DK173937B1

DK173937B1 - Antitumor aktive epoxyforbindelser, fremgangsmåde til fremstilling heraf, biologisk ren mikroorganismekultur til brug derved, farmaceutisk præparat omfattende disse forbindelser og anvendelse af forbindelserne

Info

Publication number: DK173937B1
Application number: DK198901071A
Authority: DK
Inventors: Masami Hatori; Koko Sugawara
Original assignee: Squibb Bristol Myers Co
Priority date: 1988-03-07
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 2002-02-25
Also published as: IE890724L; GR3004756T3; NO174432B; DK107189A; EP0332080B1; CA1338184C; EP0332080A1; KR960016206B1; JP2821756B2; DE68901552D1; AU3104189A; DK107189D0; IE62211B1; IL89477A; ZA891695B; PT89917B; KR890014102A; NO890944L; AU618790B2; ATE76406T1

Description

i DK 173937 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte antitumor antibiotika samt deres fremstilling, anvendelse og udvinding.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hidtil ukendt epoxyforbindelse, betegnet BU-3862T, og med formlen 5 f"» h o >. - samt dens di acetyl deri vat med formlen (II) 15 H2CWCH3 P H V~° 'L-.S' H I OCOCH-

CH,C0<r o J

20 6 og dens dihydroderivat med formlen (III) H3C /CH3 25 Γ3 η 0 Ί v° 30

Ansøgerne er ikke bekendt med antitumor antibiotika, der i struktur er beslægtet med forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse.

Den foreliggende opfindelse angår endvidere et hidtil ukendt farmaceutisk præparat omfattende en effektiv tumor-inhiberende mængde 35 BU-3862T, di acetyl-BU-3862T eller dihydro-BU-3862T ifølge krav 1 i kombination med en inert farmaceutisk acceptabel bærer eller diluent.

Den foreliggende opfindelse angår desuden en fremgangsmåde til DK 173937 B1 2 fremstilling af en epoxyforbindelse ifølge krav 1, som er ejendommelig ved, at man dyrker en BU-3862T-producerende stamme af Streptomyces hy-groscopicus, fortrinsvis Streptomyces hygroscopicus stamme P247-71 (ATCC 53709) eller en mutant eller variant deraf i et vandigt nsringsmedium 5 indeholdende assimllerbare kilder af carbon og nitrogen under submerse aerobe betingelser, indtil en væsentlig mængde BU-3862T er blevet fremstillet af den nævnte organisme i nævnte dyrkningsmedium, og derefter udvinder nævnte BU-3862T fra dyrkningsmediet, hvorpå man om ønsket omsætter BU-3862T i et organisk opløsningsmiddel med et acetyleringsmiddel 10 eller underkaster BU-3862T katalytisk hydrogenering.

Den foreliggende opfindelsen angår yderligere en biologisk ren kultur af mikroorganismen Streptomyces hygroscopicus ATCC 53709, hvilken kultur er i stand til at producere BU-3862T i en udvindelig mængde ved dyrkning i et vandigt næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder af 15 carbon og nitrogen.

Den foreliggende opfindelse angår desuden anvendelse af en epoxyforbindelse, betegnet BU-3862 T, dens di acetyl derivat eller dens dihy-droderivat ifølge krav 1 i en tumor-i nhiberende mængde til fremstilling af et farmaceutisk præparat til terapeutisk behandling af en pattedyrs-20 vært, der er angrebet af en malign tumor.

BU-3862T og dets diacetyl- og dihydroderivater udviser inhibito-risk aktivitet mod forsøgsdyr-tumorsystemer, fx B16-melanom hos mus.

Fig. 1 viser det infrarøde absorptionsspektrum af BU-3862T (KBr).

Fig. 2 viser det proton-magnetiske resonansspektrum af BU- 3862T i 25 CDCI3 (400 MHz).

Fig. 3 viser 13C-NMR spektret af BU-3862T i CDC13 (100 MHz).

En BU-3862T-producerende stamme betegnet stamme P247-71 i soleredes fra en jordbundsprøve opsamlet nær roden af et tamarindetræ ved Mt. Apo, Davao, Mindanao, Phil ippinerne. En biologisk ren kultur af denne stamme 30 er blevet deponeret i overensstemmelse med Budapesttraktaten hos The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland og føjet til den permanente samling af mikroorganismer som ATCC 53709.

Resultaterne af taxonomiske studier udført på stamme P247-71 indikerer, at stammen hører til slægten Streptomyces og til artsgruppen 35 Streptomyces hygroscopicus.

Stamme P247-71 har følgende egenskaber: 3 DK 173937 B1

I_I

Morfologi Både substrat- og luftmycelier dannes. De er lange og med mange forgreninger og ikke fragmenterede i korte filamenter. Kæder af arthro-sporer bæres af lufthyferne. Sporekæden og sporemorfologien er som føl -5 ger: 1) spiralsporekæder med 2-8 drejninger, 2) monopodielt forgrenede sporophorer, 3) sporer, oval- eller tøndeformede (0,5 til 0,7 gange 0,5 til 1,2 Mm), og 4) sporeornamentering, rynket eller glat.

Sporangium, motil spore og sclerotium observeres ikke.

10 Dvrkninasmæssiae oo fysiologiske karakteristika

Stamme P247-71 vokser godt i de fleste deskriptive medier. Gråt luftmycelium med hygroskopiske sorte pletter observeres på ISP-agarmedi-er med undtagelse af ISP-medium nr. 6. Hvidt til blegt gulligt-gråt luftmycelium dannes på Czapek's sakkarose-nitrat agar. Substratmyceliet 15 er farveløst eller gulligbrunt til gråliggult. Der dannes ikke melanin og andre diffuserbare pigmenter. De fleste sukkerarter udnyttes med hensyn til vækst. De dyrkningsmæssige og fysiologiske karakteristika vises 1 henholdsvis tabel 1 og 2.

De morfologiske, dyrkningsmæssige og fysiologiske karakteristika 20 af stamme P247-71 indikerer, at stammen hører til slægten Streptomyces.

Ifølge beskrivelserne af Pridham og Tresner* opsummeres de væsentlige karakteristika af stammen som følger: 1) gråt luftmycelium, 2) spiralsporekæde, 3) manglende melanoid og 4) glat sporevægornamentering. Den hygroscopiske forandring af sporedannet luftmycelium er en specifik 25 egenskab hos stammen. De væsentlige karakteristika samt de i tabel 1 og 2 viste karakteristika for stamme P247-71 placerer den i Streptomyces hygroscopicus.

30 1Pridham, T.G. og H.D. Tresner: Genus Streptomyces Waksman og Henrici, 1943, p. 748-829. R.E. Buchanan og N.E. Gibbons (ed.), Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th ed. 1974. The Williams & Wilkins Co, Baltimore.

DK 173937 B1

LO

* LO

ϋϊ i I

— ω ·<ο 3 CD S~ > cn —» c σι +-> £ xt cn <rt —» m <n cn ro 3 cn r~- O S- O O) O Ql s S— ··— ·/— '—^ i— O i''-' -r— i— i— r—

+-> I— -t-> Φ ·—· I— tu O) CD

<n φ ‘r- c > σι c > > > Q <J rO 3 S- 0) r— ®i S- U i- 3 > i. S- rO i— 3 t- ro Ό ro O0£^-QLi_ 03 cn «3 Lu LU Lu •i— 4-> cn — oj —* »o· +.» i— M" —- CO L-

-Q CO CM O

CM ad CO —' cn ad i— -—' cn CM (Λ ·<- ·Γ- '—· *(0 oi -r— +* »rO CL i- -r- Ol i~ o ·<ο σι >— o Ό 0> ad i- C ad E ·>- cn cn tn 3 in =3 > cn o >i i- o •r“-C= >> S- m r— ja s_ r— >to i— cn >> cn cu ·- s- >> i— ·« ·*> >, u -*-> cn :r +j +j i

> <o O) +-> fO (O

Ei-'i-C *σ <D !» l. · c

+-> CD 1— CD CD -t-> cn CD 0) »—V CD

*+- Ό I— cn S- S- C Ό ΌΙΛ σ>

3 03 C CL O T- o O CO C

—i ε cn ►—i ι/i cn od je s: —< >—t +->

CD

»-Η ω -* 'r - o s 5= CM * ~ Q. 4-> -M +j 4->

ro CO Ό (O CO

cu 4->i_ S- -Γ- (D i- S- CD

c tn φ φ .o on φ cu cn

§j ac-o -0S--0 C Ό -o C

m fy O 030 -r- O O ·>- u> > z: s +-» «j oc as ς oc cn s.

O

»4- (0

JC

•r— +> tn il Φ -—,

+-> r—I —« fO I

ad CM Φ to . · tn s- &- s- - s- >— <e ro s_ +j c i- c Φ cn i .—.

ad (O ad c > ro -t-> CO

tn Cnroo. Q_ ··— c ad

O CO—» S-LT) +J CL LO 4-> -r- O

c 4-»i-4->)—i— (/}>-icn —* cn i- l.

•r* ro rO tn —’ rO '—< »—- i *4- ro +J C

c S- cn ad E - 4-) s_ <n ar: +-> CO Φ E I S-I—.CO ad Cl J- ·<“ 13+Ji.cOrOS.Q. Φ 00 > c X &- *r- ad « oi tn c tn —. i ·—i O i O ftj Ό rO Cn ro i ro LT> S- —- Φ Q cn cu s- ro cn ad O- i fy • tn i i E r— tnc/i (— cn S-

—c O ad Ctn tn ad Φ -r— >—< OL. ICO

E i- <d o cn jd <o e c w j- e c σι — 3 O CL +->C CDS- Φ CO Φ O ro

φ -I- ad ro Q. -Γ- t-U> Ό Oli- CJ CX. +-> C

43 -o adN >, S». 5- cn φ U ro >n</> Q. S-

rO φ « U S- fy fU ad > O Ol i— r-ι Φ CD

f— Σ C/>— f— C «JO X 3 O C-3 ^ O-t-j DK 173937 B1

CD

i r— 3 -*-> ε *te —. to σ> te 3 i. i—i o i- ·«— Q) Ol r— ΟΙ -*-> (— - 01 -r- v) α» > i— .—.

-Q o i- <— s- *HJ o =i > iQ 3 <e i- σ> oo ε ac σι ll. o —' S*

VO 4J

cm J- —- o </> •te to i- o> ·- CD *r* Q.

I— O · -it: c -it: +-> ε t. 3 </> s-

3 O S- O O LO

•i— ε .o s- to -F— I— CD O.

d> #« ·ι\ ·λ O

υ +j +-> a: 4-> jx > te te te to es- s- s. o +-> as α> ^ ω s- <+- Ί3 tj ίο τ> σ> 3 O O to O >, —I s s *— £ x ω to • Φ "td td "Je Φ §1 m2 2 2 g» « to 0) tu 0) ω

-X Ό Ό Ό fv, S

(y o o o > Σ 2= ε 00

CQ

O Z

O i 00 o

CM O

00

"O ·—I

0) > s-

(U

c σ> O r—

•F— O

+J 4- te —. XI v> I— 3 0) S- -X 4-» • te c c s- σ» ·γ- ω • c te s- c i- te 4-> Co -r- 0) O.

<0 00 O) +-> to hh <e s- ««-»- 4-> w i. te tu o te oo *— o i- o. te c te 0- te to o *-> w o) te to !- te i - +j O) 1— * c Q) +-> te o ε oo +-> > r— 3 V) O 0) K0> α; ·ι— o o c o > λ -σ i. 3 c to s- to a >> i— tu xa te 1— SK- O CQ O U- 6 DK 173937 B1

Tabel 2. Fysiologiske karakteristika hos stamme P247-71 I-, □ 1-1

Hydrolyse af: Udnyttelse af:* 5 Gelatine + Glycerol +

Stivelse: Opløselig stivelse + D-Arabinose +

Kartoffelstivelse + L-Arabinose + D-Xylose ± Mælkekoagulering - D-Ri bose + 10 -peptonisering + L-Rhamnose + D-Glucose +

Fremstilling af: D-Galactose +

Nitratreduktase - D-Fructose +

Tyrosinase - D-Mannose 15 L-Sorbose

Tolerance over for: Sakkarose +

Lysozyme, 0,01% (w/v) - Lactose + 0,001% (w/v) - Cellobiose +

NaCl, l%-6% (w/v) + Melibiose + 20 7% (w/v) - Trehalose ± pH 5,5-10,5 + Raffinose + 5,0 og 11,0 - D-Melezitose

Opløselig stivelse +

Temperatur: Cellulose 25 Vækstområde 20°C - 39°C Dulcitol

Ingen vækst 17°C og 41°C Inositol +

Optimal vækst 37°C - 39°C D-Mannitol + D-Sorbitol

Salicin + 30 _ *Basalt medium: Pridham-Gottlieb's medium (=ISP-medium nr. 9).

Fremstilling af BU-3862T

7 DK 173937 B1 BU-3862T kan fremstilles ved dyrkning af en BU-3862T-producerende stamme af Streptomyces hygroscopicus, fortrinsvis en stamme, som har 5 samme karakteristika som Streptomyces hygroscopicus stamme P247-71 (ATCC 53709) eller en variant eller mutant deraf under submerse aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium. Organismen dyrkes i et næringsmedium indeholdende en assimilerbar carbonkilde, fx glycerol, D-ribose, L-rhamnose, D-glucose, D-fructose, sakkarose, lactose, mel i biose, D-10 mannitol eller opløselig stivelse. Næringsmediet bør også indeholde en assimilerbar nitrogenkilde såsom fiskemel, pepton, soyabønnemel, jord-nøddemel, bomuldsfrømel eller majsstøbevæske. Uorganiske næringssalte kan også inkorporeres i mediet. Sådanne salte kan omfatte et hvilket som helst af de sædvanlige salte, der er i stand til at tilvejebringe 15 natrium, kalium, ammonium, calcium, phosphat, sulfat, chlorid, bromid, nitrat, carbonat eller lignende ioner.

Fremstilling af BU-3862T kan ske ved en hvilken som helst temperatur, der kan bidrage til en tilfredsstillende vækst af organismen, fx 20°C til 39°C, og udføres hensigtsmæssigt ved en temperatur på ca. 28°C.

20 Fermenteringen kan udføres i kolber eller i laboratorie- eller industri fermentorer af forskellig størrelse. Ved anvendelse af tank-fermentering er det ønskeligt at fremstille et vegetativt inokulum i en næringsvæske ved at inokulere en lille mængde dyrkningsmedium med en substrat- eller jordbundskultur eller en lyofiliseret kultur af organismen.

25 Efter opnåelse af et aktivt inokulum på denne måde overføres det aseptisk til fermenteringstankmediet med henblik på fremstilling 1 stor målestok af BU-3862T. Mediet, i hvilket det vegetative inokulum fremstilles kan være det samme som eller forskelligt fra det, som udnyttes i tanken, når blot der opnås en god vækst af den producerende organisme.

30 Sædvanligvis opnås optimal fremstilling af BU-3862T efter inkuba tionsperioder på ca. fire dage.

BU-3862T kan udvindes fra dyrkningsmediet og isoleres i en i det væsentlige ren form ved konventionelle opløsningsmiddelekstraktionsprocedurer og kromatografiske procedurer. Eksempel 2 herunder viser en eg-35 net procedure til isolering og oprensning.

Di acetatderivatet (II) af BU-3862T kan fremstilles ved omsætning af BU-3862T med et konventionelt acetyleringsmiddel såsom eddikesyrean- 8 DK 173937 B1 hydrid i et inert organisk opløsningsmiddel. En typisk fremgangsmåde vises i eksempel 3 herunder. Dihydroderivatet (III) af BU-3862T kan fremstilles ved katalytisk hydrogenering af BU-3862T som vist i eksempel 4. BU-3862T opnåedes som et farveløst klæbrigt fast stof. Det var let 5 opløseligt i dimethyl sul foxid, dimethylformamid, methanol, ethanol, ethyl acetat og chloroform, men praktisk taget uopløseligt i vand og benzen.

BU-3862T udviste positiv reaktion over for iod, ammonium-molybdat-svovlsyre (AMS) og Rydone-Smith reagenser, hvorimod det var negativt i 10 ninhydrin-, anthron- og ferrichloridtests. De fysisk-kemiske egenskaber af BU-3862T er opsummerede i tabel 3. Forbindelsen udviste ikke karakteristisk UV-absorption. IR, *H-NMR og 13C-NMR spektrene af BU-3862T er vist i henholdsvis Fig. 1, 2 og 3.

15

Tabel 3. Fvsisk-kemiske egenskaber af BU-3862T

Type Farveløst klæbrigt fast stof 20 [a]24 : +32 ± 2°C (c 0,5, methanol)

D

El & FDMS : m/z 399 (M+H)+ 25 Microanalyse : Beregnet for C20H34N206 : C 60,28, H 8,60, N 7,03

Found : C 60,18, H 8,82, N 6,60 TLC, Si02 : CH2Cl2-Me0H (9:1) Rf 0,37 30 (Merck F254)

EtOAc-MeOH (4:1) 0,59

Methylethyl keton-Xylen-MeOH (10:10:2) 0,35 35

Strukturelle studier af BU-3862T

9 DK 173937 B1 BU-3862T udviser stærke absorptioner ved 3300 (hydroxy), 1720 (carbonyl), 1650 og 1530 cm"1 (amid) i IR-spektret, hvilket indike- 13 5 rer en peptidstruktur for antibiotikummet. C-NMR-spektret viste 20 carbonatomer, som identificeredes som to C-OI3» én = C-CHj, otte -CH2> tre -CH, én >C<, én >C»C1L og tre -C=0 carbonatomer. Den molekylære formel for BU-3862T fastsloges at være C20H34N2°6 øseret P^1 kroanalyse, massespektrale data((M+H)+ : m/z 399) og ^C-NMR spektralanalyse. 34 10 protoner observeredes i ^-NMR-spektret. De to dubletprotoner {& 7,03 & 6,48 ppm, i CDC13), som forsvandt lidt efter lidt ved tilsætning af tungt vand, henførtes til to -Nlj-CO-gnipper. De to brede singletprotoner (6 4,83 & 4,79) og AB-type dubletprotonerne (i 3,35 & 3,12, J:5,0 Hz) henførtes til henholdsvis exomethylen (-(CH3)C=CH2) og epoxld ( ^Z^) 15 protoner. Positionerne for disse protoner bestemtes ved COSY-eks-perimenter, der førte til de delvise strukturer, vist herunder. Yderli-gere sammenhænge mellem de delvise strukturer bestemtes ved C- H COSY-og C- H long range COSY-eksperimenter. De analyseredes som vist herunder, og således bestemtes den totale struktur for BU-3862T. Yderligere 20 bevis for strukturen tilvejebragtes ved dets massespektrum og ved nedbrydningseksperimenter. EI-MS-spectret udviste talrige fragment-ioner ved m/z 127 (iso-octanoyl), 214 (iso-octanoyl-seryl) og 325 (iso-octanoyl-seryl-4,5-didehydroleucyl), som understøttede strukturen. Ved sur hydrolyse gav BU-3862T en aminosyre og en fed syre. Den isolerede 25 aminosyre identificeredes som L-serin ved HPLC og den fede syre som 1so-octansyre ved gaskromatografi af dens methyl ester. BU-3862T gav di-acetatderivatet ved behandling med eddikesyreanhydrid i pyridin. Ved hydrogenering over pal ladium-på-carbon gav BU-3862T to reduktionsproduk-ter, dihydro-BU-3862T og tetrahydro-BU-3862T, hvis strukturer bestemtes 30 på basis af deres spectrale data. Diacetat- og dihydroforbindelsen bibeholdt den biologiske aktivitet, men tetrahydroderivatet var fri for aktiviteten.

BU-3862T kan benævnes l,2-epoxy-2-hydroxymethyl-4-(N-isooctanyl-L-serylamino)-6-methyl-hept-6-en-3-on og er et unikt peptid indeholdende 35 en epoxid- og en exomethylengruppe.

Delvise strukturer af BU-3862T

10 DK 173937 B1

I I

C-0 C-0 CH,

S II II

(CH3)2CH-(CH2)4-C=0, -nh-ch-ch2oh, -nh-ch-ch2-c=ch2,

V og -CH20H

10

BU-3862T

h2c^/H3 15 fH3 O S ^0 «,Λ^νγγίΑΧ . J " in 0 HCr 0 20

Diacetvl-BU-3862T

25 ur /CH3 H2C<s/ 3 :H3 ^ 0 0 30 ac<k y °flc 35 11 DK 173937 B1 FH3 10

Tetrahvdro-BU-3862T

H.C /“»

CH3 /OH

15 I H l]

0 hc^ :"®H

20 *H-*H og ^C-^H "long range" NMR spektrer or CH,*i 25 /\/ft *, ¥ L^A/ ) i j μ I I Jr.j y

I I · u i J

o J o* o Au

HCT OH

30 -> "long range" --> 130-!Η "long range"

Biologisk aktivitet af BU-3862T

12 DK 173937 B1 BU-3862T og diacetyl-, di hydro- og tetrahydro-BU-3862T testedes for in vitro cytotoxicitet over for flere murine og humane tumor celle-5 linier og/eller for in vivo antitumoraktivitet i mus. Mitomycin C anvendtes som referenceforbindelse i både in vitro og in vivo eksperimen ter. B16-F10 (murint melanom), P388 (murin leukæmi), L1210 (murin leukæmi) og Moser-celler (human colorectal carcinom) dyrkedes til den logaritmiske fase i beriget Eagle's minimal essentiel medium (MEM) suppleret 10 med kalvefosterserum. (FCS, 10%) og kanamycin (60 mcg/ml) og HCT-116 (human coloncarcinom) celler i Maccoy's 5A medium suppleret med FCS (10%), penicillin (100 u/ml) og streptomycin (100 mcg/ml), høstet og in-okuleret i brønde af 96- eller 24-brønds vævskulturplader med testmate-rialer i koncentrationer på henholdsvis 1,5 x 10 , 1,2 x 10 , 1,2 x 10 , 15 2,5 x 10® og 3,0 x 10® celler/ml. De inkuberedes ved 37°C i en befugtet atmosfære med 5% CO2 og 95% luft i 72 timer. De cytotoxiske aktiviteter over for B16-F10, Moser og HCT-116 celler bestemtes colorimetrisk ved 540 nm efter farvning af levedygtige celler med 0,006% neutral rød opløsning. På den anden side bestemtes de cytotoxiske aktiviteter over for 20 P388 og L1210 celler ved tælling af antallet af levedygtige celler. Resultaterne opsummeredes i tabel 4. Sammenlignet med mitomycin C udviste BU-3862T langt kraftigere cytotoxicitet over for både murine og humane celler. Styrken var ca. 50-120 gange større end for mitomycin C udtrykt i IC5Q-værdier. Diacetyl- og dihydroderivaterne udviste også ækvivalent 25 kraftige cytotoxiske potentialer over for både murine og humane celler svarende til ca. halvdelen af de tilsvarende for BU-3862T. På den anden side var tetrahydroderivatet signifikant mindre aktivt end ovenstående forbindelser.

Inhibitoriske virkninger af BU-3862T på syntese af makromolekyler 30 (DNA, RNA og protein) bestemtes i dyrkede B16-F10 melanomceller. B16-F10 celler (10® celler/ml) inkuberedes med BU-3862T ved 37°C i 3,5 (for DNA syntese) eller 4 (for RNA- og proteinsyntese) timer. Isotop-mærket præ- n i i a kursor, ^H-thymidin, 1x-uridin eller JH-leucin sattes til den dyrkede blanding, som inkuberedes yderligere i 30 min. (for DNA syntese) eller 35 60 min. (for RNA- og proteinsyntese). Efter vaskning med afkølet 5% trichloreddikesyreopløsning bestemtes den i den syre-uopløselige fraktion af tumorcellerne inkorporerede radioaktivitet i en væskescintilla- 13 DK 173937 B1 tionstæller. Som vist i tabel 5 inhiberede BU-3862T både DNA- og proteinsyntesen på samme måde, og virkningen var over 100 gange større end for RNA-syntesen udtrykt i IC50-værdier.

In vivo antitumor aktiviteter hos BU-3862T og di acetyl- og di-5 hydroderivaterne bestemtes i tumorbærende BDFj- eller CDFj-mus. BDF^-mus af hankøn inokuleredes Intraperitonealt med 0,5 ml 10% melanotisk mela-nom B16 brei, og CDF,-mus af hunkøn inokuleredes ligeledes Intraperito- X c nealt med 0,4 ml fortyndet ascites-væske indeholdende 10 lymphoide leu- g kæmlceller L1210 eller 10 lymphocytiske leukæmiceller P388. Testforbin-10 delser administreredes intraperitonealt til musene ved hjælp af følgende fire forskellige behandlingsskemaer; én gang daglig på dag 1, 2 og 3 (QD x 3), på dag 1, 4 og 7 (Q3D x 3), på dag 1, 5 og 9 (Q4D x 3) og på dag 1-9 (QD x 9). Som vist i tabel 6 udviste BU-3862T en fremragende terapeutisk virkning over for B16 melanom. Ved administrering efter Q4D x 3 15 behandlingsskemaet var virkningen (minimum effektiv dosis) af BU-3862T den samme som for mitomycin C. Denne forbindelse udviste bedre antitumor aktivitet og bredere terapeutisk rækkevidde ved det mellemliggende doseringskema (Q4D x 3) end ved det efterfølgende doseringsskema (QD x 9) udtrykt i henholdsvis maksimum T/C-værdi og kemoterapeutisk indeks (for-20 hold mellem optimal dosis og minimum effektiv dosis). Både diacetyl- og dihydroderivaterne udviste ligeledes signifikant anti-B16 melanomaktivi-tet ved Q4D x 3 behandlingsskemaet, men var ca. ti gange mindre aktive end moderforbindelsen udtrykt i minimum effektiv dosis som vist i tabel 7. På den anden side var de antileukæmiske aktiviteter af BU-3862T tem-25 melig svage. Denne forbindelse udviste moderat antitumor aktivitet over for 11210 leukæmi med maksimum T/C værdi på 145% og udviste ingen signifikant forlængelse af livslængde hos P388 leukæmi-bærende mus ved de testede doser (tabel 8 og 9).

Tabel 4. In vitro cvtotoxiciteter over for murine og humane tumor-celler 14 DK 173937 B1 IC5Q (ua/m\1 5

Forbindelse_B16-F10 P388 L1210 HCT-116 Moser BU-3862T 0,0017 0,031 0,01 0,0097 0,016 10 Di acetyl-BU-3862T 0,0030 ND* ND 0,017 0,044

Dihydro-BU-3862T 0,0032 ND ND 0,013 0,038

Tetrahydro-BU-3862T 0,53 ND ND >1,0 >1,0 15

Mitomycin C 0,50 ND ND 0,80 1,2 *ND: ikke bestemt 20

Table 5. Inhiberinq af makromolekvle-svntese i B16 melanomceller 25 IC50 ftf/mll

Forbindelse_DNA_Rfsj^_Protein 30 BU-3862T 0,10 11 0,060

Mitomycin C 1,6 11 60

Table 6. Antitumor aktivitet hos BU-3862T over for B16 melanom (ipl 15 DK 173937 B1

Behandlings- Legemsvægt-

Dos i s skema MST** T/C forandr, på 5

Forbindelse (mo/kg/daql fip)_fdagl (¾)_dag 5 (g) BU-3862T 8,0 Q4D x 3 20,0 167*2 -2,3 10 4,0 " 19,0 158*2 -1,3 2.0 " 18,0 150*2 -0,5 1.0 " 17,0 142*2 +0,3 15 0,5 " 15,5 129*2 +0,5 0,25 " 14,0 117 +0,5 20 Mitomycin C 2,0 Q4D x 3 29,0 242*2 +0,3 1.0 " 18,5 154*2 +0,5 0,5 " 15,0 125*2 +0,5 25 0,25 " 13,0 108 +0,3

Vehikel - Q4D x 3 12,0 - +1,1 16 DK 173937 B1

Tabel 6 (fortsat)

Behandl ings- Legemsvægt-

Dosis skema MST** T/C forandr.

5 på

Forbindelse (mq/kq/dag) (ipl idag) (%)___dag 5 (g) BU-3862T 2,0 QD x 9 Tox. Tox.

10 1,0 " 14,5 97 -3,3 0,5 " 20,0 133*2 -2,3 15 0,25 " 20,0 133*2 +0,3 0,13 " 18,5 123 +0,8 0,63 " 18,0 113 +1,3 20

Vehikel - QD x 9 15,0 - +1,3 25 *1 Middel overlevelsestid *2 Signifikant antitumor virkning (T/C > 125%) 17 DK 173937 B1

Tabel 7. Antitumor aktivitet hos diacetyl- og dihvdro-BU-3862T over for B16 melanom Hd1

Behandlings- Legemsvægt- 5 Dosis skema MST*1 T/C forandr, på

Forbindelse_fmo/ko/dagl (ipl_(daol (%1_daa 5 (ql

Di acetyl-BU-3862T 8,0 Q4D x 3 24,0 141*2 -2,0 10 4.0 11 23,0 135*2 +0,5 2.0 " 20,5 121 +1,0 15 1,0 " 20,0 118 +0,3 0,5 " 19,0 112 +1,3

Dihydro-BU-3862T 8,0 Q4D x 3 22,5 132*2 -1,0 20 4.0 " 20,0 118 -0,5 2.0 " 21,0 124 +0,5 25 1,0 " 19,5 115 +0,5 0,5 " 19,0 112 +0,5 18 DK 173937 B1

Tabel 7 (fortsat!

Behandlings- Legemsvægt-

Dosis skema MST*1 T/C forandr, på 5

Forbindelse_fmq/kq/daal (ipi___fdaol 1%) dag 5 fol

Mitomycin C 2,0 Q4D x 3 *33,0 >194*2 0,0 10 1,0 " 23,0 135*2 +1,0 0,5 " 22,0 129*2 +0,3 0,25 " 20,0 118 +0,3 15

Vehikel - Q4D x 3 17,0 - +0,8 20 *1 Middel overlevelsestid *2 Signifikant antitumor virkning (T/C * 125%)

Tabel 8. Antitumor aktivitet af BU-3862T over for L1210 leukæmi fip) 19 DK 173937 B1

Legemsvægt- 5 Dosis*1 MST*2 T/C forandr, på

Forbindelse_(mq/kg/daal (dag)_(%)_dag 5 (gi BU-3862T 4,0 Tox. Tox.

10 2,0 11,5 144*3 -3,5 I, 0 10,0 125*3 -2,8 J, 5 9,5 119 -0,8 15 0,25 9,5 119 0,0

Mitomycin C 2,0 13,0 163*3 -0,5 20 1,0 11,0 138*3 -0,3 0,5 10,5 131*3 0,0 0,25 10,0 125*3 +0,8 25

Vehikel - 8,0 - +1,1

30 *1 Q3D x 3, ip for BU-3862T og QD x 3, ip for mitomycin C

*2 Middel overlevelsestid *3 Signifikant antitumor virkning (T/C * 125%) 35

Tabel 9. Antitumor aktivitet af BU-3862T over for P388 leukæmi Hd! 20 DK 173937 B1

Legemsvægt- 5 Dosis** MST*^ T/C forandr, på

Forbindelse_(mq/ko/daql (dag) (¾¾_dag 5 (q) BU-3862T 4,0 11,0 105 -2,3 10 2,0 11,0 105 -2,8 1,0 11,5 110 -0,8 0,5 13,0 124 -0,3 15 0,25 12,5 119 +0,8

Mitomycin C 2,0 17,0 162*3 +1,5 20 1,0 15,0 143*3 +1,8 0,5 13,0 124 +1,8 0,25 13,0 124 +2,3 25

Vehikel - 10,5 - +2,4 30 *1 Q4D x 3, ip *2 Middel overlevelsestid *3 Signifikant antitumor virkning (T/C * 125%) 35 21 DK 173937 B1

Som de ovenfor viste data indikerer, er BU-3862T og dets dihydro-og diacetylderivater nyttige som antitumormidler for inhibering af maligne pattedyrstumorer såsom Bl6 melanom.

Opfindelsen angår også farmaceutiske præparater indeholdende en ef-5 fektiv tumorinhi berende mængde af BU-3862T, dihydro-BU-3862T eller di-acetyl-BU-3862T i kombination med en inert farmaceutisk acceptabel bærer eller diluent. Sådanne præparater kan også indeholde andre aktive antitumormidler og kan være på en hvilken som helst farmaceutisk form, der er egnet for den ønskede administreringsmåde. Eksempler på sådanne præ-10 parater omfatter faste præparater til oral administrering såsom tabletter, kapsler, piller, pulvere og granulater, flydende præparater til oral administrering såsom opløsninger, suspensioner, sirupper eller eliksirer og præparater til parenteral administrering såsom sterile opløsninger, suspensioner eller emulsioner. De kan også fremstilles 1 form 15 af sterile faste præparater, som kan opløses i sterilt vand, fysiologisk saltvand eller andet egnet sterilt injicerbart medium umiddelbart før brug.

Til anvendelse som et antitumormiddel kan optimale doseringer af BU-3862T eller dets dihydro- eller diacetylderivater til en given patte-20 dyrsvært let fastslås af fagmanden. Det vil selvfølgelig kunne indses, at den aktuelle dosis af anvendt forbindelse vil variere i henhold til det specifikke formulerede præparat, anvendelsesmetoden og den specifikke situs, vært og sygdom, som behandles. Mange faktorer, som modificerer lægemidlets virkning vil blive taget i betragtning, herunder alder, 25 vægt, køn, kost, administreringstidspunkt, administreringsmåde, udskillelseshastighed, patientens tilstand, lægemiddelkombinationer, reak-tionsensltiviteter og sygdommens alvor.

De følgende eksempler anføres til belysning af opfindelsen.

30 EKSEMPEL 1

Fermentering af BU-3862T

Et veldyrket agarsubstrat af Streptomvces hvaroscooicus. stamme nr.

35 P247-71, anvendtes til inokulering af et vegetativt medium bestående af 3% soyabønnemel (Nikko Seiyu), 0,5% Pharmamedia (Traders, U.S.A.), 3% glucose, 0,1% gærekstrakt (Oriental) og 0,3% CaC03, idet pH justeredes 22 DK 173937 B1 til 7,0 før sterilisation. Det vegetative medium inkuberedes ved 28°C i 4 dage i et rotationsrysteapparat (200 rpm) og 5 ml af væksten overførtes til en 500-ml Erlenmeyer kolbe indeholdende 100 ml af fermenterings -mediet med samme sammensætning som det vegetative medium. Fermenteringen 5 udførtes ved 28°C i 4 til 5 dage under rystning i rotationsrysteappara-tet.

Antitumor-antibiotikum produktionen i fermenteringsnæringsvæsken bestemtes ved in vitro cytotoxisk aktivitet over for B16 melanomceller. Fermenteringen udførtes også i en tankfermentor. En 2-li ters portion af 10 den vegetative kultur ved kolbefermenteringen overførtes til en 200-1i-ters tankfermentor indeholdende 120 liter af fermenteringsmediet. Fermenteringen udførtes ved 28°C med rystelse ved 250 rpm og luftningshastighed på 120 liter pr. minut. Det antitumor antibiotiske niveau nåede et maksimum på 50 μg/m^ efter ca. 90 timers fermentering.

15 EKSEMPEL 2

Isolation og oprensning af BU-3862T

20 Fermenteringsnæringsvæsken (23 liter, pH 7,4) opnået ved den almene fremgangsmåde ifølge eksempel 1 adskiltes i mycelialfilterkagen og su-pernatanten ved anvendelse af en Sharpless-type centrifuge (Kokusan nr.

4A). Mycelialfilterkagen ekstraheredes med methanol (6 liter). Efter fjernelse af de uopløselige produkter ved filtrering koncentreredes den 25 methanoliske ekstrakt 1 vakuum til en vandig opløsning. Denne vandige opløsning og supernatanten af fermenteringsnæringsvæsken kombineredes og ekstraheredes med ethylacetat (20 liter). Ekstrakten inddampedes til tørhed i vakuum til opnåelse af 21,1 g råt antibiotisk komplex. Dette rå faste stof overførtes til en søjle af silicagel (04,0 x 75 cm), som var 30 blevet forvasket med methylenchlorid, og udvikledes ved hjælp af en methylenchlorid-methanolbl ånding med trinvis forøgelse af methanol koncentrationen (2 -10¾ vol/vol). Elueringsmidlet overvågedes ved cytotoxicitet over for B16 melanom og farvereaktion med 1od på en TLC-plade. De første iod-positive fraktioner elueret med 2% methanol opsam-35 ledes og oprensedes yderligere ved Sephadex LH-20 kromatografi. Den op-rensede komponent identificeredes som 9-methylstreptimidon^ på basis af dens spektrale data. De andre iod-positive fraktioner elueret med 5% 23 DK 173937 B1 methanol opsamledes og inddampedes i vakuum til opnåelse af semi-rent fast stof af BU-3862T. Dette kromatograferedes yderligere på silicagel under anvendelse af ethylacetat-methanolblanding. Eluering med blandin- j gen i forholdet 50:1 vol/vol gav aktive fraktioner, som udviste stsrk 5 cytotoxicitet over for B16 melanom. Efter koncentration 1 vakuum opren-sedes remanensen yderligere ved Sephadex LH-20 kromatografi med methanoleluering til opnåelse af et homogent fast stof af BU-3862T (341 mg).

10

Eksempel 3

Fremstilling af diacetyl-BU-3862T

BU-3862T (10 mg) omrørtes med eddikesyreanhydrld (0,1 ml) og tør 15 pyridin (0,5 ml) i 18 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen fortyndedes med ethylacetat (10 ml), og opløsningen vaskedes med fortyndet HC1 (10 ml) og derefter vand (10 ml). Den organiske opløsning tørredes over Na2S0^ og inddampedes i vakuum til opnåelse af olieagtig diacetyl-BU-3862T (13 mg). Fysisk-kemiske egenskaber er anført i tabel 10 og 11 20 herunder.

25 1) Saito, N.; F. Kitame, M. Kikuchi og N. Ishida : Studies on a new 30 antiviral antibiotic, 9-methylstreptimidone.

I. Fysisk-kemiske og biologiske egenskaber.

J. Antibiotics 27: 206-214, 1974.

24 DK 173937 B1

Tabel 10. Fvsisk-kemiske egenskaber af BU-3862T-derivater

Diacetvl-BU-3862T Dihvdro-BU-3862T Tetrahvdro-BU-3862T

5 Karakter farveløst klæb- farveløst klæb- farveløst klæbrigt fast stof rigt fast stof rigt fast stof SIMS m/z 483 (M+H)+ 401 (M+H)+ 403 (M+H)+ 10 EIMS m/z 423 (M-C00CH3)+ 370 (M+H-CH20H)+ 372 (M+H-CH20H)+ 430 299 299 256 214 214 15 127 127 127 IR ι/maxKBr cm'1 3300 3300 3300 20 3070 3070 3070 2950 2950 2950 25 1750 1720 1710 1650 1640 1640 1550 1530 1530 30 1240 1050 1050 1040 35 TLC, Si02 Rf 0,78 0,37 0,21 CH2Cl2-MeOH (9:1) 25 DK 173937 B1

Tabel IL -H-NMR data for BU-3862T oa dets derivater (400 MHz i CDC131 1* H ci!/CHa « CH, 0 \ “ 0 5 i. 1 Η w V?

3 '·Λ 11Λ Il/V « 7 A · Λ , A

10 Di acetyl- Di hydro- Tetrahydro-

Posltion nr. BU-3862T BU-3862T BU-3862T BU-3862T

1 3,75 (d) 4,01 (d) 3,73 (d) 3,74 (dd)a) 15 4,21 (d) 4,87 (d) 4,21 (d) 3,90 (m) 2 ... 3,15 (m) 4 4,61 (ddd) 4,61 (ddd) 4,51 (m) 4,58 (m)b) 20 5 7,03 (d) 6,53 (d) 7,10 (d) 7,31 (d) 7 4,48 (ddd) 4,70 (ddd) 4,49 (ddd) 4,54 (m)b) 25 8 6,48 (d) 6,22 (d) 6,51 (d) 6,52 (d) 10 2,21 (t) 2,21 (t) 2,22 (t) 2,24 (t) 11 1,60 (m) 1,59 (m) 1,60 (m) 1,61 (m) 30 12 1,28 (m) 1,28 (m) 1,28 (m) 1,29 (m) 13 1,16 (m) 1,18 (m) 1,16 (m) 1,19 (m) 35 14 1,52 (m) 1,52 (m) 1,52 (m) 1,52 (m) 15 0,86 (d) 0,86 (d) 0,85 (d) 0,86 (d) 26 DK 173937 B1

Tabel 11 (fortsat)

Diacetyl- Dihydro- Tetrahydro-

Position nr. BU-3862T BU-3862T BU-3862T BU-3862T

5 16 3,12 (d) 3,09 (d) 3,10 (d) 3,81 (dd)a) 3,35 (d) 3,38 (d) 3,31 (d) 3,90 (m) 17 2,08 (dd) 2,07 (dd) 10 2,59 (dd) 2,60 (dd) 1,28 (m) 1,29 (m) 18 - - 1,66 (m) 1,70 (m) 15 19 1,75 (s) 1,76 (s) 0,94 (d)c> 0,96 (d)d) 20 4,79 (brs) 4,80 (brs) 0,95 (d)c) 0,97 (d)d) 4,83 (brs) 4,88 (brs) 20 21 3,58 (dd) 4,18 (dd) 3,58 (dd) 3,59 (dd) 4,02 (dd) 4,37 (dd) 4,03 (dd) 4,06 (dd) 25 22 0,86 (d) 0,86 (d) 0,85 (d) 0,86 (d) OCOCH3 2,05, 2,09 30 a), b), c) og d) viser assignationspar, der kan udskiftes med hinanden.

27 DK 173937 B1

Eksempel 4

Erepist i 11 iTK^f dihvdro- oq tetrahvdro-BU-3862T

Bu-3862T (30 mg) opløst i methanol (10 ml) hydrogeneredes under at-5 mosfærisk tryk i nærvær af 20% Pd/C (15 mg) i 20 timer. Reaktionsblandingen filtreredes, og filtratet inddampedes under reduceret tryk til opnåelse af en blanding af to hydrogeneringsprodukter (27 mg). De adskiltes ved præparativ TLC (Si02, CH2Cl2,-MeOH=9:l vol/vol) og oprense-des ved Sephadex LH-20 kromatografi til opnåelse af dihydro- (13,4 mg) 10 og tetrahydro-BU-3862T (4,7 mg). Fysisk-kemiske egenskaber er vist i tabel 10 og 11 ovenfor.

Claims

1. Epoxyforbindelse, betegnet BU-3862T, og med formlen 5 CH3 0 ^-o 10 samt dens di acetyl deri vat med formlen ch3 0 —o ”3 y H U IcOCHj CH,CO°^ 0 20 3 og dens dihydroderivat med formlen

25 CH3 CH3 0 ^--0

30 H DK 173937 B1

2. Fremgangsmåde til fremstilling af en epoxyforbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at man dyrker en BU-3862T-producerende stamme af Streptomyces hygroscopicus i et vandigt næringsmedium indeholdende assimilerbare kilder af carbon og nitrogen under submerse aerobe betin- 5 gelser, indtil en væsentlig mængde BU-3862T er fremstillet af den nævnte organisme i nævnte dyrkningsmedium, og derefter udvinder nævnte BU-3862T fra dyrkningsmediet, hvorpå man om ønsket omsætter BU 3862T i et organisk opløsningsmiddel med et acetyleringsmiddel eller underkaster BU 3862T katalytisk hydrogenering. 10

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, KENDETEGNET ved, at den BU-3862T-producerende stamme er Streptomyces hygroscopicus ATCC 53709 eller en variant eller mutant deraf.

4. Biologisk ren kultur af mikroorganismen Streptomyces hygroscopi cus ATCC 53709, hvilken kultur er i stand til at producere BU-3862T i en udvindelig mængde ved dyrkning i et vandigt næringsmedium indeholdende asslmilerbare kilder af carbon og nitrogen.

5. Farmaceutisk præparat omfattende en effektiv tumor-i nhi berende mængde BU-3862T, di acetyl-BU-3862T eller dihydro-BU-3862T ifølge krav 1 i kombination med en inert farmaceutisk acceptabel bærer eller diluent.

6. Anvendelse af epoxyforbindelse, betegnet BU-3862 T, dens di- 25 acetylderivat eller dens dihydroderivat ifølge krav 1 i en tumor-inhiberende mængde til fremstilling af et farmaceutisk præparat til terapeutisk behandling af en påttedyrsvært, der er angrebet af en malign tumor. 30