NO155780B - Fremgangsmaate for fremstilling av et antitumor- og antibiotisk kompleks. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av et nytt antitumor- og antibiotisk kompleks.

Basert på foreliggende spektraldata og tilgjengelige fysisk-kjemiske egenskaper ser det ut til at det omhandlede anti-turmo og antibiotiske kompleks er strukturelt beslektet med kinoksalingruppen av antibiotika slik som echinomycin, Dell et al., i "J.Am.Chem.Soc.", 97, 2497 (1975), kinomyci-ner, Shoji et al. i "J.Antibiotics", 14A, 335 (1961) og triostin C, "Merck Index", 9. utgave, 9399. Det omhandlede antitumor antibiotiske kompleks avviker imidlertid fra disse antibiotika i følgende henseender: 1. Det foreliggende kompleks og komponenter derav inneholder en kinolinkjerne som en kromofor istedet for kinoksalin som i aktinoleukingruppen av antibiotika. 2. Det foreligger kompleks og komponenter derav inneholder ikke svovel i motsetning til nærværet av en disulfid-eller tioacetalbro i strukturen i aktinoleukin-antibiotika. 3. Det foreligger kompleks og komponenter derav oppviser relativt svak antimikrobiell aktivitet i forhold til aktinoleukinene som er kraftige antibakterielle antibiotika.

Det omhandlede hittil ukjente antitumor antibiotiske kompleks kalles BBM.928. Komplekset som inneholder minst 6 komponenter, fremstiles ved dyrking av en BBM-928-produserende stamme av actinomycetes (ATCC 31491) eller en mutant derav i vandig næringsmedium under anvendelse av submerse aerobe betingelser. Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte til utvinning av BBM.928-komplekset fra dyrkningsmediet og separering av komplekset i bioaktive komponenter ved motstrømsfordelings- og kromatografiteknikk.

Innenfor oppfinnelsens ramme faller såvel BBM-928-komplekset som de bioaktive komponenter BBM-928 A, B, C, D, E og F. Oppfinnelsen vedrører spesielt komponentene BBm-928 A, B,

D og D i fortynnede former, som egentlige konsentrater og

i renset form.

I henhold til dette angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et antitumor og antibiotisk BBM-928 kompleks som inneholder en eller flere bioaktive bestanddeler BBM-928A, BBM-928B, BBM-928C, BBM-928D, BBM-928E og BBM-928F, hvor bestanddelene A, B, C og D kan angis ved formelen:

hvori

Ser : serin

Gly : glycin

Sar : sarcosin

NM-Val: -hydroksy-N-metylvalin,

1 2

og nar det gjelder BBM-928A er R og R acetyl, nar det gjelder BBM-928B er R 1 acetyl og R 2 hydrogen, når det gjel-12

der BBM-928C er R og R hydrogen, og når det gjelder BBM-928D er R 1 acetyl og R 2 er C2H^CO, hvilke bestanddeler oppviser følgende R^-verdier ved silikagel tynnsjiktskromato-graf i:

og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at man fermenterer aktinomycetes ATCC 31491 i vandig oppløsning inneholdende en assimilerbar karbonkilde og en assimilerbar nitrogen-

kilde under submerse aerobe betingelser, inntil det dannede BBM--928 kompleks gir oppløsningen vesentlig antitumor aktivitet, hvoretter hvis ønsket komplekset separeres i sine bestanddeler.

Oppfinnelsen skal forklares nærmere under henvisning til tegningene der:

Fig. 1 viser IR-absorbsjonsspektret for BBM-928A i KBr.

Fig. 2 viser IR- absorbsjonsspektret for BBM-928B i KBr.

Fig. 3 viser IR-absorbsjonsspektret for BBM-928C i KBr.

Fig. 4 viser IR-absorbsjonsspektret for BBM-928D i KBr.

Fig. 5 viser NMR-spektret for BBM-928A oppløst i deuterert kloroform under unvendelse av TMS som indre standard, bestemt med et NMR-spektrometer ved en frekvens på 90 MHz. Fig. 6 viser NMR-spektret for BBM-928B oppløst i deuterert kloroform under anvendelse av TMS som indre standard, bestemt ved et NMR-spektrometer ved en frekvens på 90 MHz. Fig. 7 viser NMR-spektret for BBM-928C oppløst i deuterert kloroform under anvendelse av TMS som indre standard, bestemt med et NMR-spektrometer ved en frekvens på 90 MHz. Fig. 8 viser NMR-spektret for BBM-928D oppløst i deuterert kloroform under anvendelse av TMS som indre standard, bestemt med et NMR-spektrometer ved en frekvens på 90 MHz.

Det omhandlede, hittil ukjente, antitumor- og antibiotiske kompleks som vilkårlig kalles BBM-928, antas som nevnt å være strukturelt beslektet med aktinoleukingruppen av antibiotika, og det dannes ved fermentering av en hittil uiden-tifisert stamme av actinomycetes. Enhver stamme av actinomycetes som er istand til å danne BBM-928 i et dyrknings-medium kan anvendes, idet den foretrukne produserende mikroorganisme er betegnet actinomycetes species stamme nr. G455-101 i Bristol-Banyu kultursamlingen. Mirkoorganismen ble isolert fra en jordprøve oppsamlet på Philippinene og den er deponert i American Type Culture Collection of Microorga-nisms som ATCC 31491.

Det omhandlede antitumor- og antibiotiske kompleks har som nevnt minst 6 komponenter kalt BBM-928A, B, C, D, E og F. Komponentene A, B, C og D av BBM-928-komplekset er blitt isolert i krystallinsk form med identifiserte kjemiske strukturer for komponentene A, B og C. Komplekset (og individuelle komponenter) har antitumor- og antibakterielle egenskaper. Med hensyn til antibakteriell aktivitet er komplekset og individuelle komponenter derav anvendelige som nærings-tilskudd til dyrefor og som terapeutiske midler til behandling av bakterielle infeksjoner hos pattedyr og mennesker. Videre er disse antibiotika anvendelige til rensing og sterilisering av laboratorieglassgjenstander og kirurgiske instru-menter, og de kan anvendes i kombinasjon med seper, deter-genser og vaskeoppløsninger til sanitære formål. Med hensyn til antitumorvirkningen er komplekset og individuelle komponenter derav spesielt verdifulle mot en rekke intraperitonealt implanterte muse-tumorer.

Beskrivelse av stamme nr. G455- 101 av slekten actinomycetes. Det følgende er en generell beskrivelse av den foretrukne mikroorganisme til fremstilling av det antibiotiske antitumor-kompleks BBM-928. Det ble foretatt iakttagelser av dyrkningsmessige, fysiologiske og morfologiske forhold for organismen i overensstemmelse med standard-taksonomiske metoder, f.eks. SHirling et al., i "Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313 (1966) og Lechevalier et al., i "Biol. Actinomycetes Related Org.", 11, 78 (1976).

Mikromorfologi: Stamme nr. G455-101 danner både substrat-

og luftmycel og substrat-mycelet er velutviklet, langt og forgrenet med en bredde på 0,5 - 0,8 um. Tydelig fragmen-tering av substratmycelet iakttas ikke. I motsetning til vanlige stammer av Streptomyces har stamme G455-101 kun kort eller rudimentært luftmycel eller danner ikke noe i visse agarmedier. Korte eller lange sporekjeder produseres i luftmycelet som inneholder 2-50 ovale sporer i en kjede, for det meste 5-20 sporer. Sporekjedene er rette, krumme eller løkkeformede. Sporene er sfæriske (0,3 - 0,4

um) , ovale eller sylindriske (0,3 x 1,5 - 3,0 um i form og har glatt overflate. Sporene er ofte adskilte av tomme hyfer. En amorf sporangium-lignende vesikel som omslutter en kort snofid sporekjede iakttas leilighetsvis på luftmycelet.

Sammensetning av cellevegg og helcelle- sukkerkomponenter: Celleveggen for stamme G455-101 inneholder meso-diaminopime-linsyre, men mangler glycin. Helcellehydrolysat viser nærvær av glukose, mannose og madurose (3-0-metyl-D-galak-tose). Den førstnevnte celleveggsammensetning og helcelle-sukkerkomponenter indikerer at stamme G455-101 er en actino-mycetesart av cellevegg type 111B.

Dyrkningsmessige og fysiologiske egenskaper: Stamme G455-101 vokser kraftig, danner lyserødt eller grålig lyserødt luftmycel og produserer et rødlig vannuoppløselig pigment i næringsrike agarmedier slik som gjørekstrakt-maltekstrakt-agar og havremelsagar. I uorganiske saltstivelsesagar, glyserol-asparaginagar og tyrosinagar gir den imidlertid liten vekst, danner hvitt eller beigefarget rudimentalt luftmycel og produserer små mengder rødlig pigment. Mela-noidpigment produseres ikke i pepton-gjær-jern-agar og tyrosinagar. Nitrat reduserer til nitritt. Den vokser kraftig ved 28°C, 37°C og 45°C, men vokser ikke ved 10°C eller ved 50°C. Pentoser og heksoser utnyttes godt av stammen. Dyrkningsmessige og fysiologiske egenskaper av stammen G455-101 er vist i henholdsvis tabellene I og II. Utnyttelsen av karbonkilder er vist i tabell III.

Det skal forstås at fremstillingen av det omhandlede BBM-

928 kompleks ikke er begrenset til den bestemte actinomycetesstamme nr. G455-101 som er beskrevet ovenfor med hensyn til vekst- og mikroskopiegenskaper. Disse egenskaper er kun anført som illustrasjon og oppfinnelsen omfatter anvendelse av stammer eller mutanter frembragt fra den ovenfor beskrevne organisme ved hjelp av konvensjonelle midler slik som utsettelse for røntgenbestråling, ultrafiolett bestrål-ing, nitrogen-sennep, fageksponering o.l., som er istand til å produsere BBM-928 komplekset eller individuelle komponenter derav.

Fremstilling av antitumor antibiotisk BBM- 928 kompleks. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av det antitumor- og antibiotiske BBM-928 kompleks omfatter dyrking ved fermentering av actinomycetesstamme nr. G455-101 i en vandig oppløsning inneholdende en assimilerbar karbonkilde og en assimilerbar nitrogenkilde under submerse aerobe betingelser, inntil oppløsningen er gitt vesentlig antitumor og antibiotisk aktivitet. Konvensjonelle fermenteringsmetoder anvendes ved dyrkning av actinomycetesstamme nr. G455-101. Medier som kan anvendes til fremstilling av de omhandlede antibiotiske og antitumor-midler omfatter en assimilerbar karbonkilde slik som stivelse, glukose, dekstrin, maltose, laktose, sakkarose, fruk-tose, mannose, melasse, glyserol o.l. Næringsmediet bør også inneholde en assimilerbar nitrogenkilde slik som pro-tein, proteinhydrolysat, polypeptider, aminosyrer, maisstøpe-væske, kasein, urinstoff^ o.l., -samt uorganiske nærings-salter som tilveiebringer uorganiske anioner og kationer, slik som kalium, natrium, ammonium, kalsium, sulfat, karbo-nat, fosfoat, klorid, nitrat o.l.

Ved fremstillingen av BBM-928-komplekset kan enhver temperatur anvendes som bidrar til en tilfredsstillende vekst av organismen. Temperaturer varierende fra ca. 20 - ca. 45°C kan anvendes, idet en foretrukket temperatur til optimal vekst av organismen varierer fra ca. 28 - 34°C med et temperaturintervall fra 30 - 32°C som det mest foretrukne. Maksimal produksjon av BBM-928 komplekset oppnås vanligvis

i løpet av ca. 4 - 6 dager. Konvensjonelle metoder anvendes i fermenteringsperioden. F.eks. utføres fremstillingen av små mengder hensiktsmessig i rystekolber eller ved hjelp av overflatekulturer. Fremstilling av store mengder utføres fortrinnsvis under ;sUbmerse aerobe dyrkningsbetingelser i sterile tanker. Ved tankfermentering fremstilles først et vegetativt inokulum i et næringssubstrat ved poding av substratkulturen med en spore fra organismen til dannelse av en ung, aktiv podekultur, som deretter overføres aseptisk til fermenteringstankmediet. Lufting i tanker og kolber kan oppnås ved å tvinge steril luft gjennom eller på fermen-teringsmediet med ytterligere omrøring i tankene ved hjelp av et mekanisk røreverk. Antiskummingsmidler slik som sili-konolje, soyabønneolje og fettolje kan tilsettes etter behov.

Det antibiotiske innhold i fermenteringssubstratet eller ekstraktene av BBM-928-komplekset kan bestemmes ved papir-arkagar-diffusjonsundersøkelse under anvendelse av Sarcina lutea som prøveorganisme og næringsagar som prøvemedium. pH-verdien innstilles til 9,0 for optimal følsomhet for prøvesystemet som anvendes for bestemmelse av optimal sub-stratstyrke.

BBM-928-komplekset isoleres fra fermenteringssubstratet

ved hjelp av konvensjonelle metoder, slik som oppløsnings-middelekstraksjon. Rensing utføres hensiktsmessig ved pre-parative motstrømsfordelings- og kromatografimetoder som skal beskrives nærmere nedenfor i eksemplene 2 og 3, for dannelse av BBM-928-komponentene A, B, C, D, E og F.

Fysisk- kjemiske egenskaper av BBM- 928- komponentene A, B,

C og D i eksempel 3.

Individuelle komponenter av BBM-928 oppviser ensartet opplø-selighet og fargereaksjoner. Der er f.eks. lettoppløselige i kloroform og metylenklorid, lite oppløselige i benzen, etanol, metanol og n-butanol og uoppløselige i vann og n-heksan. Positive reaksjoner med jern-III-klorid og Ehrlich's reagenser oppnås ved negative reaksjoner på Tollens, Sakaguchi og ninhydrin.

Karakteristiske fysisk-kjemiske egenskaper for BBM-928-komponentene i eksempel 3 er vist i tabell IV.

IR-spektrum og NMR-spektra for komponentene A, B, C og D er vist i fig. 1-4 henholdsvis 5-8. NMR-spektrene for BBM-928A i fig. 5, BBM-928B i fig. 6 og BBM-928C i fig.

7 ligner hverandre svært, idet den eneste forskjellen er nærværet av acetylgrupper i komponenten A (6:2,03 ppm, 2 moleekvivalenter) og B (6:2,05 ppm, 1 molekvivalent), men ikke i C. Ved acetylering med eddiksyreanhydrid i pyridin ble det innført 2, 3 og 4 molekvivalenter acetylgrupper i BBM-928-komponenten A, B henholdsvis C. De tre således oppnådde acetyleringsprodukter viste identiske egenskaper i TLC-, UV-, IR- og NMR-spektra, noe som indikerer at BBM-928A er et monoacetylderivat av BBM-928B og et diacetylderi-vat av BBM-928C.

Syrehydrolyse av BBM-928A ga fem n-butanol-oppløselige, UV-absorberende fragmenter (I, II, III, IV, V) samt fem vannoppløselige ninhydrin-positive stoffer (NPS-1, 2, 3,

4 og 5). De sistnevnte stoffer ble separert ved hjelp av "Dowex 50" x 4-kromatografering og ble identifisert som følgende aminosyrer:

S-123: 10% ammoniumacetat - metanol - 10% ammniakkalsk oppløsning (9:10:1).

De fem ovenfor omtalte UV-absorberende fragmenter er påvist å ha følgende strukturer:

Ved sur hydrolyse, 6N HC1, ga fragmentene I, II, III og V følgende nedbrytningsprodukter:

Ser : serin

HM-Val : B-hydroksy-N-metylvalin

Sar : sarcosin.

Basehydrolyse av BBM-928A eller BBM-928C med 0,IN NaOH ved 25°C i 3 timer gir fragment VI (forkortelsene Ser, HM-Val og Sar er som anført ovenfor, Gly angir glycin og symbolet "X" angir en ubestemt del).

Fragment VI

Behandling av fragment VI med 0,1 N HC1 ved 110°C i 1 time gir fragment VII pluss HM-Val.

Fragment VII

Behandling av fragment VI med 0,1 N NaOH ved 37°C i 40 timer gir fragment VIII pluss fragment I.

Fragment VIII

Behandling av fragment VII med 0,IN NaOH ved 37°C i 40 timer gir fragment IX pluss fragment I.

Fragment IX

Den ubestemte del (X) har en molekylformel C-H^N-O., (på

5 6 2 2 c peptidform) basert på mikroanalyse av fragment IX og andre peptidfragmenter inneholdende (X) og spektralanalyse som sammenfattet nedenfor.

I henhold til spektraldata for fragmentene VIII og IX samt et 360 MHz proton-NMR for BBM-928Ap i eksempel 4 synes den ubestemte aminosyredel (A) best å kunne tildeles følgende tetrahydropyridazinstruktur:

Basert på resultatene fra de ovenfor beskrevne nedbrytnings-forsøk, spektraldata, mikroanalyser og molekylvektsbestem-melser, antas følgende strukturer best å representere BBM-928A, -B og -C:

Ser : serin

Gly : glycin

Sar : sarcosin

HM-Val : e-hydroksy-N-metylvalin

Antimikrobiell aktivitet

Den antimikrobielle aktivitet av BBm-928-komponentene ble bestemt overfor en rekke bakterier og fungi ved serieagar-fortynningsmetoden i næringsagar ved pH 7 under anvendelse av Steer's multipodingsapparat. Inokulumstørrelsen var standardisert til tilføring av 0,0025 mis andel av prøve-organismer inneholdende ca. 10 4 celler pr. ml for alle bakterier og fungi med unntak av syreresistente bakterier for hvilke det ble anvendt en 10^ celle pr. ml suspensjon. De minimale inhibitoriske konsentrasjoner, MIK, ble bestemt etter inkubasjon over natt ved 37°C og er vist i tabell V. Som det fremgår er BBM-928-komponentene moderat til svakt aktive overfor gram-positive og syreresistente bakte-ier, men praktisk talt inaktive overfor gram-negative bakterier og fungi.

Aktiviteten av profag-induksjon i lysogent bakterium, ILB, ble bestemt for BBM-928-komponentene. Ingen signifikant ILB-aktivitet ble påvist med BBM-928-komponentene A, B og

C inntil en konsentrasjon på 100 ug/ml.

Antitumoraktivitet

Sammenlignende undersøkelser av BBM-928-komponentene A, B, C og D med mitomycin C for antitumoraktivitet ble utført med de intraperitonealt implanterte tumorer: P388 leukemia,

L1210 leukemia, B16 melanoma, Lewis lungecarcinoma (LL)

og sarcoma 180 acites (S180). Prøveoppløsninger av BBM-928-komponenter i 0,9% saltoppløsning inneholdende 10% dimetyl-sulfoksyd og mitomycin C i 0,9% saltoppløsning ble inngitt en gang daglig i henhold til doseringsskjemaer som varierte fra en enkelt endagsbehandling til multiple daglige behand-linger. Ved variasjon av doseringen bestemte man den minimale effektive dose, MED, som bevirket en gjennomsnittlig overlevelsestid for de behandlede dyr på minst 1,25 ganger større enn for en kontrollgruppe. Dette aktivitetsnivå betraktes som et mål for signifikant antitumoraktivitet. Resultatene er vist i tabell VI sammen med de beregnede aktivitetsforhold som viser at BBM-928A er markant mer aktiv enn mitomycin C med en faktor på 10 - 300, avhengig av tumorstammen og doseringssk jemaet. Intraperitoneale LD<-q-verdier for BBM-928-komponentene A, B, C og D samt mitomycin C, bestemt ved metoden i henhold til Van der Waerden i "Arch. Expt. Path, Pharmak.", 195, 389 (1940) er også vist i tabell

VI.

Eksempel 1.

Fremstilling av BBM- 928- kompleks

Agarfermentering: En velvokset agarskråkultur av en stamme av Actinomycetes species G455-101 ble anvendt til poding avvegetativt medium inneholdende 2% oppløselig stivelse,

1% glukose, 0,5% Pharmamedia, 0,5% gjærekstrakt, 0,5% Nz-amin (type A) og 0,1% CaCO^ med pH-verdien innstilt til 7,2 før sterilisering. Podekulturen inkuberes ved 32°C

i 72 timer på et rotasjonsrysteapparat (250 omdr./min.)

og 5 ml av vekstmediet ble overført til en 500 ml Erlenmeyer-kolbe inneholdende 100 ml fermenteringsmedium sammensatt av 2% oppløselig stivelse, 1% Pharmamedia, 0,03% ZnSO^'7H20 og 0,4% CaCO^. Produksjonen av BBM-928-kompleks når vanligvis maksimum etter ca. 5 dagers rystekultivering.

Tankfermentering: En podekultur rystes i 4 dager i Erlen-meyer-kolber og podes på 100 1 formeringsmedium sammensatt av konieossalt, 2,0% havremel, 0,5% glukose, 0,2% tørrgjær, 0,0008% MnCl2.4H20, 0,0007% CuS04.7H20, 0,0002% ZnS04.7H20 og 0,0001% FeS04-7H20 i en 200 liters podningstankfermenter som omrøres ved 200 omdr./min. ved 30°C i 54 timer. En 15 liters andel av podekulturen podes deretter på 180 liter i fermenteringsmedium inneholdende 2,0% oppløselig stivelse, 1,0% Pharmamedia, 0,003% ZnS04.7H20 og 0,4% CaC03 i en 400 liters tankfermenter som arbeider ved 30°C ved 200 omdr./ min. med beluftningshastighet på 150 l/min. Substratets pH-verdi stiger gradvis med fremskridende fermentering og når 8,4 - 8,5 etter 100 - 120 timer, på hvilket tidspunkt det oppnås en maksimal antibiotisk styrke på 30 ug/ml.

Eksempel 2

Isolering av BBM- 928- kompleks ved oppløsningsmiddel-ekstraksj on.

Utvunnet substrat, 170 1 med pH 8,5 fra eksempel 1 filtreres med et klaringsmidel. Aktiviteten bestemmes både i mycelkaken og filtratet. Mycelkaken ekstraheres to ganger med en oppløsningsmiddelblanding av aceton og metanol (1:1,

30 1 x 2). Ekstraktene forenes og dampes inn under et redu-

sert trykk for å oppnå et vandig konsentrat som ekstraheres med n-butanol. Substratfiltratet ekstraheres to ganger med n-butanol (40 1x2). Konsentrering av de forenede n-butanolekstrakter under redusert trykk og lyofilisering av resten gir et urent fast stoff i en mengde av 21,4 g. Ifølge tynnsjiktskromatografiske undersøkelser er dette materialet et kompleks bestående av tre hovedkomponenter A, B og C samt tre mindre komponenter D, E og F med Rf-ver-dier som anført i tabell VII nedenfor.

Eksempel 3

Rensing av BBM- 928- komplekset

Det urene kopleks fra eksempel 2 renses ved hjelp av et preparativt motstrøms-fordelingsapparat (Mitamura, 100 ml/ rør) under anvendelse av et oppløsningsmiddelsystem av kar-bontetraklorid-kloroform-metanol-vann (5:2:5:1). Etter 50 overføringer forenes rørene nr. 5 - 20 og konsentreres for å oppnås et lysegult pulver i en mengde av 4,4 g, inneholdende komponentene A, B, D, E og F. Denne blanding opp-løses i en liten mengde kloroform og fylles på en kolonne av silikagel C-200 (500 ml) som er forbeholdt med etylacetat. Kolonnen utvikles ved hjelp av etylacetat med en stig-ende mengde metanol (2-5% v/v) og fraksjoner bestemmes for optisk densitet ved 345 nm. Den mindre komponent D elueres først med etylacetat etterfulgt av komponent A. Komponentene E, B og F elueres deretter i denne rekkefølge ved 3% metanolkonsentrasjon. Hver fraksjon inneholdende den passende komponent inndampes under redusert trykk og resten krystalliseres fra kloroform-metanol. Tilsvarende oppnås et urent preparat av komponent C fra rør nr. 21 - 3 5 fra den ovenfor beskrevne motstrømsfordeling. Rensing av komponent C utføres ved silikagelkromatografering og krystalli-sering fra kloroform-metano. Utbyttene for komponent A,

B, C, D og E henholdsvis F er 988 mg, 420 mg, 848 mg, 130

mg, 119 mg henholdsvis 114 mg.

Eksempel 4.

Ytterligere rensing av komponent BBM- 928A fra eksempel 3. Tynnsjiktskromatografisk undersøkelse av BBM-938-komponenten fra eksempel 3 (under anvendelse av et system bestående av 10% metanol i toluen) viste at prøven ikke var fullsten-dig homogen idet den inneholdt ytterligere materiale som løp like foran BBM-928A-komponenten. Man foretok de følg-ende trinn for rensing: (1) Prøven ble kromatografert på silikagel under anvendelse av en lineær gradient av kloroform til 6% metanol-kloroform. Fraksjoner som eluerer mellom 2,4 og 3,3% metanol-kloroform

(inneholdende BBM-928A-komponenten pluss noe forurensing)

ble blandet til neste trinn.

(2) En konkav gradient dannes ved anvendelse av tre behold-ere inneholdende 2% metano-toluen i de første to og 6% metanol-toluen i den tredje. Blandingen fra trinn 1, kromatografert (silikagelkolonne) på denne gradient, gir en mindre komponent som eluerer først tett fulgt av den rensede BBM-928A-komponent (her kalt BBM-928A).

Molekylvekten av BBM-928Ap ble bestemt ved feltdesorbsjons-massespektrometri til 1427, noe som svarer til en empirisk formel <C>64<H>78<N>i4°24 (<m>olekvlvekt 1427, 417).

Elementanalyse (prøver tørket ved 100°C i 18 timer):

Claims (1)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et antitumor-og antibiotisk BBM-928 kompleks som inneholder en eller flere bioaktive bestanddeler BBM-928A, BBM-928B, BBM-928C, BBM-928D, BBM-928E og BBM-928F, hvor bestanddelene A, B,

C og D kan angis ved formelen

hvori

Ser : serin

Gly : glycin

Sar: : sarcosin

HM-Val : B-hydroksy-N-metylvalin,

og nao r det gjelder BBM-928A er R 1 og R 2 acetyl, når det gjelder BBM-928B er R 1 acetyl og R 2 hydrogen, nåor det gjel-12

der BBM-298C er R og R hydrogen, og når det gjelder BBM-928D er R<1> acetyl og R<2> er C2H5CO, hvilke bestanddeler oppviser følgende R^-verdier ved silikagel tynnsjiktskroma-toqrafi:

karakterisert ved at man fermenterer aktinomycetes ATCC 31491 i vandig oppløsning inneholdende en assimilerbar karbonkilde og en assimilerbar nitrogenkilde under submerse aerobe betingelser, inntil det dannede BBM-928 kompleks gir oppløsningen vesentlig antitumor aktivitet, hvoretter hvis ønsket komplekset separeres i sine bestanddeler .