KR960016206B1 - Bu-3862t 항종양 항생제 - Google Patents

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Abstract

내용없음

Description

BU-3862T 항종양 항생제
제1도는 BU-3862T의 적외선흡수 스펙트럼(KBr)을 도시한 도면.
제2도는 CDCl3속의 BU-3862T의 양성자 자기공명 스펙트럼(400MHz)을 도시한 도면.
제3도는 CDCl3속의 BU-3862T의13C NMR 스펙트럼(100MHz)을 도시한 도면.
본 발명은 신규의 항종양 항생제와 그 제조 및 회수방법에 관한 것이다.
본 발명은 다음 구조식(Ⅰ)을 갖고 BU-3862T로 표시되는 신규의 발효제품을 제공한다.
Figure kpo00001
또한, 본 발명은 다음 구조식(Ⅱ,Ⅲ)을 가진 BU-3862T의 디아세테이트(Ⅱ) 및 디히드로(Ⅲ) 유도체를 제공한다.
Figure kpo00002
본 발명자들은 본 발명의 화합물의 구조와 관련되는 어떠한 항종양 항생제도 알지 못한다.
본 발명은 다음 구조식(Ⅰ)을 가지고 BU-3862T로 표시되는 신규의 항종양 항생제 및 그 제조, 분리 및 정제 방법에 관한 것이다.
Figure kpo00003
본 발명의 항생제는 스트렙토마이세스 하이그로스코피우스(Streptomyces hygroscopius)인 BU-3862T 제조균주(Streptomyces hygroscopicus 균주 P247-71 ATCC 53709가 바람직함) 또는 그 돌연변이체 또는 변종을 수중호기조건하의 액체 영양배지속에서 상당한 양의 BU-3862T가 상기 배양배지속에서 상기 미생물에 의하여 생산될 때까지 발효시켜서 그리고 임의적으로 그 배지로부터 BU-3862T를 회수하여 얻어진다.
또한, 본 발명은 다음 일반식(Ⅱ)를 가진 BU-3862T의 디아세틸 유도체 및 BU-3862T의 촉매 수소화반응에 의해서 제조되는, 다음 구조식(Ⅲ)의 BU-3862T의 디히드로 유도체를 제공한다.
Figure kpo00004
상기 일반식(Ⅱ)에서 Ac는 BU-3862T의 아세틸화 반응에 의하여 생산된 CH3CO-이다.
BU-3862T 및 그 디아세틸, 디히드로 유도체들은 실험 동물의 종양계, 즉 쥐의 B16 흑색종에 대한 억제활성을 나타낸다.
본 발명의 BU-3862T 항생제는 Streptomyces hygroscopicus인 BU-3862T-제조균주의 발효에 의하여 제조된다.
균주 P247-71이라 표시되는 바람직한 BU-3862T-제조균주가 필리핀 민다나오섬의 Davao에 있는 Apo산에 자생하는 타마린드의 뿌리 근처에서 수집한 흙의 시료로부터 분리되었다. 이와 같은 균주의 생물학적 순배양체가 매릴랜드주 톡빌시 소재 The American Type Culture Collection(ATCC)에 기탁되어 미생물의 영구 기탁번호 ATCC 제53709호를 부여받았다.
균주 P247-71에 수행된 분류학적 연구 결과는 그 균주가 Streptomyces 속에 속하고 Streptomyces hygroscopicus 종에 속한다는 것을 나타내고 있다. 균주 P247-71은 다음의 특성을 가지고 있다.
[형태]
기저 및 공중균사체 둘다 형성된다.
그들은 길고, 많은 가지를 가지고 있으며 짧은 필라멘트로 분절되지 않는다. 분절포자의 사슬들이 기균사(aerial hyphae)상에 형성된다. 포자 사슬 및 포자 형태는 다음과 같다:1) 회전수 2-8을 가진 나선형 포자 사슬, 2) 단축적으로 가지를 가진 포자체, 3) 난형 또는 통형 포자(0.5-0.7×0.1-1.2μm), 및 4) 주름지거나 매끈한 포자 장식, 포자낭, 운동성 포자 및 균핵은 관찰되지 않는다.
[배양적 및 생리학적 특성]
균주 P247-71은 대부분의 기술적인(descriptive) 배지속에서 양호하게 성장한다. 흡습성 흑색 반점을 가진 회색의 공중 균사체(aerial mycelium)가 ISP 제6호 배지를 제외한 ISP 한천배지상에서 관찰된다. 백색 내지 연한 황색을 띤 회색의 공중균사체가 짜펙(Czapek)의 당-질산염 한천배지에서 형성된다. 기저균사체(substrate mycelium)는 무색 또는 황갈색 내지 회황색을 나타낸다. 멜라닌 및 다른 분산 안료가 생산되지 않는다. 대부분의 당은 성장용으로 사용된다. 배양 및 생리학적 특성을 표 1 및 2에서 각각 나타낸다.
균주 P247-71의 형태학적, 배양 및 생리학적 특성은 그 균주가 Streptomyces 속에 속한다는 것을 나타낸다. Pridham 및 Tresner(Genus Streptomyces Waksman 및 Henrici, 1943, P. 748-829.)에 의하면, 균주의 주요 특성은 다음과 같다:
1) 회색의 공중균사체, 2) 나선형 포자사슬, 3) 멜라닌의 결핍, 및 4) 매끈한 포자벽 장식.(참고문헌, Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, R.E.Buchanann 및 N.E. Gibbons, 8th ed. 1974. The williams & Wilkins Co., Baltimore.)
포자분열된 공중균사체의 흡습성 변화는 균주의 분명한 특성이다. 균주 P247-71의 주요특성 및 표 1 및 2에 나타난 성질은 그것을 Streptomyces hygroscopicus에 위치시킨다.
본 발명은 상기 서술된 특히 바람직한 균주 P247-71의 용도 및 상기 서술에 완전히 일치하는 미생물에 국한되지 않는다. 특히 본 발명은 X-선 방사, 자외선 방사, 니트로겐머스타드처리, 파지에노출 및 그 유사한 것과 같은 통상의 수단들에 의하여 생산될 수 있는, BU-3862T를 생산하는 상기 미생물의 다른 변종 또는 돌연변이체를 포함한다.
[표 1. 균주 P247-71의 배양 특성]
Figure kpo00005
28℃에서 3주간 배양후 관찰
색상 및 괄호숫자는 ISCC-NBS 명칭을 따름
[표 2. 균주 P247-71의 생리학적 특성]
Figure kpo00006
기초배지:Pridham-Gottlieb 배지(=ISP No. 9 배지).
BU-3862T의 제조
BU-3862T는 액체 영양배지속에서 수중 호기조건하에서 Streptomyces hygroscopicus인 BU-3862T 제조 균주(Streptomyces hygroscopicus 균주 P247-71(ATCC 53709)의 특성을 가진 균주가 바람직함) 또는 그 변종 또는 돌연변이체를 배양시켜 생산될 수 있다. 미생물은 탄소동화원, 예를들어 글리세롤, D-리보스, L-람노스, D-글루코스, D-프락토스, 수크로스, 락토스, 멜라바이오스, D-만니톨 또는 가용성 전분을 함유한 영양배지속에서 성장된다. 또한 영양배지는 어분, 펩톤, 콩가루, 땅콩가루, 면실분 또는 옥수수 침지액과 같은 질소원소 동화원을 함유한다. 또한 영양 무기염을 이와 같은 배지속에 섞을 수 있다. 이와 같은 염류는 나트륨, 칼륨, 암모니아, 칼슘, 인산염, 황산염, 염소, 브롬, 질산염, 탄산염 또는 그 유사한 이온들을 제공할 수 있는 어떠한 통상의 염을 포함한다.
BU-3862T의 제조는 미생물의 만족스런 성장을 촉진하는 어떠한 온도, (예 20℃-39℃)에서 효과를 발생할 수 있으며 약 28℃의 온도에서 수행시키는 것이 편리하다.
발효공정은 플라스크속에서 또는 실험실 규모나 산업적 규모의 발효기속에서 수행될 수 있다. 탱크 발효가 사용될때, 사면배양 또는 토양배양 또는 도결진공건조시킨 배양체를 포함하는 배양배지를 영양배지에 소량 접종시킴으로써 영양성 접종재료를 생산하는 것이 바람직하다. 이와 같은 방법으로 활성 접종재료를 얻은 후에, BU-3862T의 대량 생산을 위하여 발효탱크 배지에 무균적으로 접종한다. 영양성 접종재료가 생산된 배지는 제조 미생물의 양호한 성장이 이루어지는 한 탱크속에 사용된 것과 동일하거나 다를 수 있다.
일반적으로, BU-3862T의 최적 생산은 약 4일의 기간 동안 배양 후 성취된다.
BU-3862T는 배양배지로부터 회수되어 통상의 용매 추출 및 크로마토그래피 방법에 의하여 실질적으로 순수한 형태로 분리될 수 있다. 다음 실시예 2는 바람직한 분리 및 정제 방법을 나타내고 있다.
BU-3862T의 디아세테이트 유도체(Ⅱ)는 BU-3862T를 불활성 유기용매속에서 초산무수물과 같은 종래의 아세틸화제와 반응시켜 제조될 수 있다. 전형적인 방법을 아래 실시예 3에서 기술한다. BU-3862T의 디히드로 유도체(Ⅲ)는 실시예 4에서 처럼 BU-3862T의 촉매 수소화 반응에 의하여 제조된다.
BU-3862T는 무색 점액질 고체상으로 얻어졌다. 그것은 디메틸술폭사이드, 디메틸포름아미드, 메탄올, 에탄올, 초산에틸 및 클로로포름에서 가용성이지만 물, 벤젠 및 다른 유기 용매속에서 실질적으로 불용성이다.
BU-3862T는 요오드, 몰리브덴산 암모늄-황산(AMS) 및 Rydone-Smith 시약에 양성반응을 나타낸 반면, 닌히드린, 안트론, 염화제2철 시험에서는 음성이었다. BU-3862T의 물리, 화학적 특성을 표 3에 요약한다. 이 화합물은 특정의 UV 흡수를 보여주지 않았다. BU-3862T의 IR,1H-NMR 및13CNMR 스펙트럼을 제1도, 제2도 및 제3도에 각각 도시한다.
[표 3. BU-3862T의 물리-화학적 특성]
Figure kpo00007
BU-3862T의 구조연구
BU-3862T는 항생제에 대한 펩티드구조를 제시하는 IR 스펙트럼의 3300(수산기), 1720(카르보닐), 1650 및 1530cm-1(아미드)에서 강한 흡수를 나타낸다.13C-NMR 스펙트럼은 두개의 C-CH3, 하나의 =C-CH3, 여덟게의 -CH2, 세개의 -CH, 하나의 >C<, 하나의 >C=CH2및 세개의 C=O 탄소 원자들로 인지된 20개의 탄소 원자를 알려주었다. BU-3862T의 분자구조식은 미량분석 매스 스펙트럼 데이타(M+H)+:m/z 399) 및13C-NMR 스펙트럼 분석을 기초로 하여 C20H34N2O6으로 정해졌다. 34개의 양성자가1H-NMR 스펙트럼에서 관찰되었다. 두개의 -NM-CO기에 지정된 두 이중첩 양성자(δ 7.03 및 6.48ppm, CDCl3속에서)는 중수의 첨가에 의하여 점차 사라졌다. 넓은 두 단일 양성자(δ 4.83 및 4.79) 및 AB형 이중첩 양성자(δ 3.35 및 3.12, J=5.0Hz)는 엑소메틸렌(-(CH3)C=CH2) 및 에폭시드(
Figure kpo00008
) 양성자에 각각 할당되었다. 이와 같은 양성자의 연접성은 다음에 제시된 부분구조를 유도하는1H-1H COSY 시험에 의하여 결정되었다. 부분구조의 더 구체적인 연접성은13C-1H COSY 및13C-1H 긴 범위 COSY 시험에 의하여 확정되었다. 그들이 다음에 제시된 것처럼 분석되었고 따라서 BU-3862T의 전체구조가 결정되었다. 이와 같은 구조에 대한 보다 나은 증거는 매스스펙트럼 및 분해시험에 의하여 제공되었다. EI-MS 스펙트럼은 m/z 127(이소-옥타노일), 214(이소-옥타노일-세틸) 및 325(이소-옥타노일-세틸-4,5-디데히드로로이실)에서 그 구조를 지지하는 많은 단편 이온을 나타내었다. 산가수분해에 의하여, BU-3862T는 아미노산 및 지방산을 산출하였다. 분리된 아미노산은 HPLC에 의하여 L-세린으로 인지되었고 지방산은 이소-옥탄산의 메틸에스테르로써 가스크로마토그래피에 의하여 인지되었다. BU-3862T을 피리딘 속에서 무수초산으로 처리함으로써 디아세테이트 유도체를 얻었다. 팔라듐/탄소상에서 수소화될때, BU-3862T는 그 스펙트럼 데이타에 기초하여 그 구조가 결정되는 두개의 환원제품인, 디히드로-BU-3862T 및 테트라히드로-BU-3862T를 산출하였다. 디아세테이트 및 디히드로화합물은 생물학적 활성도를 보유하였지만 테트라히드로유도체는 그 활성도가 없었다.
BU-3862T는 1,2-에폭시-2-히드록시메틸-4(N-이소옥탄일-L-세릴아미노(-6-메틸-헵타-6-엔-3-온으로 명명될 수 있으며 에폭시드 및 엑소메틸렌기를 포함하는 독특한 펩티드이다.
BU-3862T의 부분구조
Figure kpo00009
Figure kpo00010
Figure kpo00011
BU-3862T의 생물학적 활성도
BU-3862T 및 디아세틸-, 디히드로- 및 테트라히드로- BU-3862T를 여러 쥐 및 사람의 종양세포주에 대한 시험관내 세포독성에 대하여 및/또는 쥐에서의 생체내 항종양 활성에 대하여 시험하였다. 미토마이신 C를 시험관 및 생체 시험 모두에서 기준화합물로 사용하였다. BU16-F10(쥐흑색종), P388(쥐백혈병), L1210(쥐백혈병) 및 모저(Moser)(사람의 결장 직장암) 세포들을 소태아혈청(FCS, 10%) 및 카나마이신(60mcg/ℓ)로 보충된 강화된 Eagle 최소 필수 배지(MEM)에서 대수기(logarithmic phase)까지 성장시키고, HCT-116(사람의 결장암) 세포는 FCS(10%), 페니실린(100μ/ml) 및 스트렙토마이신(100mcg/ml)으로 보충된 Maccoy의 5A 배지속에서 성장시키고, 회수하여 각각의 농도를 1.5×105, 1.2×104, 1.2×104, 2.5×105및 3.0×105세포/ml로 하여 시험물질들과 함께 96- 또는 24-웰(well) 조직 배양 플레이트의 웰로 이식시켰다. 그들을 5% CO2및 95% 공기인 습윤한 분위기 속에서 72시간 동안 37℃도 항온 유지시켰다. B16-F10, 모저 및 HCT-116 세포들에 대한 세포독성 활성도는 생육 가능한 세포들을 0.006% 뉴트랄레드(neutral red) 용액으로써 착색시킨 후 540nm에서 비색정략적으로 측정되었다. 한편, P388 및 L1210 세포들에 대한 세포독성 활성도는 생육가능 세포수를 계산하여 측정되었다. 표 4에 그 결과를 요약하였다. 미토마이신 C와 비교하여, BU-3862T는 쥐 및 사람 세포 둘다에 대하여 더욱 강력한 세포독성을 나타내었다. 그 유효성은 IC50수치에 있어서 미토마이신 C의 유효성보다 약 50-120배 정도 컸다. 또한, 디아세틸 및 디히드로 유도체는 BU-3862T의 약 1/2 정도로, 쥐 및 사람 세포 둘다에 대하여 대등하게 강력한 세포독성포텐셜을 나타내었다. 한편, 테트라히드로 유도체는 상기 화합물보다 상당히 덜 활성적이었다.
고분자(DNA, RNA 및 단백질) 합성에 대한 BU-3862T의 억제효과는 배양된 B16-F10 흑색종 세포속에서 측정되었다. B16-F10 세포(105세포/ml)를 BU-3862T와 함께 37℃에서 3.5시간(DNA 합성에 대하여) 또는 4시간(RNA 및 단백질 합성에 대하여) 동안 항온 유지시켰다. 동위원소로 표지된 선구물인3H-티미딘,14C-우리딘 또는3H-로이신을, 배양된 혼합물에 첨가시켜 30분간(DNA 합성에 대하여) 또는 60분간(RNA 및 단백질 합성에 대하여) 더 항온 유지시켰다. 냉각된 5% 삼염화초산 용액으로 세척한 후 종양세포의 산 불용성 부분에 결합된 방사능을 액체 섬광 계수기로 측정하였다. 표 5에 보이듯이, BU-3862T는 DNA 및 단백질 합성 둘다를 유사하게 억제하였고 그 유효성은 IC50수치에 관하여 RNA 합성시의 유효성 보다 100배 이상 높았다.
BU-3862T 및 디아세틸 그리고 디히드로 유도체의, 생체내 항종양 활성도를 종양이 있는 BDF1또는 CDF1쥐속에서 측정하였다. 수컷 BDF1쥐를 10% 흑색소성 흑색종 B16 수질 0.5ml로 복강내 접종시키고 암컷 CDF1쥐 역시 105개의 유임파구 백혈병 L1210 세포 또는 106개의 임파구 백혈병 P388 세포를 함유한 희석된 복수액 0.4ml로 복강내 접종시켰다. 시험화합물을 다음의 네가지 서로 다른 처리 계획에 의하여 그 쥐에 복강내 투여를 수행하였다; 1,2 및 3일째(QD×3), 1,4 및 7일째에(Q3D×3), 1.5 및 9일째(Q4D×3) 및 1-9일간(QD×9) 하루 한번, 표 6에 제시되었듯이, BU-3862T는 B16 흑색종에 대한 양호한 치료효능이 증명되었다. Q4D×3 처리계획에 의하여 투여되었을때, BU-3862T의 유효성(최소효과 투여량)은 미토마이신 C의 유효성과 동일하였다. 이와 같은 화합물은 각각 최대 T/C 수치 및 화학요법지수(최소효과 투여량에 대한 최적투여량의 비)에 관하여, 연속투여랑 계획(QD×9)에 의한 것 보다 간혈적 투여량 계획(Q4D×3)의 측면에서 보다 양호한 항종양 활성도 및 보다 넓은 치료범위를 보여주었다. 또한 디아세틸 및 디히드로 유도체는 Q4D×3 처리 계획에 의해 상당한 항-B16 흑색종활성도를 나타냈지만 표 7에 제시되었듯이 최소 효과 투여량에 있어서는 모화합물보다 약 10배 덜 활성적임을 나타내었다. 다른 한편, BU-3862T의 항-백혈병 활성은 오히려 약화되었다. 이 화합물은 145%의 T/C 최대수치로 L1210 백혈병에 대하여 보통의 항종양활성을 나타내었고, 시험된 투여량에서 P388 백혈병-보유 쥐에 대해 중요한 정도의 수명연장을 보여주지는 않았다(표 8 및 9).
[표 4. 쥐 및 사람의 종양세포에 대한 시험관내 세포독성]
Figure kpo00012
ND:측정되지 않음
[표 5. B16 흑색종 세포에서의 고분자합성에 대한 억제]
Figure kpo00013
[표 6. B16 흑색종(ip)에 대한 BU-3862T의 항종양활성도]
Figure kpo00014
Figure kpo00015
*1 중간 생존시간
*2 주요 항종양 효과(T/C≥125%)
[표 7. B16 흑색종(ip)에 대한 디아세틸- 및 디히드로-BU-3862T의 항종양 활성도]
Figure kpo00016
*1 중간생존시간
*2 주요 항종양 효과(T/C≥125%)
[표 8. L1210 백혈병(ip)에 대한 BU-3862T의 항종양 활성도]
Figure kpo00017
*1 BU-3862T에 대한 Q3D×3, ip 및 미토마이신 C에 대한 QD×3, ip
*2 중간생존시간
*3 주요항종양 효과(T/C≥125%)
[표 9. P388 백혈병(ip)에 대한 BU-3862T의 항종양 활성도]
Figure kpo00018
*1 Q4D×3, ip
*2 중간생존시간
*3 주요항종양효과(T/C≥125%)
상기 제시된 데이타에 의하여 알 수 있듯이, BU-3862T 및 그 디히드로 및 디아세틸 유도체들은 B16 흑색종과 같은 포유류의 악성종양의 억제에 대한 항종양 약품으로써 바람직하다.
본 발명은 그 청구범위내에 BU-3862T, 디히드로-BU-3862T 또는 디아세틸-BU-3862T와 종양-억제 유효량을, 약리학적으로 허용가능한 불활성 담체 또는 희석제와 조합하여 함유하는 약제조성물은 포함한다. 또한 이와 같은 조성물을 다른 활성 항종양제를 포함할 수 있고, 바람직한 투여경로에 적합한 어떠한 약제형태로도 만들어질 수 있다. 이와 같은 조성물의 예는 정제, 캡슐, 환(丸), 분말 및 입자와 같은 경구투여용 고체 조성물, 용액, 분산제, 시럽 또는 엘릭시르(elixer)와 같은 경구투여용 액상조성물 및 멸균액, 분산제 또는 에멀젼과 같은 비경구투여용 조제를 포함한다. 또한 그들은 멸균수, 생리적 식염수 또는 다른 적합한 멸균한 주입매질과 함께 사용전 즉시 용해될 수 있는 멸균고체 조성물 형태로 제조될 수 있다.
항종양제의 용도에 대하여, 주어진 포유류 숙주에 대한 BU-3862T 또는 그 디히드로 또는 디아세틸 유도체의 최적 투여량 및 요양법은 선행기술의 숙련자에게 쉽게 확인될 수 있다. 물론 사용된 화합물의 실제 투여량이 특별한 조제 조성, 사용방법 및 처리될 숙주 및 질병의 특별한 부위에 따라 변한다는 것을 알 수 있을 것이다. 약제의 작용을 변형시키는 많은 인자들 즉, 나이, 체중, 성별, 음식, 투여시간, 투여경로, 배설속도, 환자의 상태, 반응감수성 및 질병에 대한 심각성이 고려되어야 할 것이다.
다음의 실시예들은 예시 목적으로만 제공되며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
[실시예 1]
BU-3862T의 발효반응
Streptomyces hygroscopicus 균주 No. P247-71이 양호하게 성장된 한천 사면배양체를 멸균전 7.0으로 조정된 pH하에 콩가루(Nikko Seiyu) 3% Pharmamedia(Traders, U.S.A) 0.5%, 글루코스 3%, 효모추출물(Oriental) 0.1% 및 CaCO30.3%로 이루어진 영양배지에 접종시키는데 사용하였다. 그 영양배지를 회전식 진탕기(200rpm) 위에서 4일간 28℃로 배양시키고 그 성장체 5ml를 영양배지와 동일조성을 가진 발효배지 100ml를 함유한 500-ml 삼각 플라스크속에 넣었다. 회전식 진탕기 위에서 흔들어 주면서 4-5일간 28℃에서 발효를 수행하였다.
발효배지내의 항종양 항생제 생산은 B16 흑색종세포에 대한 시험관내 세포독성 활성에 의하여 측정하였다. 또한 발효반응을 탱크발효기내에서 수행하였다. 플라스크 발효반응에 의한 영양 배양액 2-L를 그 발효 반응 배지 120L를 함유한 200-L 탱크 발효기에 넣었다. 발효반응을 250rpm에서 교반하면서 통기속도 120L/min로써 28℃에서 수행하였다. 항종양 항생제 수준은 약 90시간 발효반응 후 최대치인 50μg/μl에 도달하였다.
[실시예 2]
BU-3862T의 분리 및 정제
실시예 1의 일반적 방법에 의하여 얻어진 발효액(23L, pH7.4)을 샤프리스(Sharpless)형 원심분리기(Kokusan No. 4A)를 사용하여 균사체 케이크(cake) 및 상징액으로 분리하였다. 균사체 케이크를 메탄올(6L)로 추출하였다. 여과에 의하여 불용물을 제거한 후, 에탄올 추출물을 수용액으로 진공하에 농축시켰다.
이와 같은 수용액 및 발효배지의 상징액을 결합시켜 초산에틸(20L)로 추출하였다. 그 추출물을 진공하에 건조상태로 증발시켜 항생제 조화합물 21.2g을 얻었다. 이와 같은 고체원을 염화메틸렌으로 미리 세척시킨 실리카겔 컬럼(4.0×75cm)에 적재하고 염화메틸렌-메탄올 혼합물에 의하여 메탄올 농도를 단계적으로 증가(2-10% v/v)시키면서 전개시켰다. 이와 같은 용리액을 B16 흑색종에 대한 세포독성 및 TLC 판위의 요오드 착색반응에 대하여 검사하였다. 2% 메탄올로 용리된 첫번째 요오드 양성 분획을 수집하여 세파덱스(Sephadex) LH-20 크로마토그래피에 의하여 더욱 정제시켰다. 그 정제된 성분은 그 스펙트럼 데이타를 기초로 하여 9-메틸스트랩티미돈으로 알려졌다(Saito, N.; F.Kitame, M. Kikuchi 및 N. Ishida:Studieson a new antivial antibiotic, 9-methylstreptimidone. 1. Physicochemical and biological properties. J. Antibiotics 27:206-214, 1974.), 5% 메탄올로 용리시킨 두번째 요오드 양성 분획을 수집하여 진공하에 증발시켜 BU-3862T의 반-순수 고체상을 얻었다. 이것을 초산에틸-메탄올 혼합물을 사용하여 실리카겔 위에서 크로마토그래피 하였다. 50:1v/v 비율의 혼합물로 용리하여 B16 흑색종에 대한 강한 세포독성을 보여준 활성성분을 분리하였다. 진공하에서 농축한 후에, 잔류물을 메탄올을 용리액으로 하여 Sephadex LH-20 크로마토그래피에 의하여 더욱 정제시켰다. 균질한 고체상의 BU-3862T(341mg)을 산출하였다.
[실시예 3]
디아세틸-BU-3862T의 제조
BU-3862T(10mg)을 상온에서 18시간 동안 무수초산(0.1ml) 및 건조한 피리딘(0.5ml)와 함께 교반하였다. 반응혼합물을 초산에틸(10ml)로 희석하고 그 용액을 굵은 HCl(10ml)과 물(10ml)로 세척하였다. 이 유기용액을 Na2SO4로 건조시키고 진공하에 증발시켜 유질의 (oily) 디아세틸 BU-3862T(13mg)을 얻었다. 물리-화학적 특성은 다음의 표 9 및 10에 제시된다.
[표 9. BU-3862T 유도체의 물리-화학적 특성]
Figure kpo00019
Figure kpo00020
[표 10. BU-3862T 및 그 유도체의1H-NMR(CDCl3내, 400MHz]
Figure kpo00021
Figure kpo00022
a), b), c) 및 d)는 서로 바뀔 수 있는 지정쌍을 나타낸다.
[실시예 4]
디히드로- 및 테트라히드로-BU-3862T의 제조
메탄올(10ml)에 용해된 BU-3862T(30mg)을 20% Pd/C(15mg)이 존재하에서, 대기압하으로 20시간 동안 수소화 반응시켰다. 반응혼합물을 걸러서 그 여과물을 감압하에 증발시켜 두가지의 수소화 산물의 혼합물(27mg)을 산출하였다. 그들을 예비 TLC(SiO2, CH2Cl2-메탄올=9:1v/v)에 의하여 분리시키고 Sephadex LH-20 크로마토그래피에 의하여 정제시켜 디히드로(13.4mg) 및 테트라히드로 BU-3862T(4.7mg)을 얻었다. 물리-화학적 특성은 상기의 표 9 및 10에 제시된 것과 같다.

Claims (8)

  1. 다음 구조식을 가지는 화합물 BU-3862T
    Figure kpo00023
  2. 다음 일반식을 가지는 디아세틸-BU-3862T
    Figure kpo00024
    상기 일반식에서, Ac는 CH3CO-임.
  3. 다음 구조식을 가지는 디히드로-BU-3862T
    Figure kpo00025
  4. 수중호기조건하에서, 탄소 및 질소동화원을 함유한 액체 영양배지에서 상당한 양의 BU-3862T가 BU-3862T 제조균주인 Streptomyces hygroscopicus에 의하여 제조될 때까지 그 미생물을 배양시키고, 그 배양배지로부터 다음 구조식을 가진 BU-3862T를 회수하는 것을 특징으로 하는 BU-3862T를 제조하는 방법.
    Figure kpo00026
  5. 제4항에 있어서, 상기 BU-3862T-제조 균주가 Streptomyces hygroscopicus(ATCC 53709)인 제조방법.
  6. 탄소 및 질소 등화원을 함유한 액체 영양배지에서 배양시킬때 회수가능한 양으로 BU-3762T를 제조할 수 있는 미생물 Streptomyces hygroscopicus(ATCC 53709).
  7. 다음 구조식(Ⅰ)의 BU-3862T를 불활성 유기 용매중에서 아세틸화제와 반응시키는 것을 특징으로 하는, 다음 일반식(Ⅱ)의 디아세틸 BU-3862T의 제조방법.
    Figure kpo00027
    상기 일반식(Ⅱ)에서 Ac는 CH3CO-를 나타냄.
    Figure kpo00028
  8. 다음 구조식(Ⅰ)의 BU-3862T를 촉매 수소화반응시키는 것을 특징으로 하는, 다음 구조식(Ⅲ)의 디히드로-BU-3862T의 제조방법.
    Figure kpo00029
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