KR100446323B1 - Ｇｍ-95 물질, 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하기의 화학식 (1)로 표현되는 화합물; 이의 제조 방법; 활성 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 제약학적 조성물; 상기 화합물 투여에 의한 종양 치료 방법; 상기 화합물의 약물용 용도; 및 상기 화합물을 생산가능한 미생물에 관한 것이다. 상기 화합물은 항종양 효과를 가진, 약물로서 유용한 신규한 화합물이다.
[화학식 1]

Description

ＧＭ-95 물질, 이의 제조 방법 및 용도 {SUBSTANCE GM-95, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND UTILIZATION THEREOF}
둘 이상의 옥사졸 고리를 가진 마크롤라이드의 공지된 예로는 나세류 (nudibranch)에서 추출한 항종양 활성이 있는 Ulapualide A 및 B (Journal of American Chemical Society, 108 권, 846∼847 페이지, 1986), 및 역시 나세류에서 추출한 항진균 효과가 있는 Kabiramide C (Journal of American Chemical Society, 108 권, 847∼849 페이지, 1986)가 있다.
본 발명의 목적은 미생물을 사용하여, 항종양 효과를 가지고 약물로서 유용한 신규 화합물, 이의 제조 방법, 및 항종양 효과가 있는 신규 화합물을 생산 가능한 미생물을 얻고자 하는 것이다.
본 발명은 항종양 효과를 가지고 약물로서 유용한 신규 화합물, 이의 제조 방법, 및 본 물질을 생산하는 미생물에 관한 것이다.
도 1은 실시예에서 수득한 본 화합물의 자외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 실시예에서 수득한 본 화합물의 적외선 흡수 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 실시예에서 수득한 본 화합물의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 실시예에서 수득한 본 화합물의13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
본 발명의 발명자는 미생물에서 발생한 다양한 화합물을 연구하였고 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속에 속하는 3533-SV4 균주의 배양액에서 항종양 활성을 가진 물질이 발생한다는 것을 발견하였다. 이어서, 본 발명자는 활성 물질을단리하여, 이의 물리화학적 성질 및 구조를 관측하고 이의 항종양 효과를 입증하였고, 이에 의해 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 하기 화학식 (1)의 화합물을 제공한다.
상기 화합물을 이후, "GM-95 물질"로 칭한다.
또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속에 속하는, GM-95 물질을 생산 가능한 미생물을 배양 배지 중에서 배양하고, 생성된 배양액으로부터 상기 물질을 단리하는 것으로 이루어지는 GM-95 물질의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 활성 성분으로서 GM-95 물질을 함유하는 약물 및 항종양제를 제공한다.
또한, 본 발명은 GM-95 물질 및 이를 위한 제약학적으로 허용가능한 운반체를 함유하는 제약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 GM-95 물질의 유효량을 환자에게 투여하는 것으로 이루어지는 종양 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 GM-95 물질의 약물로서의 용도를 제공한다.
나아가, 본 발명은 GM-95 물질을 생산 가능한 미생물, 더욱 구체적으로 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물을 제공한다.
상기 화학식 (1)로 표현되는 GM-95 물질의 물리화학적 성질은 다음과 같다.
1) 분자식: 고분별능 고속원자충돌 질량 분석법으로 측정시, 측정된 (M+H)+의 값이 583.0790으로 나타나며, 상기 값에 상응하는 분자식은 C26H15N8O7S 이다.
2) 분자량: 고속원자충돌 질량 분석법으로 측정시, 582.0712의 측정값이 나타난다.
3) 융점: 138∼143℃ (분해)
4) 고유광회전도: C = 0.129 g/100 ㎖의 농도에서 측정 (메탄올), [α]D 20=-9.38°이다.
5) 자외선 흡수 스펙트럼: 도 1에 나타난 바와 같음.
상기 측정은 메탄올(7.39 μM 용액) 중에서 수행하였다. 259.5 nm의 파장에서 최대 흡수가 있으며 상기 파장에서 흡광도는 0.288 이었다. 몰흡광계수 (ε)는 38982 였다.
6) 적외선 흡수 스펙트럼 (FT-IR): 도 2에 나타난 바와 같음.
νmax(cm-1):
7) 용매 중의 용해도
물 및 아세톤에서는 불용성
클로로포름 : 메탄올 = 1:1 의 혼합물에서 가용성
8) 물질의 색: 백황색 분말
9) 핵자기공명 스펙트럼
중수소화된 클로로포름 : 중수소화된 메탄올 = 1:1 혼합물의 용액 중, 25℃ 에서 측정한 500 MHz1H-NMR 스펙트럼 (도 3) 및 125 MHz13C-NMR 스펙트럼 (도 4)에서의 화학적 이동은 하기와 같다.
(10) 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에서의 머무름 시간 (Rt) :
다음의 조건 하에서 분석하여 6.1 분의 시간에서 피이크가 검출되었다.
분석 조건:
칼럼: PEGASIL ODS (4.6 mm I.D. ×250 mm, Senshu Scientific Co. 제조)
이동상: 아세토니트릴/트리플루오로아세트산/물 (70:0.1:30, v/v/v)
유속: 1 ㎖/분
검출: 254 nm
본 발명의 GM-95 물질은 적절한 조건 하에서, 통상적으로 하기의 조건 하에서 본 발명의 물질을 생산 가능한 미생물의 균주 (이하, GM-95 물질 생산 미생물이라 칭함)를 배양하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명은 GM-95 물질 생산 미생물을 포함하는 것이다.
GM-95 물질 생산 미생물의 예로는 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물의 균주가 있다. 또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 속의 미생물을 배양하고 배양액을 회수하는 것에 의해 수득 가능한 GM-95 물질을 포함하는 것이다.
스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물의 균주의 예로는 스트렙토마이세스 아눌라투스 3533-SV4 (Streptomyces anulatus3533-SV4) 균주 및 이의 변이균주가 있다. 스트렙토마이세스 아눌라투스 3533-SV4 균주는, 스트렙토마이세스 속에 속하는 미생물의 균주이며, 일본 쿠마모토껭 다마나군 텐슈마찌의 토양에서 본 발명자가 새로이 단리하고 1998년 8월 12일에 미생물 명칭: 스트렙토마이세스 아눌라투스 3533-SV4 (GM-95) (기탁자(DEPOSITOR)에 의해 부여된 식별 참조) 및 수탁 번호 FERM BP-6460 하에 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 (National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology) (일본 이바라끼껭 쯔꾸바시 히가시 1 쵸메 1-3)에게 기탁한 미생물의 균주이다.
스트렙토마이세스 아눌라투스 3533-SV4 의 동정(同定) 및 이의 미생물학적 특성의 연구는 International Streptomyces Project (ISP)의 방법에 따라 수행하였다. 스트렙토마이세스 아눌라투스 3533-SV4 균주의 미생물학적 특성은 하기와 같다.
a) 형태학적 특성
균주는 ISP (International Streptomyces Project) No.2, No.3, No.4 및 No.5 배지에서 27℃로, 14일 동안 배양하였다. 결과는 다음과 같다:
1) 균사 형성의 분지: 단순분지
2) 포자 형성의 형태: 나선형, 포자 형태는 원주형
3) 포자의 수: 10 ∼ 50 이상
4) 포자의 표면: 평활
5) 포자의 크기: 0.3 ∼ 0.5 ×0.7 ∼ 1.0 ㎛
6) 편모의 존재: 존재하지 않음
7) 포자낭의 존재: 존재하지 않음
8) 포자체의 부착 위치: 기균사체
9) 균사 형성성의 소유: 없음
b) 다양한 배지 상에서의 배양 특성
다양한 배지 상에서의 균주의 배양 특성은 표 2에 나타나 있다. 표 2에나타난, 배지의 성질과 관계된 색조는 Container Corporation of America 에서 출판한 The Color Harmony Manual (1958년판)에 따라 나타낸 것이다.
배지 기균사체의 색조 기질 균사체의 색조 가용성색소
수크로스 니트레이트 한천글루코스 아스파라긴 한천글리세린 아스파라긴 한천전분 무기염 한천티로신 한천영양 한천이스트 맥아 한천오트밀 한천 황색계열황색계열황색계열황색계열황색계열황색계열황색계열황색계열 담황색담황갈색/밝은 황색담황색밝은 황갈색/담황갈색밝은 황갈색담황색담황갈색담황색/밝은 황갈색 없음없음없음없음백다색없음없음없음
c) 생리학적 특성
1) 성장온도범위: 20∼32℃
최적온도: 20∼30℃
2) 젤라틴의 액화: +
3) 전분의 가수분해: +
4) 탈지우유의 응고 및 펩톤화: +
5) 멜라노이드 색소의 생성:
티로신 한천 배지: -
펩톤 이스트 철 한천 배지: -
트립톤 이스트 즙액 배지: +
6) 니트레이트의 환원: +
7) 카본 수크로스의 동화 (PridhamㆍGottlieb 한천 배지, (ISP NO.9))
L-아라비노스 : +
D-크실로스 : +
D-글루코스 : +
D-프룩토스 : +
수크로스 : +
이노시톨 : +
L-람노스 : +
라피노스 : +
D-만니톨 : +
d) 화학분류학
The Society for Actinomycetes Japan (ed.), [Experimental Method for Identifying Actinomycetes-6-2-70, 1985]에 개시된 박막 크로마토그래피로 전체 세포의 산 가수분해 생성물을 분석하였다. 그 결과, LL-형태의 디아미노피멜산을 검출하였다.
이 균주의 기질 균사체는 분해되지 않았다. 기균사체는 긴 주축을 형성하며, 축으로부터 불규칙적으로 분지된 각 균사체의 끝 상에 4∼9 회전을 가지고 10∼50 이상의 포자로 구성된 나선형 포자 사슬을 형성한다. 포자는 운동성이 없고, 원주형 또는 타원형이며, 폭 0.3∼0.5, 길이 0.7∼1.0 ㎛ 이고 평활한 표면을 가진다. 균핵, 포자낭, 및 다른 특정한 형태는 관찰되지 않는다. 세포벽의 화학형은 (Ⅰ) 형이다. 배양 성질은 표 2에 나타나 있다. 기균사체의 색조는 황색계열이다. 기질 균사체의 색조는 선명하지 않으며 pH의 변화에 영향을 받지 않는다. 가용성 색소는 전반적으로 관찰되지 않는다. 생리학적 성질은 상기 세목 c) 에서 개시된 바이다. 이 균주는 중온성이다. 이 균주의 형태학적 성질 및 세포벽의 화학형에 의해, 본 균주는 스트렙토마이세스 (이하, "에스.(S.)"로 약칭함) 속에 속하는 것으로 판단된다.
상기 성질를 기초로 하여, [Approved Lists of Bacterial Names, 1980]에 개시된 에스. 속의 종 및 다음 목록의 유용한 세균 명을 조사하고 관련된 종을 선택하였다. 에스.스페로이데스(S.spheroides) 의 진단 성질과 비교하여, 본 발명의 균주와 에스.스페로이데스의 성질은 거의 동일하였으며 오직 카본 수크로스의 동화에서 구별된다.
이에 따라, 본 발명의 균주는 에스.스페로이데스와 밀접하게 닮은 새로운 균주이다. 그러나, 에스.스페로이데스는 [Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 4권]에서 Williams 등에 의해 에스.아눌라투스(S.anulatus)라는 이명(異名)으로 정의된다. 결과적으로, 본 발명의 3533-SV4 균주는 에스.아눌라투스에 속하는 균주로서 동정되며 스트렙토마이세스 아눌라투스 3533-SV4 로서 명명한다.
다음은 본 균주와 이와 관련된 종들 사이의 비교이다.
균주 3533-SV4 스트렙토마이세스 스페로이데스
포자 사슬의 형태포자 표면기균사체의 색조기질 균사체의 색조pH 민감성가용성 색소의 생산멜라닌 색소의 생산전분의 가수분해니트레이트의 환원성장 온도카본의 동화아라비노스크실로스이노시톨만니톨람노스라피노스수크로스프룩토스 나선형평활황색선명하지않은 색10℃45℃ ++++---++--++++++++ ++++---++---+-++-++
본 발명의 GM-95 물질은 다양한 GM-95 물질 생산 미생물, 예를 들어, 상기 미생물학적 특성을 가지는 3533-SV4 균주 또는 이의 변이균주와 같이, 스트렙토마이세스 속에 속하는 다양한 GM-95 물질 생산 미생물을 적합한 배지 중에서 배양하고, 본 발명의 물질을 함유하는 조(粗) 추출물을 배양액에서 분리하고, 상기 조 추출물로부터 GM-95 물질을 단리하고 정제하여 제조할 수 있다. 배양액은 배양 여액 및 고형 세포성 분획을 포함한다.
본 발명의 미생물의 배양은 통상적인 배양 절차에 따라 수행하며 통상적으로, 바람직하게는 진탕배양 방법 또는 호기성 교반배양 방법 등의 방법에 의해 유체 배지에서 호기성으로 수행한다. 사용가능한 배지로서, GM-95 물질 생산 미생물이 이용할 수 있는 영양 공급원을 함유한 임의의 배지를 적용할 수 있고 여러 종류의 합성배지 및 천연배지를 이용할 수 있다. 배지에 첨가되는 카본 공급원으로는 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 글리세린, 덱스트린, 전분, 당밀, 옥수수 침지액, 및 유기산 등이 있으며, 이러한 공급원은 단독 또는 조합하여 사용될 수 있다. 질소 공급원으로는 Pharma 배지, 펩톤, 육(肉) 추출물, 이스트 추출물, 거친 대두 가루, 카세인, 아미노산, 우레아 등과 같은 유기 질소성 물질 및 소듐 니트레이트, 암모늄 술페이트 등과 같은 무기 질소성 물질이 있다. 이러한 물질도 또한 단독 또는 조합하여 사용할 수 있다. 필요한 경우, 배지는 소듐 염, 포타슘 염, 마그네슘 염, 포스페이트, 및 중금속 염으로 적합하게 보완할 수 있다.
배양 과정 중에 다량의 거품이 있는 경우, 소포제가 배지에 첨가될 수 있다. 소포제의 예로는 예를 들어 대두유, 아마인유 등의 식물유, 옥타데칸올, 테트라데칸올, 헵타데칸올 등의 고급 알콜, 및 다양한 규소 화합물이 있다.
배지의 pH 값은 바람직하게는 중성 주변으로 조절한다. 배양 온도는 GM-95 물질 생산 미생물의 성장에 적합한 범위 내, 통상적으로 20∼32℃, 바람직하게는 25∼30℃ 주변으로 유지해야 한다. 배양 시간은 바람직하게는 진탕배양 방법 및 호기성 교반배양 방법 모두 2∼6 일이다.
상기 설명된 다양한 배양 조건은 사용된 미생물의 종류 및 특성, 외부 조건 등에 따라 적합하게 변경될 수 있고, 최적 조건은 상기 범위 내에서 선택하고 조절할 수 있는 것이다.
GM-95 물질을 함유하는 조 추출물의 배양액으로부터의 분리는 발효 생성물을단리하기 위한 통상적인 절차에 따라 달성할 수 있다. 예를 들어, 용매 추출, 크로마토그래피, 결정화 등과 같은 관례적인 방법이 단독으로 또는 적합한 순서 및 조합하여 사용될 수 있다.
더욱 구체적으로는, 다음의 방법이 사용될 수 있다. 배양 과정 중에 생산된 GM-95 물질은 주로 배양 여액 및 세포 펠릿 중에 존재하므로, 통상적인 방식으로 배양액을 여과 또는 원심분리하여 배양 여액에서 고형 세포성 분획을 분리한다. 그 후 메탄올, 아세톤 등과 같은 용매를 사용하여 GM-95 물질을 함유한 고형 세포성 분획에서 GM-95 물질을 용리한다. 이어서, 용매를 감압 하에서 증류 제거하여 GM-95 물질을 함유한 조 농축물을 생산한다. 에틸 아세테이트, 클로로포름, 부탄올 등의 불수용성 유기 용매를 조 농축물에 첨가하여 GM-95 물질을 유기 용매 층으로 이동시킨 후, 박초를 첨가하여 용매 층을 탈수시킨다. 이어서, 용매를 감압 하에서 증류 제거하여 GM-95 물질을 함유하는 조 추출물을 얻는다. 또한, 배양 여액 중에 함유된 GM-95 물질을 상기 언급한 바와 같이 유기 용매 층으로 이동시켜 조 추출물을 얻는다. 선택적으로, 수산화 나트륨 또는 염산으로의 pH 조절, 추출 효율의 상승 및 산업적 염 첨가에 의한 에멀션 발생 방지 등과 같은 단계를 취할 수 있다.
활성탄, 실리카 겔, 알루미나, 비이온성 거대다공성 흡착제 수지 등의 흡착제를 사용한 흡착 크로마토그래피, ODS-결합된 실리카 겔 등을 사용한 역상 크로마토그래피와 같이, 저분자량 친유성 물질의 단리 및 정제를 위한 통상적인 절차에 의해, 상기 조 추출물에서 GM-95 물질을 단리 및 정제할 수 있다. 이러한 기술중에서, 용리제로서 클로로포름 또는 클로로포름/메틸 아세테이트, 클로로포름/메탄올, 클로로포름/아세톤, 벤젠/아세톤 등의 혼합물을 사용한 실리카 겔 크로마토그래피 및 용리제로서 아세토니트릴 또는 메탄올/0.05%의 트리플루오로아세트산 또는 10mM의 모노포타슘 포스페이트 등의 혼합물을 사용한 역상 크로마토그래피가 특히 유용하다. 더욱이, 추가의 정제가 필요한 경우, 상기 크로마토그래피 방법을 반복하거나 또는 Sephadex LH-20 (Pharmacia 사 제조) 및 클로로포름, 메탄올 등을 용리제로서 사용한 칼럼 크로마토그래피 등의 기술과 조합하여 수행할 수 있다. 상기 절차에 의해서, 고순도급의 GM-95 물질을 수득할 수 있다.
정제 과정 동안 GM-95 물질의 확인을 위하여, 유익하게는 박막 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 검출을 조합하여 수행할 수 있다.
본 발명의 GM-95 물질은 항종양 활성을 가지며, 항종양제로서의 이의 효능이 입증되었다.
상기와 같이 정제된 GM-95 물질을 제약학적 조성물의 형태로 사용하기 위하여, 의도하는 사용법에 따라 제약학적으로 적합한 투여형태로 가공된다. 투여형태로는 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 세립제, 액제 및 용액제, 환제, 유제, 현택액제 등의 경구 투여형태 및 주사제, 좌제, 연고제, 경고제, 습포제, 에어로솔제, 점안제 등과 같은 비경구 투여형태가 있다. 이러한 투여형태는 당업자에게 공지되고 공통적으로 사용되는 절차에 의해 제조될 수 있다.
경구용 고형제제의 제조에서, 부형제 및 선택적으로 결합제, 붕괴제, 윤활제, 착색제, 교미제, 교취제 등이 본 발명의 활성성분에 첨가되고, 정제, 캡슐제, 산제, 과립제, 세립제 등이 관례적인 방식으로 제조할 수 있다. 부형제의 예로는 락토스, 수크로스, 전분, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 결정 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스, 글리세린, 소듐 알지네이트, 아카시아 등이 있고, 결합제의 예로는 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 에테르, 에틸 셀룰로스, 아카시아, 쉘락, 백당 등이 있으며, 붕괴제의 예로는 건조된 전분, 소듐 알지네이트, 한전 분말, 탄산수소나트륨, 탄산칼슘, 소듐 라우릴 술페이트, 글리세릴 모노스테아레이트, 락토스 등이 있고, 윤활제의 예로는 마그네슘 스테아레이트, 탈크 등이 있으며, 교미제의 예로는 백당, 등피, 시트르산, 타르타르산 등이 있다. 착색제, 교취제 및 당업계에서 공지된 다른 첨가제가 사용될 수 있다. 필요하면, 이러한 정제는 공지된 방법에 의해 추가로 일반적인 피복 필름을 형성시켜 피복정으로 가공할 수 있으며, 예를 들어 당의정, 젤라틴 피복정, 장피복정, 필름 피복정 등이 있고, 이중층 정제, 다층 정제 등이 될 수 있다.
경구용 액체제제의 제조에서, 교미제, 완충제, 안정화제, 교취제 등이 본 발명의 활성 성분에 첨가되며, 용액제, 시럽제 및 엘릭시르제가 관례적인 방식으로 제조될 수 있다. 사용가능한 교미제는 상기에 언급되어 있다. 사용할 수 있는 완충제로는 소듐 시트레이트 등이 있으며 안정화제로는 트라가칸트 고무, 아카시아, 및 젤라틴 등이 있다.
주사제의 제조에서, 희석제, pH 조절제, 완충제, 안정화제, 등장화제, 국소마취제 등이 본 발명의 활성 성분에 첨가되며, 정맥내, 근육내, 피하, 피내, 또는 복강내 투여용 주사제가 관례적인 방식으로 제조될 수 있다. 사용할 수 있는 희석제로는 물, 에틸 알콜, 마크로골, 프로필렌 글리콜, 에톡시화된 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시화된 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 등이 있다. pH 조절제 또는 완충제로는 소듐 시트레이트, 소듐 아세테이트, 및 소듐 포스페이트가 있다. 안정화제로는 다른 물질 중에서도 소듐 피로술파이트, 에틸렌디아민테트라아세트산, 티오글리콜산, 및 티올락트산이 있다. 사용할 수 있는 등장화제로는 염화나트륨, 글루코스 등이 있으며, 국소마취제로는 프로카인 히드로클로라이드, 리도카인 히드로클로라이드 등이 있다.
좌제의 제조에서, 좌제 기재, 선택적으로는 계면활성제 등이 본 발명의 활성 성분에 첨가되며, 좌제는 관례적인 방식으로 제조할 수 있다. 사용할 수 있는 기재로는 마크로골, 라놀린, 카카오 버터, 지방산 트리글리세라이드, Witepsol.RTM. (Dynamit Nobel 사 제조) 등과 같은 유성 기재가 있다.
연고제의 제조에서, 기재, 안정화제, 습윤제, 보존제 등이, 필요한 경우, 본 발명의 활성 성분에 첨가되며 관례적인 방식으로 혼합 및 제제화를 수행한다. 기재로는 유동파라핀, 백색 연파라핀, 백색 밀랍, 옥틸도데실 알콜, 및 파라핀이 있고; 보존제로는 메틸 p-히드록시벤조에이트, 에틸 p-히드록시벤조에이트, 프로필 p-히드록시벤조에이트 등이 있다.
습포제의 제조에서, 관례적인 방식으로 상기 연고, 크림, 겔, 페이스트 등으로 통상적인 지지체를 피복하여 제조할 수 있다. 지지체로는 면, 스프사 또는 화학섬유의 직포 또는 부직포, 연질염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리우레탄 등의 필름, 및 이러한 물질의 발포 시트가 있다.
필요하다면, 상기 개시된 투여형태는 착색제, 보존제, 향료, 풍미제, 감미제 등과 같은 다른 첨가제 또는 이외의 의학적 활성 성분으로 보완될 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물에서 본 발명의 물질의 비율은 결정적이진 않고 넓은 범위에서 자유롭게 선택할 수 있으나, 통상적으로 말해서, 제약학적 조성물 중에 바람직하게는 1∼70 중량%이다.
상기 방법으로 제조한 본 발명의 제약학적 조성물의 투여방법에 제한은 없다. 따라서, 특정한 투여형태, 환자의 나이, 성별, 및 다른 요소, 및 질병의 정도에 따라 적합한 방법을 선택할 수 있다. 주사 형태의 제제는 정맥내, 근육내, 피하, 피내 또는 복강내적으로 투여될 수 있다. 필요한 경우, 주사제는 글루코스 용액 또는 아미노산 용액과 같은 일반적인 주입액과의 혼합물로 정맥내에 투여될 수 있다. 본 발명의 경구 투여용 정제, 환제, 과립제, 캡슐제 등과 같은 고형 제제 및 액체 제제는 경구적으로 또는 경장적으로 투여될 수 있다. 좌제는 직장으로 투여될 수 있다.
상기 형태의 각 투여 단위로 제제화될 본 발명의 활성 화합물의 양은 환자의 임상적 상태 및 투여형태에 의존하기 때문에, 통상적 어구로 정의할 수는 없다. 통상적으로, 각 단위 투여형태 중의 양은 바람직하게는 경구용 제제의 경우 약 1∼1000 mg, 주사제의 경우 약 0.1∼500 mg, 그리고 좌제의 경우 약 5∼1000 mg이다.
임의의 상기 투여형태 중의 활성 화합물의 일일 복용량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 및 다른 조건에 따라 적합하게 선택할 수 있다. 일반적으로,성인 환자의 일일 복용량은 약 0.1∼1000 mg/kg, 바람직하게는 약 1∼100 mg/kg일 수 있다. 이 복용량은 하루에 한번 또는 약 2∼4 회로 나눈 분량으로 투여할 수 있다.
본 발명의 GM-95 물질을 함유한 제제의 투여로 치료될 수 있는 종양은 제한되지 않으며 두경부암, 식도암, 위암, 결장암, 직장암, 간암, 담낭암 또는 담관암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 고환종양, 골육종, 연부육종, 자궁경부암, 피부암, 뇌종양 등의 고형 악성종양, 악성 림프종 및 백혈병, 바람직하게는 악성 고형 종양이다.
다음의 실시예 및 시험예로 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
실시예 1. GM-95 물질의 제조
(a) 배양 과정
시험관 (50 ㎖)을 1.0% 가용성 전분, 1.0% 폴리펩톤, 1.0% 당밀 및 1.0% 쇠고기 추출물을 함유한 15 ㎖의 예비 배양 배지(pre-culture medium) (pH 7.2)로 채우고, 멸균 후, 상기 배지를 스트렙토마이세스 아눌라투스 3533-SV4 균주 (FERM BP-6460)의 백금이(loopful)로 접종한다. 그 후, 시험관 중의 접종된 배양을 왕복식진탕기에서 27℃로 2일 동안 진탕배양한다.
그 후, 2.0% 글리세린, 1.0% 당밀, 0.5% 카세인, 0.1% 폴리펩톤 및 0.4% 탄산칼슘을 함유한 생산 배지(production medium) (pH 7.2)를 500 ㎖ 용량의 삼각 플라스크에 플라스크당 100 ㎖로 분배하고, 멸균(121℃, 15 분) 후, 상기 종균배양을 각 플라스크에 2% (v/v)의 비율로 첨가한다. 플라스크 중의 배양을 회전식진탕기에서 27℃로 3일 동안 진탕배양한다(분당 220 회, 진폭 7 cm).
이어서, 50 ℓ용량의 3개의 소형 발효조 (Marubishi Bioengineering Co., Ltd. 제조) 각각에 30,000 ㎖의 생산 배지로 채운다. 상기 소형 발효조에 소포제 (15 ㎖ Disfoam (CC-118, Nippon Oil and Fats Co., Ltd. 제조), 15 ㎖ Shin-Etsu Silicone (KM-68-2F, Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. 제조) 및 15 ㎖ Salad Oil (Ajinomoto Co., Inc. 제조))를 첨가하고, 멸균(120℃, 20 분) 후, 상기 종균 배양을 각 소형 발효조에 2% (v/v)의 비율로 첨가한다. 소형 발효조의 배양을 27℃로 3일 동안 배양한다 (호기성 교반기: 400 rpm (교반), 30 ℓ/분 (통기)).
(b) 분리 과정
상기 절차로 수득한 배양액을 84.0 ℓ의 양으로 채취하고, 원심분리하여 세포 펠릿을 분리한다. 상청액을 제거한 후, 빈번한 교반 하에서 아세톤 (10.0 ℓ)으로 두 시간 추출한다. 추출액을 여과 및 추출로 분리한 후 추가 부피의 아세톤 5.0 ℓ로 분리를 반복한다. 이러한 아세톤 추출물을 조합한 후, 최종 부피 2 ℓ까지 증류 및 농축한다. 아세톤과 물이 완전히 증발될 때까지 감압 하에서 용매를 증류 제거한다. 수득한 유질의 잔여물을 450 ㎖의 메탄올에 용해시키고 여과한 후, 감압 하에서 증발시켜 건조한다.
(c) 단리 및 정제 과정
수득한 유질의 잔여물을 클로로포름과 메탄올 (20:1) (v/v)로 이루어진 혼합 용매 400 ㎖ 에 용해한다. 용액을 실리카 겔 칼럼 (Wakogel C-200 (입자 크기 75∼150 ㎛), 6 cm I.D. ×45 cm)에 적용시키고 상기와 같이 제조한 클로로포름/메탄올 혼합 용매 5 ℓ로 용리한다. 활성 물질을 함유한 분획을 클로로포름/메탄올 용매 (10:1) (v/v)로 용리한다. 활성 물질을 함유한 분획을 수집하고 감압 하에서 증발시켜 건조한다. 조 정제물을 실리카 겔 칼럼 (입자 크기 75∼150 ㎛, 3.6 cm I.D. ×30 cm)에 적용시키고 클로로포름/메탄올/29% 암모니아 수용액 (700:100:1) (v/v/v)의 혼합물로 용리한다.
활성 물질을 함유한 용리액을 수집하고 증발시켜 건조한다. 잔여물을 10 ㎖ 의 상기 이동상에 용해한 후, PEGASIL ODS 칼럼 (Senshu Scientific Co. 제조, 20 mm I.D. ×250 mm)을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피에 적용시킨다 (이동상: 아세토니트릴/트리플루오로아세트산/물 (70:0.1:30, v/v/v), 유속: 10.0 ㎖/분, 254 nm(0.5 mm UV 셀로 검출)). 0.8 ㎖의 추출물이 각 회에 주입된다. GM-95 물질을 함유한 분획을 수집하고 감압 하에서 증발시켜 건조한다.
잔여물을 10% 메탄올/물 중에 부유시킨 후, PEGASIL ODS 칼럼 (Senshu Scientific Co. 제조, 1.0 cm I.D. ×3 cm)에 적용시킨다. 칼럼을 10% 메탄올/물로 세척한 후, 70% 메탄올/물로 용리를 수행한다. 용리액을 감압 하에서 증류 제거하여 3.2 mg의 GM-95 물질을 수득한다.
정제의 각 단계에서의 GM-95 물질을 함유한 분획은 PEGASIL ODS 칼럼 (Senshu Scientific Co. 제조, 4.6 mm I.D. ×250 mm)을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피로 검출한다 (이동상: 아세토니트릴/트리플루오로아세트산/물 (70:0.1:30, v/v/v), 유속: 1.0 ㎖/분).
GM-95 물질의 물리화학적 성질은 다음과 같다.
1) 분자식: 고분별능 고속원자충돌 질량 분석법으로 측정시, 측정된 (M+H)+의 값이 583.0790으로 나타나며, 상기 값에 상응하는 분자식은 C26H15N8O7S 이다.
2) 분자량: 고속원자충돌 질량 분석법으로 측정시, 582.0712의 측정값이 나타난다.
3) 융점: 138∼143℃ (분해)
4) 고유광회전도: C = 0.129 g/100 ㎖(메탄올)의 농도에서 측정, [α]D 20= -9.38°이다.
5) 자외선 흡수 스펙트럼: 도 1에 나타난 바와 같음.
상기 측정은 메탄올(7.39 μM 용액) 중에서 수행하였다. 259.5 nm의 파장에서 최대 흡수가 있으며 상기 파장에서 흡광도는 0.288 이었다. 몰흡광계수 (ε)는 38982 였다.
6) 적외선 흡수 스펙트럼 (FT-IR): 도 2에 나타난 바와 같음.
νmax(cm-1):
7) 용매 중의 용해도
물 및 아세톤에서는 불용성
클로로포름 : 메탄올 = 1:1 의 혼합물에서 가용성
8) 물질의 색: 백황색 분말
9) 핵자기공명 스펙트럼
25℃의 중수소화된 클로로포름 : 중수소화된 메탄올 = 1:1 혼합물의 용액 중에서 측정한 500 MHz1H-NMR 스펙트럼 (도 3) 및 125 MHz13C-NMR 스펙트럼 (도 4)에서의 화학적 이동은 하기와 같다.
(10) 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에서의 머무름 시간 (Rt) :
다음의 조건 하에서 분석하여 6.1 분의 시간에서 피이크가 검출되었다.
분석 조건:
칼럼: PEGASIL ODS (4.6 mm I.D. ×250 mm, Senshu Scientific Co. 제조)
이동상: 아세토니트릴/트리플루오로아세트산/물 (70:0.1:30, v/v/v)
유속: 1 ㎖/분
검출: 254 nm
상기 물리화학적 자료에 따라, GM-95 물질의 구조는 하기로서 동정된다.
[화학식 1]
약리 시험 (항종양 효과)
표 5에 개시된 종양 세포를 10% 송아지 태아 혈청을 함유한 RPMI1640 배지에 부유시키고 각 2 ×103세포의 밀도로 배양 판 (38 mm)에 도말하고, 37℃, 5% CO2의 배양기에서 하룻밤 동안 배양한다. 이어서, 10% 송아지 태아 혈청을 함유한 RPMI1640 배지를 사용하여 다양한 농도로 희석한 실험 물질 (본 발명의 화합물 및 5-플루오로우라실)을 각 판에 첨가하고, 추가로 72 시간 동안 배양한다. 세포 배양이 완결된 후, 이러한 세포를 15분 동안 25% 글루타르알데히드로 고정시키고 물로 3 회 세척한다. 그 후, 세포를 20% 메탄올 수용액 중에 희석된 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 물로 3 회 세척한 후 건조시킨다. 크리스탈 바이올렛을 100 ㎕의 0.05 M 소듐 디히드로겐포스페이트/에탄올 (1/1 (v/v))로 추출하고, 540 nm에서 이의 흡광도를 자동분광기로 측정한다. "IC50" 은 조절 흡광도와 비교하여 성장을 50% 감소하기 위해 필요한 농도로 정의된다. 결과는 다음과 같다.
다양한 종양 세포의 50% 성장저지농도 (IC50μM)
세포 균주(유래) 본 발명의 화합물 5-플루오로우라실
OVCAR-3(인간 난소암)PC-3(인간 전립선암)SKOV-3(인간 난소암)MCF-7(인간 유방암)ZR75-1(인간 유방암)PAN-3(인간 췌장암)KM12C-SM(인간 결장암)A375SM(인간 흑색종)TMK-1(인간 위암)HT-29(인간 결장암)DLD-1(인간 결장암)Renca(쥐 신장암) 3.418.823.737.734.047.093.747.043.757.16.20.97 0.375.77.841.123.638.821.322.890.332.15.50.58
본 발명의 화합물은 다양한 종양 세포의 생체밖 성장을 저지할 수 있었다.
약리 시험 (테로머라아제 저해 효과)
본 발명의 화합물로 통상적인 방식에 따라 테로머라아제를 함유하는 세포 추출물을 사용하여 테로머라아제 저해 활성 시험을 행하여, 세포 추출물 중의 테로머라아제 활성을 50% 까지 저해하는 농도 (IC50)를 얻는다. 본 발명의 화합물은 50 nM의 IC50값을 가지며, 따라서 극히 강한 테로머라아제 저해 활성을 가진다는 것이 증명되었다.
테로머라아제는 정상 세포에서 거의 존재하지 않지만, 다양한 악성 종양 중에 널리 존재한다 (피부, 유방, 폐, 위, 췌장, 난소, 목, 자궁, 신장, 방광, 결장 및 전립선의 부분, 중추신경계 (CNS), 망막 및 혈액세포계에서 기인한 것을 포함하는 모든 악성 종양의 85% 이상에서 발견됨). 본 발명의 화합물은 상기 효소의 활성을 저해하며, 광 범위의 용도를 가진 항종양제로서 유용하다는 것을 나타낸다.
제제예 1. 캡슐제
GM-95 물질 10 mg
락토스 50 mg
옥수수 전분 47 mg
결정 셀룰로스 50 mg
탈크 2 mg
마그네슘 스테아레이트 1 mg
캡슐 당 160 mg
상기 처방에 따라서, 캡슐제를 통상적인 방식으로 제조한다.
제제예 2. 주사제
GM-95 물질 5 mg
주사제용 증류수 적합한 양
앰플 당 5 ㎖
상기 처방에 따라서, 주사제를 통상적인 방식으로 제조한다.
제제예 3. 좌제
GM-95 물질 20 mg
Witepsol W-35 1380 mg
(Dynamit Nobel Co., Ltd.의 상표)
좌제 당 1400 mg
상기 처방에 따라서, 좌제를 통상적인 방식으로 제조한다.
본 발명의 GM-95 물질은 탁월한 항종양 효과를 가지며 악성 종양용 치료약으로 유용하다. 또한, GM-95 물질 생산 미생물은 탁월한 항종양 효과를 가진 GM-95 물질을 생산할 수 있기 때문에 유용하다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 (1)로 표현되는 화합물:
    [화학식 1]
  2. 스트렙토마이세스 속에 속하고, 제 1 항의 화합물을 생산할 수 있는 미생물을 배양 배지 중에서 배양시켜 배양액으로부터 상기 화합물을 단리하는 것을 특징으로 하는 제 1 항에 정의된 화합물의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 미생물이 스트렙토마이세스 아눌라투스 3533-SV4 균주 또는 이의 변이 균주인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2 항에 있어서, 미생물의 수탁 번호가 FERM BP-6460 인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 활성 성분으로서 제 1 항의 화합물을 함유하는 것을 특징으로 하는 항종양제.
  7. 제 1 항의 화합물 유효량 및 제약학적으로 허용가능한 운반체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 종양 치료용 제약학적 조성물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제 1 항의 화합물을 생산할 수 있는, 스트렙토마이세스 아눌라투스 3533-SV4 균주인 미생물.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 12 항에 있어서, 수탁 번호가 FERM BP-6460 인 것을 특징으로 하는 미생물.
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