DK153501B - Fremgangsmaade til fremstilling af et antitumor antibiotisk kompleks - Google Patents

Description

DK 153501 B

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et hidtil ukendt antitumor antibiotisk kompleks kaldet BBM-928, eller dets komponenter BBM-928 A, B, C, D, E og F, hvor BBM-928 A, B og C har formlen 05

CHO ^ °H

3 /~”V"0Ri is!5:V/Avv'N^^C0-*-Ser+N—( I C-KJly-S ar+HM-V a 1

0 "O -I HO x .OCH

io f o ~ o HM-Val^SarKily^C | il ^—N Ser*-C0 hvori Ser betegner serin, Gly glycin, Sar sarcosin, HM-Val β-hydroxy- Λ 15 N-methylvalin, og R1 og R2 betegner acetyl for BBM-928A, R betegner 2 12 acetyl, og R betegner hydrogen for BBM-928B, og R og R betegner hydrogen for BBM-928C.

Baseret på foreliggende spektraldata og tilgængelige fysisk-kemi-ske egenskaber ser det ud til, at det omhandlede antitumor antibio-20 tiske kompleks er strukturelt beslægtet med quinoxalin-gruppen af antibiotica, såsom echinomycin, Dell, et al., J. Am. Chem. Soc., 97, 2497 (1975), quinomyciner, Shoji, et al., J. Antibiotics, 14A, 335 (1961), og triostin C, Merck Index, 9. udgave, 9399. Det omhandlede antitumor antibiotiske kompleks afviger imidlertid fra disse 25 antibiotica i følgende henseender: 1. Det foreliggende kompleks og komponenter deraf indeholder en quinolin-kerne som en chromophor i stedet for quinoxalin som i actinoleukin-gruppen af antibiotica.

2. Det foreliggende kompleks og komponenter deraf inde- 30 holder ikke svovl i modsætning til tilstedeværelsen af en disulfid- eller thioacetal-bro i strukturen af actino-leukin-antibiotica.

3. Det foreliggende kompleks og komponenter deraf viser relativt svag antimikrobiel aktivitet i forhold til actino- 35 leukinerne, der er kraftige antibakterielle antibiotica.

DK 153501 B

2

Fremgangsmåden er ejendommelig ved, at man dyrker Actinomycetes ATCC 31491 eller en mutant heraf med væsentlig samme egenskaber som denne i vandig opløsning indeholdende en assimilerbar carbonkilde og en assimilerbar nitrogen kilde under submerse aerobe betingelser, 05 og udvinder BBM-928 komplekset fra dyrkningsmediet og, om ønsket, adskiller BBM-928 komplekset i dets komponenter A, B, C, D, E og F.

Der henvises nu til tegningen, hvor

Fig. 1 viser det infrarøde absorptionsspektrum af BBM-928A i 10 kaliumbromid,

Fig. 2 viser det infrarøde absorptionsspektrum af BBM-928B i kaliumbromid,

Fig. 3 viser det infrarøde absorptionsspektrum af BB.M-928C i kaliumbromid, 15 Fig. 4 viser det infrarøde absorptionsspektrum af BBM-928D i kaliumbromid,

Fig. 5 viser det kernemagnetiske resonansspektrum af BBM-928A opløst i deutereret chloroform under anvendelse af TMS som intern standard bestemt med et NMR spektrometer ved en frekvens 20 på 90 MHz,

Fig. 6 viser det kernemagnetiske resonansspektrum af BBM-928B opløst i deutereret chloroform under anvendelse af TMS som intern standard bestemt med et NMR spektrometer ved en frekvens på 90 MHz, 25 Fig. 7 viser det kernemagnetiske resonansspektrum af BBM- 928C opløst i deutereret chloroform under anvendelse af TMS som intern standard bestemt med et NMR spektrometer ved en frekvens på 90 MHz,

Fig. 8 viser det kernemagnetiske resonansspektrum af BBM-30 928D opløst i deutereret chloroform under anvendelse af TMS som intern standard bestemt med et NMR spektrometer ved en frekvens på 90 MHz.

Stammen betegnet Actinomycetes stamme nr. G455-101 i Bristol-Banyu kultursamlingen blev isoleret fra en j'ordprøve opsamlet pi 35 Philippinerne, og den er deponeret i American Type Culture Collection of Microorganisms som ATCC 31491.

DK 153501B

3

Det omhandlede antitumor antibiotiske kompleks har som nævnt mindst seks komponenter kaldet BBM-928A, B, C, D, E og F. Komponenter A, B, C og D af BBIVI-928 komplekset er blevet isoleret på krystallinsk form med identificerede kemiske strukturer for kompo-nenter A, B og C. Komplekset (og individuelle komponenter) har antitumor antibakterielle egenskaber. På grund af antibakteriel aktivitet er komplekset og individuelle komponenter deraf anvendeligt som tilskud til dyrefoder og som terapeutiske midler til behandling af bakterielle infektioner hos pattedyr og mennesker. Endvidere er 1° disse antibiotica anvendelige til rensning og sterilisering af labora-torieglasting og kirurgiske instrumenter, og de kan anvendes i kombination med sæber, detergenter og vaskeopløsninger til sanitære formål. På grund af antitumor virkninger er komplekset og individuelle komponenter deraf særlig værdifulde mod en række intraperito-15 nealt implanterede muse-tumorer.

Beskrivelse af stamme nr. G455-101 af slægten Actinomycetes

Det følgende er en almen beskrivelse af den foretrukne mikroorganisme til fremstilling af det antibiotiske antitumor kompleks BBM-20 g28. Der foretoges iagttagelser af dyrkningsmæssige, fysiologiske og morfologiske forhold for organismen i overensstemmelse med standard taxonomiske metoder, f.eks. Shirling, et al., Int. J. Syst. Bacteriol.

16, 313 (1966), og Lechevalier, et al., Biol. Actinomycetes Related Org. 11, 78 (1976).

25 Mi kromorfologi - Stamme nr. G455-101 danner både substrat- og luftmycelium, og substrat-myceliet er veludviklet, langt og forgrenet (0,5-0,8 μ i bredde). Tydelig fragmentering af substrat-myceliet iagttages ikke. I modsætning til sædvanlige stammer af Streptomyces har stamme G455-101 kun kort eller rudimentært luftmycelium eller 50 danner ikke noget i visse agar-medier. Korte eller lange sporekæder produceres i luftmyceliet, som indeholder 2-50 ovale sporer i en kæde (for det meste 5-20 sporer). Sporekæder er lige, bugtede eller løkkeformede. Sporerne er sfæriske (0,3-0,4 μ), ovale eller cylindriske (0,3 x 1,5 - 3,0 μ) af form og har glat overflade. Sporer er ofte 25 adskilt af tomme hypher. En amorf sporangium-lignende vesikel, som omslutter kort snoet sporekæde, iagttages lejlighedsvis pi luftmyceliet.

4

DK 153501B

Sammensætning af cellevæg og helcelle-sukkerkomponenter -Cellevæggen for stamme G455-101 indeholder meso-diaminopimelinsyre, men mangler glycin. Helcelle-hydrolysat viser tilstedeværelse af glukose, mannose og madurose (3-O-methyl-D-galaktose). Den førnævnte 05 cellevægssammensætning og helcelle-sukkerkomponenter indikerer, at stamme G455-101 er en actinomycetes-art af cellevæg type IIIB.

Dyrkningsmæssige og fysiologiske egenskaber - Stamme G455-101 vokser kraftigt, danner lyserødt eller gråligt lyserødt luftmycelium og producerer et rødligt vanduopløseligt pigment i næringsrige agar-10 medier, såsom gærekstrakt-maltekstrakt-agar og havremels-agar. I uorganiske salte-stivelses-agar, glycerol-asparagin-agar og tyrosin-agar giver den imidlertid ringe vækst, danner hvidt eller beigefarvet rudimentalt luftmycelium og producerer små mængder rødligt pigment. Melanoid-pigment produceres ikke i pepton-gær-jern-agar og tyrosin-15 agar. Nitrat reduceres til nitrit. Den vokser kraftigt ved 28°C, 37°C og 45°C, men vokser ikke ved 10°C eller ved 50°C. Pentoser og hexo-ser udnyttes godt af stammen. Dyrkningsmæssige og fysiologiske egenskaber af stamme G455-101 er vist i hhv. tabel I og II. Udnyttelsen af carbonkilder er vist i tabel III.

20 25 30 35

Tabel I

5

DK 153501B

Dyrkningsmæssige egenskaber af stamme nr. G455-101* 05 1. Czapek's agar G** innen eller knan vækst

(saccharose-nitrat-agar) m9en eller KnaP væKSX

^ mørk rosa ^ hvid til bleg lyserød

D

ω ingen 10 2. Trypton-gærekstrakt- substrat (ISP nr. 1) moderat vækst, fnugget, sedimenteret og ikke pigmenteret 3. Gærekstrakt-maltekstrakt- r agar (ISP nr. 2) kraftig ^ ^ dybrød til rødlig brun ^ kraftig, grålig lyserød til let blålig lyserød ^ ingen 20 4. Havremels-agar (ISP nr.3) 0 G kraftig ^ kraftig gullig-rød ^ moderat, lyserød 25 D grålig-gul

5. Uorganiske salte-stivelses- G

agar (ISP nr. 4) ringe let gullig-brun til mørkerød ^ knap, hvid til beige 30 D · w ingen 6. Glycerol-asparagin-agar o (ISP nr. 5) ® ringe gullig lyserød til rødlig brun 33 ^ knap, hvid ^ ingen

Tabel I (fortsat) 6

DK 153501B

7. Pepton-gærekstrakt-jern- G ringe, foldet agar (ISP nr. 6) R kraftig rødlig orange 05 A ingen D let gullig orange 8. Tyrosin-agar (ISP nr. 7) G ringe R mørkerød A knap, hvid D ingen 9. Glukose-ammoniumsalte- G ringe 15 agar R rødlig brun A knap, lysegrå D ingen 20 10. Bennett's agar G moderat R rødlig brun A begrænset, grålig lyserød D ingen 25 * iagttaget efter inkubation ved 37°C i 3 uger.

** Forkortelser: G - vækst R - bagsidefarve for substratmycelium A - luftmycelium D - diffunderbart pigment.

30 35 7

DK 15350 IB

Tabel II

Fysiologiske egenskaber af stamme nr. G455-101

Test_ Reaktion Metode og medium 05 Nitrit fra nitrat positiv uorganisk medium: Czapek's saccharose-nitratsubstrat

Nitrit fra nitrat positiv organisk medium: 0,5% gær ekstrakt, 1,0% glukose, 0,5% KN03, 0,1% CaC03 .jq Caseinhydrolyse i svagt positiv Luedemann's agarmedium agarmedium ...................

Skummetmælks- positiv koagulering

Gelatine-forflydigelse negativ 15% gelatine i trypton-gær- ekstrakt substrat (ISP nr.1 15 medium)

HpS-fremstilling ud fra positiv L-cystein (0,1%) sat til L - cy stein try pton -gære kstra kt- substrat (ISP nr. 1 medium) plus agar. HpS påvist med papir-strimmerindeholdende 10% 2Q vandig bly-acetat-opløsning.

Dannelse af melanoid negativ pepton-gær-jern agar (ISP nr. 6) og tyrosin-agar (ISP nr. 7).

Catalasereaktion positiv H2°2 vand'9 opløsning.

25 Oxidasereaktion positiv Kovacs1 reagens Væksttemperatur kraftig vækst Bennett's agar ved 28, 37 og 45°C. Ringe vækst ved 20°C.

Ingen vækst 30 ved 10°C og 50°C.

35

DK 153501B

8

Tabel III

Udnyttelse af carbonkilder for stamme nr G455-101 PG Lm 05 1. Glycerol ++ + 2. D(-)-Arabinose + + 3. L(+)-Arabinose + + 4. D-Xylose ++ + 5. D-Ribose ++ + 10 6. L-Rhamnose ++ + 7. D-Glukose + + 8. D-Galaktose ++ + 9. D-Fructose ++ + 10. D-Mannose ++ + 15 11. L-(-)-Sorbose 12. Saccharose 13. Laktose -,_+ 14. Cellobiose + + 15. Melibiose -,_+ 20 16. Trehalose + + 17. Raffinose 18. D(+)-Melezitose 19. Opløselig stivelse + 20. Dulcitol - 25 21. Inositol + 22. D-Mannitol ++ + 23. D-Sorbitol 24. Salicin - - 25. Cellulose + + 30 26. Chitin + + 27. Keratin + +

Basismedium PG: Pridham-Gottlieb's uorganiske medium, tilsat 0,1% gærekstrakt.

35 Lm: Luedemann's organiske medium

Inkubation i 2 uger ved 37°C.

DK 153501B

9

Ved fremgangsmåden ifølge anvendelsen kan også anvendes mutanter frembragt fra den ovenfor beskrevne organisme ved hjælp af konventionelle midler, såsom udsættelse for røntgenbestråling, ultraviolet bestråling, nitrogen-sennepsgas, fag-eksponering og lignende, 05 som har væsentlig samme egenskaber som denne, og som er i stand til at producere BBM-928 komplekset

Fremstilling af antitumor antibiotisk BBM-928 kompleks

Medier, som kan anvendes til fremstilling af de omhandlede anti-10 biotiske antitumor-midler omfatter en assimilerbar carbonkilde, såsom stivelse, glukose, dextrin, maltose, laktose, saccharose, fructose, mannose, melasse, glycerol og lignende. Næringsmediet bør også indeholde en assimilerbar nitrogenkilde, såsom protein, protein hydrolysat, polypeptider, aminosyrer, majsstøbevæske, casein, urinstof og 15 lignende samt uorganiske næringssalte, der tilvejebringer uorganiske anioner og kationer, såsom kalium, natrium, ammonium, calcium, sulfat, carbonat, phosphat, chlorid, nitrat og lignende.

Ved fremstillingen af BBM-928 komplekset kan enhver temperatur anvendes, som bidrager til en tilfredsstillende vækst af organismen.

20 Temperaturer varierende fra ca. 20° til 45°C kan anvendes, idet en foretrukket temperatur til optimal vækst af organismen varierer fra ca. 28° til 34°C med et temperaturinterval pi 30° til 32°C som det mest foretrukne. Maksimal produktion af BBM-928 komplekset opnås i almindelighed i løbet af ca. 4 til ca. 6 dage. Konventionelle metoder 25 anvendes i fermenteringsperioden. F.eks. udføres fremstillingen af små mængder hensigtsmæssigt i rystekolber eller ved hjælp af overfladekulturer. Fremstilling af store mængder udføres fortrinsvis under submerse aerobe dyrkningsbetingelser i sterile tanke. Ved tankfermentering fremstilles først et vegetativt inoculum i et næringssub-50 strat ved podning af substratkulturen med en spore fra organismen til dannelse af en ung, aktiv podekultur, som dernæst overføres aseptisk til fermenteringstankmediet. Luftning i tanke og kolber kan opnås ved at tvinge steril luft gennem eller på fermenteringsmediet med yderligere omrøring i tanke ved hjælp af en mekanisk propel.

55 Antiskumningsmidler, såsom silikonolie, sojabønneolie og fedtolie kan tilsættes efter behov.

10

DK 153501B

Det antibiotiske indhold i fermenteringssubstratet eller ekstrakterne af BBM-928 kompleks kan bestemmes ved papirskiveagar-diffu-sionsundersøgelse under anvendelse af Sarcina lutea som testorganisme og næringsagar som prøvemedium. pH-værdien indstilles på 05 9,0 til optimal sensitivitet for prøvesystemet, der anvendes til be stemmelse af optimal substratstyrke.

BBM-928 komplekset isoleres fra fermenteringssubstratet ved hjælp af konventionelle metoder, såsom opløsningsmiddelekstraktion. Rensning udføres hensigtsmæssigt ved præparative modstrømsforde-10 lings-og kromatografi-metoder som nærmere beskrevet i eksempel 2 og 3 nedenfor til dannelse af BBM-928 komponenter A, B, C, D, E og F.

Fysisk-kemiske egenskaber af BBM-928 komponenter A, B, C og D 15 Individuelle komponenter af BBM-928 udviser ensartet opløse lighed og farvereaktioner. De er f.eks. letopløselige i chloroform og methylenchlorid, ringe opløselige i benzen, ethanol, methanol og n-bu-tanol og uopløselige i vand og n-hexan. Positive reaktioner med ferri-chlorid og Ehrlich's reagenser opnås ved negative reaktioner på Toliens, 20 Sakaguchi og ninhydrin.

Karakteristiske fysisk-kemiske egenskaber for BBM-928 komponenter er vist i tabel IV.

25 30 35

Tabel IV

DK 153501B

11

Fysisk-kemi ske egenskaber af BBM-928 komponenter A, B, C og D

05 _BBM-928_

A B C D

Smeltepunkt 246-248°C 214-217°C 244-248°C 224-227°C

[<x]p5 (c 1, CHCI3) -27° -74° -91° -13° 10

Analyse, fundet C: 53,19 50,14 51,77 50,75 H: 5,40 5,29 5,29 5,25 N: 12,92 12,34 13,55 12,58 (ved difference) O: 28,49 32,23 29,39 31,42 15 λ i nm (E 1-6 ) max 1 cm i EtOH 235(586) 235(570) 235(638) 235(550) 264(415) 264(400) 264(442) 264(380) 345(165) 345(163) 345(173) 345(155) „n i EtOH-HCI 234(610) 234(556) 234(650) 234(565) 264(410) 264(446) 264(442) 264(405) 345(165) 349(188) 345(173) 345(165) i EtOH-NaOH 230(564) 230(530) 230(580) 230(650) 256(763) 256(775) 256(704) 256(930) 330(180) 330(116) 330(117) 330(140) 383(170) 383(122) 383(122) 383(145) 25

Molekylvægt (Osmometer, i CHCI3) 1.450 - 1.470 30 35 DK 153501 B f s, 12

Infrarøde spektrer (IR) og kernemagnetiske resonansspektrer (NMR) for komponenter A, B, C og D er vist i hhv. fig. 1-4 og fig. 5-8 af tegningen. NNIR-spektrerne for BBM-928A (fig. 5), q5 BBM-928B (fig. 6) og BBM-928C (fig. 7) ligner hinanden meget, idet den eneste forskel er tilstedeværelsen af acetylgrupper i komponenter A (δ: 2,03 ppm, 2 molækv.) og B (δ: 2,05 ppm, 1 molækv.), men ikke i C. Ved acetylering med eddikesyreanhydrid i pyridin indførtes 2, 3 og 4 molækvivalenter acetylgruppe i hhv. BBM-928 kom-ponenter A, B og C. De tre således opnåede acetyleringsprodukter viste identiske egenskaber på TLC-, UV-, IR- og NMR-spektrer, hvilket indikerer, at BBM-928A er et monoacetylderivat af BBM-928B og et diacetylderivat af BBM-928C.

Syrehydrolyse af BBM-928A gav fem ri-butanol-opløselige, UV-ab-^ sorberende fragmenter (I, II, III, IV og V) samt fem vand-opløselige ninhydrin-positive stoffer (NPS-1, 2, 3, 4 og 5). De sidstnævnte stoffer adskiltes ved hjælp af Dowex 50 x 4 kromatografering og identificeredes som følgende aminosyrer: 2q Forbindelser Rf (S-123)* Identifikation NPS-1 0,72 β-hydroxy-N-methylvalin (HM-Val) NPS-2 0,49 glycin (Gly) NPS-3 0,46 serin (Ser) 25 NPS-4 0,45 sarcosin (Sar) NPS-5 0,23 (ikke bestemt) *TLC, silicagelplade S-123: 10% ammoniumacetat - methanol - 10% ammoniakalsk opløsning 30 0:10:1)

De fem ovenfor omtalte UV-absorberende fragmenter er påvist at have følgende strukturer:

—0H Fragment I

'H2°H °ιΑΛ°6 “ CO-NH-GH-CO-H + ^ MS: m/e 306 (M ) λΜβΟΗ; 227 233 251 345 ^

Max DK 153501B f 3 13

Fragment II

NH OH C20H25N3°8 OH ' ' , 0-CO-CH-C(CH3)2 MS; m/e 377 (h -58)

Il I ch2 ^^"^CO-NH-CH-COjH ^H: 229, 234, 261, 345 nm

Fragment III

OH MeOH

CH O λ : 230, 235, 262, 345 ran

Uil3 max C0-(NPS-5)

Fragment IV CinH7NO.

OH 10 7 4 H0'Y^Vvvjj/^/ MS: m/e 205 (M+) rn o XMe0H: 228, 260, 354 ran " bU2n max

H,C CH, Fragment V

V

0H · C23H30-V9

0-C0-CH-H-C0-CH2?H

I CH_ CH. CH,Xn : 230, 235, 262, 345 nm L jL I 2 3 3 max

^ΪΓ ^C0-NH-CH-C02H

DK 153501 B

14

Ved sur hydrolyse (6N HCI) gav fragmenter I, II, III og V følgende nedbrydningsprodukter:

Hydrolysebetingelser_ 05 lukket rør tilbagesvalet

Fragment nO°C, 20 timer 110°C, 3 timer I IV, Ser II IV, Ser, HM-Val I, HM-Val

III

10 V - I, HM-Val, Sar

Ser: serin . HM-Val: β-hydroxy-N-methyl valin

Sar: sarcosin 15

Basehydrolyse af BBM-928A eller BBM-928C med 0,1N NaOH ved 25°C i 3 timer giver fragment VI (forkortelserne Ser, HM-Val og Sar er som ovenfor anført, Gly betegner glycin, og symbolet "X,J betegner en ubestemt del).

20

OH

lNJts^ — CCH-Ser-^X->Giy->Sar^HM-Val 25 Fragment VI

Behandling af fragment VI med 0,1N HCI ved 110°C i 1 time 30 giver fragment VII plus HM-Val.

. OH

—CO+Ser+X-HSly^Sar

35 Fragment VII

DK 153501 B

15

Behandling af fragment VI med 0,1N NaOH ved 37°C i 40 timer giver fragment VIII plus fragment I.

X-KBly-s-Sar-^HM-Val 05

Fragment VIII

Behandling af fragment VII med 0,1 N NaOH ved 37°C i 40 timer giver fragment IX plus fragment I.

10 X-M3ly-»Sar

Fragment IX

15 Den ubestemte del (X) har en molekylformel CgHgNgO,, (på peptidform) baseret på mi kroanalyse af fragment IX og andre peptidfragmenter indeholdende (X) og spektralanalyse som sammenfattet nedenfor.

20 ^C-NMR Proton-NMR Bestemmelse 30,14 (t) 2,36 ppm (2H, m) -CH2~ 61,4 (d) , 4,2-4,5 (2H, m) 2 x -CH^T ^ 61,7 (d) * e,'N; 25 140,7 (d) 6,76 (1H, t) -CH=N- 171 (s) - -CO- (amid)

-OH

NH

30 I henhold til de spektrale data for fragmenter VIII og IX samt en 360 MHz proton NMR for BBM-928A i eksempel 4 synes den ube- I-* stemte aminosyredel (X) bedst at kunne tildeles følgende tetrahydro-pyridazin-struktur: 35 I'

DK 153501 B

16 CO-

ll T

05 (X) 10 Baseret pi resultaterne af de ovenfor beskrevne nedbrydnings forsøg, spektraldata, mikroanalyse og molekylvægtbestemmelser antages følgende strukturer bedst at repræsentere BBM-928A, B og C: 15 LI LL * _/-°Ri C0+Ser*N—i OHHLy+Sar+flM-Val 20 0 g o £ HM-Val-f-Sar-i-Gly+i x \ | 3 \—N <-Ser+C0 Λϋ/\/ 25

Rg Ser: serin

Gly: glycin 30 BBM-928A Ac Ac Sar: sarcosin BBM-928B Ac H HM-Val: β-hydroxy-N-methylvalin

BBM-928C Η H

35

DK 153501 B

17

Antimikrobiel aktivitet

Den antimikrobiel le aktivitet af BBM-928 komponenter bestemtes over for en række bakterier og fungi ved serieagarfortyndingsmetoden 05 i næringsagar ved pH 7 under anvendelse af Steer's multipodnings-apparat. Inokulum-størrelsen var standardiseret til tilføring af en 0,0025-ml portion af testorganismer indeholdende ca. 10 celler pr. ml for alle bakterier og fungi med undtagelse af syreresistente bak- g terier, for hvilke der anvendtes en 10 celle pr. ml suspension. De 10 minimale inhibitoriske koncentrationer (MIK) bestemtes efter inkubation natten over ved 37°C og er vist i tabel V. Som det fremgår heraf, er BBM-928 komponenter moderat til svagt aktive over for gram--positive og syreresistente bakterier, men praktisk taget inaktive over for gram-negative bakterier og fungi.

15 Aktiviteten af prophag-induktion i lysogent bacterium (ILB) bestemtes for BBM-928 komponenter. Ingen signifikant ILB-aktivitet påvistes med BBM-928 komponenter A, B og C indtil en koncentration på 100 pg/ml.

’ 20 25 30 35 18 DK 153501 B i i

Tabel V

In vitro antimikrobiel aktivitet af BBM-928 komponenter over for aerobe bakterier 05 BBRl BBM-928 komponenter (MIK i pg/ml)_

Kode Test-organisme A B C D E F Sa-1 S. aureus 209P 12.5 25 50 .100 100 25

Sp-1 S. pyogenes S-23 6.3 12.5 25 50 50 12.5

Sl-1 S. lutea PCI 1001 6.3 12.5 50 50 50 25

Mf-1 flavus D12 12.5 25 50 100 100 25

Cr-1 C2_ xerosis 53K-1 25 50 >100 >100 >100 50 15 Bs-1 B^ subtilis PCI 219 25 25 100 100 100 25

Bg-1 B^_ megaterium D2 25 25 50 100 100 25

Ba-3 B. anthracis A9504 6.3 12.5 25 50 50 12.5 M6-1 fL. smegmatis 607 D87 25 25 25 100 100 25

Mp-1 M. phlei D88 12.5 12.5 12.5 50 50 12.5 20 Ec-1 E;_ coli NIEJ >100 >100 >100 >100 >100 >100

Kp-1 K;_ pneumoniae D-ll >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pa-3 aeruginosa A9930 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pv-1 P^ vulgaris A9436 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Pm-1 P^ mirabilis A9554 >100 >100 >100 >100 >100 >100 25 Pg-1 morganii A9553 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Sm-1 Si^ marcescens A20019 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Al-1 A^_ faecalis ATCC 8750 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Ca-1 C^_ arbicans IAM 4888 >100 >100 >100 >100 >100 >100

Cn-3 C. neoformans 100 >100 100 >100 >100 >100 30 ------------------------------------- 35

DK 153501 B

19

Antitumor-aktivitet

Sammenlignende undersøgelser af BBM-928 komponenter A, B, C og D med mitomycin C for antitumor-aktivitet udførtes med de intra-peritonealt implanterede tumorer: P388 leukemia, L121X) leukemia, B16 05 melanoma, Lewis lunge-carcinoma (LL) og sarcoma 180.ascites (S180). Test-opløsninger af BBM-928 komponenter i 0,9% saltopløsning indeholdende 10% dimethylsulfoxid og mitomycin C i 0,9% saltopløsning administreredes én gang daglig i henhold til doseringsskemaer varierende fra en enkelt éndags-behandling til multiple daglige behand-10 Unger. Ved variation af doseringen bestemtes den minimale effektive dosis (MED), som bevirkede en gennemsnitlig overlevelsestid for de behandlede dyr pi mindst 1,25 gange større end for en kontrolgruppe. Dette aktivitetsniveau betragtes som et mål for signifikant antitumoraktivitet. Resultater er vist i tabel VI sammen med beregnede aktivi-15 tetsforhold, der illustrerer, at BBM-928A er markant mere aktiv end mitomycin C med en faktor på 10 til 300, afhængigt af tumorstammen og doseringsskemaet. Intraperitoneale LD^-værdier for BBM-928-komponenter A, B, C og D samt mitotycin C bestemt ved metoden ifølge Van der Waerden, Arch. Expt. Path. Pharmak., 195, :389 (1940) er 20 også vist i tabel VI.

25 30 35

DK 153501 B

20

Tabel VI

Antitumor-aktivitet og toxicitet af BBM-928 A, B, C og D og Mitomycin C

05

Minimal effektiv dosis (MED, mg/kg/dag) LD-,,, i.p.

P388 L1210 B16 LL SI 80 (md/kg/dag

Behandling3 BBM-928A 0,003 >0,1 0,003 0,03 0,003 0,13 BBM-928B 0,1 - - - 0,18 10 BBM-928C ----- 0,81 BBM-928D 0,003 - - - - 0,083

Mitomycin C 0,1 3 1 0,3 0,3 9,3

Behandling BBM-928A 0,001 0,003 0,003 0,003 0,0001 0,013 15 Mitomycin C 0,1 0,3 0,3 0,3 0,03 1,4

Aktivitetsforhold (BBM-928A vs. Mitomycin C

Behandling3 30 - 300 10 100

Behandling0 100 100 100 100 100 a. enkelt behandling 1. dag 20 b. daglige behandlinger fra 1. til 9. dag 25 30 35

DK 153501 B

21

Eksempel 1

Fremstilling af BBM-928 kompleks φ5 Agar-fermentering. - En velvokset agar-skråkultur af en stamme af Actinomycetes ATCC 31491 anvendes til podning af vegetativt medium indeholdende 2% opløselig stivelse, 1% glukose, 0,5% Pharmamedia, 0,5% gærekstrakt, 0,5% NZ-amin (type A) og 0,1% CaCO^ med pH-vær-dien indstillet pi 7,2 før sterilisering. Podekulturen inkuberes ved .jq 32°C i 72 timer pi et rotationsrysteapparat (250 opm), og 5 ml af vækstmediet overføres til en 500-ml Erlenmeyer-kolbe: indeholdende 100 ml fermenteringsmedium sammensat af 2% opløselig stivelse, 1% Pharmamedia, 0,003% ZnS04,7H20 og 0,4% CaCOg· Produktionen af BBM-928 kompleks når i almindelighed maksimum efter ca. 5 dages ^ rystekultur.

Tankfermentering - En podekultur rystes i 4 dage i Erlenmeyer-kolber og podes pi 100 liter formeringsmedium sammensat af 2,0% havremel (Quaker Products, Australien), 0,5% glukose, 0,2% tørgær, 0,0008% MnCI2,4H20 , 0,0007% CuS04,7H2O, 0,0002% ZhS04,7H20 og 2q 0,0001% FeSC>4,7H2Q i en 200-liter podnings-tankfermentor, der om røres ved 200 opm ved 30°C i 54 timer. En 15-liter portion af podekulturen podes dernæst på 170 liter fermenteringsmedium indeholdende 2,0% opløselig stivelse, 1,0% Pharmamedia, 0,003% ZnS04,7H20 og 0,4% CaCOg i en 400-liter tankfermentor, der arbejder ved 30°C ved 2g 200 opm med en luftningshastighed pi 150 liter/min. Substratets pH-værdi stiger gradvis med fremskridende fermenteringcog når 8,4-8,5 efter 100-120 timer, på hvilket tidspunkt der opnås en maksimal antibiotisk styrke på 30 pg/ml.

30 Eksempel 2

Isolering af BBM-928 kompleks ved opløsningsmiddelekstraktion

Udvundet substrat (170 liter, pH 8,5) fra eksempel 1 filtreres 2g med et klaringsmiddel. Aktiviteten bestemmes i både myceliekagen og filtratet. Myceliekagen ekstraheres to gange med en opløsningsmiddelblanding af acetone og methanol (1:1, 30 liter x 2). Ekstrakter DK 153501 B ; 22 forenes og inddampes under reduceret tryk til dannelse af et vandigt koncentrat, der ekstraheres med n-butanol. Substratfiltratet ekstraheres to gange med n-butanol (40 liter x 2). Koncentrering af de forenede n-butanolekstrakter under reduceret tryk og lyofilisering 05 af remanensen giver et råt fast stof (21,4 g). I henhold til tyndt-lagskromatografisk undersøgelse er dette materiale et kompleks bestående af tre hovedkomponenter A, B og C samt tre mindre komponenter D, E og F med Rf-værdier som anført i tabel VII nedenfor.

10 Tabel VII

Silicagel-TLC af BBM-928 komponenter _Rf-værdier*_ 15 System N-118** System N-103*** BBM-928A 0,71 0,48 BBM-928B 0,53 0,26 BBM-928C 0,27 0,07 20 BBM-928D 0,73 0,53 BBM-928E 0,56 0,34 BBM-928F 0,39 0,17 * bestemmelse med UV-scanner (Shimadzu CS-910) ved 345 25 nm ** n-butanol - methanol - vand (63:27:10) *** xylen - methyl ethyl keton - methanol (5:5:1)

Eksempel 3 30

Rensning af BBM-928 kompleks

Det rå kompleks fra eksempel 2 renses ved hjælp af et præparativt modstrøms-fordelingsapparat (Mitamura, 100 ml/rør) under an-35 vendelse af et opløsningsmiddeisystem af carbontetrachlorid-chloro-form-methanol-vand (5:2:5:1). Efter 50 overføringer forenes rør nr.

5-20 og koncentreres til dannelse af et lysegult pulver (4,4 g) inde-

DK 153501B

23 holdende komponenter A, B, D, E og F. Denne blanding opløses i en lille smule chloroform og fyldes på en kolonne af silicagel C-200 (500 ml), som er forbehandlet med ethylacetat. Kolonnen udvikles ved hjælp af ethylacetat med en stigende mængde methanol (2-5%, 05 V/V) og fraktioner bestemmes for optisk densitet ved 345 nm. Den mindre komponent D elueres først med ethylacetat efterfulgt af komponent A. Komponenter E, B og F elueres dernæst i denne rækkefølge ved 3% methanol koncentration. Hver fraktion indeholdende den passende komponent inddampes under reduceret tryk, og remanensen 10 krystalliseres fra chloroform-methanol. Tilsvarende opnås et råt præparat af komponent C fra rør nr. 21-35 fra den ovenfor beskrevne modstrøms-fordeling. Rensning af komponent C udføres ved silicagef-kromatografering og krystallisation fra chloroform-methanol. Udbytterne for komponenterne A, B, C, D, E og F er hhv. 988 mg, 420 15 mg, 848 mg, 130 mg 119 mg og 114 mg.

Eksempel 4

Yderligere rensning af komponent BBM-928A fra eksempel 3 20

Tyndtlagskromatografisk undersøgelse af BBM-928A komponent fra eksempel 3 (under anvendelse af et system bestående af 10% methanol i toluen) viste, at prøven ikke var fuldstændig homogen, idet den indeholdt yderligere materiale, der løb lige foran BBM-928A kom-25 ponenten. De følgende trin foretoges til rensning.

(1) Prøven kromatograferes pi silicagel under anvendelse af en lineær gradient af chloroform til 6% methanol-chloroform. Fraktioner, som eluerer mellem 2,4 og 3,3% methanol-chloroform (indeholdende BBM-928A komponenten plus nogen forurening) blandes til næste 30 trin.

(2) En konkav gradient dannes ved anvendelse af tre beholdere indeholdende 2% methanol-toluen i de første to og 6% methanol-toluen i den tredie. Blandingen fra trin 1, kromatograferet (silicagelkolonne) på denne gradient, giver en mindre komponent, som eluerer først 35 tæt fulgt af den rensede BBM-928A komponent (her kaldet BBM-928A ).

P

DK 153501 B , , 24

Molekylvægten af BBM-928A bestemt ved Field Desorption Mass

P

Spectrometry er 1427 svarende til en empirisk formel på ^54^73^-14^24 (molekylvægt 1427,417).

Elementær analyse (prøver tørret ved 100°c i 18 timer).

05 C Η N Oa

Beregnet for cø4H7g^']4(-)24: 53,85 5,51 13,74 26,90

Fundet: 52,47 5,48 13,81 28,24b 10 a. Ved difference.

b. Gennemsnit af tre bestemmelser.

15 20- 25 30 35

Claims (1)

1. DK 153501B Fremgangsmåde til fremstilling af et antitumor antibiotisk kompleks kaldet βΒΜ-928, eller dets komponenter BBM-928 A, B, C, D, 05. og F, hvor BBM-928 A, B og C har formlen OH “3°υΥΥ j~\_ T ί X i J-°\ CO^Ser+N—^ Λ I C-KJly^S ar+HM-Val 10 0 ..I i HO x ✓OCH« t o S O 3 HM-V al-**S arKJly^ | il - V"—N. <—SerKIO—^ 15 hvori Ser betegner serin, Gly glycin, Sar sarcosin, HM-Val β-hydroxy-N-methylvalin, og R1 og R2 betegner acetyl for BBM-928A, R1 betegner acetyl, og R2 betegner hydrogen for BBM-928B, og R1 og R2 betegner hydrogen for BBM-928C, KENDETEGNET ved, at man dyrker Actinomycetes ATCC 31491 eller en mutant heraf med væsentlig 20 samme egenskaber som denne i vandig opløsning indeholdende en assimilerbar carbonkilde og en assimilerbar nitrogenkilde under submerse aerobe betingelser, og udvinder BBM-928 komplekset fra dyrkningsmediet og, om om ønsket, adskiller BBM-928 komplekset i dets komponenter A, B, C, D, E og F. 30 35