NL8001868A - Verbindingen met antitumor- en antibacterieele werk- zaamheid; werkwijze voor het bereiden daarvan; prepa- raraten met antitumor- en antibacterieele werkzaamheid. - Google Patents

Description

i VO 307

Verbindingen met antitumor- en antibacteriële werkzaamheid; werkwijze voor het bereiden daarvanj preparaten met antitumor- en anti-bacteriële werkzaamheid.

De uitvinding heeft betrekking op een nieuw antitumor-anti-biotisch complex alsmede op werkwijzen voor het bereiden, winnen en scheiden in biologisch actieve verbindingen.

Gebaseerd op thans ter beschikking staande spectraalgege-5 vens en fysisch-chemische eigenschappen, blijkt het antitumor- antibiotische complex volgens de uitvinding structureel verwant te zijn aan de chinoxalinegroep van antibiotica zoals echinomyci-ne, Dell, et al., J. Am. Chem. Soc. 97, 2497 (1975), chinomycinen Shoji, et al., J. Antibiotics 14A, 335 C1961) en triostine C, 10 The Merck Index, 9th Ed., 9399. Het antitumor-antibiotische com plex verschilt echter van deze antibiotica in de volgende opzichten: 1. Het complex volgens de uitvinding en de componenten daarvan bevatten een chinolinekern als chromofoor in plaats van chinoxali- 15 ne zoals in de actinoleukinegroep van antibiotica.

2. Het complex volgens de uitvinding en de componenten daarvan bevatten geen zwavel in tegenstelling tot de aanwezigheid van disulfide of thioacetaalbruggen in de structuur van actinoleukine-antibiotica.

20 3. Het complex volgens de uitvinding en de componenten daarvan ver tonen een betrekkelijk zwakke antimicrobiële werking in vergelijking tot de actinoleukinen die sterke antibacteriële antibiotica zijn.

De uitvinding verschaft een nieuw antitumor-antibiotisch 25 complex, dat algemeen zal worden aangeduid met BBM-928. Het complex dat tenminste zes componenten bevat wordt bereid door een ΒΒΓ1-92Β producerende stam van actinomyceten (ATCC 31491) of een mutant daarvan te kweken in een waterhoudend voedingsmedium waarbij onder- 800 1 868 - 2 - gedompelde aerobe omstandigheden worden toegepast. De uitvinding heeft tevens betrekking op een werkwijze voor het winnen van het BBM-928 complex uit het cultuurmedium en het scheiden van het complex in zijn biologisch actieve componenten door tegenstroomse 5 verdelings- en chromatografische technieken.

De uitvinding strekt zich uit over het BBM-928 complex en de biologisch actieve componenten BBM-928 A, B, C, D, E en F daarvan. De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op de componenten BBM-928 A, B, C ,en D in verdunde vormen, als echte concentraten 10 en in gezuiverde vorm.

Fig.l is het infraroodabsorptiespectrum van BBM-928 A in kaliumbromide.

Fig.2 is het infraroodabsorptiespectrum van BBM-928 B in kaliumbromide.

15 Fig.3 is het infraroodabsorptiespectrum van BBM-928 C in kaliumbromide.

Fig.4 is het infraroodabsorptiespectrum van BBM-928 D in kaliumbromide.

Fig.5 toont het protonenmagnetisch resonantiespectrum van 20 BBM-928 A opgelost in gedeutereerd chloroform onder toepassing van TMS als interne standaard, bepaald met een NMR-spectrometer bij een frequentie van 90 MHz.

Fig.6 toont het protonenmagnetisch resonantiespectrum van BBM-928 B opgelost in gedeutereerd chloroform onder toepassing van 25 TMS als interne standaard, bepaald met een NMR-spectrometer bij een frequentie van 90 MHz.

Fig.7 toont het protonenmagnetisch resonantiespectrum van BBM-928 C opgelost in gedeutereerd chloroform onder toepassing van TMS als interne standaard, bepaald met een NMR-spectrometer bij 30 een frequentie van 90 MHz.

Fig.8 toont het protonenmagnetisch resonantiespectrum van BBM-928 D opgelost in gedeutereerd chloroform onder toepassing van TMS als interne standaard, bepaald met een NMR-spectrometer bij een frequentie van 90 MHz.

35 De uitvinding heeft betrekking op een nieuw antitumor-anti- 80 0 1 8 68 •F * - 3 - biotisch complex dat hier willekeurig is aangeduid als BBM-928.

Het complex is naar men aanneemt structureel verwant met de actino-leukinegroep van antibiotica en wordt verkregen door fermentatie van een tot op heden nog niet geïdentificeerde stam van actinomy-5 ceten. Elke actinomycetenstam die BBM-928 in een cultuurmedium kan vormen, kan worden toegepast, waarbij de voorkeur uitgaat naar een actinomycetensoort microorganisms van de stam No.G455-101 in de Bristol-Banyu cultuurverzameling. Het microarganisme werd geïsoleerd uit een bodemmonster, dat op de Filippijnen is verzameld en 10 bij de Amerikaanse type cultuurverzameling van microörganismen ATCC is gedeponeerd als ATCC 31491.

Het nieuwe antitumor-antibiotische complex volgens de uitvinding heeft tenminste zes componenten, aangeduid als BBM-928 A, B, C, O, E en F. De componenten A, B, C en D van het BBM-928 com-15 plex zijn in kristallijne vorm geïsoleerd,· de chemische structuren van de componenten A, B en C zijn geïdentificeerd. Het complex (en de individuele componenten] volgens de uitvinding hebben antitumor- en antibacteriële eigenschappen. Met betrekking tot de anti-bacteriële werking zijn het complex en de individuele componenten 20 daarvan bruikbaar voor toevoeging aan voeder voor dieren en als therapeutische middelen voor het behandelen van bacteriële infectie bij zoogdieren. Bovendien kunnen de antibiotica gebruikt worden voor het reinigen en steriliseren van labaratoriumglaswerk en chirurgische instrumenten en in combinatie met zepen, wasmiddelen en 25 wasoplossingen worden gebruikt voor sanitairdoeleinden. Wat de anti- tumorwerkingen betreft, zijn het complex en de individuele componenten daarvan bijzonder nuttig voor toepassing tegen een verscheidenheid aan intraperitoneaal geïmplanteerde muistumoren.

Actinomycetes sport jstam Mo_.C!_455-1Q1.

30 Thans zal een algemene beschrijving worden gegeven van het microörganisme dat bij voorkeur wordt toegepast voor het bereiden van het antibioticum-antitumorcomplex BBM-928. Waarnemingen werden verricht van de kweekeigenschappen, fysiologische en morfologische eigenschappen van het organisme volgens standaard taxonomische 35 methoden, waarvoor b.v.kan worden verwezen naar Shirling et al..

Int. J. Syst. Bacteriol. 16_, 313 (1966] en Lechevalier et al., Biol.

ö η n 1 ft fift .-4-

Actinomycetes Related Org. _11, 78 (1976).

Micromorfologie:

Stam No. G455-1Q1 vormt zowel substraat- als luchtmycelia, en het substraatmycellum is goed ontwikkeld, lang en vertakt (een 5 breedte van 0,5 - 0,8 ym). Aparte fragmentatie van het substraat- mycelium wordt niet waargenomen. Anders dan gewone soorten Strepto-myces, draagt stamG455-101 slechts korte of rudimentaire luchtmycelia, of vormt ze in bepaalde agarmedia geheel niet. Korte of lange sporenketens worden in het luchtmycelium gevormd, welke 2 -10 50 ovale sporen bevatten in een keten (meestal 5-20 sporen).

Sporenketens zijn recht, kronkelig of lusvormig. De sporen zijn bolvormig (0,3 - 0,4 ym), ovaal of cilindrisch (0,3 x 1,5 - 3,0 ym) van vorm en hebben een glad oppervlak. Sporen worden vaak gescheiden door lege hyphae. Een amorf sporangiumachtig blaasje dat een 15 korte gewonden sporenketen omhult, wordt af en toe op het luchtmy celium waargenomen.

Samenstelling yan_de_celwand_en_suikercgmpongnten van de_hele_cel:

De celwand van stam G455-101 bevat meso-diaminpimelinezuur maar bevat geen glycine. Hydrolysaat van hele cellen toont de aan-20 wezigheid van glucose, mannose en madurose (3-O-methyl-D-galacto- se). De bovengenoemde celwandsamenstelling en suikercomponenten van de hele cel tonen aan dat stam G455-101 een actinomycetensoort met celwandtype IIIB is.

!Sbi§§!lz_ë^fysi0i0g--------2®!2§?!)?PB§n: 25 Stam (3455-101 groeit overvloedig, vormt rose of grijsachtige rose luchtmycelium en produceert een roodachtig, niet in water oplosbaar pigment in agarmedia met hoge voedingswaarde, b.v. gist-extract-» moutextractagar en havermeelagar. In anorganische zouten » zetmeelagar, glycerol - asparagineagar en tyrosineagar geeft hij 30 echter slechte groei, vormt wit of beige rudimentair luchtmycelium, en produceert een kleine hoeveelheid roodachtig pigment. Melanoide-pigment wordt in pepton-gist-ijzeragar en tyrosineagar niet geproduceerd. Nitraat wordt tot nitriet gereduceerd. Hij groeit overvloedig bij 28°C, 37aC en 45°C, maar groeit niet bij 10°C of bij 50°C.

35 Pentosen en hexosen worden door de stam goed gebruikt. De kweek- eigenschappen en fysiologische eigenschappen van stam G 455-1C1 800 1 8 68 - * i - 5 - zijn in de tabellen A en B weergegeven. Het gebruik van koolstof-bronnen is in tabel C weergegeven.

Tabel A

%

Kweekeigenschappen van stam G455-101 5 1. Czapek’s agar G geen of weinig groei (sucrose - nitraatagar) r donKsr „3e A wit tot lichtrose D geen 10 2. Trypton - gistextract- matige groei, floccose, bouillon (ISP No.l) _ gesedimenteerd en niet ge- pigmenteerd 3. gistextract - moutextract- G overvloedig 15 a^ar No.2] R dieprood tot roodbruin A overvloedig, grijsachtig rose tot puperrose D geen 20 4. havermeelagar. CISP No.3) G overvloedig R sterk gelig rood A matig rose D grijsachtig geel 25 5. anorganische zouten - zet- G slecht meelagar (ISP No.4] R licht geelbruin tot donker rood A weinig, wit tot beide - 0 geen 30 6. glycerol-asparagineagar G slecht (ISP No.5) R gelig rose tot roodbruin A weinig, wit D geen 800 1 8 68 35 - 6 -

Tabel A (vervolg) 7. pepton-gistextract-ijzeragar G slecht, geplooid CISP No.6) D . . . ...

R sterk roodachtig A geen 5 D licht geeloranje 8. tyrosineagar (ISP No.7) G slecht R donkerrood A weinig, wit 10 D geen 9. glucose-ammoniumzoutenagar G slecht R roodbruin A weinig, lichtgrijs 15 0 geen 10. Bennett Js agar G matig R roodbruin A beperkt,grijsachtig rose 20 D geen x waargenomen na incubatie bij 37°C gedurende 3 weken xx afkortingen: G - groei R - kleur achterzijde van substraatmycelium 25 A - luchtmycelium D - diffundeerbaar pigment

Tabel B

Fysiologische eigenschappen van stam G455-1Q1 30 Test___________________ Responsie __Met hode _gn ^medium nitriet uit nitraat positief anorganisch medium: Czapek's sucrosenitraatbouillon nitriet uit nitraat positief organisch medium: 0,5% gist- extract, 1,0% glucose, 0,5% 35 KN03, 0,1% CaC03 8001868 1 t - 7 -

Tabel B (vervolg] casefnehydrolyse in zwak positief Luedemann's agarmedium agarmedium 5 taptemelkcoagulatie positief gelatine-vloeistoftest negatief 15% gelatine in trypton- gistextractbouillon (ISP No.l medium] i-^S-vorming uit L-cyste- positief L-cysteine (0,1%] toegevoegd ine · aan trypton-gistextract- bouillon (ISP No.l medium) plus agar. f^S-detectie met een papierstrip die 10% aq. loodacetaatoplossing bevat

vorming van melanoxde negatief pepton-gist-ijzeragar (ISP

No.S) en tyrosineagar (ISP

· No.7)

Catalasereactie positief at^‘ °Pl°ss*nS

oxydatiereactie positief Kovacs' reagens groei-temperatuur overvloedige Bennett's agar 7n groei bij

28, 37 en 45°C

Slechte groei bij 20°C.

Geen groei bij 10 en 50°C

25 Tabel C

Gebruik van koolstofbronnen voor stam G455-101 PG Lm 1. glycerol ++ + 2. D(-)-arabinose + + 30 3. L(+)-arabinose + + 4. D-xylose ++ + 5. D-ribose ++ + 6. L-rhamnose ++ + 7. 0-glucose + + 35 8. D-galactose ++ + 9. D-fructose ++ + unn18 68 - a -

Tabel C (vervolg) 10. D-mannose + + ++ + 11.. LC-)-sorbose 12.. sucrose 5 13.. lactose · 1. ~ .

14. cellobiose + + 15. melibiose -, _+ 16. trehalose + + 17. raffinose 10 18. D(+)-melezitose - 19. oplosbaar zetmeel + 20. duloitol 21. inositol + 22. D-mannitol ++ + 15 23. D-sorbitol 24. salicine 25.. cellulose ' + + 26. chitine + + 27. Keratine + + 20 Basaal medium PG : Pridham - Gottlieb’s anorganisch medium, aan- gevuld met 0,1% gistextract.

Lm ; Luedemann’s organisch medium Incubatie gedurende 2 weken bij 37°C.

Vanzelfsprekend is de bereiding van het BBM-928 complex vol-25 gens de uitvinding niet beperkt tot toepassing van de bijzondere actinomyceten stam G455-101 beschreven door de bovenstaande groei en microscopische eigenschappen. Deze eigenschappen worden slechts ter illustratie gegeven en de uitvinding beoogt dan ook toepassing van stammen of mutanten, verkregen uit het bovenstaand beschreven 30 organisme met bekende methoden zoals blootstelling aan röntgen straling, ultraviolette straling, stikstofmosterd, blootstelling aan fagen, en dergelijke, waarmede BBM-928 complex of individuele componenten daarvan kunnen worden bereid. §sreiding_vanj3ntitumpr^ntibiotisch_BBM-928_cgmplexj: 35 De werkwijze volgens de uitvinding voor het bereiden van het antitumor-antibiotisch BBM-928 complex omvat kweken door fermen- 8001868 * % - 9 - tatie van actinomycetes stam G455-101 in een waterhoudende oplossing, welke een assimileerbare koolstofbron en een assimileerbare stikstofbron bevat onder ondergedompelde aerobe omstandigheden totdat een aanzienlijke antitumor- en antibiotische activiteit aan de 5 oplossing is meegedeeld. Gebruikelijke fermentatiemethoden worden voor het kweken van actinomycetes stam G455-1Q1 toegepast. Voor de bereiding van de antibiotische-antitumormiddelen volgens de uitvinding geschikte media bevatten een assimileerbare koolstofbron zoals zetmeel, glucose, dextrine, maltose, lactose, sucrose, fructose, 10 mannose, melasse, glycerol, en dergelijke. Het voedingsmedium bevat tevens bij voorkeur een assimileerbare stikstofbron zoals eiwit, eiwithydrolysaat, polypeptiden, aminozuren, maisweekwater, casei'ne, ureum en dergelijke alsmede anorganische zouten met voedingswaarde, die anorganische anionen en kationen zoals kalium, natrium, ammo-15 nium, calcium, sulfaat, carbonaat, fosfaat, chloride, nitraat en dergelijke leveren.'

Bij de bereiding van het ΒΒΠ-92Β complex kan elke temperatuur die tot een bevredigende groei van het organisme leidt, worden taegepast. Temperaturen die variëren van ongeveer 20 tot onge-20 veer 45°C zijn bruikbaar, waarbij voor optimalisering van de groei van het organisme bij voorkeur een temperatuur van ongeveer 28 tot ongeveer 34°C wordt gekozen. De grootste voorkeur gaat uit naar een temperatuurgebied van 30 - 32°C. Een maximum bereiding van het BBM-928 complex wordt in het algemeen na ongeveer 4-6 dagen be-25 reikt. In de fermentatieperiode worden bekende methoden toegepast.

De bereiding van kleine hoeveelheden wordt b.v. geschikt uitge-voerd in schudkolven of met oppervlakteculturen. De bereiding van grote hoeveelheden wordt bij voorkeur uitgevoerd ander andergedom-pelde aerobe kweekomstandigheden in steriele vaten. Bij vatfermen-30 tatie wordt eerst een vegetatief entpreparaat bereid in een voe- dingsbouillon door de bouilloncultuur te enten met een spore van het organisme teneinde een jonge actieve entcultuur te verkrijgen die vervolgens aseptisch in het fermentatievatmedium wordt overgebracht. Beluchting in vaten en flessen kan worden verkregen door 35 steriele lucht door of op het oppervlak van het fermentatiemedium 8001868 - 10 - te dwingen, waarbij verdere agitatie in de vaten wordt verkregen met behulp van een mechanische roerder. Antischuimmiddelen zoals siliconenolie, sojabonenolie en varkensreuzelolie kunnen naar behoefte worden toegevoegd, 5 Antibioticumgehalten in de fermentatiebouillon of de extrac ten van BBM-928 complex kunnen worden vastgesteld met behulp van papierschijfagar-diffusieanalyse met Sarcina lutea als testorganisme en onder toepassing van voedingsagar als analysemedium. De pH wordt voor een optimale gevoeligheid van het analysesysteem dat 10 ƒ voor de bepaling van de optimale bouillonsterkte wordt gebruikt, ingesteld op 9,0.

Het BBM-928 complex wordt uit de fermentatiebouillon geïsoleerd op bekende- wijze, b.v. met oplosmiddelextractieprocédés. De zuivering wordt bij voorkeur uitgevoerd volgens preparatieve tegen-15 stroomse verdelings- en chromatigrafische procédés, zoals nader in de voorbeelden II en III zal worden toegelicht, om BBM-928 componenten A, B, C, 0, E en F te verkrijgen.

Fysisch-chemische_eigenschagpen yan_BBM-928_componenten_A C_,_ en D van voorbeeld III: 20 Individuele componenten van BBM-928 tonen oplosbaarheid en kleurreacties die op elkaar lijken. Ze zijn b.v. gemakkelijk oplost-baar in chloroform en methyleenchloride, licht oplosbaar in benzeen, ethanol, methanol en n-butanol en onoplosbaar in water en n-hexaan. Positieve reacties met ijzer(III)chloride en Ehrlich-reagens worden 25 verkregen, met negatieve reacties op Tollens, akaguchi en ninhy- drien.

karakteristieke fysisch-chemische eigenschappen van BBM-928 componenten van voorbeeld III zijn in tabel D weergegeven.

Tabel D

38 Fysisch-chemische eigenschappen van BBM-928 componenten

A, B, C en D

BBM-928

A B C D

Smeltpunt, °C 246 - 248 214 - 217 244 - 248 224 - 227 35 (c, 1, CHC13) -27° -74° -91° -13° 8001868 - 11 -

Tabel D (vervolg]

Analyse; gevonden C: 53,19 50,14 51,77 50,75 H: 5,40 5,29 5,29 5,25 5 N: 12,92 12,34 13,55 12,58 (door verschil] 0: 28,49 32,23 29,39 31,42 in nm (E^ 3 'max 1 cm in EtDH 235(586] 235(570] 235(638] 235(5503 264(415] 264(4003 264(442] 264(380] 10 345(165] 345(163] 345(173] 345(155) in EtOH-HCl 234(610) 234(556) 234(650) 234(565) 264(410) 264(446) 264(442) 264(405) 345(165) 349(188) 345(173) 345(165) 15 i in EtOH-NaGH 230(564) 230(530) 230(580) 230(650) 256(763) 256(775) 256(704) 256(930) 330(180) 330(116) 330(117) 330(140) 383(170) 383(122) 383(122) 383(145) 20 mol-gewicht (osmometer, in CHClg) 1.450 - 1.470

Infrarood (IR) en Kernmagnetische resonantie (NMR) spectra van componenten A, B, C en D zijn weergegeven in de fig.l - 4 en 5 - 8. De NMR-spectra van BBM-928 A (fig.5), BBM-928 B Cfig.B), en BBM-928 C (fig.7) lijken sterk op elkaar met als enig verschil de aanwezigheid van acetylgroepen in component A (J :2,03 dpm, 2 mol-equivalent) en B (X: 2,05 dpm, 1 mol-equivalent) maar niet in 30 C. Bij acetylering met azijnzuuranhydride in pyridine, werden 2, 3 en 4 mol equivalenten acetylgroep in resp. BBM-928 componenten A, B en C ingeleid. De drie aldus verkregen acetyleringsprodukten vertoonden identieke eigenschappen in TLC, UV, IR en NMR-spectra, waaruit blijkt dat BBM-928 A een monoacetylderivaat van BBM-928 B 35 en een diacetylderivaat van BBM-928 C is, 8001868 - 12 -

Zure hydrolyse van BBM-928 A gaf 5 n-butanol-oplosbare, UV-absorberende fragmenten (I - V) en vijf in water oplosbare, nin-hydrinepositieve materialen CNPS-1 - NPS-5]. Laatstgenoemde materialen werden door Dowex 50 x 4 chromatografie gescheiden en gei'den-5 tificeerd als de volgende aminozuren:

Verbinding Rf CS-123)* Identificatie NPS-1 0,72 ^-hydroxy-N-methylvaline (HM-Val) NPS-2 0,49 glycine (Gly] 10 NPS-3 0,46 serine CSer) NPS-4 0,45 sarcosine (Sar) NPS-5 0,23 niet vastgesteld x TLC, silicagelplaat S-123: 10% ammoniumacetaat - methanol - 10% ammoniakoplossing 15 C9 : 10 : 1) , De vijf UV-absorberende fragmenten bleken de volgende struc turen te hebben:

Fragment I: formule 1 C14H14N2D6 20 MS/ m/e 306 (M+) ^ MeOH 227 233 25 345 nm max

Fragment II: formule 2 C20H25N3°8 25 MS: m/e 377 CM+-58) ^MeOhi 22g 234 345 nm max

Fragment III: formule 3 λΜβ0Η : 230, 235, 262, 345 nm max 30

Fragment IV: formule 4 C10H7ND4 MS: m/e 205 CM+) ^MeOlH ; 22fli 260 354 nm max 35 8001868 - 13 -

Fragment V: formule 5 C23H30N4°9 A Ms0H ; 230, 235, 262, 345 nm max 5

Bij zure hydrolyse (SN HC1], gaven de fragmenten I, II, III en V de volgende afbraakprodukten:

Hydrolyseomstandigheden * dichte buis onder terugvloeikoeling gekookt 1 Fragment 11Q°C,2Q uren 11Q°C, 3 uren_ I IV, Ser II IV, Ser, HM-Val I, HM-Val

III IV

15 V - I, HM-Val, Sar

Ser: serine HM-Val: /3 -hydroxy-N-methylvaline

Sar: sarcosine

20 Basische hydrolyse van BBM-928 A of BBM-928 C met 0,1N NaOH

gedurende 3 uren bij 25°C gaf fragment VI (afkortingen Ser, HM-Val, en Sar zoals boven, terwijl Gly glycine voorstelt en het symbool X een onbekend gedeelte voorstelt] met formule 6 van het formuleblad.

25 Behandeling van fragment VI met Q,1N HC1 gedurende 1 uur bij 110°C gaf fragment VII met formule 7 plus HM-Val.

Behandeling van fragment VI met 0,1N NaOH gedurende 40 uren bij 37°C gaf fragment VIII met formule 8 plus fragment I.

Behandeling van fragment VII met Q,1N NaOH gedurende 40 uren 30 bij 37°C gaf fragment IX met formule 9 plus fragment I.

Het onbekende gedeelte CX) heeft een molecuulformule C5HgN202 (in peptidevorm], gebaseerd op microanalyse van fragment IX en andere peptidefragmenten die (X] bevatten en onderstaande speetTaalanalyse.

35 9001868 C-NMR proton-NMR toegekend aan 30,14 Cti 2,36 dpm (2H, m) -Cl·^- - 14 -13 61,4 Cd) l 4,2 - 4,5 C2H, m) 2 x -CH^ 61.7 Cd] j '(0 of N) 5 140.7 Cd) 6,76 C1H, t) -CH«N- 171 Cs) - -CO- (amide)

-OH

NH

10 Volgens spectraalgegevens voor de fragmenten VIII en IX

en een 360 MHz protonen NMR van ΒΒΜ-92Θ A^ van voorbeeld IV, bleek dat het onbekende aminozuurgedeelte (X) het best met de tetrahydro-pyridazinestructuur met formule 10 kan worden weergegeven.

Gebaseerd op de resultaten van de bovenstaand beschreven 15 ontledingsproeven, spectraalgegevens, microanalyse en molecuulge- wichtbepalingen, kunnen BBM-928 A, B en C naar men aanneemt het best worden weergegeven met formule 11 van het formuleblad, waarin R^ R2 Ser: serine " Gly: glycine 20 BBM-928 A Ac Ac Sar: sarcosine BBM-928 B Ac H HM-Val: β -hydroxy-N-methyl- BBM-928 C Η H Valine

AntimicrobiSle_werking:

De antimicrobiële werking van BBM-928 componenten werd be-25 paald. tegen een verscheidenheid van bacteriën en schimmels door de agarverdunningsreeksmethode in voedingsagar bij een pH van 7 onder toepassing van Steer's multi-entapparatuur. De entgrootte werd gestandaardiseerd tot het aanbrengen van een hoeveelheid van 0,0025 3 4 3 cm testorganismen, bevattende ongeveer 10 cellen/cm voor alle 30 bacteriën en schimmels behalve voor zuurbestendige bacteriën, waar- 6 3 voor een 10 cellen/cm suspensie werd gebruikt. De minimum remmende concentraties (MIC), bepaald na een incubatie gedurende 1'nacht bij 37°C, zijn in tabel E aangegeven. Hieruit blijkt dat BBM-928 componenten matig tot zwak werkzaam tegen gram-positieve en zuur-35 bestendige bacteriën zijn, maar praktisch inactief zijn tegen gram- 3001868 - 15 - negatieve bacteriën en schimmels.

De activiteit van profagen-inductie in lysogene bacterium (ILB) werd voor BBM-928 componenten bepaald. Met de BBM-928 compo- 3 nenten A, B en C werd tot een concentratie van 100 yg/cm geen sig-5 nificante ILB-activiteit aangetoond.

Tabel E

In vitro antimicrobiële werking van BBM-928 componenten tegen aerobe bacteriën BBRI- BBM-928 componenten CMIC in ug/cm^)

10 code Testorganisme A B C D s F

Sa-1 S.aureus 209P 12,5 25 50 100 100 25

Sp-1 S. pyogenes S-23 6,3 12,5 25 50 50 12,5

Sl-1 Srlutea PCI 1001 6,3 12,5 50 50 50 25

Mf-1 M. flavus D12 12,5 25 50 100 100 25 15 Cr-1 C. xerosis 53K-1 25 50 >100 >100 >100 50

Bs-1 B. subtilis PCI 219 25 25 100 100 100 25

Bg-1 B. megaterium D2 ::25 25 50 100 100 25

Ba-3 B. anthracis A9504 6 ,3 12 ,5 25 50 50 12,5 M6-1 M.· smegmatis 607D87 25 25 25 100 ~ 100 25 20 Mp-1 M. phlei D88 12,5 12,5 12,5 50 50 12,5

Ec-1 E. coli NIHJ >100 >100 >100 >100 >100 >100

Kp-1 K. pneumoniae D-11>100 >100 >100 >100 >100 >100

Pa-3 P.aeruginosa A9930>100 >100 >100 >100 >100 >100

Pv-1 P.vulgaris A9436 >100 >100 >100 >100 >100 >100 25 Pm-1 P.mirabilis A9554 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pg-1 P.morganii A9553 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Sm-1 S.marcescens A2001S>100 >100 >100 >100 >100 >100

Al-1 A.faecalis ATCC8750>100 >100 >100 >100 >100 >100

Ca-1 C.arbicans IAM4888 >100 >100 >100 >100 >100 >100 30 Cn-3 C.neoformans 100 >100 >100 >100 >100 >100

Antitumcractiviteit:

Vergelijkend onderzoek van BBM-928 componenten A, B, C en D met mitomycine C op antitumorwerking werd uitgevoerd met de intra-35 peritoneaal geïmplanteerde tumoren: P388 leukemie, L1210 leukemie,

80 0 1 80S

- 16/17 - B16 melanoma, Lewis Lung (LL) carcinoom, en sarcoma 180 ascites (S180). Testoplossingen van de ΒΒΙΊ-928 componenten in 0,9% pekel, bevattende 10% dimethylsulfoxyde en mitomycine C in 0,9% pekel, werden eenmaal per dag toegediend volgens doseringsschema’s, die 5 varieerden van een enkelvoudige eendaagse behandeling tot meervoudige dagelijkse behandelingen. Door de dosering te variëren werd de minimum effectieve dosis (MED) bepaald, die een middelwaarde voor de overlevingsduur voor de behandelde dieren gaf welke tenminste 1,25-maal zo groot was als die van een controlegroep. Dit werk-10 zaamheidsniveau wordt geacht een maat te zijn voor een signifante antitumorwerkzaamheid. De resultaten staan in tabel F, tezamen met berekende werkzaamheidsverhoudingen, waaruit blijkt dat ΒΒΙΊ-928 A aanzienlijk sterker is dan mitomycine C met een factor van 10 -300, afhankelijk van de tumorstam en het doseringsschema. Intrape-15 ritoneale LD^g-waarden voor ΒΒΙΊ-928 componenten A, B, C en D en mitomycine C, bepaald met de methode van Van der Waerden, Arch. Expt. Path. Pharmak., 195, 389 (1940) zijn eveneens in tabel F weergegeven.

Tabel F

20 Antitumorwerkzaamheid en toxiciteit van BBM-928 A,

B, C en D en mitomycine C

Behande- Minimum effectieve dosis (MED, mg/kg/dag) LD^g,i.p. ling (a) P38B L121Q B16 LL S180 (mg/kg/dag) BBM-928A 0,003 >0,1 0,003 0,03 0,003 0,13 25 BBM-928B 0,1 - - - 0,18 BBM-928C - 0,81 BBM-928D 0,003 - - - 0,083 mitomycine CO,13 1 0,3 0,3 9,3

Behande-30 llngjtil BBM-928A 0,001 0,003 0,003 0,003 0,0001 0,013 mitomycine C 0,1 0,3 0,3 0,3 0,03 1,4

Activiteitsverhouding (BBM-928A ten opzichte van mitomycine C) 35 Behandeling (a) 30 - 300 10 100 8001868 - 18 -

Tabel F (vervolg)

Behandeling (b) 100 100 100 100 100 a. eenvoudige behandeling op dag 1.

5 b. dagelijkse behandelingen van dag 1 tot dag 9.

Voorbeeld_I

Bereiding_van_BBM;928_cgmgle><

Agarfermentatie - Een goed gegroeide agarhelling van een stam van Actinomycetes, G455-101, werd gebruikt voor het enten 10 van vegetatief medium dat 2% oplosbaar zetmeel, 1% glucose, 0,5% farmamedia, 0,5% gistextract, 0,5% NZ-amine (type A) en 0,1% CaCOg bevatte, waarbij de pH voor de sterilisatie op 7,2 werd ingesteld.

De entcultuur werd gedurende 72 uren bij 32°C geïncubeerd op een 3 roterend schudapparaat (250 omw./min), en 5 cm van het gegroeide 3 15 materiaal werd overgebracht in een 500 cm Erlenmeyerkolf die 100 3 o cm fermentatiemedium, bestaande uit 2% oplosbaar zetmeel, 1% farmamedia, 0,003% ZnSO^.7Η^0 en 0,4% CaCOg bevatte. De bereiding van het BBM-928 complex bereikte in het algemeen zijn maximum na ongeveer 5 dagen schuddend kweken.

20 Vatfermentatie - Een entcultuur werd gedurende 4 dagen in 3 ERlenmeyerkolven geschud en geënt in 100 dm ontkiemingsmedium, bestaande uit 2,0% havermeel (Quaker Products, Australië), 0,5% glucose, 0,2% droge gist, 0,0008% MnC^^h^O, 0,0007% CuSO^^I^Q, 0,0002% ZnSO^.fl^O en 0,0001% FeSO^.71^0 in een 200 dm^ entvatfer-25 mentator die gedurende 54 uren bij 30°C geroerd werd met 200 omw./ 3 minuut. Een 15 dm deel van de entcultuur werd vervolgens geéYit in 3 170 dm fermentatiemedium, dat 2,0% oplosbaar zetmeel, 1,0% farma- •3' media, 0,003% ZnSO^^h^O en 0,4% CaCO^ bevatte in een 400 dm vat-fermentator die met 200 omw./minuut bij 30°C werd bedreven met een 3 30 beluchtingssnelheid van 150 dm per minuut. De pH van de bouillon steeg geleidelijk met het voortschrijden van de fermentatie en bereikte 8,4 - 8,5 na 100 - 120 uren, op welk moment een antibioticum- 3 sterktepiek van 30 yg/cm werd verkregen.

35 8001868 - 19 -

y°orbseld_II

Isolatie van_BBM^28_cgrn£le><_door oglosm^delextractie: 3

Men filtreerde 170 dm , pH 8,5, van de uit voorbeeld I verzamelde bouillon met een klaarmiddel; In zowel de myceriële koek’ 5 als in het filtraat werd werkzaamheid aangetroffen. De myc eriële koek werd tweemaal geëxtraheerd met een oplosmiddelmengsel van ace- 3 ton en methanol Cl : 1, 30 dm , 2-maal). De extracten werden gecombineerd en verdampt onder verminderde druk, waarbij een waterig concentraat werd verkregen dat met π-butanol werd geëxtraheerd.

10 Het bouillonfiltraat werd tweemaal met n-butanol C2 x 40 dm ) ge- • extraheerd. Concentratie van de gecombineerde n-butanolextracten onder verminderde druk en lycfilisatie van het residu gaf 21,4 g van een ruwe vaste stof. Volgens een analyse met dunnelaagchromato-grafie was dit materiaal een complex, bestaande uit 3 hoofdcomponen-15 ten A, B en C, en drie bijcomponenten D, E en F met Rf-waarden als in tabel G zijn aangegeven.

Tabel G

Silicagel TLC van BBM-928 componenten

Rf-waarden x 20 Systeem N-118 xx Systeem N-103 xxx BBM-928A 0,71 0,48 BBM-928B 0,53 0,26 BBM-928C 0,27 0,07 BBM-928D 0,73 0,53 25 BBM-928E 0,56 0,34 BBM-928F 0,39 0,17 x: detectie met UV scanner CShimadzu CS-910) bij 345 nm xx: n-butanol - methanol - water C63 : 27 : 10) xxx:xyleen - methylethylketon - methanol (5:5:1)

30 Voorbeeld_III

?yiy?iiQg_y§D_§0öl9?8_cgmgl§x.

Het ruwe complex van voorbeeld II werd gezuiverd door een 3 preparatieve tegenstroomse verdelingsapparatuur (Mitamura, 100 cm per buis) onder toepassing van een oplosmiddelsysteem van koolstof-35 tetrachloride - chloroform - methanol - water (5 : 2 : 5 : 1). Na 800 1 8 68 - 20 - 50 doorgangen werden buizen 5-20 verenigd en geconcentreerd, waarbij 4,4 g van een lichtgeel poeder werd verkregen dat de componen- . ten A, B, D, E en F bevatte. Dit mengsel werd opgelost in een kléine hoeveelheid chloroform en op een kolom van sillcagel C-200 3 5 C500 cm 3 gebracht, die vooraf met ethylacetaat was behandeld. De kolom werd ontwikkeld met ethylacetaat met een toenemende hoeveelheid methanol (2 - 5 vol.%3 en de fracties werden met een optische dichtheid bij 345 nm gevolgd. De bij component D werd eerst geëlu-eerd met ethylacetaat, gevolgd door component A. De componenten 10 E, B en F werden vervolgens in die volgorde bij een methanolcon- centratie van 3% geëlueerd. Elke fractie welke de geschikte component bevatte, werd onder verminderde druk verdampt en het residu uit chloroform-methanol gekristalliseerd. Eveneens werd een ruw preparaat van component C verkregen uit buizen 21 - 35 van de bo-15 venstaand beschreven tegenstroomse verdeling. Zuivering van compo nent C werd uitgevoerd door silicagelchromatografie en kristallisatie uit chloroform-methanol. De opbrengsten voor de componenten A, B, C, D, E en F waren resp. 980 mg, 420 mg, 848 mg, 130 mg, 119 mg en 114 mg.

20 Voprbeeld_iy

Verdere zuivering_yan^compgnent_BBri-92SA_van_voorbeeld^III

Dunnelaagchromatografie-analyse van de ΒΒΙΊ-928Α component van voorbeeld III (onder toepassing van een systeem dat uit 10% methanol in tolueen bestond] toonde aan dat het monster niet volle-25 dig homogeen was. Het bevatte extra materiaal dat net voor de BBM-928A component liep. De volgende trappen werden ter zuivering uitgevoerd.

(13 Het monster werd chromatografisch behandeld op silica-gel onder toepassing van een lineaire gradiënt van chloroform tot 30 6% methanol-chloroform. Fracties die geëlueerd werden tussen 2,4 en 3,3% methanol-chloroform (die de BBN-928A component plus enige verontreiniging bevatten] werden voor de volgende trap samengebracht .

(23 Een concave gradiënt werd gecreëerd onder toepassing 35 van drie vaten die 2% methanoltolueen in de eerste twee en 6% metha- 3001868 - 21 - noltolueen in de derde bevatten. Het mengsel van trap (1), chroma- tografisch over een silicagelkolom behandeld met deze gradiënt, gaf een bijcomponent die eerst geëlueerd werd, dicht op de hielen gevolgd door de gezuiverde BBM-928A component Chier aangeduid als 5 ΒΒΙΊ-928Α ).

P

Het molecuulgewicht van BBM-928Ap, bepaald door velddesorp-tiemassaspectrometrie, bedroeg 1427, overeenstemmend met een empy-rische formule van Cg^H^N^O^ (molecuulgewicht 1427,417).

Elementairanalyse (monsters gedurende 18 uren op 100°C ge-10 droogd): berekend voor Cg^H^gN^^Q^^ï C 53,85, H 5,51, N 13,74, 0a:26,90.

gevonden0 : C 52,47, H 5,48, N 13,81, 0 :28,243 a. door verschil b. gemiddelde van drie bepalingen.

8001868

Claims (5)

1. Antitumorantibiotische verbinding BBM-928A met de volgende eigenschappen: a. oplosbaar in chloroform en methyleenchloride, enigszins oplosbaar in benzeen, ethanol, methanol en n-butanol, en nagenoeg on- 5 oplosbaar in water en n-hexaanj b. geeft een positieve reactie met ijzer(III)chloride en Ehrlich-reagens en een negatieve reactie met Tollens, Sakaguchi en • ninhydrinereagens; c. is een effectief antitumormiddel tegen P388 leukemie, 11210 leu- 10 kemie, B16 melanoma, Lewis Lung carcinoom, sarcoma 180 ascitep tumoren, intraperitoneaal geïmplanteerd in de muis; d. heeft een smeltpunt van 246 - 248°C; 25 e. heeft een specifieke rotatie van ZH7D = 27° (c 1, EHClg); f. heeft een molecuulgewicht van 1427; 15 g. heeft een elementairsamenstelling van ongeveer 52,47% koolstof, 5,48% waterstof, 13,81% stikstof en 28,24% zuurstof; h. vertoont bij silicageldunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,71 met het oplosmiddelsysteem n-butanol - methanol - water (63 : 27 : 10); en een Rp-waarde van 0,48 met het oplosmiddel- 20 systeem xyleen - methylethylketon - methanol (5:5:1); i. geeft bij zure hydrolyse in water oplosbare ninhydrine positieve materialen, waaronder /3-hydroxy-N-methyl-valine, glycine, serine en sarcosine; j. geeft bij basische hydrolyse fragment VI met formule 6, waarin

25 Ser setine voorstelt, Gly glycine voorstelt, Sar sarcosine voor stelt, HM-Ual /3-hydroxy-N-methylvaline voorstelt en het symbool X een aminozuurgedeelte voorstelt; k. heeft een infraroodabsorptiespectrum in kaliumbromide in hoofdzaak ivolgens fig.l; en 1. geeft bij oplassen in gedeutereerd chloroform een protonen-NMR- spectrum in hoofdzaak -volgens fig.5.

2. Antitumorantibioticum volgens conclusie 1, waarin het amino-' 8001868 - 23 - zuurgedeelte X de empirische formule C_HcN_CL in peptidevorm heeft.

3. Antitumorantibioticum volgens conclusie 2, met het Kenmerk, dat het aminozuurgedeelte X in peptidevorm de tetrahydropyridazine-groep met formule 10 is.

4. Antitumorantibioticum volgens conclusie 1, met formule 11, •waarin Ser serine voorstelt, Gly glycine voorstelt, Sar sarcosine voorstelt, HM-Val /3-hydroxy-N-methylvaline voorstelt, en en R2 acetyl zijn.

5. Antitumorantibiotische verbinding 8BP1-928B met een chinoline- 10 chromofoor welke bij zure hydrolase in water oplosbare componenten waaronder serine, glycine, sarcosine en/3-hydroxy-N-methylvaline geeft, en welke in nagenoeg zuivere vorm de volgends eigenschappen heeft: a. oplosbaar in chloroform en methyleenchloride, enigszins oplos- 15 baar in benzeen, ethanol, methanol en n-butanol, en nagenoeg on oplosbaar in water en n-hexaanj b. geeft een positief reactie met ijzer(III]chloride en Ehriich-reagens en een negatieve reactie met Tollens, Sakaguchi en nin-hydrienreagens; 20 c. is een effectief antitumormiddel tegen P388 leukemie intraperi- toneaal geïmplanteerd in de maag; d. heeft een smeltpunt van 214 - 217¾ e. heeft een specifieke rotatie van =* -74° Cc 1, CHClg); f. heeft een elementairsamenstelling van ongeveer 50,14% koolstof, 25 5,29% waterstof, 12,34% stikstof, en 32,23% zuurstof; g. vertoont bij silicageldunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,53 met het oplosmiddelsysteem n-butanol - methanol - water (S3 : 27 ; 19], en een R^-waarde van 0.26 met het oplosmiddelsysteem xyleen - methylethylketon - methanol (5 : 5 : 1]; 30 h. heeft een infraroodabsorptiespectrum in kaliumbromide in hoofd zaak volgens fig.2; en i. bij oplossen in gedeutereerd chloroform geeft het een protonen-NMR-spectrum in hoofdzaak volgens fig.6.

6, Verbinding volgens conclusie 5 met de structuur volgens for- 35 mule 11, waarin Ser serine voorstelt, Gly glycine voorstelt, Sar 8001868 * ί - 24 - sarcosine voorstelt, HM-Val /3 -hydroxy-N-methylvaline voorstelt, R^ acetyl voorstelt, en R2 waterstof is.

7. Antitumorantibiotisohe verbinding BBM-928C met een chinoli-neohromofoor, welke verbinding bij zure hydrolyse in water oplos-5 bare componenten waaronder serine, glycine, sarcosine, en /3-hy- droxy-N-methylvaline geeft, en in nagenoeg zuivere vorm de volgende eigenschappen heeft: a. oplosbaar in chloroform en methyleenchloride, enigszins oplosbaar in benzeen, ethanol, methanol en n-butanol, en nagenoeg on- 10 oplosbaar in water en n-hexaan; b. geeft een positieve reactie met ijzer[III]chloride en Ehrlich-reagens en een negatieve reactie met Tollens, Sakaguchi en ninhydrinereagensj c. is een effectief antitumormiddel tegen B388 leukemie, L1210 leu- 15 kemie, BIS melanoma, Lewis Lung carcinoom, en sarcoma 180 ascii: tes tumoren, intraperitoneaal geïmplanteerd in de muis; d. heeft een smeltpunt van 244 - 248°C; e. heeft een specifieke rotatie = -91° Cc 1, CHClg); f. heeft een molecuulgewicht van ongeveer 1470; 20 g. heeft een elementairsamenstelling van ongeveer 51,77% koolstof, 5,29% waterstof, 13,55% stikstof, en 29,39% zuurstof,· h. vertoont bij silicageldunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,27 met een oplosmiddelsysteem n-butanol - methanol - water (63 : 27 : 10], en een R^-waarde van 0,07 met het oplosmiddel- 25 systeem xyleen - methylethylketon - methanol (5:5:1); i. heeft een infraroodabsorptiespectrum in kaliumbromide in hoofdzaak volgens fig.3; en j. bij oplossen in gedeutereerd chloroform geeft het een protonen-NMR-spectrum in hoofdzaak volgens fig.7.

8. Verbinding volgens conclusie 7, met de structuur volgens formule 11, waarin Ser serine voorstelt, Gly glycine voorstelt, Sar sarcosine voorstelt, Htl-Val /3-hydroxy-N-methylvaline voorstelt, R^ en Rj waterstof voorstellen.

9. Antitumarantibioticum BBM-928D met de volgende eigenschap- 35 pen: too 1868 - 25 - a. oplosbaar in chloroform en methyleenchloride, enigszins oplosbaar in benzeen, ethanol, methanol en n-butanol, en nagenoeg onoplosbaar in water en n-hexaanj b. geeft een positieve reactie met ijzer(III]chloride en Ehrlichf 5 reagens en een negatieve reactie met Tollens, Sakaguchi en ninhydrinereagensj c. is een effectief antitümormiddel tegen intraperitoneaal geïmplanteerde P388 leukemie bij de muis; d. heeft een smeltpunt van 224 - 227°C; 10 e. heeft een specifieke rotatie van L«3% = -13° (c 1, CHC13); f. heeft een elementairsamenstelling van ongeveer 50,75% koolstof, 5,25% waterstof, 12,58% stikstof, en 31,42% zuurstof; g. vertoont bij silicageldunnelaagchromatografie een R^-waarde van 0,73 met het oplosmiddelsysteem n-butanol - methanol - water

15 C63 : 27 ; 10], en een R^-waarde van 0,53 met het oplosmiddel- systeem xyleen - methylethylketon - methanol (5 : 5 : 1]; h. heeft een infraroodspectrum in kaliumbromide in hoofdzaak volgens fig.4; en i. geeft bij oplossen in gedeutereerd chloroform een protonen-NMR- 20 spectrum in hoofdzaak volgens fig.8.

10. Fermentatieproces voor het bereiden van antitumorantibiotisch BBM-928 complex, waarbij een stam van Actinomyceten met de eigenschappen van stam G455-101 wordt gekweekt in een waterhoudende oplossing, welke een assimileerbare koolstofbron en een assimileer- 25 bare stikstofbron bevat onder ondergedompelde aerobe omstandigheden, totdat het verkregen BBM-928 complex een aanzienlijke antitumor-en antibiotische activiteit aan de oplossing meedeelt.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij bovendien het BBM-928 complex uit het cultuurmedium wordt gewonnen.

12. Werkwijze volgens conclusie 10, waarbij bovendien het BBM- 928 complex gescheiden wordt in de componenten A, B, C, D, E en F, welke componenten de volgende R^-waarden in silicageldunnelaagchro-matografie vertonen: 8001868 ψ - 26 - R_P~waarden π-butanol-methanol- xyleen-methylethyl-water (63:27:10) Keton-methanol(5:5:1) ^ 1 — I'··" BBM-928A 0,71 0,48

5 BBM-928B 0,53 0,26 BBM-928C 0,27 0,07 BBM-928D 0,73 . 0,53 BBM-928E .0,56 0,34 BBM-928F 0,39 0,17 10. 13. Preparaat met antitumaractiviteit en/of antibiotische werk zaamheid, gekenmerkt doordat het het BBH-928 complex of een van zijn componenten bevat. 8001868