FI83422C - Foerfarande foer framstaellning av tumoerbekaempande antibiotika bbm-1675c och bbm-1675d. - Google Patents

Description

1 83422

Menetelmä kasvaimia torjuvien antibioottien BBM-1675C ja ja BBM-1675D valmistamiseksi Tämä keksintö koskee kasvaimia torjuvia uusia antibioottisia aineita ja niiden valmistusta ja eristämistä.

5 Esillä olevan keksinnön mukaiset, kasvaimia torjuvat yhdisteet eivät vielä ole identifioituja rakenteen osalta. Niiden ainutlaatuisten fysikaalisten, kemiallisten ja biologisten ominaisuuksien vuoksi hakija kuitenkin uskoo, että BBM-1675 C ja BBM-1675D-antibiootit ovat uusia aineita.

10 GB-patenttihakemus nro 2 141 425, julkaistu 19. jou lukuuta, 1984, esittää, että Actinomadura verrucosospora -kannan H964-92 (ATCC 39334) tai Actinomadura verrucosospora -kannan A1327Y (ATCC 39638) käyminen tuottaa kasvaimia torjuvan uuden antibioottisen kompleksin, josta käytetään ni-15 mitystä BBM-1675. Tässä esitetyn BBM-1675-kompleksin kahdesta pääasiallisesta bioaktiivisesta komponentista käytettiin nimityksiä BBM-1675A^ ja BBM-1675A2· BMM-1675A.J- ja BBM-1675A2-antibioottien, jotka myöskin tunnetaan vastaavasti nimityksillä esperamisiini A^ ja esperamisiini A2, 20 rakenteita ei vielä ole selvitetty, mutta molemmat kompo-. . nentit osoittavat oivallista, mikrobeja tappavaa ja kasvai mia torjuvaa aktiviteettia.

US-patentti nro 4 530 835, joka on julkaistu 23. heinäkuuta, 1985 ja myönnetty Bunge et ai., esittää, että 25 ei-identifioidun Actinomycete isolaatin WP-444 (ATCC

39363) käyminen tuottaa antibiootteja, joista on käytetty nimityksiä CL-1577A ja CL-1577B. CL-1577-antibioottien rakenteita ei ole vielä selvitetty, mutta antibiooteille saadut karakterisoivat ominaisuudet osoittavat, että CL-1577A 30 ja CL-1577B ovat rakenteeltaan samanlaisia kuin BBM-1675-antibiootit ja erityisesti BBM-1675A^ ja -A2, jotka on mai-. . nittu edellä esitetyssä GB-patenttihakemuksessa nro 2 141 425.

R.H. Bunge et ai. ovat esittäneet aikakauslehdessä 35 j. Antibiotics, 37 (12), 1566-1571 (1984), että Actinomadura sp. (ATCC 39363):n käyminen tuottaa bioaktiivista kompleksia 2 83422 josta eristettiin kaksi pääkomponenttia, PD 114 759 ja PD 115 028. J.H. Wilton et ai. esittivät aikakauslehdessä J. Chem. Soc. Chem. Commun., 919-920 (1985) antibioottien PD 114 759 ja PD 115 028 rakenteen osittaisen selvityksen.

5 PD 114 759- ja PD 115 028 -antibioottien valmistus, eristäminen ja karakterisointi näyttävät olevan identtisiä vastaavasti edellä mainittujen CL-1577A- ja CL-1577B-anti-bioottien kanssa.

EP-patenttihakemus nro 95 154, julkaistu 30. marras-10 kuuta 1983, esittää, että Actinomadura pulveraceus sp. nov. nro 6049 (ATCC 39100) -lajin käyminen tuottaa kasvaimia torjuvia antibiootteja, joista on käytetty nimityksiä WS 6049-A ja WS 6049-B. WS 6049 -antibioottien rakenteita ei ole vielä selvitetty, mutta antibiooteille saadut karakte-15 risoivat ominaisuudet osoittavat, että WS 6049-A ja WS 6049-B ovat rakenteeltaan läheisiä GB-patenttihakemuksen nro 2 141 425 BBM-1675-antibiooteille ja US-patentin nro 4 530 835 CL-1577-antibiooteille. Spektritiedot osoittavat kuitenkin, ettei WS 6049-A eikä WS 6049-B ole identtinen 20 minkään BBM-1675-komponentin kanssa. EP-patenttihakemuk-: · sessa nro 95 154 selostettu, tuottava organismi voidaan sitä paitsi selvästi erottaa GB-patenttihakemuksessa nro 2 141 425 käytetystä Actinomadura verrucosospora1sta sen ilmahuovaston värin puolesta ISP-väliaineilla nro 2, 3, ja 25 4, sen positiivisen, maidon peptonisoimisen puolesta ja sen, D-fruktoosin, D-mannitolin, trehaloosin ja selluloosan positiivisen hyväksikäytön puolesta.

Esillä olevan keksinnön avulla saadaan kasvaimia torjuvia uusia antibioottisia aineita, joista tässä on käy-30 tetty nimityksiä BBM-1675C ja BBM-1675D ja jotka tunnetaan vastaavasti myöskin nimityksillä BMY-27305 ja BMY-27307, joita aineita valmistetaan bioaktiivisten komponenttien BBM-1675A.J (esperamisiini A^) tai BBM-1675A2 (esperamisii-ni A2) selektiivisen kemiallisen hydrolyysin avulla, joita 35 vuorostaan valmistetaan viljelemällä Actinomadura verru-cosospora'n BBM-1675:ta tuottavaa kantaa. Bioaktiiviset li 3 83422 aineet BBM-1675C ja BBM-1675D voidaan erottaa ja puhdistaa tavanomaisten kromatografisten menetelmien avulla ja molemmat aineet osoittavat oivallista antimikrobiaalista ja kasvaimia torjuvaa aktiviteettia.

5 Kuvio 1 esittää BBM-1675C:n ultraviolettivalon ab- sorptiospektriä.

Kuvio 2 esittää BBM-1675D:n ultraviolettivalon ab-sorptiospektriä.

Kuvio 3 esittää BBM-l675C:n infrapunavalon absorp-10 tiospektriä (KBr, kalvo),

Kuvio 4 esittää BBM-1675D:n infrapunavalon absorptio-spektriä (KBr, kalvo).

Kuvio 5 esittää BBM-l675C:n suhteellisen runsauden massaspektriä.

15 Kuvio 6 esittää BBM-1675D:n suhteellisen runsauden massaspektriä.

Kuvio 7 esittää BBM-1675C:n protonimagneettista resonanssispektriä CDCl3:ssa (360 MHz).

Kuvio 8 esittää BBM-1675D:n protonimagneettista re-20 sonanssispektriä seoksessa, jossa on CDCl^ + 10 % CD^OD . . (360 MHz).

13

Kuvio 9 esittää BBM-1675C:n C-magneettista reso nanssispektriä CDCl^:ssa (90,6 MHz).

·* 13

Kuvio 10A esittää BBM-1675D:n C-magneettista re-: . 25 sonanssispektriä (110-200 ppm) seoksessa, jossa on CDCl^ + 10 % CD^OD (90,6 MHz).

^ 13

Kuvio 10B esittää BBM-1675D:n C-magneettista resonanssispektriä (0-110 ppm) seoksessa, jossa on CDCl^ + 10 % CD30D (90,6 MHz).

30 Kuvio 11A esittää yhdisteen 3A (Qf-anomeeri) protoni magneettista resonanssispektriä CDCl3:ssa (360 MHz).

. . Kuvio 11B esittää yhdisteen 3B (/3-anomeeri) proto nimagneettista resonanssispektriä CDCl3:ssa (360 MHz).

Tämä keksintö koskee kahta uutta kasvaimia torjuvaa : 35 antibioottista ainetta, joista tässä käytetään vastaavasti nimityksiä BBM-1675C ja BBM-1675D ja jotka tunnetaan myös « 83422 nimityksillä BMY-27305 ja BMY-27307, jolloin mainittuja aineita valmistetaan bioaktiivisten komponenttien BBM-1675A1:n (esperamisiini ) tai BBM-1675Ä2:n (esperamisii-ni A2) selektiivisen kemiallisen hydrolyysin avulla, joi-5 ta vuorostaan valmistetaan viljelemällä BBM-1675:tä tuottavaa Actinomadura verrucosospora'n kantaa, edullisimmin Actinomadura verrucosospora'n kantaa H964-92 (ATCC 39334) tai Actinomadura verrucosospora'n kantaa A1327Y (ATCC 39638) tai näiden mutanttia. Erään toisen piirteensä mu-10 kaan esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmän BBM-1675C-aineen valmistamiseksi bioaktiivisten komponenttien BBM-1675A.J tai BBM-1675A2 selektiivisen hydrolyysin avulla. Vielä erään piirteensä mukaan esillä oleva keksintö tarjoaa menetelmän BBM-1675D:n valmistamiseksi BBM-1675C-ai-15 neen selektiivisen hydrolyysin avulla tai edullisemmin bioaktiivisista komponenteista BBM-1675A^ tai BBM-1675A2* BBM-1675C:n ja BBM-1675D:n eristäminen reaktioseoksesta ja puhdistaminen voidaan suorittaa tavanomaisilla kromatografisilla menetelmillä.

20 Bioaktiiviset aineet BBM-1675C ja BBM-1675d osoit- : .· tavat antimikrobiaalista aktiviteettia laajaa mikro-orga nismien sektoria vastaan ja niiden on myös osoitettu omaavan ehkäisevää vaikutusta erilaisia hiiren kasvainjärjes-;;· telmiä, kuten P-388-leukemiaa ja B16-melanoomaa vastaan.

• 25 Juuri esitettyjä, esillä olevan keksinnön mukaisia aineita voidaan tällöin käyttää antimikrobiaalisina aineina tai antitumoraalisina aineina nisäkkäiden kasvainten torjumiseksi.

Kasvaimia torjuvien antibioottien, BBM-1675A^:n 30 (esperamisiini A1) ja BBM-1675A2:n (esperamisiini A2) rakenteen selvittämiseksi suoritettujen degradaatiotutkimus-ten aikana muodostui komponenttien seos, mikä johti kahden inaktiivisen fragmentin, vastaavasti kaavan 1 ja 2 mukaisten fragmenttien eristämiseen ja identifiointiin. Yllättäen ·... 35 todettiin kuitenkin, että kemiallinen degradaatio johti kahden bioaktiivisen fragmentin BBM-1675C ja BBM-1675D

II

5 83422 vaiheittaiseen vapautumiseen. Vielä yllättävämpää oli sen seikan toteaminen, että kaksi eri antibioottia BBM-1675A^ ja -C2 tuotti samoja bioaktiivisia fragmentteja kuin mitä kaaviossa 1 on kuvattu. Vieläkin yllättävämpää oli se, et-5 tä molekyylipainoltaan vähäisempien fragmenttien BBM-1675C ja -D (joiden molekyylipainot olivat vastaavasti noin 70 % ja 55 % lähdeantibioottien BBM-1675A^ ja -A2 molekyylipai-nosta) todettiin olevan tehokkaampia kuin BBM-1675A2 ja samanvertaisia kuin BBM-1675A^ kasvaimia torjuvina ja anti-10 mikrobiaalisina aineina.

Kaavio 1 BBM-1675A1 (esperamisiini

15 V

BBM-16 75C-BBM-1675D

20 . . BBM-1675A2^^ (esperaiciisimi a2) BBM-1675C- ja BBM-1675D-aineita voidaan valmistaa 25 antibioottisen BBM-1675A^:n selektiivisen kemiallisen hyd-rolyysin avulla, kuten kaaviossa 2 on esitetty 6 83422

Kaavio 2 ch.__

HO O

5 β CHjCix^Ao

BBM-167SA1 —CH 011 >BBM-1675C * IMI

(molekyylipaino J (molekyylipaino 855) CH 1248) 3 I

OCH3 1 0 1 Yhdiste 1 (molekyylipaino 425) (Of- ja /3-anomeerien seos)

H©/CH,OH

15 3 20

BBM-16 75D + CHjS-/ OCH.J

(molekyylipai- \_/ no 695) /

0H

:·.· 25 • . Yhdiste 3 (molekyylipaino . .· 192) (of- ja /3-anomeerien seos) Lähtöaineena käytettyä BBM-1675A^-yhdistettä valmistetaan menetelmän mukaan, joka on esitetty GB-patenttihake-30 muksessa nro 2 141 425, julkaistu 19. joulukuuta 1984. Puhdistettu BBM-1675A^-komponentti hydrolysoidaan mineraaliha-polla tai orgaanisella hapolla, kuten kloorivedyllä, rikki-hapolla, p-tolueenisulfonihapolla, bentseenisulfonihapolla .·. tai niiden kaltaisella, orgaanisessa liuottimessa tai vesi- 35 pitoisessa orgaanisessa inertissä liuotinseoksessa lämpöti-lassa, joka on noin 0°C:n ja liuottimen palautustislaus- 7 83422 lämpötilan välillä siksi kunnes oleellinen määrä toivottua BBM-1675C:tä tai BBM-1675D:tä on muodostunut. Hydrolyysi suoritetaan edullisesti -Cg-alkoholiliuottimissa ja edullisimmin alkoholyysi suoritetaan metanolissa. Reak-5 tion lämpötila ei ole kriittinen, mutta on edullista suorittaa reaktio suunnilleen ympäristön lämpötilan ja 60°C:n välillä ja edullisimmin välillä noin 40-60°C.

BBM-1675A^:n selektiivinen hydrolyysi edistyy vaiheittain siten, että aluksi muodostuu BBM-1675C-antibioot-10 tia ja kaavan 1 mukaista inaktiivista fragmenttia. Seuraa-va tai jatkettu käsittely hydrolysoivissa olosuhteissa johtaa kaavan 3 mukaisen tiosokerin 06* ja /3-anomeerien seoksen vapautumiseen ja antibioottisen BBM-1675D:n muodostumiseen, Alan ammattimiehille tulisi olla selvää, että reak-15 tio-olosuhteiden, kuten ajan, lämpötilan ja hapon konsen-traation muuttaminen tuottaa vaihtelevia suhteellisia määriä antibiootteja BBM-1675C ja -D. Tämän vuoksi on toivottavaa valvoa reaktion kulkua ohutkerroskromatografiän avulla, kuten tässä on esimerkeissä esitetty.

20 Mikäli on toivottua valmistaa ainoastaan BBM-1675D- antibioottia, on edullista suorittaa selektiivinen hydrolyysi orgaanisella hapolla, kuten p-tolueenisulfonihapolla, kuten tässä on esitetty, kvantitatiivisen BBM-1675D-määrän saamiseksi.

25 BBM-1675C- ja BBM-1675D-aineita voidaan myös valmis taa antibioottisen BBM-1675A2:n selektiivisen kemiallisen hydrolyysin avulla, kuten kaaviossa 3 on esitetty.

8 83422

Kaavio 3

o 0H

5 J© CH3°VÄ>Ao BBM-16 75A2—> BBM-16 7SC + JC 7 (molekyylipaino 3 (molekyylipaino 855)

1248) CH3° NH

oA^ch2 och3 10

Yhdiste 2 (molekyylipaino 425) (c<- ja /J-anomeerien seos)

ΐβ/CH-OH

15 3 20 CH3 l.\ 1 Jr\ BBM-16 75D + CH3S N. VoCH3 ·*· (molekyylipa!- \_/

J no 695) OH

:'· 25 - Yhdiste 3 (molekyylipaino — 192) (of— ja /J-anomeerien seos) Lähtöaineena käytettyä BBM-1675A2-yhdistettä valmis-30 tetaan menetelmän mukaan, joka on esitetty GB-patenttihake-muksessa nro 2 141 425, julkaistu 19. joulukuuta 1984. Puhdistetun BBM-1675Ä2:n selektiivinen hydrolyysi tapahtuu samoin asteittaisella tavalla, jolloin aluksi muodostuu BBM-1675C-antibioottia sekä kaavan 2 mukaista inaktiivista -'·· 35 fragmenttia. Jatkettu käsittely hydrolysoivissa olosuhteis- / ‘ sa johtaa kaavan 3 mukaisen tiosokerin O(r ja Of-anomeerien 9 83422 seoksen vapautumiseen sekä antibioottisen BBM-1675D:n muodostumiseen.

BBM-1675A2:n selektiiviseen kemialliseen hydrolyy-siin käytetyt reaktio-olosuhteet ovat oleellisesti samat 5 kuin mitä käytettiin edellä kuvattuun BBM-1675A^:n hydro-lyysiin. Mikäli pidetään parempana valmistaa ainoastaan BBM-1675D-antibioottia, suoritetaan BBM-1675Ä2:n hydrolyy-si samalla tavalla kuin valmistettaessa BBM-1675D:tä BBM-1675A^:sta aina siihen asti että BBM-1675A2 ja BBM-1675C 10 ovat oleellisesti kokonaan muuttuneet BBM-1675D:ksi. Hydro-lyysi suoritetaan edullisimmin käyttämällä orgaanista happoa, kuten p-tolueenisulfonihappoa.

Se tässä kuvattu havainto, että edellä mainittuja BBM-1675C- ja -D-antibiootteja muodostuu kahdesta eri an-15 tibiootista BBM-1675A1 ja BBM-1675A2, jolloin samanaikaisesti menetetään kaksi vastaavasti kaavojen 1 ja 2 mukaista inaktiivista fragmenttia sekä kaavan 3 mukainen tioso-keri, tuottaa esillä olevan keksinnön erään lisäedun. Niinpä esillä olevan keksinnön erään lisäpiirteen mukaan on 20 käytettävissä menetelmä BBM-1675A^:n ja -A2:n seoksen se-. . lektiiviselle hydrolyysille BBM-1675C:n ja -D:n valmista-;; miseksi, kuten kaaviossa 4 on esitetty.

Kaavio 4

. 25 BBM-1675A1 + BBM-1675A2 —-> BBM-1675C -> BBM-1675D

Tämä etu käy ilmeiseksi otettaessa huomioon se, että käymisprosessin aikana muodostuneiden BBM-1675A-|:n ja -A2:n suhteelliset määrät ovat vaihtelevuuden kohteena.

30 BBM-1675C:n ja -D:n tuottaminen on tämän vuoksi riippuma ton esillä olevassa keksinnössä lähtöaineena käytettyjen .. BBM-1675Al:n ja -A2:n suhteellisista määristä.

Kuten tässä selostettiin, on BBM-1675A^-, -A2- ja ’/· -C-antibioottien hydrolyysistä tuloksena inaktiivisen tio- : 35 sokerifragmentin vapautuminen. Tämä tiosokeri eristettiin ·[ lisätiedon hankkimiseksi BBM-1675C-antibiootin ja siten 10 83422 BBM-1675A^- ja -A2_antibioottien kemiallisesta rakenteesta. Kaavan III mukainen yhdiste identifioitiin tiosokerin 0Cr ja /3-anomeerien seokseksi, jolla tiosokerilla on kaavioissa 2 ja 3 kuvattu rakenne. Lisäkarakterisointi kävi mahdolli-5 seksi kun alkoholyysin tuotteet, ofr ja /3-anomeerit erotettiin toisistaan. Yhdisteen 3A (ö£-anomeeri) ja yhdisteen 3B ^3-anomeeri) protonimagneettiset resonanssispektrit (360 MHz) on esitetty vastaavasti kuvioissa 11A ja 11B. Spektritieto-jen analyysin perusteella ilmoitettiin kaavan 3 mukaisten 10 tiosokerimetyyliglykosidien suhteellinen stereokemia varauksin kaavaltaan seuraavanlaiseksi

OH

CH3^-\0^__^-OCH,.

Tällä hetkellä ei absoluuttista stereokemiaa, so.

D- tai L-muotoa ole vielä määritetty. Niinpä spektritieto-jen nykyiseen tulkintaan pohjautuen päätellään, että kaa-20 van 3 mukainen tiosokeri (miinus siitä anomeerisestä nietoksista peräisin oleva CH^-ryhmä, joka on liittynyt metano-lyysin aikana) on antibioottisen BBM-1675C:n rakenteessa oleva komponentti ja lisäksi se on komponenttina lähtöai-_ - neina käytettyjen BBM-1675A^- ja -A2-antibioottien raken- :· 25 teessä.

• BBM-1675C:n fysikokemiallisia ominaisuuksia . .· Tuntomerkki: amorfinen kiinteä aine

Ultraviolettivalon absorptiospektri: katso kuviota 1 Määrityslaite: Hewlett-Packard 8458 30 Liuotin: metanoli

Konsentraatio: 0,0155 g/1 Λ-maks absorboituvuudet 210 21 770 274 9 340 35 313 sh (olake) 4 190 11 83422

Mitään merkittävää muutosta ei havaittu käytettäessä happoa tai emästä.

Infrapunavalon absorptiospektri: katso kuviota 3 Määrityslaite: Nicolet 5DX FT-IR 5 Pääasialliset absorptionauhat (KBr, kalvo): 540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118, 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930, 2970, 3450 cm-1.

10

Massaspektri: katso kuviota 5 Määrityslaite: Finigan 4500 TSQ

Menetelmä: ionisointi pommittamalla nopeilla atomeilla (fast atom bombardment) (FAB) 15 Molekulaa- Suhteellinen

Matriisi m/z rinen ioni runsaus glyseroli 856 Jm+HJ+ 100 % glyseroli + NaCl 878 /M+Na7+ 100 % ditiotreitoli:ditioery- 20 tritoli (3:1) (p/p) 856 fH+Uj+ 100 % Määrityslaite; Kratos MS-50

Suurtehoerottelu FAB (m/z): /M+H} +

Molekyylipaino; näennäinen molekyylipaino = 856

Edellä esitettyjen massaspektritietojen perusteella) ; - 25 Alkuainekoostumus: ,Ν-,Ο.,.S0 . . 36 61 3 14 3 (edellä esitettyjen suurtehoerottelun tietojen perusteella)

Protonimagneettinen resonanssispektri: katso kuviota 7 Määrityslaite: WM 360 Bruker 30 Liuotin: CDCl^ 12 83422 ΧΗ NMR 360 MHz δ (ppm) : 6 τ 54 (1H, dd, J=7f7, 7,0); 6,21 (1H, brs); 5,87 (1H, d, J=9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6, 1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J=10,3, 1,8); 4,61 (1H, d, 5 J=7,7); 4,25 (1H, s); 4,09 (1H, q, J=2,6); 3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92-3,53 (10H), 3,45 (1H, dt, J=10,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (1H, m); 2^69 (1H, dt, J=9,9, 5,2); 2,49 (1H, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m); 2,13 (1H, m); 2,09 (3H, s); 1,50 (2H, m); 1,37 (3H, d, 10 J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); 1,08 (6H).

1 3 C-magneettinen resonanssispektri: katso kuviota 9 Määrityslaite; WM 360 Bruker Liuotin: CDCI2 15 1 XJC NMR 90.6 MHz δ (ppm): 13.7, 17,5, 19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 35,2, 39,5, 47.7, 52,7, 55,8, 56,1, 57,7, 62,4, 64,7, 67,4, 69,3, 69.8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7, 79,7, 83,2, 88,4, 97;3, 99,7, 123,4, 124,6, 130,1, 193,1.

20 : .· BBM-1675D:n fysikokemiallisia ominaisuuksia ,-·· Tuntomerkki: amorfinen kiinteä aine

Ultraviolettivalon absorptiospektri: katso kuviota 2 Määrityslaite: Hewlett-Packard 8458 • · 25 Liuotin: metanoli

Konsentraatio: 0,01 g/1 \iaks absorboituvuudet 214 27 000 274 12 800 30 325 5 400 ·.·· Mitään merkittävää muutosta ei havaittu käytettäes sä happoa tai emästä.

• · Infrapunavalon absorptiospektri: katso kuviota 4

'· ' Määrityslaite: Nicolet 5DX FT-IR

35 Pääasialliset absorptionauhat (KBr) , kalvo) :

II

13 83422 735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195, 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 1720, 1735, 2880, 2930, 2960, 3400 cm"1.

5 Massaspektri: katso kuviota 6

Määrityslaite: Finigan 4500 TSQ

Menetelmä: ionisointi käyttämällä pommitusta nopealla atomilla (FAB)

Matriisi: tioglyseroli 10 Molekulaarinen ioni (m/z): /M+H7+ = 696

Suhteellinen runsaus: 100 % Määrityslaite: Kratos MS-50

Suurtehoerottelu FAB (m/z): /M+HJ+ = 696,2794 Molekyylipaino: näennäinen molekyylipaino = 695 15 (edellä esitettyjen massaspektritietojen perusteella)

Alkuainekoostumus: C29H49N3°12S2 (edellä esitettyjen suurtehoerottelun tietojen perusteella) /M+H7+:n ja /^(M+H)+2_7+:n suhteellisten runsauksien 20 korrelaatio niiden laskettuihin arvoihin vahvistaa sitä al-. . kuainekoostumusta, joka on johdettu suurtehoerottelu-FAB- mittauksista.

Protonimagneettinen resonanssispektri: katso kuviota 8 Määrityslaite: WM 360 Bruker : 25 Liuotin: CDC13 + 10 % CD3OD

XH NMR 360 MHz 6 (ppm) : 6,43 (1H, dd, J-4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5,48 (1H, 6 brs); 4,48 (1H, d, J=8,1); 4,02 (1H, d, J=2,0); 3,95-3,80 liuo~ 30 tintausta); 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm); 3,35 (1H, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23-2,12 (2H, m); 1,42 (1H, brdt); 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6); 0,87 (3H, d, J=5r 9) .

i4 83422 1 3 C-magneettinen resonanssispektri: katso kuvioita

10A ja 10B

Määrityslaite: WM 360 Bruker

Liuotin: CDC13 + 10 % CD-jOD

5 13C NMR 90,6 MHz δ (ppm): 17,5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8, 62,1, 67,8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4, 83.3, 88,2, 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8, 134.3, 148,7, 192,8.

10 BBM-1675-aineiden biologisia ominaisuuksia BBM-1675-aineiden antimikrobiaalinen teho määritettiin useiden gram-positiivisten ja gram-negatiivisten mikro-organismien osalta. Jäljempänä oleva taulukko 1 esittää 15 tiedot antimikrobiaalisen erottelumenetelmän avulla saatujen tulosten muodossa, jossa menetelmässä käytettiin lähtökohtana olevaa BBM-1675A1-komponenttia ja esillä olevan keksinnön mukaisia BBM-1675C- ja BBM-1675D-aineitä. Erot-telumenetelmässä pantiin kasvuviljelmään paperisuikale, 20 joka oli kyllästetty liuoksella, joka sisälsi yhdenmukai-. . seita konsentraatioltaan 10 ^ug/ml jokaista koeyhdistettä, ja antibioottisen tehon mittana on paperisuikaleesta saatu *·-- ehkäisy vyöhyke. Kuten taulukossa 1 on esitetty, osoittivat BBM-1675C- ja -D-aineet laajaa antimikrobiaalisen tehon : . 25 aluetta ja aineet olivat ainakin yhtä tehokkaita kuin BBM- 1675A.J-komponentti; ja erityisesti BBM-1675C- ja -D-aineet olivat tehokkaampia gram-negatiivisten organismien ehkäisy-aineina.

II

*

Taulukko I

BBM-1675-aineiden antimikrobiaalinen aktiviteetti 15 83422

Ehkälsyvyöhyke, mm

Koemikro-organisml BBM-^SAj^ BBM-1675C BBM-16 75D

5

Escherichia coli AS 19 22 52 51

Escherichia coli K 12 13 . 36 35

Escherichia coli P 1373 12 34 33

Escherichia coli R Azaserine 14 35 34

Escherichia coli R Netropsin 11 32 32

Escherichia coli R Mitomycin C 12 35 34 io--

Escherichia coli R Bleomycin 16 38 36

Escherichia coli R Daunomycin 19 45 44

Escherichia coli R Neomycin 24 53 52

Escherichia coli R Sibiromycin 14 32 30

Escherichia coli R Hedamycin 14 30 25

Escherichia coli R Aclacinomycin 15 41 40 ^ ^ Bacillus subtilis ATCC 6633 34 43 41

Klebsiella pneumoniae 17 35 35

Staphylococcus 209 P 32 47 44

Staphylococcus R Actinoleukin 33 35 33

Staphylococcus R Streptonigrin 37 50 48

Staphylococcus faecali s P1377 30 39 3¾ 20 Streptococcus aureus Smith P 36 47 45

Staphylococcus aureus Smith R 40 55 53

Actinomycin D

Staphylococcus aureus Smith R 17 32 31

Aureolic acid •· Acinetobacter 16 33 32 ' 25 Micrococcus luteus 35 57 55 . Saccharomyces cerevisiae petite 22 42 43 R = vastustuskykyinen nimettyä antibioottia vastaan

Teho P-388-leukemiaa vastaan 30 Taulukot II ja III sisältävät laboratoriokokeiden tulokset, joissa kokeissa käytettiin CDF^-hiiriä, joihin . . oli istutettu intraperitoneaalisesti kasvainymppi, joka käsitti 10^ P-388-leukemian vesivatsasolua (ascites cells) : - ja joita hiiriä oli käsitelty erilaisilla annoksilla BBM- 35 1675A.J, -C tai -D. Aineet annettiin intraperitoneaalisena ruiskeena. Jokaista annostusta kohti käytettiin kuuden 16 83422 hiiren ryhmää ja hiiriä käsiteltiin yhdellä ainoalla aine-annoksella ymppävksen jälkeisenä päivänä. Jokaiseen koesarjaan sisällytettiin 10 suolaliuoksella käsiteltyä vertailu-hiirtä. Taulukossa III esitetty BBM-1675A^:11a käsitelty 5 ryhmä sisällytettiin kokeeseen suorana vertailukohteena. Koepöytäkirjaa pidettiin 30 päivän ajan ja jokaisen hiiri-ryhmän osalta määritettiin keskimääräinen elossapysymisaika päivissä ja eloonjääneiden lukumäärä merkittiin muistiin viiden päivän pituisen ajanjakson päätyttyä. Hiiret punnit-10 tiin ennen käsittelyä ja jälleen neljäntenä päivänä. Painonmuutosta pidettiin lääkeaineen myrkyllisyyden mittana. Käytettiin hiiriä, joista jokainen painoi 20 g ja enintään noin 2 g:n suuruista painon pienenemistä ei katsottu liialliseksi. Liuottimena käsitellyt vertailueläimet kuolivat 15 yleensä yhdeksän päivän kuluessa. Tulokset määritettiin muodossa % T/C, joka on käsitellyn ryhmän keskimääräisen elossapysymisajan suhde liuottimella käsitellyn vertailuryhmän keskimääräiseen elossapysymisaikaan kerrottuna luvulla 100. Teho, joka ilmoitettuna muodossa % T/C, on yhtä 20 suuri tai suurempi kuin 125, osoittaa sen, että saavutet-: tiin merkittävä kasvaimia torjuva teho. Taulukossa II ole vat erottelutulokset osoittavat BBM-1675C-aineen sellaista kasvainten torjuntatehon tasoa, jota ei alunperin osattu odottaa. Taulukossa III esitetään tulokset, jotka on saatu 25 vertaamalla suoraan BBM-1675A^- (esperamisiini A^) ja BBM-1675C- ja BBM-1675D-aineita. Tiedot viittaavat siihen, että BBM-1675C on suunnilleen samanvertainen kuin BBM-1675A^ voimakkuudeltaan ja kasvainta torjuvalta teholtaan ja että se ei ole ajoituksesta riippuvainen, samalla kun BBM-30 1675D on vain hiukan vähemmän tehokas.

. .. Esillä olevassa keksinnössä osoitetaan lisäksi, että samoja aineita BBM-1675C ja BBM-1675D voidaan saada myös BBM-1675A2- (esperamisiini A2) -komponentista. Verrattaessa tässä selostuksessa ilmoitettuja BBM-1675C:n 35 ja BBM-1675D:n osalta saatuja tietoja ja niitä tietoja, jotka on esitetty julkaistussa GB-patenttihakemuksessa il 17 83422 nro 2 141 425 BBM-1675A2-komponentin osalta, todetaan yllättäen, että aineet BBM-1675C ja -D ovat tehokkaampia kasvaimia torjuvia aineita kuin lähde-BBM-1675A2~kompo-nentti, josta ne on johdettu.

5 Taulukko II

BBM-1675C:n teho P-388-leukemiaan (Päivänä 1 käsittely)

Teho AWC Elossa

Annos, IP MST MST g olevia ^ q Yhdiste mq/kq/inj. pv % T/C pv 4 pv 5_ BBM-1675C 3,2 TOX TOX - 0/6 0,8 TOX TOX - 0/6 0,2 TOX TOX - 0/6.

0,05 TOX TOX -1,8 1/6 0,0125 11,0 122 -2,5 5/6 15 0,003125 13,5 150 -2,5 6/6

Liuotin - 9,0 100 10/10 g

Kasvaimen ymppi: 10 vesivatsasolua istutettuna intraperi-20 toneaalisesti

Itäntäeläin: urospuoliset CDF^-hiiret

Arvosteluperuste: keskimääräinen elossapysymisaika MST (median survival time)

Teho: % T/C = (MST käsitelty/MST verranne) x 100 25 Kriteerit: % T/C £ 125 katsottiin merkittäväksi, kasvaimia torjuvaksi tehoksi AWC: (average weight change) keskimääräinen painonmuutos (käsitelty-verranne) grammoissa (päivänä 4)

Taulukko III

BBM-1675-aineiden teho P-388-leukemiaan 18 83422

Teho AWC Elossa Käsittelyn Annos, IP MST MST g olevia g Yhdiste ajoitus mq/kq/inj. pv. % T/C pv 4 pv 5_ BBM-16 75 päivä 1 0,0512 TOX . TOX - 0/6 0,0256 TOX TOX - 0/6 0,0128 TOX TOX -1,8 3/6 0,0064 15,5 172 -0,3 6/6 0,0032 15,0 167 -0,6 6/6 0,0016 15,5 172 0,6 6/6 0,0008 12,5 139 0,3 6/6 0,0004 12,0 133 1,4 6/6 0,0002 11,0 122 0,8 6/6 0,0001 11,5 128 1,4 6/6 BBM-1675C päivä 1 0,0256 TOX TOX - 0/6 0,0128 TOX TOX -0,8 3/6 0,0064 11,5 128 -0,3 6/6 0,0032 14,5 161 -0,1 6/6 0,0016 10,5 117 0,0 6/6 0,0008 12,0 133 0,3 676 20 0,0004 11,5 128 0,8 6/6 0,0002 11,0 122 1,4 6/6 f · 0,0001 11,0 122 0,8 6/6 0,00005 10,5 117 1,3 6/6 19 83422

Taulukko III (jatkoa) AWS Elossa Käsittelyn Annos, IP MST m ST g olevia

Yhdiste ajoitus mq/kq/inj . pv % T/C pv 4 pv 5_ 5 BBM-1675D päivä 1 0, 0256 9,0 100 0, 1 6/6 0,0128 11,5 128 0,3 6/6 0,0064 12,5 139 0,3 6/6 0,0032 12,0. 133 0,1 6/6 0,0016 11,5 128 0,8 6/6 1Q 0,0008 10,0 111 0,2 6/6 0,0004 10,0 111 0,5 6/6 0,0002 9,5 106 1,7 6/6 0,0001 9,5 106 1,7 6/6 0,00005 9,0 100 2,0 6/6 BBM-1675C päivä 1-5 0,0032 16,0 178 -1, 3 6/6 15 il* 0,0016 13,5 150 -1,0 6/6 0,0008 13,5 150 -0,3 6/6 0,0004 12,0 133 -0,4 6/6 0,0002 12,0 133 -0,4 6/6 0,0001 11,0 122 -0,4 5/6 0,00005 11,0 122 0,9 6/6 20 0,000025 8,5 94 2,2 6/6 0,0000125 8,0 89 2,4 6/6 : 0,00000625 8,0 89 2,4 6/6 ·· Liuotin — 9,0 100 2,4 10/10 .... ^

Kasvaimen ymppi: 10^ vesivatsasolua istutettuna intraperi-toneaalisesti

Isäntäeläin: naaraspuoliset CDF^-hiiret Arvosteluperuste: keskimääräinen elossapysymisaika MST 30 (median survival time)

Teho: % T/C = (MST käsitelty/MST verranne) x 100 Kriteerit: % T/C *125 katsottiin merkittäväksi kasvaimia torjuvaksi tehoksi AWC: (average weight change) keskimääräinen painonmuutos 35 käsitelty-verranne) grammoissa (päivänä 4) 20 8 3 4 2 2

Teho B16-melanoomaa vastaan

Taulukko IV sisältää tulokset kasvainten torjumista koskevista kokeista, joissa käytettiin hiirissä kasvatettua B16-melanoomaa. Käytettiin BDF^-hiiriä ja näihin ympät-5 tiin subkutaanisesti kasvainistute. Pöytäkirjaa pidettiin 60 päivän ajan. Jokaista koestettua annostusmäärää kohti käytettiin 10 hiiren ryhmää ja jokaisen ryhmän keskimääräinen elossapysymisaika määritettiin. Vertailueläimet ympättiin samalla tavalla kuin koe-eläimet ja niitä käsiteltiin 10 antamalla niille ruiskeena liuotinta eikä lainkaan lääkettä ja näille eläimille saatiin keskimääräiseksi elossapysymis-ajaksi 22,5 päivää. Jokaisen annostusmäärän osalta käsiteltiin koe-eläimiä koestettavalla yhdisteellä antamalla päivinä 1, 5 ja 9 intraperitoneaalinen ruiske. Teho, joka il-15 moitettuna muodossa % T/C, on yhtä suuri tai suurempi kuin 125 osoittaa, että saavutettiin merkittävä kasvainta torjuva vaikutus. Taulukossa IV esitetyt tulokset osoittavat, että suorassa vertailussa BBM-1675C oli myös tehokas käsiteltäessä hiiriä, joilla oli B16-melanooma ja se oli suun-20 nilleen samanvertainen BBM-1675A^:n kanssa voimakkuudeltaan.

Taulukko IV

BBM-1675-aineiden teho B16-melanoomaan 21 83422

Teho ÄWC Elossa

Annos, xp MST MST 9 olevia 5 Yhdiste mq/kq/inj. pv % T/C pv_12 Pv 10_ ΒΒΜ-1675Αχ 0,0032 37,5 167 0,3 10/10 0,0016 37,5 167 0,3 ' 10/10 0,0008 38,5 171 1,4 10/10 0,0004 37,0 164 1,8 10/10 1 0 0,0002 34,5 153 2,0 10/ 10 0,0001 32,0 142 1,9 10/10 BBM-1675C 0,0008 31,5 140 0,6 10/10 0,0004 37,0 164 1,2 10/10 0,0002 31,0 138 0,6 10/10 0,0001 31,5 140 1,0 10/10 15 0,00005 27,5 122 0,8 10/10 0,000025 25,0 111 0,5 10/10

Liuotin - 22,5 100 0,3 10710 20 Kasvaimen ymppi: 0,5 ml 10-%:ista "puuroa", intraperitone-aalisesti

Isäntäeläin: naaraspuoliset BDF^-hiiret

Arvosteluperuste: MST ( = median survival time) keskimääräinen elossapysymisaika 25 Teho: % T/C = (MST käsitelty/MST verranne) x 100

Kriteerit: % T/C £ 125 katsottiin merkittäväksi kasvainta torjuvaksi aktiviteetiksi AWC: (average weight change) keskimääräinen painonmuutos (käsitelty-verranne) grammoissa (päivänä 12) 30 Kuten edellä esitetyt antimikrobiaaliset ja hiirten kasvaimia koskevat tiedot osoittivat, BBM-1675C ja BBM-1675D ovat tällöin käyttökelpoisia antibiootteina käsiteltäessä terapeuttisesti nisäkkäitä ja muita eläimiä tartun-tasairauksissa sekä myös kasvaimia torjuvina aineina eh-35 käistäessä terapeuttisesti nisäkkäissä esiintyvien kasvainten kasvua.

22 8 3 4 2 2

Esillä oleva keksintö tarjoaa siten käytettäväksi menetelmän elollisen olennon käsittelemiseksi terapeuttisesti, jota vaivaa mikrobiaalinen tartunta tai pahanlaatuinen kasvain, jonka menetelmän mukaan mainitulle kohteel-5 le annetaan tehokas antimikrobiaalinen tai kasvaimia ehkäisevä annos BBM-1675C:tä tai BBM-1675D:tä tai näiden farmaseuttista koostumusta.

Keksintö käsittää puitteissaan farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät tehokkaan antimikrobiaalisen tai 10 kasvaimia ehkäisevän määrän BBM-1675C:tä tai BBM-1675D:tä yhdessä inerttisen, farmaseuttisesti hyväksyttävän kantajata! laimennusaineen kanssa. Tällaiset koostumukset voivat myös sisältää muita aktiivisia antimikrobiaalisia tai kasvaimia torjuvia aineita ja ne voidaan valmistaa johonkin 15 farmaseuttiseen muotoon, joka on sopiva toivottua lääkkeen-antamistapaa silmällä pitäen. Esimerkkejä tällaisista koostumuksista ovat kiinteät koostumukset lääkkeen oraalista antamista silmällä pitäen, kuten tabletit, kapselit, pillerit, jauheet ja rakeet, nestemäiset koostumukset oraalis-20 ta lääkkeenantamista varten, kuten liuokset, suspensiot, siirapit tai eliksiirit sekä valmisteet lääkkeen antamista parenteraalisesti, kuten steriilit vesiliuokset tai vettä sisältämättömät liuokset, suspensiot tai emulsiot. Ne voidaan myös valmistaa steriilien, kiinteiden koostumusten ' 25 muotoon, jotka voidaan liuottaa steriiliin veteen, fysiologiseen ruokasuolaliuokseen tai johonkin muuhun steriiliin, injektoitavissa olevaan väliaineeseen välittömästi ennen käyttöä.

Antimikrobiaalisena aineena käyttämistä varten BBM-30 1675C:tä tai BBM-1675D:tä tai näiden farmaseuttista koos tumusta annetaan siten, että aktiivisen aineosan konsen-traatio on suurempi kuin minimiehkäisykonsentraatio kulloinkin käsiteltävän erityisen organismin osalta. Kasvaimia torjuvana aineena käytön osalta voi alan ammattimies hel-35 posti selvittää BBM-1675C:n tai BBM-1675D:n optimaaliset annostukset ja hoito-ohjeet kulloinkin kysymyksessä olevalle 23 83422 nisäkkäälle. Luonnollisestikin on huomattava, että kulloinkin käytetty BBM-1675C:n tai BBM-1675D:n annos vaihte-lee valmistetun erityisen koostumuksen, antotavan ja anto-kohdan, kohteen ja käsiteltävän sairauden mukaan. Monet 5 tekijät, jotka vaikuttavat lääkkeen vaikutukseen, on otettava huomioon, kuten potilaan ikä, paino, sukupuoli, ruokavalio, antoajankohta, antotapa, erittymisnopeus, potilaan tila, lääkeyhdistelmät, reaktioherkkyydet ja taudin ankaruus. Lääkkeenanto voidaan suorittaa jatkuvasti tai jaksoit-10 tain maksimaalisen siedettävän annoksen puitteissa. Optimaaliset käyttömäärät tietylle olosuhdeyhdistelmälle voivat alan ammattimiehet selvittää käyttämällä tavanomaisia annostuksen määrityskokeita ottaen huomioon edellä esitetyt ohjeet.

15 Seuraavat esimerkit ovat tarkoitetut ainoastaan va laisemaan keksintöä rajoittamatta millään tavoin sen piiriä.

BBM-1675C:n ja BBM-1675D:n kemiallinen valmistus ja eristäminen 20 Esimerkki 1 BBM-1675A.J :n näyte (50 mg) liuotettiin 2,5 ml:aan metanolia ja käsiteltiin 2,5 ml:n kanssa kloorivedyn 0,1 molaarista metanoliliuosta. Reaktion annettiin edistyä noin 50°C:n lämpötilassa ja lähtöaineen häviämistä (noin 25 30 minuutin kuluessa) seurattiin joka 5-10 minuutti ohut- kerroskromatografiän (TLC) avulla käyttämällä piihappogee-lilevyjä (Analtech, 250 mikronia, GF) ja eluointiliuotti-mena tolueeni:asetoni (3:2, til./til.)-seosta. Sen jälkeen kun lähtöaine oli kulunut loppuun, neutraloitiin reaktio-30 seos NaHCO^sn kyllästetyllä metanoliliuoksella, sen jälkeen haihdutettiin alipaineessa, jolloin saatiin kuiva jäännös, joka sisälsi bioaktiivisia fragmentteja. BBM-1675C-aine eristettiin jäännöksestä pikapylväskromatogra-fian (flash column chromatography) avulla käyttämällä pyl-35 västä, jonka sisähalkaisija oli 2 cm ja pituus 10 cm ja joka oli pakattu Woelm'in piihappogeelillä (osaskoko 24 83422 32-63 mikronia). Pylväs eluoitiin tolueeni:asetoni (3:2, til./til.)-seoksella ja 3 ml:n suuruiset fraktiot otettiin talteen. Jokainen fraktio analysoitiin TLC:n avulla ^piihappogeeli ja eluenttina tolueeni:asetoni (3:2, til./ 5 til.)-seos_7 ja TLC-täplät tehtiin silminnähtäviksi UV 254 nm-valolähteen ja seriumsulfaattisuihkeen avulla (1 % seriumsulfaattia ja 2,5 % molyboolihappoa 10-%:isessa rikkihapossa). Fraktiot 6-12 (R^-arvo BBM-1675C:lle on 0,28) yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 10 12 mg (35 %) oleellisesti puhdasta BBM-1675C.

BBM-1675C:n fysikokemialliset ominaisuudet käyvät ilmi keksinnön selityksestä ja yhdisteen ultravioletti-, 1 13 infrapuna-, massa-, H-NMR- ja NMR-spektrit käyvät ilmi vastaavasti kuvioista 1, 3, 5, 7 ja 9.

15 Esimerkki 2

Kun menetelmän reaktioaikaa esimerkissä 1 pidennetään, pienenee BBM-1675C:n määrä ja todetaan kaksi uutta tuotetta, joista on käytetty nimityksiä yhdiste 3 (R^ = 0,65) ja BBM-1675D (R^ pysyy perusviivalla) /TLC: piihap-20 po, tolueeni .-asetoni (3:2, til./til.) -seosj? ja ne tulevat silmiinpistävämmiksi ajan kuluessa.

Yhdiste BBM-1675D, joka tavallisesti muodostuu BBM-1675C;n valmistuksen yhteydessä, eristettiin esimerkissä 1 kuvatusta kromatografisesta pylväästä eluoimalla pyl-25 väs kloroformi:metanoli (5:1, til./til.)-seoksella. Sopivat fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 18 mg oleellisesti puhdasta BBM-1675D:tä esi- · merkissä 1 kuvatusta reaktiosta.

BBM-1675D-aine antaa yhden pääasiallisen täplän, 30 jolle saatiin R^-arvo = 0,37 käänteisfaasi TLC:ssä (Whatman MKC^gF, 200 mikronia) käytettäessä 30-%:ista veden metano-liliuosta eluenttina ja saatiin R^-arvo = 0,22 normaali-faasi-piihappogeeli-TLC:ssa käytettäessä kloroformi^etanoli (5:0,5, til./til.)-seosta eluenttina.

Il 25 83422

Esimerkki 3

Huomattava paraneminen BBM-1675D:n saannossa voidaan saavuttaa käyttämällä p-tolueenisulfonihappoa kloorivedyn sijasta BBM-1675Ä2:n tai BBM-1675A^:n kemiallises-5 sa hydrolyysissä, kuten on kuvattu vastaavasti esimerkkien 3 ja 5 avulla.

BBM-1675A2tn näyte (15,2 mg) hydrolysoitiin p-tolu-eenisulfonihapon 0,03 molaarisen metanoliliuoksen (1 ml) kanssa noin 63°C:n lämpötilassa noin tunnin ajan. Reaktio-10 seos haihdutettiin sen jälkeen kuiviin alipaineessa noin 30°C:ssa. BBM-1675D-aine eristettiin kuivasta jäännöksestä pikapylväskromatografiän avulla käyttämällä pylvästä, joka oli pakattu Woelm'in piihappogeelillä (osaskoko 32-63 mikronia) . Pylväs eluoitiin kloroformi:etanoli (5:0,5, til./ 15 til.)-seoksella ja yhdistetyt fraktiot analysoitiin TLC:n avulla /käyttämällä piihappogeeliä ja eluenttina kloroformi :metanoli (5:0,5 til./til.)-seosta^. Käytetyt kromato-grafiaolosuhteet sallivat inaktiivisten yhdisteiden 2 ja 3 (7 mg) seoksen erottamisen bioaktiivisesta BBM-1675D-ai-20 neesta, jolla on R^-arvo 0,22. Sopivat fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 8 mg oleellisesti puhdasta BBM-1675D:tä, mikä vastasi lähes kvantitatiivista saantoa.

BBM-1675D:n fysikokemialliset ominaisuudet käyvät 25 ilmi keksinnön selityksestä ja yhdisteen ultravioletti-, 113 infrapuna-, massa-·, H-NMR- ja C-NMR-spektrit käyvät ilmi vastaavasti kuvioista 2, 4, 6, 8 ja yhdistetyistä kuvioista 10A ja 10B.

Esimerkki 4 30 BBM-1675A2:n näytettä (40 mg) käsiteltiin 5 ml:n kanssa kloorivedyn 0,5 molaarista metanoliliuosta noin 50°C:ssa noin kahden tunnin ajan esimerkissä 1 esitetyn yleisen valmistusmenetelmän ja eristysmenetelmän mukaan. NaHCO^sn avulla suoritetun neutraloinnin ja kuiviinhaih-35 dutuksen jälkeen BBM-1675C-aine eristettiin jäännöksestä pikapylväskromatografiän avulla käyttämällä pylvästä, 26 83422 joka oli täytetty Woelm'in piihappogeelillä (osaskoko 32-63 mikronia) ja eluenttina tolueeni:asetoni (3:2, til./ til.)-seosta. Sopivat fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 8,4 mg oleellisesti puhdasta 5 BBM-1675C:tä, joka on identtistä esimerkissä 1 eristetyn tuotteen kanssa.

Edellä mainittu kromatografinen pylväs eluoitiin sen jälkeen kloroformiimetanoli (5:0,25 til./til.)-seoksella ja kootut fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin 10 kuiviin, jolloin saatiin BBM-1675D:tä. BBM-1675D-aine puhdistettiin edelleen sen jälkeen käyttämällä vielä yhtä pikakromatografiapylvästä, joka oli täytetty piihappogeelillä ja eluenttina kloroformi:metanoli (5:0,5, til./til.)-seosta. Sopivat fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin 15 kuiviin, jolloin saatiin 6,3 mg oleellisesti puhdasta BBM-1675D:tä, joka on identtistä esimerkissä 3 eristetyn tuotteen kanssa.

Esimerkki 5 BBM-1675A.J :n näyte (49,3 mg) hydrolysoitiin p-toluee-20 nisulfonihapon 0,035 molaarisella metanoliliuoksella (1,5 ml) noin 60°C:n lämpötilassa noin 1,5 tunnin ajan.

! Reaktioseos haihdutettiin kuiviin alipaineessa noin 30°C:ssa, jolloin saatiin jäännös, joka sisältää BBM-1675D:tä sekä inaktiivisia yhdisteitä 1 ja 3. Bioaktiivi-25 nen BBM-1675D-aine eristettiin jäännöksestä pikapylväs-kromatografiän avulla käyttämällä pylvästä, joka oli täytetty Woelm'in piihappogeelillä (osaskoko 32-63 mikronia) ja eluenttina kloroformi:metanoli (5:0,2, til./til.)-seosta. Sopivat fraktiot yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, 30 jolloin saatiin 27 mg oleellisesti puhdasta BBM-1675D:tä, joka oli identtistä esimerkissä 3 eristetyn tuotteen kanssa.

Esimerkki 6 BBM-1675C:n näyte (5,1 mg) hydrolysoitiin kloorivedyn 0,5 molaarisella metanoliliuoksella (1 ml) välillä noin 35 40-50°C yön yli. NaHCOjsn avulla suoritetun neutraloinnin ja kuiviinhaihdutuksen jälkeen bioaktiivinen BBM-1675D- 27 83422 aine eristettiin jäännöksestä pikapylväskromatografiän avulla käyttämällä pylvästä, joka oli täytetty Woelm'in piihappogeelillä (osaskoko 32-63 mikronia) ja eluenttina kloroformi:metanoli (5:0,25, til./til.)-seosta. Sopivat 5 fraktiot antoivat oleellisesti puhdasta BBM-1675D:tä, joka oli identtistä esimerkissä 3 eristetyn tuotteen kanssa.

Esimerkki 7

Kun esimerkkien 1 ja 2 mukainen yleinen menetelmä toistetaan, lukuun ottamatta sitä, että lähtömateriaali 10 BBM-1675A.J korvataan ekvimolaarisella määrällä seosta, joka sisältää BBM-1675A^:tä ja BBM-1675A2:ta, saadaan tällöin BBM-1675C- ja BBM-1675D-aineita.

Esimerkki 8

Kun esimerkin 5 yleinen menetelmä toistetaan, lu-15 kuun ottamatta sitä, että lähtömateriaali BBM-1675A1 korvataan ekvimolaarisella määrällä seosta, joka sisältää BBM-1675A1:tä ja BBM-1675Ä2:ta, saadaan tällöin BBM-1675D-ainetta.

Claims (2)

28 83 422

1. Menetelmä kasvaimia torjuvan antibiootin BBM-1675C valmistamiseksi, tunnettu siitä, että hyd-5 rolysoidaan BBM-1675A!, BBM-1675A2 tai näiden seos mineraa- lihapon tai orgaanisen hapon avulla siksi kunnes oleellinen määrä BBM-1675C:tä on muodostunut ja sen jälkeen otetaan reaktion väliaineesta talteen BBM-1675C, jolla oleellisesti puhtaassa muodossaan on seuraavia tuntomerkit) kejä: (a) se näyttää amorfiselta kiinteältä aineelta; (b) se on liukoinen metanoliin, etanoliin, etyyliasetaattiin, asetoniin, tetrahydrofuraaniin ja kloroformiin; 15 (c) se antaa piihappogeeli-ohutkerroskromatografi- assa Rf-arvon 0,28 käytettäessä liuotinjärjestelmänä tolu-eeni: asetoni (3:2, til./til.)-seosta; (d) sen näennäinen molekyylipaino on 855 määritettynä suurtehoisen erottelukyvyn omaavan FAB-massaspektros- 20 koplan avulla: (e) sen ultraviolettivalon absorptiospektri metano-liliuoksessa on oleellisesti sellainen kuin kuviossa 1 on esitetty ja osoittaa ultraviolettivalon absorptiomaksimit ja absorboituvuudet arvoilla 210 nm (a 21 770), 274 nm 25 (a * 9 340) ja 313 nm (olake) (a = 4 190), ilman että ilmenee mitään merkittävää muutosta lisättäessä happoa tai emästä; (f) sen infrapunavalon absorptiospektri (KBr, kalvo) on oleellisesti sellainen kuin kuviossa 3 on esitetty 30 ja osoittaa pääasialliset absorptiohuiput kohdissa 540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118, 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930, 2970 och 3450 cm"1; (g) sen heikkotehoisella erottelulaitteella saatu 35 massaspektri on oleellisesti sellainen kuin kuviossa 5 on 29 8 3 4 2 2 esitetty ja osoittaa molekulaarinen ioni [M+H]+ -arvoa 856; (h) sen protonimagneettinen resonanssispektri (360 MHz) CDCl3:ssa on oleellisesti sellainen kuin kuviossa 7 on esitetty ja osoittaa signaalit kohdissa 5 6,54 (1H, dd, J=7,7, 7,0); 6,21 (1H, brs); 5,87 (1H, d, J=9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6, 1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J-10,3, 1,8); 4,61 (1H, d, J=7,7); 4,25 (1H, s); 4,09 (1H, q, J=2,6); 3,97 (1H, t, J-9,6); 3,92-3,53 (10H), 3,45 (1H, dt, 10 J=10,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (1H, m); 2,69 (1H, dt, J*9,9, 5,2); 2,49 (1H, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m); 2,13 (1H, m); 2,09 (3H, s); 1,50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); ja 1,08 (6H) ppm; tetrametyylisilaanista; 15 (i) sen hiili-13:n magneettinen resonanssispektri (90,6 MHz) CDCl3:ssa on oleellisesti sellainen kuin kuviossa 9 on esitetty ja osoittaa signaalit kohdissa 13,7, 17,5 19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 35,2, 39,5, 47,7, 52,7, 55,8, 56,1, 57,7, 62,4, 64,7, 20 67,4, 69,3, 69,8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7, 79,7, 83,2, 88,4, 97,3, 99,7, 123,4, 124,6, 130,1 och 193,1 ppm; tetrametyylisilaanista.

2. Menetelmä kasvaimia torjuvan antibiootin BBM-1675D valmistamiseksi, tunnettu siitä, että hyd-25 rolysoidaan BBM-1675AJ, BBM-1675A2 tai näiden seos tai BBM-1675C mineraalihapon tai orgaanisen hapon avulla siksi kunnes oleellinen määrä BBM-1675D:tä on muodostunut ja sen jälkeen otetaan reaktion väliaineesta talteen BBM-1675D, jolla oleellisesti puhtaassa muodossaan on seuraavia tun-30 tomerkkejä: (a) se näyttää amorfiselta kiinteältä aineelta; (b) se on liukoinen metanoliin, etanoliin, asetoniin ja tetrahydrofuraaniin ja on niukkaliuokoinen kloroformiin; 35 (c) antaa piihappogeeli-ohutkerroskromatografiässä 30 8 3 422 Rf-arvon 0,22 käytettäessä liuotinjärjestelmää kloroformi: metanoli (5:0,5, til./til.)-seosta ja antaa käänteisfaasi-piihappogeeli-ohutkerroskromatografiässä Rf-arvon 0,37 käytettäessä liuotinjärjestemänä metanoli:vesi (70:30 5 til./til.)-seosta; (d) sen näennäinen molekyylipaino on 695 määritettynä korkean erottelukyvyn omaavan FAB-massaspektroskopian avulla; (e) sen ultraviolettivalon absorptiospektri matano-10 liliuoksessa on oleellisesti sellainen kuin kuviossa 2 on esitetty ja osoittaa ultraviolettivalon absorptiomaksimit ja absorboituvuudet arvoilla 214 nm (a - 27 000), 274 nm (a = 12 800) ja 325 nm (a = 5 400), ilman että ilmenee mitään merkittävää muutosta lisättäessä happoa tai emästä; 15 (f) sen infrapunavalon absorbtiospektri (KBr, kal vo) on oleellisesti sellainen kuin kuviossa 4 on esitetty ja osoittaa pääasialliset absorptiohuiput kohdissa 735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195, 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 20 1720, 1735, 2880, 2930, 2960 och 3400 cm'1; (g) sen heikkotehoisella erottelulaitteella saatu massaspektri on oleellisesti sellainen kuin kuviossa 6 on esitetty ja osoittaa molekulaarinen ioni [M+H]+-arvoa 696; (h) sen protoni-magneettisen resonanssispektri (360 25 MHz) (CDC13 + 10-%:inen CD30D)-seoksessa on oleellisesti sellainen kuin kuviossa 8 on esitetty ja osoittaa signaalit kohdissa 6,43 (1H, dd, J=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (lH,d, J=8,8); 5,48 (1H, 6 brs); 30 4,48 (1H, d, J=8,1); 4,02 (1H, d, J«2,0); 3,95-3,80 (liuotintausta); 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm); 3,35 (1H, m); 3,28, (3H, s,); 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23-2,12 (2H, m); 1,42 (1H, brdt); 1,22 (3H, d, J-5,9); 0,94 35 (3H, d, J=6,6); och 0,87 (3H, d, J=5,9) ppm; tetra- il 3i 83422 metyylisilaanista; (i) sen hiili-13:n magneettinen resonanssispektri (90,6 MHz) (CDC13 + 10-%:inen CD30D)-seoksessa on oleellisesti sellainen kuin kuviossa 10 (kuviot 10A + 10B) on 5 esitetty ja osoittaa signaalit kohdissa 17,5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8, 62,1, 67,8, 69,8, 70,1 71,3, 75,8, 77,1, 78.1, 82,4, 83,3, 88,2, 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130.1, 130,8, 134,3, 148,7 och 192,8 ppm; tetra- 10 metyylisilaanista. 32 8 3 4 2 2