0,0016 13,5 150 -1,0 6/6 0,0008 13,5 150 -0,3 6/6 0,0004 12,0 133 -0,4 6/6 0,0002 12,0 133 -0,4 6/6 0,0001 11,0 122 -0,4 5/6 0,00005 11,0 122 0,9 6/6 0,000025 8,5 94 2,2 6/6 0,0000125 8,0 89 2,4 6/6 0,00000625 8,0 89 2,4 6/6 Véhicule - 9,0 100 2,4 10/10 g

Inoculum de tumeur : 10 cellules d'ascites implantées de façon péritonéale (i.p.) Hôte : souris femelles CDF^

Evaluation : MST = temps moyen de survie

Effet : T/C (%) =(MST traité/MST échantillon) x 100

Critère : T/C % 125 est considéré comme une activité antitumorale significative AWC : variation moyenne de poids (traité-échantillon) en grammes (au 4ème jour) « s 22 *

Activité contre le mélanome B16 Le Tableau IV contient les résultats d'essais antitumoraux utilisant la croissance du mélanome B16 chez la souris. Des souris BDF^ ont été utilisées et inoculées 5 de façon sous-cutanée avec un implant de tumeur. Un protocole sur 60 jours a été utilisé. Des groupes de dix souris ont été utilisés pour chaque quantité de dosage testée, et le temps moyen de survie pour chaque groupe a été déterminé . Des animaux de crontrôle inoculés de la même 10 façon que les animaux testés ont été traités avec un véhicule d'injection sans médicament, et présentaient un taux moyen de survie de 22,5 jours. Pour chaque niveau de dosage, les animaux testés ont été traités avec le composé testé les jours 1, 5 et 9 par injection intrapéritonéale. Un pour-15 centage T/C égal ou supérieur à 125 indique qu'un effet antitumoral significatif est obtenu. Les résultats du Tableau IV montrent par une comparaison directe que BBM-1675C était également efficace dans le traitement des souris portant un mélanome B16 et est pratiquement comparable 20 à BBM-1675Ar 23

TABLEAU IV

EFFET DES SUBSTANCES BBM-1675 SUR MELANOME B16 (Traitements réalisés les jours 1, 5 et 9)

Effet AWC

Dose, IP MST MST gm Survivants

Composé mg/kg/inj. jours % T/C Jour 12 Jour 10 BBM-1675A1 0,0032 37,5 167 0,3 10/10 0,0016 37,5 167 0,3 10/10 0,0008 38,5 171 1,4 10/10 0,0004 37,0 164 1,8 10/10 0,0002 34,5 153 2,0 10/10 0,0001 32,0 142 1,9 10/10 BBM-1675C 0,0008 31,5 140 0,6 10/10 0,0004 37,0 164 1,2 10/10 0,0002 31,0 138 0,6 10/10 0,0001 31,5 140 1,0 10/10 0,00005 27,5 122 0,8 10/10 0,000025 25,0 111 0,5 10/10 Véhicule - 22,5 100 0,3 10/10

Inoculum de tumeur : 0,5 ml d'un brei à 10%, IP

Hôte: souris femelles BDF^

Evaluation : MST = temps moyen de survie T Effet : T/C (%) = (MST traité/MST échantillon) x 100

Critère: T/C % ?/- 125 est considéré comme une activité antitumorale significative AWC : variation moyenne de poids (traité-échantillon) en grammes (au 12ème jour).

. \ 24

Comme l'indiquent les données antimicrobiennes et tumorales chez la souris précitées, BBM-1675C et BBM-1675D sont ainsi utiles comme antibiotiques dans le traitement v thérapeutique des mammifères et d’autres animaux souffrant 5 d'infections et également comme agents antitumoraux pour inhiber de façon thérapeutique la croissance des tumeurs chez les mammifères.

Aussi, la présente invention a également pour objet des compositions pharmaceutiques contenant une quantité 10 efficace antimicrobienne ou antitumorale de BBM-1675C ou BBM-1675D et un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable inerte. De telles compositions peuvent également contenir d'autres agents antimicrobiens ou antitumoraux et peuvent être réalisés sous toute forme pharmaceutique 15 appropriée selon la voie choisie d'administration. Des exemples de telles compositions comprennent des compositions solides pour administration orale telles que cachets, capsules, pillules, poudres et granules, des compositions liquides pour administration orale telles que des solutions 20 ou suspensions, sirops ou élixirs et des préparations pour administration parentérale telles que solutions aqueuses ou non aqueuses stériles, suspensions ou émulsions. Ils peuvent être également réalisés sous forme de compositions solides stériles qui peuvent être dissoutes dans de l'eau 25 stérile, une solution saline physiologique ou d'autres milieux injectables stériles immédiatement avant utilisation.

Pour une utilisation comme agent antimicrobien, r BBM-1675C ou BBM-1675D, ou une composition pharmaceutique 30 les contenant est administré de façon que la concentration de la substance active soit supérieure à la concentration inhibitrice minimum pour l'organisme particulier à traiter. Pour l'utilisation comme agent antitumoral, les doses et régimes optimum de BBM-1675C ou BBM-1675D pour un hôte 35 donné peuvent être facilement établis pour ceux qui sont « 25 compétents dans le domaine. On comprendra, bien entendu, que la dose réelle de BBM-16755C ou BBM-1675D à utiliser variera selon la composition particulière formulée, le mode d'application et les sites particuliers , ainsi que l'hôte 5 et la maladie à traiter. De nombreux facteurs qui modifient l'action du médicament devront être pris en considération, parmi lesquels l'âge, le poids, le sexe, le régime, le temps d'administration, le mode d'administration, le taux d'excrétion, l'état du patient, la combinaison de différents 10 médicaments, la sensibilité aux réactions et la gravité de la maladie. L'administration peut être réalisée de façon continue ou de façon périodique dans la plage maximum tolérée. Les taux d'application optimum pour un jeu de conditions donné peuvent être déterminés par ceux qui sont 15 compétents dans la matière, en utilisant des tests de détermination des doses traditionnels à la lumière des lignes directrices données ici.

Les exemples suivants sont donnés pour illustrer la présente invention, sans en limiter la portée.

20 Préparation chimique et isolation de BBM-1675C

et BBM-1675D EXEMPLE 1

Un échantillon de BBM-1675A^ (50 mg) a été dissous dans 2,5 ml de méthanol et traité avec 2,5 ml d'une solution 25 0,1 molaire de chlorure d'hydrogène dans du méthanol. La réaction a été réalisée à une température d'environ 50°C, et la consommation du matériau de départ (approximativement 30 minutes) a été suivie toutes les 5 à 10 minutes par chromatographie sur couche mince (TLC) sur des plaques de

Ml 30 gel de silice (Analtech, 250 microns, GF) avec un mélange de toluène : acétone (3:2, volume/volume) comme solvant d'élution. Lorsque le matériau de départ a été consommé, le mélange réactionnel a été neutralisé avec une solution saturée de NaHCOg dans du méthanol , puis évaporé sous pression 35 réduite pour conduire à un résidu sec contenant les fragments 26 t

. H

biologiquement actifs. La substance BBM-1675C a été isolée du résidu par chromatographie flash sur colonne , sur une colonne de 2 cm (diamètre intérieur) x 10 cm emplie de gel ,· de silice Woelm (taille de particule 32-63 microns). La 5 colonne a été éluée par un mélange toluène : acétone (3:2, volume/volume) en récupérant des fractions de 3 ml .

Chaque fraction a été analysée par chromatographie sur couche mince [_gel de silice avec toluène : acétone (3:2, volume/volume) comme éluant^ , et les taches ont été 10 visualisées avec une source de lumière UV de 154 nm et une vaporisation de sulfate cérique (1% en sulfate cérique et 2,5% d'acide molybolique dans 10% d'acide sulfurique).

Les fractions 6-12 (valeur Rf pour BBM-1675C = 0,28) ont été mises en commun et évaporées jusqu'à siccité pour 15 donner 12 mg (35%) de BBM-1675C sensiblement pur.

Les propriétés physico-chimiques de BBM-1675C ont été données précédemment et les spectres UV, infrarouge, de masse, RMN du proton et RMN du carbone 13 du composé apparaissent aux figures 1, 3, 5, 7 et 9, respectivement.

20 EXEMPLE 2

Lorsque le temps de réaction du processus de l'Exemple 1 est étendu, la quantité de BBM-1675C décroît, etdeuxnouveaux produits dénommés composé 3 (R^= 0,65) et BBM-1675D (R^ identique à la ligne de base) £chromato-25 graphie sur couche mince : silice, toluène-acétone (3:2, volume/volume) apparaissent et deviennent d'autant plus importants que le temps s'écoule.

Le composé BBM-1675D qui accompagne la production de *. BBM-1675C a été isolé par la colonne de chromatographie 30 décrite à l'Exemple 1 par élution avec un mélange chloroforme :méthanol (5:1, volume/volume). Les fractions appropriées ont mises en commun et évaporées jusqu'à siccité pour conduire à 18 mg de BBM-1675D substantiellement pur à partir de la réaction décrite à l'Exemple 1.

27

La substance BBM-1675D présente une tache majeure à = 0,37 dans la chromatographie sur couche mince en phase inverse (Whatman MKC^gF, 200 microns) en utilisant 30% d'eau dans du méthanol comme éluant et R^ = 0,22 par 5 chromatographie sur couche mince sur gel de silice en phase normale en utilisant un mélange chloroforme :méthanol (5:0, volume/volume) comme éluant.

EXEMPLE 3

On peut obtenir une amélioration sensible du rende-10 ment en BBM-1675D en utilisant l'acide p-toluènesulfonique au lieu du chlorure d'hydrogène dans l'hydrolyse chimique de BBM-1675A2 ou BBM-1675A^ , comme le montrent les processus des Exemples 3 et 5, respectivement.

Un échantillon de BBM-1675A2 (15,2 mg) a été 15 hydrolysé avec une solution 0,03 molaire d'acide p-toluène-sulfonique dans du méthanol (1 ml) à une température d'environ 63°C pendant environ une heure. Le mélange réactionnel a été ensuite évaporé jusqu'à siccité sous pression réduite à 30°C. La substance BBM-1675D a été isolée du 20 résidu sec par chromatographie flash sur colonne, sur une colonne emplie de gel de silice Woelm (taille de particule 32-63 microns). La colonne a été éluée avec un mélange chloroforme:méthanol (5:0,5, volume/volume) , et les fractions récupérées ont été analysées par chromatographie 25 en couche mince \_gel de silice avec chloroforme : méthanol (5:0,5, volume/volume) comme éluant ^ . Les conditions de chromatographie utilisées ont permis la séparation du mélange des deux composés inactifs 2 et 3 (7 mg) de la substance biologiquement active BBM-1675D présentant une 30 valeur R^ de 0,22. Les fractions appropriées ont été mises en commun et évaporées jusqu'à siccité pour obtenir 8 mg de BBM-1675D sensiblement pur en un rendement pratiquement quantitatif.

Les propriétés physico-chimiques de BBM-1675D ont 35 été données et les spectres ultraviolet, infrarouge, de masse, * * h 28 RMN ydu proton et RMN du carbone 13 de ce composé apparaissent aux figures 2, 4, 6, 8 et 10A et 10B, respectivement.

EXEMPLE 4 ' Un échantillon de BBM-1675A2 (40 mg) a été traité 5 avec 5 ml d'une solution 0,5 molaire de chlorure d'hydrogène dans du méthanol à environ 50°C pendant environ 2 heures selon le processus général et le procédé d'isolation décrits dans l'Exemple 1. Après neutralisation par NaHCOg et évaporation jusqu'à siccité, la substance BBM-1675C a 10 été isolée du résidu par chromatographie sur colonne, sur une colonne emplie de gel de silice Woelm (taille de particule 32-63 microns) en utilisant un mélange toluène: acétone (3:2, volume/volume) comme éluant. Les fractions appropriées ont combinées et évaporées jusqu'à siccité 15 pour donner 8,4 mg de BBM-1675C sensiblement pur qui est un produit identique à celui isolé dans l'Exemple 1.

La colonne chromatographique précitée a été ensuite éluée avec un mélange chloroforme :méthanol (5:0,25, volume/ volume) et les fractions collectées ont été mises en commun 20 et évaporées jusqu'à siccité pour conduire à BBM-1675D.

La substance BBM-1675D a été ensuite purifiée au moyen d'une colonne de chromatographie flash avec du gel de silice en utilisant un mélange chloroforme :méthanol (5:0,5, volume/volume) comme éluant. Les fractions appro-25 priées ont été combinées et évaporées jusqu'à siccité pour donner 6,3 mg de BBM-1675D pratiquement pur qui est un ' produit identique à celui isolé dans l'Exemple 3.

EXEMPLE 5

Un échantillon de BBM-1675A^ (49,3 mg) a été 30 hydrolysé avec une solution 0,037 molaire d'acide p- toluènesulfonique dans du méthanol (1,5 ml) à une température d'environ 60°C pendant environ 1,5 heure. Le mélange de réaction a été évaporé jusqu'à siccité sous pression réduite à environ 30°C pour donner un résidu contenant du 35 BBM-1675D et les composés inactifs 1 et 3. La substance

«I

V \ 29 biologiquement active BBM-1675D a été isolée du résidu par chromatographie flash sur colonne , sur une colonne emplie de gel de silice Woelm (taille de particule 32-63 microns) utilisant un mélange chloroforme:méthanol (5:0,25, 5 volume/volume) comme éluant. Les fractions appropriées ont été combinées et évaporées jusqu'à siccité pour donner 27 mg de BBM-1675D pratiquement pur qui est un produit identique à celui isolé dans l'Exemple 3.

EXEMPLE 6 10 Un échantillon de BBM-1675C (5,1 mg) a été hydrolysé avec une solution 0,5 molaire de chlorure d'hydrogène dans du méthanol (1 ml) à environ 40 à 50°C pendant une nuit.

Après neutralisation par NaHCOg et évaporation jusqu'à siccité, la substance biologiquement active BBM-1675D a 15 été isolée du résidu par chromatographie flash sur colonne, sur une colonne emplie de gel de silice Woelm (taille de particule 32-63 microns) en utilisant un mélange chloroforme :méthanol (5:0,25, volume/volume) comme éluant.

Les fractions appropriées ont conduit au BBM-1675D prati- 20- quement pur qui est un produit identique à celui isolé dans l'Exemple 3.

EXEMPLE 7

Lorsque le processus général des Exemples 1 et 2 est répété, à l'exception du fait que le matériau de départ 25 BBM-1675A^ est remplacé par une quantité équimolaire d'un mélange contenant BBM-1675A1 et BBM-1675A2, on produit les substances BBM-1675C et BBM-1675D.

EXEMPLE 8 r Lorsque le processus général de l'Exemple 5 est 30 répété en utilisant une quantité équimolaire d'un mélange contenant BBM-1675A^ et BBM-1675A2 comme matériau de départ à la place de BBM-1675A^ , on produit ainsi la substance BBM-1675D.

On notera que BBM-1675 C est soluble dans le méthanol,1'éthanol, 35 l'acétate d'éthyle, l'acétone, le tétrahydofuranne et le chloroforme.

BBM 1675 0 est soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone et le tétra-hydrofuranne et faiblement soluble dans le chloroforme.

Claims

1.- Antibiotique et antitumoral constitué par une substance sensiblement pure, caractérisé en ce qu'il s'agit d'une substance dénommée BBM-1675C qui : 5 (a) est un solide amorphe; (b) est soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétate d'éthyle, l'acétone, le tétrahydrofuranne et le chloroforme; (c) présente par chromatographie sur couche mince sur gel de silice une valeur de 0,28 avec pour solvant le 10 mélange toluène:acétone (3:2, volume/volume); (d) présente un poids moléculaire apparent de 855 déterminé par spectroscopie de masse par bombardement d'atomes accélérés en haute résolution ; (e) présente un spectre d'absorption ultraviolet dans 15 une solution de méthanol tel que représenté à la figure 1, et présentant les maxima d'absorption et les aptitudes d'absorption à 210 nm (a = 21.770); 274 nm (a = 9.340) et 313 nm (épaulement) (a = 4.190) sans changement significatif par addition d'acide ou de base); 20 (f) présente un spectre d'absorption infrarouge (KBr, film) tel que représenté à la figure 3 et présentant les pics d'absorption principaux à 540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118, . 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 25 1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2030, 2970, et 3450 cm ; (g) présente un spectre de masse à faible résolution tel que représenté à la figure 5, présentant un CM+HÜ+ de 856; 30 (h) présente un spectre de résonance magnétique du proton à 360 MHz dans CDCl^ tel que représenté à la figure 7 * 31 et présentant des signaux à 6,54 (1H, dd, J=7,7, 7,0); 6,21 (1H, brs); 5,87 (1H, d, J=9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6, 1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J=10,3, 1,8); 4,61 (1H, d, J=7,7); 4,25 (1H, s); 4,09 (1H, q, J=2,6); 5 3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92-3,53 (10H); 3,45 (1H, dt, J=10,3, " 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (1H, m); 2,69 (1H, dt, J=9,9, 5,2); 2,49 (1H, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m); 2,13 (1H, m); 2,09 (3H, s); 1,50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); et 1,08 (6H) parties par 10 million à partir du tétraméthylsilane; (i) présente un spectre de résonance magnétique du carbone 13 à 90,6 MHz dans CDCl^ tel que représenté à la figure 9 et présentant des signaux à 13,7, 17,5, 19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 35,2, 39,5, 47,7, 52,7, 55,8, 56,1, 15 57,7, 62,4, 64,7, 67,4, 69,3, 69,8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7, 79,7, 83,2, 88,4; 97,3, 99,7, 123,4, 124,6, 130,1 et 193,1 parties par million à partir du tétraméthylsilane.

2.- Antibiotique et antitumoral sous forme pratiquement pure, caractérisé en ce qu'il s'agit de la substance 20 BBM-1675D qui : (a) est un solide amorphe; (b) est soluble dans le méthanol, l'éthanol, l'acétone et le tétrahydrofuranne, et faiblement soluble dans le chloroforme ; 25 (c) présente par chromatographie sur couche mince sur gel de silice une valeur R^ de 0,22 avec comme solvant un „ mélange chloroforme :méthanol (5:0,5, volume/volume) et présente en chromatographie sur couche mince sur gel de silice en phase inverse une valeur Rf de 0,37 avec comme 30 solvant un mélange méthanolreau (70:30, volume/volume); (d) présente un poids moléculaire apparent de 695 déterminé par spectroscopie de masse par bombardement d'atomes accélérés en haute résolution ; (e) présente un spectre d'absorption ultraviolet dans 35 une solution de méthanol tel que représenté à la figure 2, , s 32 N et présentant les maxima d'absorption en ultraviolet et pouvoirs absorbants (a) suivantes à 214 nm (a = 27.000), à 274 nm (a = 12.800), et à 325 nm (â = 5.400) sans changement significatif par addition d'acide ou base; 5 (f) présente un spectre d'absorption infrarouge (KBr, film) tel que représenté à la figure 4 et montrant des pics d'absorption principaux à 735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 10 1720, 1735, 2880, 2930, 2960, et 3400 cm"1; (g) présente un spectre de masse en basse résolution tel que représenté à la figure 6 et présentant un M+H + de 696 ; (h) présente un spectre de résonance magnétique du proton 15 à 360 MHz dans CDClg + 10% CD^OD tel que représenté à la la figure 8 et présentant les signaux à 6,43 (1H, dd, J=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5,48 (1H, 6brs); 4,48 (1H, d, ,\ J=8,1) ; 4,02 (1H, d, J = 2,0); 3,95-3,80 (JÈèsë du solvant) ; 20 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm); 3,35 (1H, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23-2,12 (2H, m); 1,42, brdt) ; 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6) et 0,87 (3H, d, J=5,9) parties par million à partir du tétraméthylsilane; 25 (i) présente un spectre de résonance magnétique du carbone 13 à 90,6 MHz dans CDCl^ + 10% CD^OD tel que représenté aux figures 10A et 10B et présentant des signaux à 17,5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8, 62,1, 30 67,8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4, 83,3, 88,2 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8, 134,3, 148,7 et 192,8 parties par million à partir du tétraméthylsilane.

3.- Procédé d'obtention de l’antibiotique antitumoral BBM-1675C, défini à la revendication 1, caractérisé en ce 35 qu'il comprend l'hydrolyse de BBM-1675A^ ou BBM-1675A2 par c 33 un acide minéral ou organique jusqu'à formation d'une quantité de BBM-1675C, puis la récupération de BBM-1675C dans le milieu réactionnel.

4.- Procédé d'obtention de l’antibiotique 5 antitumoral BBM-1675D selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse de la substance BBM-1675A^ ou BBM-1675A2 avec un acide minéral ou organique jusqu'à obtenir une quantité substantielle de BBM-1675D et ensuite à récupérer BBM-1675D du milieu réactionnel. 10 5,- Procédé d'obtention de l'antibiotique anti- tumoral BBM-1675D selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse de la substance BBM-1675C selon la revendication 1 avec un acide minéral ou organique jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle 15 de BBM-1675D et la récupération de BBM-1675D du milieu réactionnel.

6. Procédé d'obtention de l'antibiotique antitumoral BBM-1675C, tel que défini à la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse d'un mélange 20 de BBM-1675A^ et BBM-1675A2 avec un acide minéral ou organique jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle de BBM-1675C et la récupération de BBM-1675C du milieu réactionnel.

7. Procédé d'obtention de l'antibiotique anti-25 tumoral BBM-1675D tel que défini à la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse d'un mélange " de BBM-1675A^ et BBM-1675A2 avec un acide organique ou minéral jusqu'à l'obtention d'une quantité substantielle de BBM-1675D, puis la récupération de BBM-1675D du milieu 30 réactionnel.

8. Composition pharmaceutique antimicrobienne, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de BBM-1675C tel que défini à la revendication 1 avec un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable. *“ 34

9.- Composition pharmaceutique entimicrobienne, caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de BBM-1675D tel que défini à la revendication 2 avec un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.

10. Composition pharmaceutique antitumorale, " caractérisée en ce qu'elle comprend une quantité efficace de BBM-1675C ou BBM-1675D avec un diluant ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.