FI90991B - Menetelmä kasvainten vastaisen antibiootin BU-3862T valmistamiseksi - Google Patents

Description

90991

Menetelmä kasvainten vastaisen antibiootin BU-3862T valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää yhdisteen BU-3862T, 5 jonka kaava on sekä tämän yhdisteen diasetyyli- ja dihydrojohdannaisten valmistamiseksi, joiden kaava on m<H3 jossa Ac on CH3CO-, ja vastaavasti 30 Hakijan tiedossa ei ole rakenteeltaan kyseisen kek sinnön mukaisia yhdisteitä läheisesti muistuttavia kasvainten vastaisia antibiootteja.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että BU-3862T:tä tuottavaa Streptomvces hvqroscopicus -35 kantaa viljellään vesipitoisessa ravintokasvualustassa, 2 joka sisältää assimiloituvan hiili- ja typpilähteen, aerobisissa submerssiolosuhteissa, kunnes mainittu organismi on tuottanut huomattavan määrän BU-3862T:tä kasvualustaan, minkä jälkeen muodustunut BU-3862T otetaan kasvualustasta 5 talteen, ja haluttaessa valmistaa diasetyylijohdannaista BU-3862T saatetaan reagoimaan asetyloivan aineen kanssa inertissä orgaanisessa liuottimessa, tai vastaavasti di-hydrojohdannaisen valmistamiseksi, BU-3862T hydrataan ka-talyyttisesti.

10 BU-3862T ja sen diasetyyli- ja dihydrojohdannaiset osoittavat inhibitioaktiivisuutta kokeellisissa eläinkas-vainjärjestelmissä, esim. B16-melanoomakasvainta vastaan hiiressä.

Kuvio 1 esittää BU-3862T:n infrapuna-absorptiospek-15 triä (KBrrssä mitattuna).

Kuvio 2 esittää BU-3862T:n protoniydinmagneettisen resonanssin spektriä CDCl3:ssa mitattuna (400 MHz).

Kuvio 3 esittää BU-3862T:n 13C-nmr-spektriä CDCl3:ssa mitattuna (100 MHz).

20 Keksinnön mukaisesti BU-3862T-antibiootti tuotetaan fermentoimalla BU-3862T:tä tuottavaa Streptomvces hvaro-scopicus -kantaa.

Edullinen BU-3862T:tä tuottava, P247-7l:ksi nimetty kanta eristettiin maanäytteestä, joka oli otettu läheltä 25 erään tamarindipuun juurta Mt. Apossa, Davao, Mindanaon saari, Filippiinit. Tätä kantaa edustava biologinen puh-dasviljelmä on talletettu talletuslaitokseen the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, ja liitetty laitoksen vakinaiseen mikro-organismikokoelmaan ha-30 kunumerona ATCC 53709.

Kannalla P247-71 suoritetut taksonomiset tutkimukset viittaavat siihen, että kyseinen kanta kuuluu Streptomvces -sukuun ja siinä lajiryhmään Streptomvces hvaros-copicus.

35 Kannan P247-71 tuntomerkit ja ominaisuudet ovat li 90991 3 seuraavat:

Kanta muodostaa sekä substraatti- että ilmamyseele-jä. Ne ovat pitkiä ja runsaasti haaroittuneita; ne eivät pilkkoudu lyhyiksi säikeiksi. Ilmahyyfeihin muodostuu ni-5 velitiöketjuja. Itiöketju ja -morfologia ovat seuraavat: 1) 2-8 kierrettä käsittäviä kierteisiä itiöketjuja, 2) monopodiaalisesti haarautuneita sporoforeja, 3) itiöt, ovaalin tai lieriön muotoisia (0,5-0,7/0,5-1,2 Mm), ja 4) itiökuvioitus, rosoinen tai sileä.

10 Itiöpesäkkeitä, liikkuvia itiöitä tai kovettumia ei havaita.

Kanta P247-71 kasvaa hyvin useimmissa tavanomaisissa kasvualustoissa. Hygroskooppisia mustia täpliä käsittävää harmaata ilmamyseeliä todetaan ISP-agar-kasvualus-15 toissa lukuunottamatta ISP-alustaa n:o 6. Czapekin sakka-roosi-nitraatti-kasvualustassa muodostuu väriltään valkoisesta vaalean kellanharmaaseen ilmamyseeliä. Substraatti-myseeli on väritöntä tai sen väri vaihtelee kellanruskeasta harmaankeltaiseen. Melaniinia tai muita diffundoituvia 20 pigmenttejä ei muodostu. Useimmat sokerit käytetään kasvuun. Kasvatusominaisuudet sekä fysiologiset ominaisuudet on esitetty taulukossa 1 ja vastaavasti 2.

Kannan P247-71 morfologiset ominaisuudet, kasvatus-ominaisuudet ja fysiologiset ominaisuudet viittaavat sii-25 hen, että kanta kuuluu Streotornvces -sukuun. Pridhamin ja Tresnerin (Pridham, T.G. ja H.D. Tresner: Genus Strep- tomvces Waksman and Henrici, 1943, s. 748-829; toim. R.E. Buchanan ja N.E. Gibbons, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. painos, 1974, The Williams & Wilkins Co., 30 Baltimore, USA) mukaan kantojen tärkeimmät ominaisuudet ovat yhteenvetona seuraavat: 1) harmaa ilmamyseeli, 2) kierteinen itiöketju, 3) melaaniiniyhdisteiden puuttuminen, ja 4) sileä itiöseinämäkuvioitus. Itiöineen ilmamy-seelin hygroskooppisuuden muutos on kannan selvä ominais-35 piirre. Nämä tärkeimmät ominaisuudet sekä taulukoissa 1 ja 4 2 esitetyt kannan P247-71 ominaisuudet sijoittavat sen lajiryhmään Streptomvces hvaroscopicus.

Huomattakoon, että kyseinen keksintö ei rajoitu edellä kuvatun erityisen edullisen kannan P247-71 käyttöön 5 tai organismeihin, jotka muuten täysin vastaavat edellä kuvattua. Siihen tarkoitetaan erityisesti kuuluviksi sanotun organismin muut BU-3862T:tä tuottavat variantit tai mutantit, joita voidaan saada tavanomaisin keinoin kuten säteilyttämällä röntgen-, ultraviolettisäteillä, käsitte li) lemällä typpisinappi-yhdisteillä, altistamalla fageille ja muilla vastaavilla tavoilla.

5 90991 <0 m > 3 .μ uo φ o» φ α> •η -η η r-ι <η (Η <υ οι α> α) φ α> Ο μ Ο Ο Ο Ο Ή Ή I—I rH ιΗ Ή Ό μ ΟΟΟΟΟΟ C C ·Η -Η -Η ·Η 3 Φ Φ φ φ Q) -Η ·Η ·Η ·Η ·Η ·Η ιμι g 0)(1)0)(1)(1)11) μ σ •Η ·Η · ο οΐ «β «0 ι ε •H C <Η rH β C Φ 0) «Η -Η —* I Λ μ 0) rH φ O CH · φ Φ Φ Φ r- β σν μ® > ,¾ C w (0 β w Ή -rt e ^ <0 « ε φ μ -HC^r MCE hC X «ö μ β r·» Ο Φ S β Φ G τη

μ μ (O'-* C β C C C X! C C <0 I

•Η β X G <0 ·Η JG :0 :0 :0 ·Η :0 β Μ

Λί β β :0 φβ · —η μ μ μ ββμ Ε —* CQ

μ μ β Φ μ «η μ μ ιη ·η ·η ·η εμ-π >-ιο a Φ μ Ε Αί ·η β rH χ in μ μ μ |η μ β σν ι

EW-Ηΐομ β φ ·Η η ίβ :β -J0 3 Φ ae Ä'-' U

O X Ο 3 ao > .* > ^ > > > μ * > U

μ 3 > μ > (Ο C W · β β Η 3 β X Λ μ β μ β μ Φ Ε Φ μ μ μ β Φ ο )η 3 Φ β •π «β βμ ΦΕ ι 3 ·* > p' βΕ β θ' β X · C Ε β ,β ι φ μ ε >ι β · χ β · μ c μ γ- ^ β u χ ε ή μ ε * ω §μ <ν rH.fi β)πβ3 Ε Φ 3 m β η· β G X β β μ· 3 3 · Ε ϊ Ό CU >β .fi.fi> X μ ^ 53 ·**ιΗ rH <0 · ·«* ··*(/] · ^ «<—* ·*» (/} · ^ ·ιΛ Ο c-HCrH ββΗ c co fivococ :ζ, c β ιΗ Φ Φ β μ β φ φ J-ι φνοφμφ C Φ C X >Φβ C CD' C rv) C O' C -μ C Φ ·Η 3 > ·Η ·Η >ι -Η ^ -Η >, ·Η . ™ 0) β Φ β C ·» E β β£ β β X β Αί « Φ US > Η β φ β ·*. rH ιΗ φ (ΗβιΗ Η φ (ι Ε βφ «H Ο —' β λ β ·» ιΗ ββ β·*· βΟ Γ»3 • β μ η ο Αί *«· G η- μ η· μ ο μ Ε μ μ ^ r μ Η E X β 3 νο Ο νο X νο X ιη Χ^ΧιηΧΟνω-Η rH Ο β ·Η ·Η (Ν 3Μ O cn) Ο νο ·Η Οβ OVO Ο >ι cg Α! O M X > φ C — X ~ Χ'-' X — Φ Αί X Α! — «X Ο X G 3

Αί -Η rH

3 ·*> CO

•HCfi CC fi CtH

3 ΦΦ ΦΦ Φ C C -H φ

β C C - C CC C Φ Φ O E

E-t -H -H β Φ -H -H -H C C X 3

β β Φ C ββ β ·Η ·Η 3 C

cHrHE’H rH rH rH β β A

3 β ββ>ι Ο β β Ο β rH Ή ββ >μ μ φ μ :β C μ μ C μ β β -η-η

Φ X X >, > Ο X X Ο X μ μ βΟ Ο ·Η :0 >ι 3 Ο Ο 3 O X X CI

« X Α! Φ X X X X X X X Ο Ο 0·Η X X X k — -Η :β I νο ·Η > -H I II > μ U Φ · · I O I μ μ β μ I X θ'®·· · n Sh β θ' 3 Η φ ^ u β μ C θ' μ β β 3 μ n U uo *r U if) 3 β >ιΦ >η β Ο 3 β μ β 3 Ci 1η μμ μ ^> > ·· 3 Ο θ' ΙΟΟίΟβΜ^ β Χ·Η •Hl -H C Φ ·· β β·« φ» > Η β α ^ ΦΦ β C X ·Η flCI—.rHGflC-H'-'O't·^® β μφ μ -H o X Λ ιΗ On O I ·Η^ιβ β θ' Φ ΦΟ I W Η CU X 3 Λ ·Η CU X β ·Η ι β μ β 3 ΟΙ ·Η Η β W 30 Φ (Ο «Η CO ID'CO-H I ΟΦ rH ΟΧ C'-'EH β·. * Η Ο Η ·Η β ·Η ·· Φ μ C Φ

β 1η Φ O I w τι C O'"-' Jh w Cl ·Η C O μ C-H

3 β α μ -H β β b φ Ο β Φ Ο Φ ·Η Φ > Α! β α Ε > ^ ^ Λ Ο^ι Φ 1η μμ Oft. A! ^ C β Αί

Φ Λί Ν >1 φ -η β 3(0 :β β >1 β α 3 ^ W 3 β G >rH

β βυ >Η·Η ·Η D> βΗ Ο. θ' Η θ' φβ >ιΗ Η θ' φ β3

« (θ'-r Εη«Η Κ β * ~ W β Οβ Οι b ΕΠ'- Οβ Λ XW

6

Taulukko 2. Kannan P247-71 fysiologiset ominaisuudet

Hydrolyysikokeen tulos: Yhdistekäyttö:1 gelatiini + glyseroli + liukoinen tärkkelys + D-arabinoosi +/- 5 perunatärkkelys + L-arabinoosi + D-ksyloosi +/

Maidon koagulointi - D-riboosi +

Maidon peptonisaatio + L-ramnoosi + D-glukoosi + 10 Tuotanto: D-galaktoosi + nitraattireduktaasi - D-fruktoosi + tyrosinaasi - D-mannoosi L-sorboosi

Sieto: sakkaroosi + 15 lysotsyymi, 0,01 % - laktoosi + (w/v) , 0,001 % - sellobioosi +

NaCl, 1-6 % (w/v) + melibioosi + 7 % (w/v) - trehaloosi +/- pH 5,5-10,5 + raffinoosi + 20 5,0 ja 11,0 - D-meletsitoosi liuk. tärkkelys + Lämpötila: selluloosa kasvualue 20° - 39°C dulsitoli ei kasvua 17° ja 41°C inositoli + 25 optimikasvu 37° - 39°C D-mannitoli + D-sorbitoli - salisiini + li

Perusalusta: Pridham-Gottliebin kasvualusta ( = ISP n:o 30 9 -kasvualusta).

90991 7 BU-3862T:tä voidaan valmistaa viljelemällä BU-3862T:tä tuottavaa Streptomvces hvaroscopicus -kantaa, edullisesti kantaa, joka omaa Streptomvces hvaroscopicus -kannan P247-71 (ATCC 53709) ominaisuudet, tai sen vari-5 anttia tai mutanttia, aerobisissa submerssiolosuhteissa vesipohjaisessa ravintokasvualustassa. Organismia kasvatetaan ravintokasvualustassa, joka sisältää assimiloituvan hiililähteen, joita ovat esim. glyseroli, D-riboosi, L-ramnoosi, D-glukoosi, D-fruktoosi, sakkaroosi, laktoosi, 10 melibioosi, D-mannitoli tai liukoinen tärkkelys. Ravinto-kasvualustan tulisi niinikään käsittää assimiloituva typ-pilähde, kuten kalajauhoa, peptonia, soijajauhoa, maapäh-kinäjauhoa, puuvillansiemenjauhoa tai maissinliuotusvettä. Kasvualustaan voidaan lisätä myös epäorgaanisia ravinne-15 suoloja. Näitä suoloja voivat olla mitkä tahansa tavalliset suolat, jotka kykenevät tarjoamaan natrium-, kalium-, ammonium-, kalsium-, fosfaatti-, sulfaatti-, kloridi-, bromidi-, nitraatti-, karbonaatti- tai muun ionilähteen.

BU-3862T:tä voidaan tuottaa missä tahansa lämpöti-20 lassa, jossa organismi tyydyttävästi kasvaa, esim. 20° -39°C:ssa, ja edullisesti organismin viljely suoritetaan noin 28°C:ssa.

Fermentointi voidaan suorittaa joko pulloissa tai sitten vaihtelevan kokoisissa laboratoriofermentoreissa 25 tai teollisuusfermentoreissa. Tankissa fermentoitaessa tuotetaan edullisesti vegatatiivisolusiirroste ravintolie-meen siirrostamalla pieni tilavuus kasvualustaa vinopinta-tai maa-alustaviljelmästä tai kyseisen organismin kylmäkuivattua viljelmää. Kun näin on saatu aktiivinen siirros- 30 te, se siirretään aseptisesti fermentaation tankkikasvua- lustaan BU-3862T:n tuottamiseksi suurina määrinä. Kasvualusta, jossa vegatiivinen siirroste valmistetaan, voi olla sama kuin tankissa käytetty, tai poiketa siitä, kunhan kyseinen tuotanto-organismi kasvaa tässä alustassa 35 hyvin.

8

Yleensä ottaen BU-3862T:n optimituotantoon päästään noin 4 päivää kestäneen inkuboinnin jälkeen.

BU-3862T voidaan ottaa talteen kasvualustasta ja eristää oleellisesti puhtaana tavanomaisten liuotinuutto-5 menettelyiden ja kromatografisten menettelyiden avulla. Esimerkissä 2 alla on havainnollistettu sopivaa eristys-ja puhdistustapaa.

BU-3862T:n diasetaattijohdannainen (II) voidaan valmistaa saattamalla BU-3862T reagoimaan tavanomaisen 10 asetyloivan aineen kuten asetanhydridin kanssa inertissä orgaanisessa liuottimessa. Tyypillistä menettelyä havainnollistetaan alla esimerkissä 3. BU-3862T:n dihydrojohdannainen (III) voidaan valmistaa hydraamalla katalyyttisesti BU-3862T:tä kuten esitetty esimerkissä 4.

15 BU-3862T saatiin värittömänä tahmeana kiinteänä aineena. Se liukeni hyvin dimetyylisulfoksidiin, dimetyy-liformamidiin, metanoliin, etanoliin, etyyliasetaattiin ja kloroformiin, mutta oli käytännöllisesti katsoen liukenematon veteen, bentseeniin ja muihin orgaanisiin liuot-20 timiin.

BU-3862T antoi positiivisen reaktion jodille, am-moniummolybdaatti-rikkihapolle (AMS:lle) ja Rydone-Smith-reagensseille, mutta sen sijaan se oli negatiivinen nin-hydriini-, antroni- ja rauta(3)kloridikokeissa. BU-25 3862T:n fysikokemialliset ominaisuudet on koottu tauluk koon 3. Tämä yhdiste ei osoittanut karakteristista UV-ab-sorptiota. BU-3862T:n IR-, 1H-nmr- ja 13C-nmr-spektrit on esitetty vastaavasti kuvioissa 1, 2 ja 3.

90991 9

Taulukko 3. BU-3862T:n fvsikokemialliset ominaisuudet

Olomuoto : väritön, tahmea kiinteä aine [alfa]*4 : +32 +/- 2°C (c=0,5, metanoli) 5 EI & FMDS : m/Z 399 (M+H)+

Mikroanalyysi : laskettu C20H34N2°6: C 60,28; H 8,60; N 7,03 todettu: C 60,18; H 8,82; N 6,60 10 TLC, Si02 ί CH2Cl2-MeOH (9:1) Rf „ 0,37 (Merck F254) EtOAc-MeOH (4:1) Rf = 0,59 MEK-ksy1eeni-MeOH Rf = 0,35 (10:10:2) BU-3862T:11a oli voimakas infrapuna-absorptio koh-15 dissa 3300 (hydroksyyli), 1720 (karbonyyli), 1650 ja 1530 cm*1 (amidi) , mikä viittaa antibiootin peptidirakenteeseen. 13C-nmr-spektri osoitti yhdisteessä olevan 20 hiiliatomia, jotka tunnistettiin kahdeksi C-CH3, yhdeksi =C-CH3, kahdeksaksi -CH2, kolmeksi -CH, yhdeksi >C<, ja yhdeksi >C=CH: 20 sekä kolmeksi C=0 -hiileksi. BU-3862T:n molekyylikaavaksi saatiin C2oH34N2°6 mikroanalyysin, massaspektritietojen ((M+H)* : m/z 399) sekä 13C-nmr-spektrianalyysin perusteella. 1H-nmr-spektrissä todettiin 34 protonia. Saadut kaksi dublettiprotonia (delta 7,03 ja 6,48 miljoonaosaa, CDC13) 25 hävisivät asteittain kun lisättiin deuteriumoksidia, ja niiden katsottiin edustavan kahta -NH-CO -ketjua. Leveät kahden singletin protonit (delta 4,83 ja 4,79) ja AB-tyy-pin dublettiprotonit (delta 3,35 ja 3,12; J=5,0Hz) katsottiin ekso-metyleeni- (-(CH3)C=CH2) ja vastaavasti epoksidi- 30 C \7°> . · .

y protoneiksi. Näiden protonien keskinäiset yhteydet määritettiin ’H^H-COSY-kokeiden avulla, jolloin saatiin alla esitetyn mukaiset osarakenteet. Osarakenteiden välisiä yhteyksiä määritettiin 13C-1H-C0SY- ja 13C-1H-35 pitkänmatkan-COSY-kokeissa. Ne analysoitiin kuten on esi- 10 tetty alla, ja siten saatiin BU-3862T:n rakenne kokonaisuudessaan. Lisätodisteita rakenteesta saatiin mas-saspektri- ja degradaatiokokeesta. EI-MS-spektrissä esiintyi runsaasti fragmentti-ioneja kohdassa m/z 127 (iso-ok-5 tanoyyli), 214 (iso-oktanoyyliseryyli) ja 325 (iso-okta- noyyliseryyli-4,5-didehydroleusyyli), mikä tukee oletettua rakennetta. Happohydrolyysissä BU-3862T:stä saatiin aminohappo ja rasvahappo. Aminohappo eristettiin ja tunnistettiin L-seriiniksi HPLCrllä, ja rasvahappo metyyli-10 esterinään tunnistettiin kaasukromatograf isesti iso-oktaa- nihapoksi. BU-3862T:stä saatiin diasetaattijohdannainen käsittelemällä sitä asetanhydridillä pyridiinissä. Hydrat-taessa käyttäen katalysaattorina palladiumia hiilellä BU-3862T:stä saatiin kaksi pelkistystuotetta, dihydro-BU-15 3862T ja tetrahydro-BU-3862T, joiden rakenteet määritet tiin niiden spektritietojen nojalla. Diasetaatti- ja di-hydroyhdisteellä on biologinen aktiivisuus tallella, kun taas tetrahydrojohdannaiselta aktiivisuus puuttui.

BU-3862T voidaan nimetä 1,2-epoksi-2-hydroksi-20 metyyli-4-(N-iso-oktanyyli-L-seryyliamino)-6-metyylihept- 6-en-3-oniksi, ja se on yksittäinen, epoksidi- ja ekso-metyleeniryhmän käsittävä peptidi.

90991 11 BU-3862T:n osarakenteita

I I

C=0 C=0 CH, I I I I 3 5 (CH3)2CH-(CH2)^-C=0 , -NH-CH-CH20H , -NH-CH-CH2-C=CH2 ,

ja -CH20H

10 BU-3862T:n rakenne 15 ch3 H=C<H3 ί H ° I \7°

] U rr^ H OH

20 u hcr o

Diasetvvli-BU-3862T

25 ch3 - ^—0¾ fleer y one 12

Dihvdro-BU-3862T

5 H3C /CH3 CH3 3 Her H n oh 10

Tetrahvdro-BU-3862T

15

H3C /»S

CH. H

0 I I

o Htr^" 25 1H-1H- ia 13C-1H-pitkänmatkan-ninr-sDektri /CH, 9“»V· .-•'H*'· 9^1 -Τ?Λ I } · \ · Π · JJ I · i 30

‘W '-· ° 0H

-* 1H“1H-pitkänm. spektri ---> 13C-1H-pitkänm. spektri 35 li 90991 13 BU-3862T:n ja diasetyyli-, dihydro- ja tetrahydro-BU-3862T:n mahdollista in vitro -sytotoksisuutta tutkittiin useassa hiiri- ja ihmiskasvainsolulinjassa ja/tai in vivo -kasvainvastaisen aktiivisuuden osalta hiirissä. Sekä 5 in vitro - että in vivo -kokeissa käytettiin verrokkiyh-disteenä mitomysiini-C:tä. B16-F10- (hiirimelanooma-), P388- (hiirileukemia-) ja Moser- (ihmisen perä-/paksunsuo-lensyöpä-) solut kasvatettiin logaritmiseen kasvuvaiheeseen täydennetyssä Eaglen minimivaatimuskasvualustassa 10 (MEM), jota oli täydennetty vasikansikiöseerumilla (FCS, 10 %) ja kanamysiinilla (60 pg/ml), ja HCT-116- (ihmisen paksunsuolensyöpä-) solut puolestaan Maccoyn 5A-kasvualus-tassa, jota oli täydennetty FCS:llä (10 %), penisilliinillä (100 u/ml) ja streptomysiinillä (100 pg/ml), minkä jäl-15 keen ne otettiin talteen, ja siirrostettiin edelleen 96-tai 24-kuoppaisten kudosviljelmälevyjen kuoppiin pitoisuutena 1,5 x 105 , 1,2 x 104 , 1,2 x 104 , 2 , 5 x 105 ja vastaavasti 3,0 x 105 solua/ml. Levyjä inkuboitiin 37°C:ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5 % hiilidioksidia ja 20 95 % ilmaa, 72 tunnin ajan. Sytotoksinen aktiivisuus B16- F10-, Moser- ja HCT-116-soluja vastaan määritettiin kolo-rimetrisesti 540 nm:n aallonpituudella, sen jälkeen kun elävät solut oli värjätty 0,006-%:isella neutraalipunavä-riliuoksella. Toisaalta sytotoksinen aktiivisuus P388- ja 25 L1210-soluja vastaan määritettiin laskemalla elävät solut. Tulokset on koottu taulukkoon 4. Mitomysiini-C:hen verrattuna BU-3862T osoitti huomattavasti tehokkaampaa sytotok-sista aktiivisuutta sekä hiiri- että ihmissoluja vastaan.

IC50-arvoihin suhteutettuna teho oli mitomysiini-C:hen 30 verrattuna noin 50-120-kertainen. Samoin diasetyyli- ja dihydrojohdannaiset osoittivat rinnastettavaa sytotoksis-ta tehoa sekä hiiri- että ihmissoluja vastaan, jolloin saadut arvot olivat noin puolet BU-3862T:n vastaavista. Toisaalta tetrahydrojohdannainen oli merkittävästi vähem-35 män aktiivinen kuin edellä mainitut yhdisteet.

14 BU-3862T:n inhibitiovaikutukset makromolekyyli-(DNA-, RNA- ja proteiini-) synteesiin määritettiin B16-FlO-melanoomasoluviljelmässä. B16-F10-soluja (105 so-lua/ml) inkuboitiin BU-3862T:n kanssa 37°C:ssa 3,5 tunnin 5 ajan (DNA-synteesin kyseessä ollen) tai 4 tunnin ajan (RNA- tai proteiinisynteesin kyseessä ollen). Viljelmä-seokseen lisättiin isotooppileimattua prekursoria, 3H-tymidiiniä, 1 4C-uridiinia tai 3H-leusiinia, ja inkuboitiin edelleen 30 minuutin (DNA-synteesi) tai 60 minuutin (RNA-10 tai proteiinisynteesi) ajan. Solut pestiin jäähdytetyllä 5-%:isella trikloorietikkahappoliuoksella, minkä jälkeen kasvainsolujen happoon ei-liukenevaan osuuteen sitoutunut radioaktiivisuus määritettiin nestetuikelaskijalla. Kuten ilmenee taulukosta 5, BU-3862T inhiboi sekä DNA- että pro-15 teiinisynteesiä rinnasteisella tavalla, ja IC50-arvona teho oli yli 100-kertainen verrattuna RNA-synteesille saatuun.

BU-3862T:n sekä sen diasetyyli- ja dihydrojohdannaisten in vivo -kasvainvastaiset aktiivisuudet määritet-20 tiin kasvaimia potevissa BDFX- tai CDF1-hiirissä. Urospuolisiin BDFj-hiiriin istutettiin vatsaontelonsisäisesti 0,5 ml 10-%:ista tummaa melanooma-B16-’puuroa', ja naaraspuolisiin -hiiriin istutettiin niinikään vatsaontelon sisäisesti 0,4 ml laimennettua vatsaontelonestettä, joka 25 sisälsi 105 imukudosliitteinen-leukemia-L1210-solua tai 106 imusoluleukemia-P388-solua. Tutkittavat yhdisteet annettiin hiirille vatsaontelonsisäisesti noudattaen jotain neljästä eri annosteluaikataulusta: kerran päivässä päivinä 1, 2 ja 3 (QD x 3), päivinä 1, 4 ja 7 (Q3D x 3), päivi-30 nä 1, 5 ja 9 (Q4D x 3) ja päivinä 1-9 (QD x 9). Kuten esitetty taulukossa 6 BU-3862T osoitti erinomaista terapeuttista tehoa B16-melanoomaa vastaan. Q4D x 3 -annosteluoh-jelmaa noudattaen annettuna BU-3862T:n teho (pienin tehokas annos) oli sama kuin mitomysiini-C:n. Tämä yhdiste 35 osoitti suurempaa kasvainvastaista aktiivisuutta sekä laa- 90991 15 jempaa terapeuttista skaalaa käytettäessä jaksottaista annosteluaikataulua (Q4D x 3) kuin käytettäessä jatkuvaa annosteluaikataulua (QD x 9), jolloin mainittu todettiin T/C-arvon ja vastaavasti kemoterapeuttisen indeksin (op-5 timiannos/pienin tehokas annos). Sekä diasetyyli- että dihydrojohdannaiset osoittivat niinikään merkittävää B16-melanoomavastaista aktiivisuutta Q4D x 3 -annosteluaikataulua käytettäessä, mutta ne olivat noin 10 kertaa vähemmän aktiivisia kuin isäntäyhdiste, kun vertailuperusteena 10 oli pienin tehokas annos taulukossa 7 esitetyn mukaisesti. Toisaalta BU-3862T:n leukemiavastaiset aktiivisuusarvot olivat verraten alhaiset. Tällä yhdisteellä saatiin kohtalainen kasvainvastainen aktiivisuus L1210-leukemiaa vastaan maksimi-T/C-arvon ollessa 145 %, ja se ei tutkittuina 15 annoksina osoittanut merkitsevää elinkaaren pitenemistä P388-leukemiaa potevissa hiirissä (taulukot 8 ja 9).

Taulukko 4. In vitro -svtotoksisuus hiiri- ia ihmis-kasvainsoluia vastaan 20 _IC50 _Qjg/ml)_

Yhdiste B16-F10 P388 L1210 HCT-116 Moser BU-3862T 0,0017 0,031 0,01 0,0097 0,016

Diasetyyli- 25 BU-3862T 0,0030 ei m.* ei m. 0,017 0,044

Dihydro- BU-3862T 0,0032 ei m. ei m. 0,013 0,038 30 Tetrahydro- BU-3862T 0,53 ei m. ei m. >1,0 >1,0

Mitomysiini-C 0,50 ei m. ei m. 0,80 1,2 35 * ei m. * ei määritetty 16

Taulukko 5. Makromolekvvlisvnteesin inhibitio B16-melanoo-masoluissa _IC50 (Mq/.ml)_

Yhdiste DNA RNA Proteiini 5 BU-3862T 0,10 11 0,060

Mitomysiini-C 1,6 11 60

Taulukko 6. BU-3862T:n kasvainvastainen aktiivisuus Bl6-melanoomasoluia vastaan fi.p.) 10 Annos Käsittely- MST11 T/C Paino-

Tutkittu aikataulu muutos (g) yhdiste (ma/ka/p.) (i.p.) fpäivät (%) päivänä 5 BU-3862T 8,0 Q4DX3 20,0 16712 -2,3 4.0 " 19,0 15812 -1,3 15 2,0 " 18,0 15012 -0,5 1.0 " 17,0 14212 +0,3 0,5 " 15,5 12912 +0.5 0,25 " 14,0 117 +0.5

Mitomysiini 2,0 Q4Dx3 29,0 24212 +0,3

-C

20 1.0 " 18,5 15412 +0,5 0,5 " 15,0 12512 +0,5 0,25 " 13,0 108 +0,3

Kantaja - Q4Dx3 12,0 - +1,1 25 BU-3862T 2,0 QDx9 toks. toks.

1.0 " 14,0 97 -3,3 0,5 " 20,0 13312 -2,3 0,25 " 20,0 13312 +0,3 0,13 " 18,5 123 +0,8 30 0,63 " 18,0 113 +1,3

Kantaja - QDx9 15,0 - +1,3 li 1 keskimääräinen eloonjääntiaika *2 merkitsevä kasvainvastainen vaikutus (T/C > 125%) 35 90991 17

Taulukko 7. Diasetvvli- ia dihydro-BU-3862T:n kasvainvas-tainen aktiivisuus B16-melanoomasoluia vastaan (i.p.l Tutkittu Annos Käsittely- MST*1 T/C Paino- 5 aikataulu muutos (g) yhdiste (mo/ka/o.) (i.p.) (päivä) (%) päivänä 5

Diasetyyli- BU-3862T 8,0 Q4Dx3 24,0 141*2 -2,0 4.0 " 23,0 135*2 +0,5 10 2,0 " 20,5 121 +1,0 1.0 " 20,0 118 +0,3 0,5 " 19,0 112 +1,3

Dihydro- BU-3862T 8,0 Q4Dx3 22,5 132*2 -1,0 15 4,0 " 20,0 118 -0,5 2.0 " 21,0 124 +0,5 1.0 " 19,5 115 +0,5 0,5 " 19,0 112 +0,5

Mitomysiini 2,0 Q4Dx3 >/=33,0 >/=194*2 0,0

20 “C

1.0 " 23,0 135*2 +1,0 0,5 " 22,0 129*2 +0,3 0,25 " 20,0 118 +0,3

Kantaja - Q4Dx3 17,0 - +0,8 25 _ *1 keskimääräinen eloonjääntiaika *2 merkitsevä kasvainvastainen vaikutus (T/C > 125%) 18

Taulukko 8. BU-3862T:n kasvainvastainen vaikutus L1210-leukemiaa vastaan (i.O.)

Tutkittu Annos*1 MST*2 T/C Paino- 5 muutos yhdiste (ma/ka/p.) (päivä) (%) päivänä 5 BU-3862T 4,0 toks. toks.

2.0 11,5 144*3 -3,5 1.0 10,5 125*3 -2,8 10 0,5 9,5 119 -0,8 0,25 9,5 119 0,0

Mitomysiini-c 2,0 13,0 163*3 -0,5 1.0 11,0 138*3 -0,3 0,5 10,5 13l*3 0,0 15 0,25 10,0 125*3 +0,8

Kantaja - 8,0 - +1,1 *1 Q3DX3, i.p. BU-3862T:lie ja QDx3, i.p. mitomysiini-C:lie 20 *2 keskimääräinen eloonjääntiaika *3 merkitsevä kasvainvastainen vaikutus (T/C > 125%) 90991 19

Taulukko 9. BU-3862T:n kasvainvastainen vaikutus P388-leukemiaa vastaan fi.p.)

Tutkittu Annos*1 MST*2 T/C Paino- 5 muutos (g) yhdiste (ma/kq/p.) (päivä) (%) päivänä 5 BU-3862T 4,0 11,0 105 -2,3 2.0 11,0 105 -2,8 1.0 11,5 110 -0,8 10 0,5 13,5 124 -0,3 0,25 12,5 119 +0,8

Mitomysiini-C 2,0 17,0 162*3 +1,5 1.0 11,0 143*3 +1,8 0,5 13,0 124 +1,8 15 0,25 13,0 124 +2,3

Kantaja - 10,5 - +2,4 *1 Q4DX3, i.p.

*2 keskimääräinen eloonjääntiaika 20 *3 merkitsevä kasvainvastainen vaikutus (T/C > 125%)

Kuten esitetyistä tuloksista ilmenee, BU-3862T sekä sen dihydro- ja diasetyylijohdannaiset ovat hyödyllisiä kasvainten vastaisia aineita syöpäkasvaimien kuten B16-25 melanooman inhiboimiseksi nisäkkäissä.

Voidaan valmistaa farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät tehokkaan kasvaimia estävän määrän BU-3862T:tä, dihydro-BU-3862T:tä tai diasetyyli-BU-3862T:tä yhdistettynä inerttiin farmaseuttisesti hyväksyttävään 30 kantajaan tai laimentimeen. Tällaiset koostumukset voivat sisältää myös muita aktiivisia kasvainten vastaisia aineita, ja ne on voitu koostaa mihin tahansa suunnitellun an-totien kannalta soveliaaseen farmaseuttiseen muotoon. Esimerkkejä tällaisista koostumuksista ovat suun kautta an-35 nettavat kiinteät koostumukset kuten tabletit, kapselit, 20 pillerit, jauheet ja rakeet, suun kautta annettavat nestemäiset koostumukset kuten liuokset, suspensiot, siirapit tai eliksiirit sekä ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta annettavat formulaatiot kuten steriilit liuokset, suspen-5 siot tai emulsiot. Ne voidaan valmistaa niinikään steriileiksi kiinteiksi koostumuksiksi, jotka liuotetaan välittömästi ennen käyttöä steriiliin veteen, fysiologiseen suolaliuokseen tai muuhun sopivaan steriiliin injisointi-kelpoiseen väliaineeseen.

10 Alan ammattilaiset kykenevät vaikeuksitta päättä mään BU-3862T:n tai sen dihydro- tai diasetyylijohdannaisen optimiannostuksen ja -ohjelman, joka soveltuu mainittujen käyttöön kasvainten vastaisena aineena tietylle ni-säkäsisännälle. Luonnollisesti tulee pitää mielessä, että 15 käytettävän yhdisteen tosiasiallinen annos vaihtelee riippuen formuloidusta nimenomaisesta koostumuksesta, antotavasta sekä hoidettavasta nimenomaisesta kohdasta elimistössä, hoidettavasta isännästä sekä sairaudesta. Useita lääkkeen vaikutusta modifioivia tekijöitä joudutaan otta-20 maan huomioon mukaanlukien kohteen ikä, paino, sukupuoli, ravintotottumukset, lääkkeenannon ajankohta, antotie, u-lostus- ym. eritystiheys, potilaan tila, mahdolliset lääkeyhdistelmät, yliherkkyysreaktiot sekä taudin vakavuus-aste.

25 Seuraavat esimerkit valaisevat keksintöä.

Esimerkki 1 BU-3862T;n fermentointi

Hyvin kasvaneesta Streptomyces hvaroscopicus -kanta n:o P247-7l:n vinopinnasta siirrostettiin soluja vegeta-30 tiivisolukasvulaustaan, joka koostui 3 %:sta soijajauhoa (Nikko Seiyu), 0,5 %:sta Pharmamedia-valmistetta (Traders, USA), 3 %:sta glukoosia, 0,1 %:sta hiivauutetta (Oriental) ja 0,3 %:sta kalsiumkarbonaattia ja jonka pH säädettiin ennen sterilointia 7,0:aan. Tätä vegetatiivisolukasvualus-35 taa inkuboitiin 28°c:ssa 4 päivän ajan kiertoravistelijas- 90991 21 sa (200 kier./min), minkä jälkeen 5 ml solukasvusta siirrettiin 500 ml:n erlenmeyerpulloon, joka sisälsi 100 ml saman koostumuksen kuin vegetatiivisolukasvualusta omaavaa viljelyväliainetta. Tämän jälkeen fermentoitiin 28°C:ssa 5 4-5 päivää kiertoravistelijassa ravistaen.

Kasvainten vastaisen antibiootin tuotanto fermen-taatiolietteessä todettiin määrittämällä in vitro -syto-toksinen aktiivisuus B16-melanoomasoluja vastaan.

Fermentointi suoritettiin myös tankki f ermentorissa.

10 Pullofermentoinnista saadusta vegetatiivisoluviljelmästä erotettiin 2 litran erä, joka siirrettiin 200 litran 120 litraa viljelyväliainetta sisältävään tankkifermentoriin. Tämän jälkeen fermentoitiin 28°C:ssa sekoitusnopeuden ollessa 250 kier./min ja ilmastusnopeuden 120 1/min. Kasva-15 inten vastaisen antibiootin pitoisuustaso saavutti maksi miarvon 50 Aig/ml noin 90 tunnin fermentoinnin jälkeen.

Esimerkki 2 BU-3862T;n eristys ia puhdistus

Esimerkin 1 yleismenettelyn mukaan saatu fermentaa-20 tioliete (23 litraa, pH 7,4) erotettiin myseelikakuksi ja supernatantiksi käyttämällä Sharpless-tyyppistä sentrifu-gia (Kokusan n:o 4A). Myseelikakkua uutettiin metanolilla (6 litraa). Liukenematon aines poistettiin suodattamalla, minkä jälkeen metanolipitoisesta uutteesta poistettiin 25 metanoli tyhjössä haihduttamalla. Nestemäinen haihdutus- jäännös ja fermentoinnista saatu supernatantti yhdistettiin ja seosta uutettiin etyyliasetaatilla (20 litraa). Uute haihdutettiin tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin 21,1 g epäpuhdasta antibioottikompleksia. Tämä raaka tuote pa-30 nostettiin silikageelikolonniin (halkaisija 4,0 x 75 cm), jota oli edeltäkäsin pesty metyleenikloridilla, minkä jälkeen uutettiin metyleenikloridi/metanoli-seoksella nostaen asteittain metanolipitoisuutta seoksessa (2-10 % v/v) .

Eluaatin B16-melanoomavastaista sytotoksisuutta tarkkail-35 tiin jodivärireaktion TLC-levyn avulla. Ensimmäiset posi- 22 tiivisen jodireaktion antavat fraktiot eluoituivat meta-nolipitoisuudessa 2 %; ne otettiin talteen ja niitä puhdistettiin edelleen kromatografisesti Sephadex LH-20:lla. Puhdistettu ainesosa tunnistettiin 9-metyylistreptimido-5 niksi sen spektritulostietojen nojalla (ks. Saito, N; F. Kitame, M. Kikuchi ja N. Ishida: "Studies on a New Antiviral Antibiotic, 9-methylstreptimidone. 1. Physicochemical and Biological Properties", J.Antibiotics 27 (1974) 206-214). Seuraavat positiivisen jodireaktion antavat 10 fraktiot eluoituivat pitoisuudessa 5 % metanolia; ne otettiin talteen ja haihdutettiin tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin verraten puhdasta kiinteää BU-3862T:tä. Tuote puhdistettiin edelleen kromatografisesti silikageelillä etyy-liasetaatti/metanoli-seoksella eluoiden. Seossuhteen ol-15 lessa 50:1 (v/v) eluoitui aktiivisia fraktioita, jotka osoittautuivat erittäin sytotoksisiksi B16-melanoomaso-luille. Fraktiot haihdutettiin tyhjössä kuiviin, minkä jälkeen saatua jäännöstä puhdistettiin edelleen kromatograf isesti Sephadex LH-20:llä metanolilla eluoiden, ja 20 saatiin tasa-aineista, kiinteää BU-3862T:tä (341 mg).

Esimerkki 3

Diasetvvli-BU-3862T:n valmistus

Seosta, jossa oli BU-3862T:tä (10 mg) ja asetanhyd-ridiä (0,1 ml) kuivassa pyridiinissä (0,5 ml), sekoitet-25 tiin 18 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Reaktioseosta laimennettiin etyyliasetaatilla (10 ml) , minkä jälkeen liuos pestiin laimealla kloorivetyhapolla (10 ml) ja sitten vedellä (10 ml) . Muodostuneet faasit erotettiin, orgaaninen faasi kuivattiin natriumsulfaatilla ja haihdutet-30 tiin tyhjössä kuiviin, jolloin saatiin öljymäistä diase-tyyli-BU-3862T:tä (13 mg) . Sen fysikokemialliset ominaisuudet on esitetty alla taulukoissa 10 ja 11.

li 90991 23

Taulukko 10. BU-3862T:n diasetvvli-. dihvdro- ia tetrahvdroiohdannaisen fvsikokemialliset ominaisuudet

Diasetvvliiohd. Dihvdroiohd. Tetrahvdroi ohd.

Ulkonäkö Väritön,tahmea Väritön,tahmea Väritön,tahmea 5 kiinteä aine kiinteä aine kiinteä aine SIMS rn/z 483 (M+H)+ 401 (M+H)+ 403 (M+H)* EIMS m/z 423 370 372 (M-COOCH3)+ (M+H-CH2OH)+ (M+H-CH20H)+ 430 299 299 10 256 214 214 127 127 127 IR KBr 3300 3300 3300 (max, cm'1) 3070 3070 3070 15 2950 2950 2950 1750 1720 1710 1650 1640 1640 1550 1530 1530 1240 1050 1050 20 1040 TLC, Rf x) 0,78 0,37 0,21 x) piihapolla, eluointi metyleenikloridi/metanoliseoksella 25 (9:1).

24

Taulukko 11. Ή-nmr-spektritietoia BU-3862T;lie ia sen johdannaisille (400 MHz. CPC13) 1* ch3 0 \ “ 0 5 I H i» V/ h 3criN>1

KJ“ H J tH

Asema BU-3862T Diasetvlii. Dihvdroj. Tetrahvdroi.

1 3,75 (d) 4,01 (d) 3,73 (d) 3,74 (dd)a 10 4,21 (d) 4,87 (d) 4,21 (d) 3,90 (m) 2 - 3,15 (m) 4 4,61 (ddd) 4,61 (ddd) 4,51 (m) 4,58 (m)b 5 7,03 (d) 6,53 (d) 7,10 (d) 7,31 (d) 7 4,48 (ddd) 4,70 (ddd) 4,49 (ddd) 4,54 (m)b 15 8 6,48 (d) 6,22 (d) 6,51 (d) 6,52 (d) 10 2,21 (t) 2,21 (t) 2,22 (t) 2,24 (t) 11 1,60 (m) 1,59 (m) 1,60 (m) 1,61 (m) 12 1,28 (m) 1,28 (m) 1,28 (m) 1,29 (m) 13 1,16 (m) 1,18 (m) 1,16 (m) 1,19 (m) 20 14 1,52 (m) 1,52 (m) 1,52 (m) 1,52 (m) 15 0,86 (d) 0,86 (d) 0,85 (d) 0,86 (d) 16 3,12 (d) 3,09 (d) 3,20 (d) 3,81 (dd)a 3,35 (d) 3,38 (d) 3,31 (d) 3,90 (m) 17 2,08 (dd) 2,07 (dd) 25 2,59 (dd) 2,60 (dd) 1,28 (m) ^ 1,29 (m) 18 - 1,66 (m) 1,70 (m) 19 1,75 (s) 1,76 (s) 0,94 (d)c 0,96 (d)d 20 4,79 (lev.s) 4,80 (lev.s) 0,95 (d)c 0,97 (d)d 4,83 (lev.s) 4,88 (lev.s) 30 21 3,58 (dd) 4,18 (dd) 3,58 (dd) 3,59 (dd) 4,02 (dd) 4,37 (dd) 4,03 (dd) 4,06 (dd) 22 0,86 (d) 0,86 (d) 0,85 (d) 0,86 (d) OCOCHj 2,05; 2,09

Yläviitteet a, b, c ja d merkitsevät asemapareja, jotka 35 voivat vaihtaa paikkaa.

1: 90991 25

Esimerkki 4. Dihvdro- ia tetrahvdro-BU-3862T:n valmistus .

BU-3862T:tä (30 mg) liuotettiin metanoliin (10 ml), ja hydrattiin ilmakehän paineessa katalysaattorin (20 % 5 palladiumia hiilellä; 15 mg) läsnäollessa 20 tunnin ajan. Reaktioseos suodatettiin ja suodos haihdutettiin alipaineessa kuiviin, jolloin saatiin otsikossa mainittujen yhdisteiden seos (27 mg) . Yhdisteet erotettiin preparatiivi-sen TLC:n avulla (Si02, CH2Cl2-MeOH 9:1, v/v) avulla, minkä 10 jälkeen ne puhdistettiin kromatografisesti Sephadex LH-20:n avulla. Saatiin 13,4 mg BU-3862T:n dihydrojohdannaista sekä 4,7 mg tetrahydrojohdannaista. Näiden yhdisteiden fysikokemialliset ominaisuudet on esitetty edellä taulukoissa 10 ja 11.

Claims (3)

26

1. Menetelmä yhdisteen BU-3862-T valmistamiseksi, jonka kaava on sekä tämän yhdisteen diasetyyli- ja dihydrojohdannaisten valmistamiseksi, joiden kaava on ‘ 20 jossa Ac on CH3C0-, ja vastaavasti H3C /CHa CH3 o'VS\

0 Htr ‘o bH tunnettu siitä, että BU-3862T:tä tuottavaa Streo-30 tomvces hvoroscopicus -kantaa viljellään vesipitoisessa ravintokasvualustassa, joka sisältää assimiloituvan hiili-ja typpilähteen, aerobisissa submerssiölosuhteissa, kunnes mainittu organismi on tuottanut huomattavan määrän BU-3862T:tä kasvualustaan, minkä jälkeen muodostunut BU-3862T 35 otetaan kasvualustasta talteen, ja haluttaessa valmistaa ti 90991 27 diasetyylijohdannaista BU-3862T saatetaan reagoimaan ase-tyloivan aineen kanssa inertissä orgaanisessa liuottimes-sa, tai vastaavasti dihydrojohdannaisen valmistamiseksi, BU-3862T hydrataan katalyyttisesti.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että BU-3862T:tä tuottava kanta on Streptomvces hvaroscopicus ATCC 53709.

3. Mikro-organismin Streptomvces hvaroscopicus ATCC 53709 biologinen puhdasviljelmä, tunnettu siitä, 10 että se kykenee tuottamaan BU-3862T:tä talteenottokelpoi-sen määrän viljeltäessä sitä vesipitoisessa ravintokasvu-alustassa, joka sisältää assimiloituvan hiili- ja typpi-lähteen. 28