FI67403C - Foerfarande foer framstaellning av antibiotfoereningar med antitumoereffekt - Google Patents

Description

I5SF1 M iM)*uu,LOTOS*uulA,su sld n -7 11 UTLAGGNINGSSKRIFT 0/4U0 (51) KvJk/fcit.CL^ C 12 P 1/06, 17/16 SUOMI—FINLAND pi)hii«»^-fwM*e^i 800973 (22) H»k«mbp*lvfl — AmBknJnftdaf 28.03.80 ' ' (23) Alk«ipilvt--Gltäffc*t»d*f 28.03.80 (41) Tullut JuUriMksI — Bllvlt ο€·μΧ| g, , g g g

Putantti- ja rekisterihallitut .......... „ ,_ _ . . ' , , (44) NMiMwMalfwon 1» fcuul|ufal—i prm.— -n

Patent- och registarstyralsan Ammuu ικΐφΐ odi ucLskrift·* puMiceratf 30.11.o4 (32)(33)(31) PjrjMeejr ueuoHcuu» BfV4 prtoricat 02.04.79 USA(US) 026488 Toteennäytetty-Styrkt (71) Bristol-Myers Company, 345 Park Avenue, New York, New York 10022, USA(US) (72) Hideo Koshiyama, Tokyo, Fumihide Sakai, Yokohama,

Hiroaki Ohkuma, Tokyo, Japani-Japan(jP) (74) Oy Kolster Ab (54) Menetelmä kasvainten vastaisten antibioottiyhdisteiden valmistamiseksi -Förfarande för framställning av antibiotföreningar med antitumöreffekt

Keksintö koskee menetelmää uusien kasvainten vastaisten, antibioottiyhdisteiden BBM-928A, BBM-928B, BBM-928C ja BBM-928D sekä niitä sisältävän BBM-928-kompleksin valmistamiseksi, jolloin (A) yhdisteellä BBM-928A on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin ja metyleenikloridiin, jonkin verran bentseeniin, etanoliin, metanoliin ja n-buta-noliin, ja on olennaisesti liukenematon veteen ja n-heksaaniin; (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridi- ja Ehrlich-reagenssien kanssa ja negatiivisen reaktion Tollens-, Sakaguchi- ja ninhydriinireagenssien kanssa; (c) se on tehokas kasvainten vastainen aine seuraavia hiiriin intraperitoneaalisesti istutettuja kasvaimia vastaan: P388 leukemia, L1210 leukemia, B16 melanooma, Lewis keuhko-karsinooma ja sarkooma 180 askiitit; (d) sen sulamispiste on 246-248°C; 67403 - 25 o (e) sen ominaiskiertokyky on /*7D - “27 (c 1, CHCl^); (f) sen molekyylipaino on 1427; (g) sen alkuaineanalyysi on noin 52,47 % hiiltä, 5,48 % vetyä, 13,81 % typpeä ja 28,24 % happea; (h) sen R^-arvo silikageeliohutkerroskromatografiässä on 0,71 liuotinsysteemillä n-butanoli-metanoli-vesi (63:27:10) ja 0,48 liuotinsysteemillä ksyleeni-metyylietyyliketoni-meta-noli (5:5:1); (i) happohydrolyysissä siitä saadaan vesiliukoisia nin-hydriini-positiivisia aineita, kuten /5-hydroksi-N-metyyli-valiinia, glysiiniä, seriiniä ja sarkosiinia; (j) emäshydrolyysissä siitä saadaan fragmentti, jonka kaava on “Tr^r08

Ser->X^ Gly-^s· Sar-^ HM-Val jossa Ser on seriini, Gly on glysiini, Sar on sarkosiini, HM-Val on β-hydroksi-N-metyylivaliini ja X on aminohappo-ryhmä, jonka bruttokaava peptimuodossa on C^Hg^C^; (k) sen infrapunaspektri kaliumbromidissa on oleellisesti kuviossa 1 esitetty; ja (l) liuotettuna deuteroituun kloroformiin sillä on oleellisesti kuviossa 5 esitetty protoni-NMR-spektri; (B) yhdisteellä BBM-928B on kinoliinikromofori ja happohydrolyysissä saadaan vesiliukoisia komponentteja, kuten seriiniä, glysiiniä, sarkosiinia ja p-hydroksi-N-metyyliva-liinia, ja oleellisesti puhtaassa muodossa sillä on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin ja metyleenikloridiin, jonkin verran bentseeniin, etanoliin, metanoliin ja n-buta-noliin, ja on olennaisesti liukenematon veteen ja n-heksaaniin; (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridi- ja Ehrlich-reagenssien kanssa ja negatiivisen reaktion Tollens-, Sakaguchi- ja ninhydriinireagenssien kanssa; (c) se on tehokas hiiriin intraperitoneaalisesti istutettua P 388 leukemiaa vastaan; (d) sen sulamispiste on 214-217°C; (e) sen ominaiskiertokyky on = -74° (c 1, CHCl^) ; 3 67403 (f) sen alkuaineanalyysi on noin 50,14 % hiiltä, 5,29 % vetyä, 12,34 % typpeä ja 32,23 % happea; (g) sen Rf-arvo silikageeliohutkerroskromatografiässä on 0,53 liuotinsysteemillä n-butanoli-metanoli-vesi (63:27:10) ja 0,26 liuotinsysteemillä ksyleeni-metyylietyyliketoni-meta-noli (5:5:1); (h) sen infrapunaspektri kaliumbromidissa on oleellisesti kuviossa 2 esitetty; ja (i) liuotettuna deuteroituun kloroformiin sillä on oleellisesti kuviossa 6 esitetty protoni-NMR-spektri; (C) yhdisteellä BBM-928C on kinoliinikromofori ja hap-pohydrolyysissä saadaan vesiliukoisia komponentteja, kuten seriiniä, glysiiniä, sarkosiinia ja p> -hydroksi-N-metyyliva-liinia, ja oleellisesti puhtaassa muodossa sillä on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin ja metyleenikloridiin, jonkin verran bentseeniin, etanoliin, metanoliin ja n-buta-noliin, ja on olennaisesti liukenematon veteen ja n-heksaaniin; (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridi- ja Ehrlich-reagenssin kanssa ja negatiivisen reaktion Tollens-, Sakaguchi- ja ninhydriinireagenssien kanssa; (c) se on tehokas hiiriin intraperitoneaalisesti istutettuja seuraavia kasvaimia vastaan: P388 leukemia, L1210 leukemia, B16 melanooma, Lewis-keuhkokarsinooma ja sarkooma 180 askiitit; (d) sen sulamispiste on 244-248°C; (e) sen ominaiskiertokyky on /ot_7p5 = -91° (c1, CHCl^) ; (f) sen molekyylipaino on noin 1470; (g) sen alkuaineanalyysi on noin 51,77 % hiiltä, 5,29 % vetyä, 13,55 % typpeä ja 29,39 % happea; (h) sen R^-arvo silikageeliohutkerroskromatografiässä on 0,27 liuotinsysteemillä n-butanoli-metanoli-vesi (63:27:10) ja 0,07 liuotinsysteemillä ksyleeni-metyylietyyliketoni-metanoli (5:5:1) ; (i) sen infrapunaspektri kaliumbromidissa on oleellisesti kuviossa 3 esitetty; ja (j) liuotettuna deuteroituun kloroformiin sillä on oleellisesti kuviossa 7 esitetty protoni-NMR-spektri; ja (D) yhdisteellä BBM-928D on seuraavat ominaisuudet: 4 67403 (a) se liukenee kloroformiin ja metyleenikloridiin, jonkin verran bentseeniin, etanoliin, metanoliin ja n-buta-noliin, ja on olennaisesti liukenematon veteen ja n-heksaaniin; (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridi- ja Ehrlich-reagenssien kanssa ja negatiivisen reaktion Tollens-, Sakaguchi- ja ninhydriinireagenssien kanssa; (c) se on tehokas intraperitoneaalisesti hiiriin istutettua P388 leukemiaa vastaan; (d) sen sulamispiste on 224-227°C; (e) sen ominaiskiertokyky on &_7D = ~13° (c 1, CHCl^); (f) sen alkuaineanalyysi on noin 50,75 % hiiltä, 5,25 % vetyä, 12,58 % typpeä ja 31,42 % happea; (g) sen R^-arvo silikageeliohutkerroskromatografiässä on 0,73 liuotinsysteemillä n-butanoli-metanoli-vesi (63:27:10) ja 0,53 liuotinsysteemillä ksyleeni-met.yylietyyliketoni-me-tanoli (5:5:1) ; (h) sen infrapunaspektri kaliumbromidissa on oleellisesti kuviossa 4 esitetty; (i) liuotettuna deuteroituun kloroformiin sillä on oleellisesti kuviossa 8 esitetty protoni-NMR-spektri.

Esitettyjen spektrien ja saatavissa olevien fysiko-kemiallisten ominaisuuksien perusteella kyseessä olevat kasvainten vastaiset antibioottiyhdisteet ovat rakenteeltaan lähellä kinoksaliiniantibiootteja, kuten ekinomysiiniä, Dell et ai., J. Am. Chem. Soc., 97, 2497 (1975), kinomysiinejä,

Shoji et ai., J. Antibiotics, 14a, 335 (1961), ja triostiini C:tä, The Merck Index, 9. painos, 9399. Nyt kuvatut kasvainten vastaiset antibioottiyhdisteet eroavat näistä antibiooteista kuitenkin seuraavasti: 1. Nyt valmistettu antibioottikompleksi ja sen komponentit sisältävät kromoforina kinoliiniryhmän aktinoleukiini-ryhmän antibioottien sisältämän kinoksaliinin sijasta.

2. Nyt valmistettu antibioottikompleksi ja sen komponentit eivät sisällä rikkiä, kun sen sijaan aktinoleukiini-antibiooteissa on disulfidi- tai tioasetaalisilta.

3. Nyt valmistettu antibioottikompleksi ja sen komponentit ovat suhteellisen heikosti antimikrobisia verrattuna aktinoleukiineihin, joilla on vahva antibakteerinen vaikutus.

67403

Uudet kasvainten vastaiset antibioottiyhdisteet BBM-928A, BBM-928B, BBM-928C ja BBM-928D sekä niitä sisältävä BBM-928-kompleksi valmistetaan keksinnön mukaan siten, että Actino-mycetes-kantaa ATCC 31491 viljellään vesipitoisessa liuoksessa, joka sisältää assimiloituvan hiililähteen ja assimiloituvan typpilähteen, submerssisissa aerobisissa olosuhteissa kunnes muodostunutta BBM-928-kompleksia sisältävä liuos osoittaa oleellista kasvainten vastaista, antibioottista aktiivisuutta, minkä jälkeen BBM-928-kompleksi otetaan talteen vil-jelyväliaineesta ja haluttaessa yhdisteet BBM-928A, BBM-928B, BBM-928C ja BBM-928D erotetaan. BBM-928-kompleksin talteenoton jälkeen kompleksin sisältämät bioaktiiviset komponentit voidaan erottaa käyttäen vastavirtajakautuma- ja kromatogra-fiatekniikkaa.

Kuviossa 1 on BBM-928A:n infrapuna-absorptiospektri KBr:ssä.

Kuviossa 2 on BBM-928B:n infrapuna-absorptiospektri KBr:ssä.

Kuviossa 3 on BBM-928C:n infrapuna-absorptiospektri KBr:ssä.

Kuviossa 4 on BBM-928D:n infrapuna-absorptiospektri KBr:ssä.

Kuviossa 5 on deuteroituun kloroformiin liuotetun BBM-928A:n protoni-magneettinen-resonanssispektri määritettynä NMR-spektrometrillä, frekvenssi 90 MHz, käyttäen sisäisenä standardina TMS:aä.

Kuviossa 6 on deuteroituun kloroformiin liuotetun BBM-928B:n protoni-magneettinen-resonanssispektri määritettynä NMR-spektrometrillä, frekvenssi 90 MHz, käyttäen sisäisenä standardina TMS:ää.

Kuviossa 7 on deuteroituun kloroformiin liuotetun BBM-928C:n protoni-magneettinen-resonanssispektri määritettynä NMR-spektrometrillä, fekvenssi 90 MHz, käyttäen sisäisenä standardina TMS:ää.

Kuviossa 8 on deuteroituun kloroformiin liuotetun BBM-928D:n protoni-magneettinen-resonanssispektri määritettynä NMR-spektrometrillä, frekvenssi 90 MHz, käyttäen sisäisenä standardina TMS:ää.

6 67403

Uuden BBM-928-kompleksin uskotaan olevan rakenteellisesti lähellä aktinoleukiiniantibiootteja, ja sitä on valmistettu viljelemällä aktinomykeetteihin kuuluvan mikro-organismin kantaa n:o G455-101, joka on talletettu Bristol-Banyu'n viljelmäkokoelmaan. Mikro-organismi on eristetty Filippiineiltä peräisin olevasta maanäytteestä ja talletettu laitokseen American Type Culture Collection tunnuksella ATCC 31491.

Uusi kasvainten vastainen antibioottikompleksi sisältää vähintään kuusi komponenttia, joille on annettu nimitykset BBM-928A, B, C, D, E ja F. BBM-928 komponentit A, B, C ja D on eristetty kiteisinä, ja komponenttien A, B ja C rakenteet on identifioitu. Kompleksilla ja sen eri komponenteilla on kasvainten vastaista antibakteerista aktiivisuutta. Antibak-teerisen aktiivisuutensa vuoksi kompleksia ja sen komponentteja voidaan käyttää eläinrehujen lisäaineina ja terapeuttisina aineina nisäkkäiden bakteeri-infektioiden käsittelyssä. Lisäksi antibiootteja voidaan käyttää laboratoriolasitavaroi-den ja kirurgisten instrumenttien puhdistamiseen ja sterilointiin sekä yhdessä saippuoiden, pesuaineiden ja pesuliuosten kanssa puhdistustarkoituksiin. Kompleksilla ja sen komponenteilla on osoitettu olevan kasvainten vastaista aktiivisuutta erityisesti erilaisia intraperitoneaalisesti hiiriin istutettuja kasvaimia vastaan.

Aktinomykeettikanta n:o G455-101

Seuraavassa kuvataan yleisesti kasvainten vastaista an-tibioottikompleksia BBM-928 tuottavaa mikro-organismia. Havaintoja tehtiin mikro-organismin viljelyolosuhteista ja fysiologisista ja morfologisista ominaisuuksista taksonometristen standardimenetelmien mukaisesti, ks. esim. Shirling et ai.,

Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313 (1966) ja Lechevalier et ai., Biol. Actinomycetes Related Org. 11, 78 (1976).

Mikromorfologia - Kanta G455-101 muodostaa sekä viljely-väliaine- että ilmarihmastoa, ja viljelyväliainerihmasto on hyvin kehittynyttä, pitkää ja haarautunutta (paksuus 0,5-0,8 jm) . Viljelyväliainerihmastossa ei havaita selvää fragmenttien muodostumista. Poiketen tavallisista Streptomyces-lajeista G455-101-kannassa on vain lyhyitä, surkastuneita ilmarihmastoja, ja joillakin agar-väliaineilla se ei muodosta niitä lainkaan. Ilmarih-mastossa on lyhyitä ja pitkiä itiöketjuja, jotka sisältävät 2-50 soikeaa 7 67403 itiötä (useimmiten 5-20 itiötä) ketjussa. Itiöketjut ovat muodoltaan suoria, mutkaisia tai silmukkamaisia. Itiöt ovat muodoltaan pallomaisia (0,3 - 0,4 ^um), soikeita tai lieriömäisiä (0,3 x 1,5 - 3,0 ^um) ja niiden pinta on sileä. Itiöitä erottaa toisistaan usein tyhjät hyyfit. Ilmarihmastossa havaitaan toisinaan amorfinen sporanginkal-tainen rakkula, josta kehittyy lyhyitä kierteisiä itiöketjuja.

Soluseinämän koostumus ja koko solun sokerikomponentit - Kannan G455-101 soluseinämä sisältää meso-diaminopimeliinihappoa, mutta ei sisällä glysiiniä. Koko solun hydrolysaatissa on glukoosia, mannoosia ja maduroosia (3-0-metyyli-D-galaktoosi). Soluseinämäkoos-tumus ja koko solun sokerikomponentit osoittavat kannan G455-101 kuuluvan aktinomykeettien soluseinämätyyppiin IIIB.

Viljely- ja fysiologiset ominaisuudet - Kanta G455-101 kasvaa runsaasti, muodostaa vaaleanpunaista tai harmahtavan vaaleanpunaista ilmarihmastoa ja tuottaa punertavaa veteen liukenematonta pigmenttiä ravintorikkaissa agarväliaineissa, kuten hiivauute-mallas-uuteagarissa ja kaurajauhoagarissa. Sen kasvu on kuitenkin heikkoa epäorgaanisia suoloja sisältävässä tärkkelysagarissa, glyseroli-asparagiiniagarissa ja tyrosiiniagarissa, joissa se muodostaa valkeaa tai beigenväristä surkastunutta ilmarihmastoa ja tuottaa vähäisen määrän punertavaa pigmenttiä. Peptoni-hiiva-rauta-agarissa ja tyrosiiniagarissa ei muodostu melanoidipigmenttiä. Nitraatti pelkistyy nitraatiksi. Sen kasvu on runsasta lämpötiloissa 28°C, 37°C ja 45°C, mutta se ei kasva 10°C:ssa eikä 50°C:ssa. Kanta käyttää hyvin hyväkseen pentooseja ja heksooseja. Kannan G455-101 viljelyominaisuudet on esitetty taulukossa 1 ja fysiologiset ominaisuudet taulukossa 2. Hiililähteiden hyväksikäyttö on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 1

Kannan G455-101A viljelytunnusmerkit

XX

1. Czapek-agar G ei kasvua tai heikko kasvu (Sakkaroosi-nitraatti) „ .

R tummanruusunpunamen A valkea tai vaaleanpunainen D ei ole 2. Tryptoni-hiivauuteliemi kohtalainen kasvu, höytymäi- (ISP nro 1) nen, sedimentoitunut, ei pigmenttiä 8 67403 3. Hiivauute - mallasuuteagar G runsas (ISP nro 2) „ ..

R syvanpunaisesta punertavan- ruskeaan A runsas, harmahtavan vaalean punaisesta vaaleanpurppuraan D ei ole 4. Kaurajauhoagar (ISP nro 3) G runsas R vahvan kellertävän punainen A kohtalainen, vaaleanpunainen D harmahtavankeltäinen 5. Epäorgaaniset suolat - G heikko tärkkelysagar (ISP nro 4) R vaalean keilertävtaruskeasta tummanpunaiseen A heikko, valkea tai beige D ei ole 6. Glyseroli-asparagiiniagar G heikko (ISP nro 5) R kellertävän vaaleanpunaisesta punertavaan A heikko, valkea D ei ole 7. Peptoni-hiivauute-rauta- G heikko, poimuinen agar (ISP nro 6) R vahva punertavanoranssi A ei ole D vaalean kellertävän oranssi 8. Tyrosiiniagar (ISP nro 7) G heikko R tummanpunainen A heikko, valkea D ei ole 9. Glukoosi-ammoniumsuo.lat- G heikko a<3ar r punertavanruskea A heikko, vaaleanharmaa D ei ole 10. Bennet1 in agar G kohtalainen R punertavanruskea A rajoittunut, harmahtavan vaa leanpunainen D ei ole 9 67403 χ havainnot suoritettu kolmen viikon inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa xx Lyhenteet: G - kasvu R - substraattirihmaston alapuolen väri A - ilmarihmasto D - diffundoituvaa pigmenttiä

Taulukko 2

Kannan G455-101 fysiologiset ominaisuudet

Koe Tulos Menetelmä ja väliaine

Nitraatti nitriiliksi positiivinen epäorgaaninen väliaine: Czapek- sakkaroosi-nitraattiliemi

Nitraatti nitriitiksi positiivinen orgaaninen väliaine: 0,5 % hii- vauutetta, 1,0 % glukoosia, 0,5 % KN03, 0,1 % CaC03

Kaseiinin hydrolyysi heikosti Luedemann1 in agarväliaine agarväliaineessa positiivinen

Rasvattoman maidon positiivinen koaguloituminen

Gelatiinin nesteyty- negatiivinen tryptoni-hiivauuteliemi (ISP

minen nro 1 väliaine) + 15 % gela tiinia

H2S:n tuottaminen positiivinen tryptoni-hiivauutelieni (ISP

kysteiinistä nro 1 väliaine) + 0,1 % L-kys- teiiniä + agaria. H2S todettiin 10-%:ista lyijyasetaatti-liuosta sisältävällä paperi-liuskalla

Melanoidin muodostu- negatiivinen peptoni-hiivauute-rauta-agar minen (ISP nro 6) ja tyrosiiniagar (ISP nro 7)

Katalaasireaktio positiivinen H202~vesiliuos

Oksidaasireaktio positiivinen Kovacs'in reagenssi

Kasvulämpötila runsas kasvu Bennet'in agar lämpötiloissa 28, 37 ja 45°C Heikko kasvu 20°C:ssa. Ei kasva 10°C:ssa eikä 50°C:ssa 10 67403

Taulukko 3

Kannan G455-101 hiililähteiden hyväksikäyttö PG Lm 1. Glyseroli ++ + 2. D(-)-arabinoosi + + 3. L (+)-arabinoosi + + 4. D-ksyloosi ++ + 5. D-riboosi ++ + 6. L-ramnoosi ++ + 7. D-glukoosi + + 8. D-galaktoosi ++ + 9. D-fruktoosi ++ + 10. D-mannoosi ++ + 11. L(-)-sorboosi 12. Sakkaroosi 13. Laktoosi - 14. Sellobioosi + + 15. Melibioosi 16. Trehaloosi + + 17. Raffinoosi 18. D(+)-meletsitoosi 19. Liukoinen tärkkelys + 20. Dulsitoli 21. Inositoli + 22. D-mannitoli ++ + 23. D-sorbitoli 24. Salisiini 25. Selluloosa + + 26. Kitiini + + 27. Herätiini + +

Perusväliaine PG: Pridham-Gottlieb'in epäorgaaninen väline + 0,1 % hiivauutetta LM: Luedemann'in orgaaninen väliaine Inkubaatio kaksi viikkoa 37°C:ssa.

67403

Kasvainten vastaisen antibioottikompleksin BBM-928 valmistus

Kasvainten vastaisen antibiootin, BBM-928-kompleksin valmistamiseksi viljellään aktinomykeettikantaa, jolla on kannan G455-101 tunnusmerkit, vesipitoisessa liuoksessa, joka sisältää assimiloituvaa hiilenlähdettä ja assimiloituvaa ty-penlähdettä, submerssisissa aerobisissa olosuhteissa, kunnes tuotetun BBM-928-kompleksin muodostuksen ansiosta mainittu liuos on saanut kasvainten vastaista antibioottista aktiivisuutta. Aktinomykeettikannan G455-101 viljelyssä käytetään tavanomaisia fermentointimenetelmiä. Kasvainten vastaisten antibioottien valmistuksessa käytetään väliaineita, jotka sisältävät assimiloituvan hiilen lähteinä esimerkiksi tärkkelystä, glukoosia, dekstriiniä, maltoosia, laktoosia, sakkaroosia, fruktoosia, mannoosia, melassia, glyserolia tms. Ravintoväliaineen tulisi sisältää myös assimiloituvan typen lähdettä, kuten proteiinia, proteiinihydrolysaattia, poly-peptidejä, aminohappoja, maissin liuotuslientä, kaseiinia, ureaa tms., sekä epäorgaanisia ravinnesuoloja, joista saadaan epäorgaanisia anioneja ja kationeja, kuten kaliumia, natriumia, ammoniumia, kalsiumia, sulfaattia, karbonaattia, fosfaattia, kloridia, nitraattia ym.

Tuotettaessa BBM-928-kompleksia voidaan käyttää mitä tahansa viljelylämpötilaa, jossa organismi kasvaa tyydyttävästi. Viljely voidaan suorittaa noin 20-45°C:ssa, jolloin optimaalisen kasvun kannalta edullinen lämpötila-alue on 28-34°C ja edullisin 30-32°C. BBM-928-kompleksin maksimisaanto saadaan tavallisesti noin 4-6 vuorokaudessa. Fermentoinnissa käytetään tavanomaisia menetelmiä. Pieniä määriä valmistetaan esimerkiksi tavanomaisissa ravistuspulloissa tai pintaviljel-millä. Suurempien määrien valmistus suoritetaan edullisesti submerssisissa aerobisissa viljelyolosuhteissa steriileissä tankeissa. Tankkifermentaatiossa tuotetaan ensin vegetatirvinen ymppi viljelyliemessä ymppäämällä viljelyliemeen organismin itiöitä, jolloin saadaan nuori aktiivinen ymppiviljelmä, joka siirretään sitten aseptisesti fermentointitankissa olevaan väliaineeseen. Ilmastus tankissa ja pulloissa voidaan suorittaa johtamalla steriiliä ilmaa fermentointiväliaineeseen 12 67403 ja samalla sekoittamalla tankin sisältöä mekaanisella sekoit-timella. Tarvittaessa voidaan käyttää vaahdonestoainetta, kuten silikoniöljyä, soijaöljyä tai laardiöljyä.

Fermentointiliemen tai BBM-928-kompleksiuutteen anti-bioottitaso voidaan määrittää paperikiekko-agardiffuusioko-keella käyttäen koeorganismia Sareina lutea ja koeväliaineena ravintoagaria. Kasvuliemen parhaan tehon määrittämiseen käytetyn koesysteemin optimiherkkyyden saavuttamiseksi sen pH säädetään arvoon 9,0.

BBM-928-kompleksi eristetään fermentointiliemestä tavanomaisin menetelmin, kuten liuotinuutolla. Puhdistus suoritetaan sopivasti preparatiivisilla vastavirtajakautuma- ja kromatografiamenetelmillä, kuten jäljempänä esimerkeissä 2 ja 3 yksityiskohtaisemmin kuvataan, jolloin saadaan BBM-928-kompo-nentit A, B, C, D, E ja F.

Esimerkin 3 BBM-928 komponenttien A, B, C ja D fysiko- kemialliset ominaisuudet BBM-928:n yksittäisillä komponenteilla on kaikilla samankaltaiset liukoisuusominaisuudet ja värireaktiot. Ne liukenevat esimerkiksi helposti kloroformiin ja metyleeniklori-diin, jonkin verran bentseeniin, etanoliin, metanoliin ja n-butanoliin ja ovat liukenemattomia veteen ja n-heksaaniin. Ferrikloridi- ja Ehrlich-reagensseilla saadaan positiiviset reaktiot ja Tollens-, Sakaguchi- ja ninhydriini-reagensseilla negatiiviset reaktiot.

Esimerkin 3 BBM-928 komponenttien tyypilliset fysiko-kemialliset ominaisuudet on esitetty taulukossa 4.

J

13 67403

Taulukko 4 BBM-928 komponenttien A, B, C ja D fysikokemialllset ominaisuudet _ BBM-928__

A B C D

Sulamispiste 246-248°C 214-217°C 244-248°C 224-227°C

fO&p5 (c 1, CHC13) -27° -74° -91° -13°

Analyysi, saatu C: 53,19 50,14 51,77 50,75 H: 5,40 5,29 5,29 5,25 N: 12,92 12, 34 13,55 12,58 (erotuksesta) O: 28,49 32,23 29, 39 31,42 \naks' <E Ϊ L>

EtOH: ssa 235(586) 235(570) 235(638) 235(550) 264(415) 264(400) 264(442) 264(380) 345(165) 345(163) 345(173) 345(155)

EtOH-HCl: ssa 234(610) 234(556) 234(650) 234(565) 264(410) 264(446) 264(442) 264(405) 345(165) 349(188) 345(173) 345(165)

EtOH-NaOH: ssa 230(564) 230(530) 230(580) 230(650) 256(763) 256(775) 256(704) 256(930) 330(180) 330(116) 330(117) 330(140) 383(170) 383(122) · 83(122) 383(145)

Mol- p.

(osmometri, CHClj) 1,450 - 1,470

Komponenttien A, B, C ja D infrapuna- (IR) ja NMR-spektrit on esitetty kuvioissa 1-4 ja vastaavasti 5-8. BBM-928A:n (kuvio 5), BBM-928B:n (kuvio 6) ja BBM-928C:n (kuvio 7) NMR-spektrit ovat sangen samankaltaisia, ainoan eron ollessa komponenttien A ja B ase-tyyliryhmissä (A, &: 2,03 ppm, 2 molekv.) (B, &: 2,05 ppm, 1 molekv.), jollaista komponentissa C ei ole. Asetyloimalla etikkahappoanhydri-dillä pyridiinissä BBM-928 komponentteihin A, B ja C liitettiin vastaavasti 2, 3 ja 4 mooliekvivalenttia asetyyliryhmiä. Näin saaduilla asetyloiduilla yhdisteillä oli identtiset ominaisuudet ohutker- 14 67403 roskromatografiässä, UV-, IR- ja NMR-spektreissä, mikä osoittaa, että BBM-928A on BBM-928B:n monoasetyylijohdannainen ja BBM-928C:n diasetyylijohdannainen.

BBM-928A:n happohydrolyysissä saatiin viisi n-butanoliliu-koista, UV-absorboivaa fragmenttia (I, II, III, IV ja V) ja viisi vesiliukoista, ninhydriini-positiivista ainetta (NPS-1, 2, 3, 4 ja 5). Viimeksi mainitut erotettiin kromatografoimalla (Dowex 50 x 4) ja identifioitiin seuraaviksi aminohapoiksi:

Yhdiste Rf (S-123)x Identifiointi NPS-1 0,72 -hydroksi-N-metyyliväline (HM-Vai) NPS-2 0,49 glysiini (Gly) . NPS-3 0,46 seriini (Ser) NPS-4 0,45 sarkosiini (Sar) NPS-5 0,23 (ei määritelty) x TLC, silikageelilevy S-123: 10-%:inen ammoniumasetaatti-metanoli-10-%:inen ammoniakki (9:10:1)

Edellä mainituilla UV-absorboivina fragmenteilla osoitettiin olevan seuraavat rakenteet:

OH Fragmentti I

| CH-0H C H N 0 ' 2 l4M14N2 o N C0-NH-GH-C0-H , 1 MS: m/e 306 (M ) ^MeOH; 227 233 251 345

Max 15 67403

CH^ Fragmentti II

NH OH C20H25N3°8 0-CO-CH-C(CH3)2 MS; m/e 377 (M+-58)

If I ch2 C0-NH-CH-C02H λϋ^Η; 229 · 234 > 261 * 345 nm

Fragmentti III

CH 0 0H XMe0H: 230, 235, 262, 345 nm (NPS-5)

Fragmentti IV

C10H7NO4 Η0\ΓΧν^/^γ/°Η MS: m/e 205 (M+) kJ^^COjH 228, 260, 354 m»

H,C CH, Fragmentti V

3w 3 C-OH C H N 0 * ^23H30 4 9

CH 0H 0-C0-CH«N-C0-CH2NH

3 I T T CH2 CH3 CH3X^H: 230, 235, 262, 345 nm

N C0-M-CH-C02H

16 67403

Fragmenttien I, II, III ja V happohydrolyysissä (6-n HCl) saatiin seuraavat hajaantumistuötteet:

Hydrolyysiolosuhteet

Fragmentti Suliettu putki Kuumennus, 110°, 20 h palautusjäähdytys 110°C, 3 h I IV, Ser II IV, Ser, HM-Val I, HM-Val

III

V I, HM-Val, Sar

Ser: seriini HM-Val: /3-hydroksi-N-metyylivaliini Sar: sarkosiini BBM-928A:n tai BBM-928C:n emäshydrolyysissä 0,1-n NaOH:lla 25°C:ssa kolmen tunnin aikana saatiin fragmenttia VI (lyhenteet Ser, HM-Val ja Sar merkitsevät edellä määriteltyä, Gly on glysiini ja symboli "X" tarkoittaa määrittelemätöntä ryhmää) oh (_lj^ ^_CCH'Ser-'-X-+Gly-*-Sar-*'HM-Val

Fragmentti VI

Käsittelemällä fragmenttia VI o,l-n HCl:llä 110°C:ssa tunnin ajan saatiin fragmenttia VII + HM-Val.

0H

^—CCH-Ser-^X-KJly^Sar 67403

Fragmentti VII

Käsittelemällä fragmenttia VI 0,1-n NaOH:lla 37°C:ssa 40 tuntia saatiin fragmenttia VIII + fragmenttia I.

X —> Gly —> Sar —> HM —Ä/al

Fragmentti VIII

Käsittelemällä fragmenttia VII 0,1-n NaOHslla 37°C:ssa 40 tuntia, saatiin fragmenttia IX + fragmenttia I.

X —» Gly —> Sar

Fragmentti IX

Määrittelemättömällä ryhmällä X on bruttokaava C5HgN202 (peptidimuodossa) fragmentin IX ja muiden X:ää sisältävien fragmenttien mikroanalyysin ja spetraalianalyysien perusteella, jotka on esitetty alla olevassa taulukossa.

13C-NMR Protoni-NMR Ryhmä 30,14 (t) 2,36 ppm (2H, m) "CH2~ 4,2 - 4,5 (2H, m) 2 x -CH<^ 61/7 (d) ^(0 tai N) 140,7 (d) 6,76 (1H, t) -CH=N- 171 (s) - -CO- (amidi)

-OH

NH

Fragmenttien VIII ja IX spektritulosten ja esimerkin 4 BBM-928Ap:n protoni-NMR:n (360 MHz) perusteella määrittelemätön amino-happoryhmää X voidaan parhaiten esittää seuraavalla tetrahydropyri-datsiinirakenteella: a o-

OH

(X)

IB

67403

Edellä kuvattujen, hajaantumistuotteilla suoritettujen kokeiden, spektrien, mikroanalyysien ja molekyylipainomääritysten perusteella BBM-928A:n, B:n ja C:n rakenteita voitanee parhaiten kuvata seuraavalla kaavalla:

_ OH

y^)~0h C0-"Ser-*N—/ OGly-Sar-*HM-Val

0 On ^ HO

1 » ; 1 3 HM-Val«-Sar*-Gly-C v | V—n *^er<-C0 R2 R2 Ser 5 seriini

Gly : glysiini BBM-928 A Ac Ac Sar : sarkosiini BBM-928 B Ac H HM-Vai : /}-hydroksi-N-metyy- BBM-928 C H H livaliini

Antlmikrobinen aktiviteetti BBM-928 komponenttien antimikrobinen aktiviteetti määritettiin agarlaimennussarjamenetelmällä ravintoagarilla pH-arvossa 7 useita eri bakteereja ja sieniä vastaan käyttäen Steer'in moniymp- pgyslaitetta. Ympin koko oli standardisoitu 0,0025 ml:ksi koeorga- 4 nismisuspensiota, joka sisälsi noin 10 solua/ml, paitsi happoa kestävillä bakteereilla, joiden suspensio sisälsi 106 solua/ml. Mini-miestokonsentraatiot (MIC) määritettiin yön yli suoritetussa inku-boinnissa 37°C:ssa, ja ne on esitetty taulukossa 5. Tuloksista voidaan nähdä, että BBM-928 komponentit ovat kohtalaisen aktiivisia tai heikosti aktiivisia gram-positiivisia ja happoa kestäviä bakteereja vastaan, mutta käytännöllisesti katsoen inaktiivisia grara-negatiivisia bakteereja ja sieniä vastaan.

19 67403 BBM-928 komponenttien profaagi-induktioaktiviteetti lysogee-nisissa bakteereissa (ILB) määritettiin. BBM-928 komponenteilla A, B ja C ei aina konsentraatioihin 100 pg/ml asti vbitu osoittaa olennaista ILB-aktiviteettia.

Taulukko 5 BBM-928:n komponenttien antimikrobinen aktiviteetti aerobisia bakteereja vastaan in vitro BBRE BBM-928 komponentit (MIC ^g/ml)

Koodi Koeorganismi_ X ö 5 E-F—

Sa-1 S. aureus 209P 12,5 25 50 100 100 25

Sp-1 S. pyogenes S-23 6,3 12,5 25 50 50 · 12,5 S1-1 S. lutea PCI 1001 6,3 12,5 50 50 50 25

Mf-1 M. flaws D12 12,5 25 50 100 100 25

Cr-1 xerosis 53K-1 25 50 >100 >100 >100 50

Bs-1 B^ subtllis PCI 219 25 25 100 100 100 25

Bg-1 B^ megaterium D2 25 25 50 100 100 25

Ba-3 B. anthracis A9504 6,3 12,5 25 50 50 12,5 M6-1 M. smegmatis 607 D87 25 25 25 100 100 25

Mp-1 M. phlei D88 12,5 12,5 12,5 50 50 12,5

Ec-1 _E;_ coli NIHJ >100 >100 >100 >100 >100 >100

Kp-i K£_ pneumoniae D-ll >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pa-3 aeruginosa A9930 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pv-1 P^ vulgaris A9436 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Po-1 Ll mirabilis A9554 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pg-1 P^_ morganii A9553 >100 ' >100 >100 >100 >100 >100

Sm-1 marcescens A20019 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Al-1 A. faecalls ATCC 8750 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Ca-1 albicans IAM 4888 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Cn-3 Cneoformans 100 >100 100 >100 >100 >100 20 67403 BBM-928 komponenttien A, B, C ja D ja mitomysiini C:n kas-vannaistenvastaista aktiviteettia tutkittiin istuttamalla hiiriin intraperitoneaalisesti seuraavia: P388 leukemia, L1210 leukemia, B16 melanooma, Lewis-keuhkokarsinooma (LL) ja sarkooma 180:n as-kiitteja (S180). BBM-928 komponenttien ja mitomysiini C:n koeliuok-sia 0,9-%:isessa suolaliuoksessa, joka sisälsi 10 % dimetyylisulfoksidia, annettiin koe-eläimille kerran vuorokaudessa annostusohjel-malla, joka käsitti yhdestä ainoasta useampaan päivittäiseen käsittelyyn. Vaihtelemalla annoksia määritettiin minimi-vaikuttava annos (MED), jolla käsiteltyjen eläinten keskimääräinen hengissäpysymis-aika kontrolliryhmään verrattuna oli vähintään 1,25-kertainen. Tätä aktiviteettitasoa pidetään merkitsevänä kasvaintenvastaisen aktiviteetin mittana. Tulokset on koottu taulukkoon 6, jossa on myös laskettu aktiviteettisuhteet, joista ilmenee, että BBM-928A on selvästi aktiivisempi kuin mitomysiini C, aktiviteettisuhteen ollessa kas-vairiajista riippuen 10-300. Intraperitoneaaliset LD^g-arvot BBM-928 komponenteille A, B, C ja D ja mitomysiini C:lle määritettiin menetelmällä, jonka on kuvannut Van der Waerden, Arch. Exp. Path. Pharmak., 195, 389 (1940). LD^g-arvot on esitetty myös taulukossa 6.

67403

Taulukko 6 BBM-928 komponenttien A, B ja C ja mitomysiini C:n kasvain-tenvastainen aktiviteetti ja myrkyllisyys

Minimi vaikuttava annos (MED, mg/kg/vrk) ^D50' *'p' P388 L1210 B16 LL S180 (mg/kg/vrk) Käsittely3 BBM-928A 0,003 >0,1 0,003 0,03 0,003 0,13 BBM-928B 0,1 - - - 0,18 BBM-928C ----- 0,81 BBM-928D 0f003 - - - 0,083

Mitomysiini C 0,1 3 1 0,3 0,3 9,3 Käsittelyt BBM-928A 0,001 0,003 0,003 0,003 0,0001 0,013

Mitcmysiini C 0,1 0,3 0,3 0,3 0.03 1,4

Aktiviteettisuhde (BBM-928A/bitanysilnl C) Käsittely3 30 - 300 10 100· Käsittelyt 100 100 100 100 100 a. yksi ainoa käsittely päivänä 1 b. päivittäiset käsittelyt päivinä 1-9

Esimerkki 1 BBM-928 kompleksin tuottaminen

Agar -fermentaatio - Aktinomykeetteihin kuuluvaa hyvin kasvanutta kannan G455-101 (ATOC 31491) agarvinoviljelmää käytettiin ymppäämään kas-vuväliaine, joka sisälsi 2 % liukoista tärkkelystä, 1 % glukoosia, 0,5 % Pharmamediaa, 0,5 % hiivauutetta, 0,5 % NZ-amiinia (tyyppi A) ja 0,1 % CaC03:a, ja jonka pH ennen sterilointia oli säädetty arvoon 7,2. Siemenviljelmää inkuboitiin 72 tuntia 32°C:ssa kiertora-vistimessa (250 rpm) ja 5 ml kasvuväliainetta siirrettiin sitten 67403 500 ml Erlenmeyer-pulloon, jossa oli 100 ml fermentointiväliai-netta, joka sisälsi 2 % liukoista tärkkelystä, 1 % Pharmamediaa, 0,003 % ZnSo^ · 7H20 ja 0,4 % CaCO^. RAvistusviljelmässä saatiin BBM-928 kompleksin maksimisaanto tavallisesti noin 5 vrk:ssa.

Tankkl-fermentaatio - Siemenviljelmää ravisteltiin Erlenmeyer-pulloissa 4 vrk, ja viljelmällä ympättiin sitten 200 litran tankki-fermentorissa oleva viljelyväliaine (100 1), joka sisälsi 2,0 % kaurajauhoa (Quaker Products, Australia), 0,5 % glukoosia, 0,2 % kuivaa hiivaa, 0,0008 % MnCl2 * 4H20' 0/0007 % CuS04 * 7H20, 0,0002 % ZnSO^ 7H20 ja 0,0001 % FeSO^ · 7H20, ja viljelylientä sekoitettiin kierrosnopeudella 200 rpm 30°C:ssa 54 tuntia. Tämän jälkeen 15 litraa siemenviljelmää käytettiin ymppäämään 400 litran tankkifermentorissa oleva 170 litraa fermentointiväliainetta, joka sisälsi 2,0 % liukoista tärkkelystä, 1,0 % Pharmamediaa, 0,003 % ZnSO^ '7H20 ja 0,4 % CaCO^, ja fermentointiväliainetta sekoitettiin 200 rpm 30°C:ssa ja johtaen ilmaa 150 1/min. Fermentoin-nin jatkuessa kasvuliemen pH vähitellen kohosi ja saavutti arvon 8,4 - 8,5 100-120 tunnissa, jolloin antibioottimäärä oli saavuttanut maksimiarvonsa 3 0 ug/ml.

Esimerkki 2 BBM-928 kompleksin eristäminen liuotinuutolla

Esimerkissä 1 valmistettu kasvuliemi (170 1, pH 8,5) suodatettiin käyttäen suodatinapuainetta. Sekä huovastokakussa että suo-doksessa todettiin aktiivisuutta. Huovastokakku uutettiin kaksi kertaa asetoni-metanoliseoksella (1:1, 30 1 x 2). Uutteet yhdistettiin ja haihdutettiin alennetussa paineessa, ja saatu vesipitoinen kon-sentraatti uutettiin n-butanolilla. Kasvuliemen suodos uutettiin kaksi kertaa n-butanolilla (40 1 x 2). Yhdistetyt n-butanoliuutteet haihdutettiin alennetussa paineessa ja lyofilisoitiin, jolloin saatiin raakatuote (21,4 g). Ohutkerroskromatografiän mukaan se oli kompleksi, joka sisälsi kolmea pääkomponenttia A, B ja C ja vähäisempiä komponentteja D, E ja F, joiden Rf-arvot nähdään seuraavassa taulukossa 7.

23 67403

Taulukko 7

BBM-928 komponenttien silikageeli-TLC

Rf-arvot

Systeemi N-118xx Systeemi N~103XXX

BBM-928A 0,71 0,48 BBM-928B 0,53 0,26 BBM-928C 0,27 0,07 BBM-928D 0,73 0,53 BBM-92 8E 0,56 0,34 BBM-928F 0,39 0,17 x osoitettiin UV-ilmaisimella {Shimadzu CS-910) aaltopituudella 345 nm xx n-butanoli-metanoli-vesi (63:27:10) xxx ksyleeni-metyylietyyliketoni-metanoli (5:5:1)

Esimerkki 3 BBM-928 kompleksin puhdistaminen

Esimerkissä 2 saatu raakakompleksi puhdistettiin preparatii-visella vastavirtajakautuma-laitteella (Mitamura, 100 ml/putki) käyttämällä liuotinsysteemiä hiilitetrakloridi-kloroformi-metanoli-vesi (5:2:5:1). 50 siirron jälkeen putkien 5-20 sisältö yhdistettiin ja haihdutettiin, jolloin saatiin komponentteja A, B, D, E ja F sisältävää vaaleankeltaista jauhetta (4,4 g). Tämä seos liuotettiin pieneen määrään kloroformia, ja liuos vietiin etyyliasetaatilla esikä-siteltyyn silikageelikolonniin (silikageeli C-200, 500 ml). Kolonni eluoitiin etyyliasetaatilla, joka sisälsi kasvavia määriä metanolia (2-5 %, tilav./tilav.) ja fraktioiden optista tiheyttä seurattiin aaltopituudella 345 nm. Ensin eluoitui vähäisempi komponentti D etyyliasetaatilla ja sitten komponentti A. 3 % metanolia sisältävällä liuotinseoksella eluoituivat komponentit E, B ja F tässä järjestyksessä. Kukin eri komponenttia sisältävä fraktio haihdutettiin alennetussa paineessa, ja jäännös kiteytettiin kloroformi-metanoliseok-sesta. Putkista 21-35 saatiin saunoin edellä kuvatulla vastavirtaja-kautumalaitteella epäpuhdasta komponenttia C. Komponentti C:n puhdistaminen suoritettiin kromatografoimalla silikageelillä ja kiteyttämällä kloroformimetanoliseoksesta. Komponenttien A, B, C, D, E ja 24 67403 F saannot olivat vastaavasti 988 mg, 420 mg, 843 mg, 130 mg, 119 mg ja 114 mg.

Esimerkki 4

Esimerkissä 3 saadun BBM-928A -komponentin lisäpuhdistus

Esimerkissä 3 saadun BBM-928A -komponentin ohutkerroskroma-tografia-analyysi (käytettiin systeemiä tolueeni-metanoli 9:1) osoitti, ettei se ollut täysin homogeenista, vaan sisälsi ainetta, joka oli kromatografia-ajossa hieman edellä. Komponentti A:n puhdistamiseksi suoritettiin seuraavat vaiheet: (1) Näyte kromatografoitiin silikageelillä käyttäen lineaarista gradienttia kloroformi-6 % metanolia kloroformissa. Fraktiot, jotka eluoituivat metanolipitoisuuksilla 2,4 - 3,3 % (jotka fraktiot sisälsivät BBM-928A:ta ja jonkin verran epäpuhtauksia) otettiin seu-raavaan puhdistusvaiheeseen.

(2) Kolmea astiaa käyttäen, joista kahdessa ensimmäisessä oli 2 % metanolia tolueenissa ja kolmannessa 6 % metanolia tolueenissa, saatiin aikaan kovera gradientti. Vaiheessa 1 saatu aine kromatografoitiin (silikageelikolonni) tällä gradientilla, jolloin ensin eluoitui vähäisempi komponentti ja heti sen perään puhdas BBM-928A-komponentti (josta käytetään tässä nimitystä BBM-928A ).

Γ BBM-928A :n molekyylipaino määritettiin Field-Desorptiomas-i» saspektrometrillä, ja se oli 1427, mikä vastaa bruttokaavaa C64H78N14°24 (mo^-e^yyliPa^no 1427,417).

Alkuaineanalyysi (näytteitä kuivattiin 100°C:ssa 18 tuntia) kaavasta C64H78N14024: laskettu: C 53,85 H 5,51 N 13,74 Oa 26,90 saatu*5: c 52,47 H 5,48 N 13,81 28,24a a. Laskettu erotuksesta b. Kolmen määrityksen keskiarvo

Claims (1)

1. 6740 3 Patenttivaatimus Menetelmä kasvaintenvastaisten, antibioottiyhdisteiden BBM-928A, BBM-928B, BBM-928C ja BBM-928D sekä niitä sisältävän BBM-928-kompleksin valmistamiseksi, jolloin (A) yhdisteellä BBM-928A on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin ja metyleenikloridiin, jonkin verran bentseeniin, etanoliin, metanoliin ja n-butanoliin, ja on olennaisesti liukenematon veteen ja n-heksaaniin; (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridi- ja Ehrlich-reagenssien kanssa ja negatiivisen reaktion Tollens-, Sakaguchi-ja ninhydriinireagenssien kanssa; (c) se on tehokas kasvaintenvastäinen aine seuraavia hiiriin intraperitoneaalisesti istutettuja kasvaimia vastaan: P388 leukemia, L1210 leukemia, B16 melanooma, Lewis keuhkokarsinooma ja sarkooma 180 askiitit; (d) sen sulamispiste on 246-248°C; (e) sen ominaiskiertokyky on £*7^ ~ -27° (c 1, CHC13); (f) sen molekyylipaino on 1427; (g) sen alkuaineanalyysi on noin 52,47 % hiiltä, 5,48 % vetyä, 13,81 % typpeä ja 28,24 % happea; (h) sen R^-arvo silikageeliohutkerroskromatografiassa on 0,71 liuotinsysteemillä n-butanoli-metanoli-vesi (63:27:10) ja 0,48 liuotinsysteemillä ksyleeni-metyylietyyliketoni-metanoli (5:5:1); (i) happohydrolyysissä siitä saadaan vesiliukoisia ninhyd-riini-positiivisia aineita, kuten ,^-hydroksi-N-metyylivaliinia, glysiiniä, seriiniä ja sarkosiinia; (j) emäshydrolyysissä siitä saadaan fragmentti, jonka kaava on CH3<Y^\^W0H VI N __CO—* Ser * X—* Gly > Sar—» HM-Vai jossa Ser on seriini, Gly on glysiini, Sar on sarkosiini, HM-Val on £>-hydroksi-N-metyylivaliini ja X on aminohapporyhmä, jonka 26 67403 bruttokaava peptimuodossa on CgHg^C^; (k) sen infrapunaspektri kaliumbromidissa on oleellisesti kuviossa 1 esitetty; ja (l) liuotettuna deuteroituun kloroformiin sillä on oleellisesti kuviossa 5 esitetty protoni-NMR-spektri; (B) yhdisteellä BBM-928B on kinoliinikromofori ja happohyd-rolyysissä saadaan vesiliukoisia komponentteja, kuten seriiniä, glysiiniä, sarkosiinia ja -hydroksi-N-metyylivaliinia, ja oleellisesti puhtaassa muodossa sillä on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin ja metyleeniklotidiin, jonkin verran bentseeniin, etanoliin, metanoliin ja n-butaholiin, ja on olennaisesti liukenematon veteen ja n-heksaaniin; (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridi- ja Ehrlich-reagenssien kanssa ja negatiivisen reaktion Tollens-, Sakaguchi- ja ninhydriinireagenssien kanssa; (c) se on tehokas hiiriin intraperitoneaalisesti istutettua P 388 leukemiaa vastaan; (d) sen sulamispiste on 214-217°C; (e) sen ominaiskiertokyky on /X7^ = -74° (c 1, CHCl^) ; (f) sen alkuaineanalyysi on noin 50,14% hiiltä, 5,29% vetyä, 12,34% typpeä ja 32,23% happea; (g) sen R^-arvo silikageeliohutkerroskromatografiässä on 0,53 liuotinsysteemillä n-butanoli-metanoli-vesi (63:27:10) ja 0,26 liuotinsysteemillä ksyleeni-metyylietyyliketoni-metanoli (5:5:1); (h) sen infrapunaspektri kaliumbromidissa on oleellisesti kuviossa 2 esitetty; ja (i) liuotettuna deuteroituun kloroformiin sillä on oleellisesti kuviossa 6 esitetty protoni-NMR-spektri; (C) yhdisteellä BBM-928C on kinoliinikromofori ja happo-hydrolyysissä saadaan vesiliukoisia komponentteja, kuten seriiniä, glysiiniä, sarkosiinia ja -hydroksi-N-metyylivaliinia, ja oleellisesti puhtaassa muodossa sillä on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin ja metyleenikloridiin, jonkin verran bentseeniin, etanoliin, metanoliin ja n-butanoliin, ja on olennaisesti liukenematon veteen ja n-heksaaniin; 27 67403 (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridi- ja Ehrlich-reagenssin kanssa ja negatiivisen reaktion Tollens-, Sakaguchi- ja ninhydriinireagenssien kanssa; (c) se on tehokas hiiriin intraperitoneaalisesti istutettuja seuraavia kasvaimia vastaan: P388 leukemia, L1210 leukemia, B16 melanooma, Lewis-keuhkokarsinooma ja saikooma 180 askiitit; (d) sen sulamispiste on 244-248°C; (e) sen ominaiskiertokyky on /V(.7^5 = -91° (c1 , CHCl^) ; (f) sen molekyylipaino on noin 1470; (g) sen alkuaineanalyysi on noin 51,77% hiiltä, 5,29% vetyä, 13,55% typpeä ja 29,39% happea; (h) sen R^-arvo silikageeliohutkerroskromatografiässä on 0,27 liuotinsysteemillä n-butanoli-metanoli-vesi (63:27:10) ja 0,07 liuotinsysteemillä ksyleeni metyylietyyliketoni-metanoli (5:5:1) ; (i) sen infrapunaspektri kaliumbromidissa on oleellisesti kuviossa 3 esitetty; ja (j) liuotettuna deuteroituun kloroformiin sillä on oleellisesti kuviossa 7 esitetty protoni-NMR-spektri; ja (D) yhdisteellä BBM-928D on seuraavat ominaisuudet: (a) se liukenee kloroformiin ja metyleenikloridiin, jonkin verran bentseeniin, etanoliin, metanoliin ja n-butanoliin, ja on olennaisesti liukenematon veteen ja n-heksaaniin; (b) se antaa positiivisen reaktion ferrikloridi- ja Ehrlich-reagenssien kanssa ja negatiivisen reaktion Tollens-, Sakaguchi-ja ninhydriinireagenssien kanssa; (c) se on tehokas intraperitoneaalisesti hiiriin istutettua P388 leukemiaa vastaan; (d) sen sulamispiste on 224-227°C; 25 o (e) sen ominaiskiertokyky on = "13 (c 1, CHCl^) ; (f) sen alkuaineanalyysi on noin 50,75% hiiltä, 5,25% vetyä, 12,58% typpeä ja 31,42% happea; (g) sen Rf-arvo silikageeliohutkerroskromatografiässä on 0,73 liuotinsysteemillä n-butanoli-metanoli-vesi (63:27:10) ja 0,53 liuotinsysteemillä ksyleeni-metyylietyyliketoni-metanoli (5:5:1) ; 28 6 7 4 0 3 (h) sen infrapunaspektri kaliumbromidissa on oleellisesti kuviossa 4 esitetty; ja (i) liuotettuna deuteroituun kloroformiin sillä on olennaisesti kuviossa 8 esitetty protoni-NMR-spektri, tunnettu siitä, että Actinomycetes-kantaa ATCC 31491 viljellään vesipitoisessa liuoksessa, joka sisältää assimiloituvan hiililähteen ja assimiloituvan typpilähteen, submerssi-sissa aerobisissa olosuhteissa kunnes muodostunutta BBM-928-kompleksia sisältävä liuos osoittaa oleellista kasvainten-vastaista, antibioottista aktiivisuutta, minkä jälkeen BBM-928-kompleksi otetaan talteen viljelyväliaineesta ja haluttaessa yhdisteet BBM-928A, BBM-928B, BBM-928C ja BBM-928D erotetaan. 29 Patentkrav 6 74 0 3 Förfarande för framställning av antibiotikumföreningarna BBM-928A, BBM-928B, BBM-928C och BBM-928D samt ett BBM-928-komplex innehällande dessa, vilka har en antitumöreffekt, varvid (A) föreningen BBM-928A har följande egenskaper: (a) den löser sig i kloroform och metylenklorid, nägot i bensen, etanol, metanol och n-butanol, och är väsentligen olöslig i vatten och n-hexan; (b) den ger en positiv reaktion med ferriklorid- och Ehrlich-reagenser och en negativ reaktion med Tollens-, Sakaguchi- och ninhydrinreagenser; (c) den är ett effektivt antitumörmedel mot följande i i möss intraperitonealt implanterade tumörer: P388 leukemi, L1210 leukemi, B16 melanom, Lewis lungkarcinom och sarkoin 180 askites; (d) dess smältpunkt är 246-*248°C; (e) dess specif ikä vridningsförmäga är “27° (c 1, CHC13); (f) dess molekylvikt är 1427,· (g) dess elementaranalys är ca 52,47 % koi, 5,48 % väte, 13,81 % kväve och 28,24 % syre; (h) dess Rf-värde vid silikageltunnskiktskromatografi är 0,71 med lösningsmedelssystemet n-butanol-metanol-vatten (63:27:10) och 0,48 med lösningsmedelssystemet xylen-metyletylketon-metanol (5:5:1); (i) vid syrahydrolys erhälles frän den vattenlösliga nin-hydridin-positiva ämnen, säsom ^-hydroxi-N-metylvalin, glycin, serin och sarkosin? (j) vid bashydrolys erhälls fran denna ett fragment med formeln OH Ser-3 X-^ Gly-> Sar^ HM—Vai där Ser är serin, Gly är glycin, Sar är sarkosin, HM-Vai är ji- 30 67403 hydroxi-N-metylvalin och X är en aminosyragrupp, vars bruttoformel i peptidform är (k) dess infrarödspektrum i kaliumbromid är väsentligen det i figur 1 angivna; och (l) löst i deutererad kloroform har den väsentligen det i figur 5 angivna proton-NMR-spektrumet; (B) föreningen BBM-928B har en kinolinkromofor och via syra-hydrolys erhälles vattenlösliga komponenter, säsom serin, glycin, sarkosin och /i-hydroxi-N-metylvalin, och i väsentligen ren form har den följande egenskaper; (a) den loser sig i kloroform och metylenklorid, nägot i bensen, etanol, metanol och n-butanol, och är väsentligen olöslig i vatten och n-hexan; (b) den ger en positiv reaktion med ferriklorid- och Ehrlich-reagenser och en negativ reaktion med Tollens-, Sakaguchi- och ninhydrmreagenser; (c) den är effektiv mot i moss intraperitonealt implanterat P388 leukemi; (d) dess smältpunkt är 214-217°C (e) dess specif ikä vridningsförmäga är -74° (c 1, CHCl^) ; (f) dess elementaranalys är ca 50,14 % kol, 5,29 % väte, 12,34 % kväve och 32,23 % syre; (g) dess R^-värde vid silikageltunnskiktskromatografi är 0,53 med lösningsmedelsystemet n-butanol-metanol-vatten (63:27:10) och 0,26 med lösningsmedelsystemet xylen-metyletylketon-metanol (5:5:1) ; (h) dess infrarödspektrum i kaliumbromid är väsentligen det i figur 2 angivna; och (i) lost i deutererad kloroform har den väsentligen det i figur 6 angivna proton-NMR-spektrumet; (C) föreningen BBM-928C är en kinolinkromofor och vid syra-hydrolys erhälls vattenlösliga komponenter, säsom serin, glycin, sarkosin och /3-hydroxi-N-metylvalin, och i väsentligen ren form har den följande egenskaper; (a) den löser sig i kloroform och metylenklorid, nägot i bensen, etanol, metanol och n-butanol, och är väsentligen olöslig i vatten och n-hexan; 67403 31 (b) den ger en positiv reaktion med ferriklorid- och Ehrlich-reagenser och en negativ reaktion med Tollens-, Sakaguchi-och ninhydrinreagenser; (c) den är effektiv mot följande i moss intraperitonealt inplanterade tumörer: P3881eukemi, L1210 leukemi, B16 melanom, Lewis lungkarcinom och sarkom 180 askites; (d) dess smältpunkt är 244-248°C; 25 o (e) dess specifika vridningsförmäga är /*^D = -91 (c 1, CHCl^); (f) dess molekylvikt är ca 1470; (g) dess elementaranalys är ca 51,77 % kol, 5,29 % väte, 13,55 % kväve och 29,39 % syre; (h) dess R^-värde vid silikageltunnskiktskromatografi är 0,27 med lösningsmedelssystemet n-butanol-metanol-vatten (63:27:10) och 0,07 med lösningsmedelssystemet xylen-metyletylketon-metanol (5:5:1); (i) dess infrarödspektrum i kaliumbromid är väsentligen det i figur 3 angivna; (j) lost i deutererad kloroform har den väsentligen det i figur 7 angivna proton-NMR-spektrumet; (D) förenigen BBM-928D har följande egenskaper: (a) den löser sig i kloroform och metylenklorid, nägot i bensen, etanol, metanol och n-butanol, och är väsentligen olöslig i vatten och n-hexan; (b) den ger en positiv reaktion med ferriklorid- och Ehrlich-reagenser och en negativ reaktion med Tollens-, Sakaguchi- och ninhydrinreagenser, (c) den är effektiv mot i moss intraperitonealt inplanterat P388 leukemi; (d) dess smältpunkt är 224-227°C; (e) dess specifika vridningsförmäga är /«/^= -13° (c 1, CHCLj); (f) dess elementaranalys är ca 50,75 % kol, 5,25 % väte, 12,58 % kväve och 31,42 % syre; (g) dess R^-värde vid silikageltunnskiktskromatografi är 0,73 med lösningsmedelssystemet n-butanol-metanol-vatten (63:27:10) och 0,53 med lösningsmedelssystemet xylen-metyletylketon-metanol (5:5:1) ;