DE3783218T2

DE3783218T2 - Fermentationsanaloge von virginiamycin-m1.

Info

Publication number: DE3783218T2
Application number: DE8787310022T
Authority: DE
Inventors: Raymond S Chang; Otto D Hensens; Yiu-Kuen T Lam; Cheryl D Schwartz; H Boyd Woodruff; Deborah L Zink
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1986-11-21
Filing date: 1987-11-12
Publication date: 1993-06-03
Anticipated expiration: 2007-11-13
Also published as: EP0269322A1; DE3783218D1; EP0269322B1; CA1279278C

Description

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist ein H¹-kernmagnetisches Resonanz(NMR)spektrum der Verbindung der Formel I.
Figur 2 ist ein H¹-kernmagnetisches Resonanz(NMR)spektrum der Verbindung der Formel II.
Figur 3 ist ein H¹-kernmagnetisches Resonanz(NMR)spektrum der Verbindung der Formel III.
Figur 4 ist ein H¹-kernmagnetisches Resonanz(NMR)spektrum der Verbindung der Formel IV.

Ziele der Erfindung

Es ist folglich ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Virginiamycin M&sub1; und Analoge, die CCK- und Gastrinantagonisten sind, zur Verfügung zu stellen. Ein anderes Ziel ist es, neue Analoge von Virginamycin M&sub1; mit antibiotischer Aktivität zur Verfügung zu stellen. Ein weiteres Ziel ist es, ein Fermentationsverfahren zur Herstellung von Virginamycin M&sub1; und den Analogen der Formeln I, III und IV zu entwickeln. Ein weiteres Ziel ist es, ein chemisches Verfahren zur Synthese von Verbindungen der Formeln I, II und III zu liefern. Noch ein Ziel ist es, pharmazeutische Mittel, enthaltend Virginamycin M&sub1; und derartige Analoge, zu liefern. Ein weiteres Ziel ist es, Verfahren zur Behandlung zu entwickeln, umfassend die Verabreichung von Virginamycin M&sub1; und solchen Analogen und Mitteln, wenn ein antibiotisches, analgetisches Antiulcus-, Antitumor- oder ein therapeutisches Mittel für Störungen des Magen-Darm-Trakts, des zentralen Nervensystems und des appetitregulierenden Systems angezeigt ist. Diese und andere Ziele der vorliegenden Erfindung gehen aus der folgenden Beschreibung hervor.

Zusammenfassung der Erfindung

Virginiamycin M&sub1; der Formel:
und Virginiamycin M&sub1;-Analoge der Formeln I bis IV:
Virginiamycin M&sub1; und die Analogen I bis IV sind Antagonisten von Cholecystokinin (CCK) und Gastrin. Cholecystokininantagonisten sind geeignet als Analgetika und zur Behandlung und Verhinderung von Störungen des Magen-Darm-Systems, des zentralen Nervensystems und des appetitregulierenden Systems bei Tieren, besonders Menschen. Gastrinantagonisten sind geeignet zur Blokkierung der Rezeptoren für Gastrin beim Menschen und können als Mittel zur Behandlung von Ulcus, Tumoren und anderen Magen-Darm- Störungen dienen. Die Verbindungen der Formeln I bis IV sind auch Antibiotika und sind geeignet als antimikrobielle Mittel bei Tieren einschließlich Menschen und sind geeignet als Nahrungsmittelzusätze, um die Futterverwertung bei Tieren zu verbessern.

Hintergrund der Erfindung

Cholecystokinin (CCK) und Gastrin (G) sind Regulationspeptide, die sich im Gastrointestinal (Magen-Darm) -Gewebe und im zentralen Nervensystem finden, Mutt. Gastrointestinal Hormones, Glass, Hrsg. Raven Press, N.Y., S. 169 (1980). Die CCK-Peptide liegen, wie berichtet wird, zusammen mit Dopamin in bestimmten Mittelhirnneuronen vor und können somit eine Rolle beim Funktionieren des dopaminergen Systems im Hirn spielen sowie als Neurotransmitter dienen, Prange et al., Ann. Repts. Med. Chem. 17: 31 (1982). Gastrointestinales CCK und Gastrin können auf die Rand- und Hauptzellen der Fundusdrüsen der Magenschleimhaut von Säugetieren einwirken, um die Säure-und Pepsinogensekretion zu stimulieren, Chew und Hersey, Am. J. Physiol. 242: G504 (1982). Es wird auch angenommen, daß Cholecystokinine physiologische Sättigungshormone sind und damit eine Rolle bei der Appetitregulation spielen, Smith, Eating and Its Disorders, Stunkard und Steller, Hrsg., Raven Press, N.Y., S. 67 (1984). Zusätzliche Wirkungen von CCKs umfassen die Stimulierung der Colonmobilität, Gallenblasenkonzentration, Enzymsekretion in der Bauchspeiseldrüse und Hemmung der Magenleerung.
Intestinales CCK liegt in Formen mit 39 und 33 Aminosäuren vor, wobei die C-terminalen 33-Aminosäurereste identisch sind. Die biologische Aktivität ist beschränkt auf das C-terminale Heptapeptid des nativen Peptids und ein C-terminales Octapeptid besitzt die gleiche Wirksamkeit wie CCK-33, ist jedoch etwa zehnmal wirksamer, Jensen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2079 (1980).
Gastrin kommt auch natürlich in mehreren unterschiedlichen Formen vor: 34 Aminosäuren, 17 Aminosäuren und 13 Aminosäuren, wobei das Tyrosin entweder sulfatiert oder nicht sulfatiert ist. Die 17- und 13-Aminosäureformen können als C-terminale Fragmente der 34-Aminosäureformen angesehen werden. Die unterschiedlichen Formen zeigen unterschiedliche Wirksamkeit bei der Stimulierung der Magensäuresekretion. Gastrin-17 ist fünfmal wirksamer als Gastrin-34 und 2,5-mal wirksamer als Gastrin-13, Walsh und Grossman, New Engl. J. Med. 292:1324 (1975). Gastrin und CCK haben eine gemeinsame C-terminale Pentapeptidamidsequenz, Gly-Trp-Met- Asp-Phe-NH&sub2;.
Gastrin- und CCK-Antagonisten sind geeignet zur Behandlung von Erkrahkungen, die durch Gastrin und CCK vermittelt werden. CCK- Antagonisten sind geeignet zur Verhinderung oder Behandlung von mit CCK zusammenhängenden Störungen des Gastrointestinaltrakts, des zentralen Nervensystems und des appetitregulierenden Systems von Tieren, besonders Menschen. Antagonisten von CCK sind auch geeignet zur Verstärkung und Verlängerung der durch Opiate hervorgerufenen Analgesie und besitzen so eine Nützlichkeit zur Behandlung von Schmerzen, Faris et al., Science 226: 1215 (1984). Gastrinantagonisten sind geeignet zur Behandlung und Verhinderung von gastrinabhängigen Störungen des Gastrointestinalsystems bei Menschen und Tieren, wie Ulcus, Zollinger-Ellison-Sydrom, Antral-G-Zellhyperplasie und anderen Zuständen, bei denen eine verringerte Gastrinaktivität von therapeutischem Wert ist. CCK und Gastrin besitzen auch trophische Wirkungen auf bestimmte Tumoren, Ohyama, Hokkaido J. Med. Sci., 60: 206 (1985), und Antagonisten von CCK und Gastrin sind geeignet zur Behandlung dieser Tumore.
Antibiotika der Virginiamycin-Gruppe wurden verwendet als Futterzusätze, um das Wachstum von Geflügel, Schweinen und Rindern zu verbessern. Obwohl die Wachstumsbeschleunigung durch Antibiotika nicht genau zu erklären ist, besteht nur wenig Zweifel daran, daß die Wirkung zum Teil auf einer Hemmung der Intestinalflora beruht, Coccito, Micro. Ref. 43: 145 (1979). Virginiamycin M&sub1; und verwandte Antibiotika sind allgemein spezifisch für grampositive Bakterien und verhindern die Zellvermehrung. Die Virginiamycin-Antibiotika sind am wirksamsten, wenn sie in ihrer komplexen Form vorliegen, das heißt, wenn sie sowohl aus M- als auch aus S-Komponenten bestehen, Coccito, Micro. Rev. 43: 145 (1979). Die verbreitete Anwendung dieser Antibiotika als Wachstumsbeschleuniger beruht auf ihrer geringen Toxizität,der Tatsache, daß sie sich nicht im tierischen Gewebe ansammeln, keine resistenten Mutanten bilden und in den Ausscheidungen der Tiere schnell abgebaut werden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Virginiamycin M&sub1; und die Verbindungen der Formeln I, II und IV werden hergestellt durch kontrollierte aerobe Fermentation eines Stammes von Streptomyces olivaceus. Es ist verständlich, daß bezüglich der Fermentationsbildung von Virginiamycin M&sub1; und den Verbindungen der Formeln I, III und IV die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung dieser speziellen Spezies oder des Stammes von Streptomyces beschränkt ist. Es ist besonders erwünscht und vorgesehen, daß hier innerhalb des Rahmens der Erfindung eingeschlossen sind die Verwendung von anderen natürlichen oder künstlichen Mutanten, die gebildet worden sind oder abgeleitet sind von den beschriebenen Kulturen oder anderen Varianten oder Spezies der Art Streptomyces, soweit sie Virginiamycin M&sub1; und die Verbindungen der Formeln I, III und IV oder etwaige verwandte Analoge bilden können. Die künstliche Herstellung von mutanten Arten oder Stämmen dieses Stammes von Streptomyces kann erreicht werden durch übliche physikalische oder chemische Mutagene, zum Beispiel Ultraviolettbestrahlung der beschriebenen Kulturen oder Nitrosoguanidinbehandlung und ähnliches. Jüngere DNA-Rekombinationsverfahren, wie Plasmideinbau in Bakterien, Pilze u.ä. können sich als nützlich erweisen.
Virginiamycin M&sub1; und die Verbindungen der Formeln I, III und IV werden gebildet durch kontrollierte aerobe Fermentation einer Spezies von Streptomyces, die hinterlegt worden ist bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA, am 29. Juli 1986, entsprechend dem "Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure" und die Hinterlegungsnummer ATCC 53527 hat.
Die Streptomycesspezies wurde isoliert aus Boden zusammen mit Baumwurzeln in Pimpri, Indien, und besitzt die morphologischen und Züchtungseigenschaften, die in der folgenden Tabelle angegeben sind:

TABELLE I

Morphologie: Sporophoren aus sehr lockeren Spiralen, Ketten enthalten mehr als 15 Sporen in der Länge, Sporen sind sphärisch bis oval und etwa 0,9 um bis 0,9 x 1,2 um groß.

Kultureigenschaften:

Hefeextrakt/Malzextrakt-Agar (ISP Medium 2) V: Rückseite graubraun mit grauem Rand.
A. Hellgrau vermischt mit Weiß und am Rand dunkelgrau
SP: keine
Hafermehl-Agar (ISP Medium 3) V: Rückseite hellgrau-lohfarben mit grauem Rand.
A: Hellgrau vermischt mit Weiß, am Rand dunkelgrau
SP: keine

TABELLE 1 (Fortsetzung)

Anorganische Salze/Stärke-Agar (ISP Medium 4) V: Rückseite grau-lohfarben, am Rand grau
A: Hellgrau vermischt mit Weiß, am Rand dunkelgrau
SP: keine
Glycerin-Asparagin-Agar (ISP Medium 5) V: Rückseite lohfarben mit grauem Rand
A: Hellgrau vermischt mit Weiß, am Rand hellgrau
SP: keine
Pepton-Eisen-Hefeextrakt-Agar (ISP Medium 6) V: Rückseite lohfarben
A: Blaßgrau vermischt mit Weiß und am Rand mit mittelgrau
SP: keine
Melanin: keines
Tyrosin-Agar (ISP Medium 7) V: Rückseite lohfarben mit braunem Rand
A: gemischtes Grau-Weiß und Grau mit dunkelgrauem Rand
SP: leicht bräunlich vom Medium
Czapek-Dox-Agar V: Rückseite grau-lohfarben
A: Hellgrau vermischt mit Weiß
SP: leicht bräunlich vom Medium
V = vegetatives Wachstum; A = Luftmycel;
Sp = lösliches Pigment.
Farbbezeichnungen sind entnommen aus Color Harmony Manual, 1958, 4. Aufl., Container Corporation of America, Chicago, Illinois.
Die Kohlenstoffausnutzung von ATCC 53527 wurde bestimmt unter Anwendung eines Pridham-Gottlieb-Grundmediums (ISP Medium 9), ergänzt mit 1 % Kohlenstoffquellen, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht:

TABELLE II

Glucose + Mannitol +
Arabinose + Mannose +
Cellulose - Raffinose ±
Fructose + Rhamnose +
Inositol + Saccharose +
Lactose + Xylose +
Maltose +
[+ = Wachstum; ± = Wachstum gering oder fraglich; - = kein Wachstum, verglichen mit einer negativen Kontrolle (keine Kohlenstoffquelle)]
Der Temperaturwachstumsbereich und das Sauerstofferfordernis wurden bestimmt unter Verwendung von Hefeextraktdextrose + Salzagar. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben:

TABELLE III

Temperaturbereich (Hefeextrakt-Dextrose + Salzagar)
28ºC = gutes vegetatives Wachstum und Sporenbildung
37ºC = gutes vegetatives Wachstum und Sporenbildung
42ºC = kein Wachstum
50ºC = kein Wachstum
Sauerstoffbedarf (Stichkultur in Hefeextrakt-Dextrose + Salzagar)
aerob
Alle Werte wurden nach 3 Wochen bei 28ºC gemessen, soweit nicht anders angegeben. Der pH-Wert aller Medien war nahezu neutral (6,8 bis 7,2).
Die Kultureigenschaften dieses Organismus wurden verglichen mit den Beschreibungen von Streptomyces-Spezies, wie sie beschrieben sind in Berger's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl., 1974, Williams & Wilkens, Baltimore, MD, und die Streptomyces-Spezies ist vermutlich identisch mit einem Stamm von Streptomyces olivaceus.
Die Fermentation wird bei einem Temperaturbereich von etwa 20ºC bis etwa 37ºC durchgeführt, wobei 28ºC bevorzugt sind. Allgemein kann die Zusammensetzung des assimilierbaren Nährmediums in einem weiten Bereich variieren. Die wesentlichen Nährstoffbestandteile sind eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle. Andere wesentliche Nährstoffe werden durch Mineralsalze, wie Chloride, Nitrate, Sulfate, Carbonate und Phosphate von Natrium, Kalium, Ammonium und Calcium zur Verfügung gestellt. Das Nährmedium kann auch Quellen für anorganische Spurenelemente, wie Magnesium, Eisen, Kupfer, Mangan, Zink, Cobalt u.ä. enthalten.
Typische Quellen für Kohlenstoff umfassen Zucker, Öle, organische Säuren, Dextrin, Stärkearten, Glycerin und ähnliches. Typische Stickstoffquellen umfassen Aminosäuren, pflanzliche Mehle und Extrakte (zum Beispiel Malz, Soja, Baumwollsamen, Feigen, Tomaten, Mais usw.), Tiereingeweide, verschiedene Hydrolysate (zum Beispiel Casein, Hefe, usw.) und industrielle Nebenprodukte, wie Fettwasser und Brennereirückstände.
Die maximale Ausbeute an Virginiamycin M&sub1; und den Verbindungen der Formeln I, III und IV wird innerhalb von etwa 24 bis etwa 96 Stunden, üblicherweise von etwa 48 bis etwa 72 Stunden, Fermentation unter optimalen Bedingungen erzielt. Das Inokulum für die Fermentation wird geliefert von einem vegetativen Wachstum in einem Medium, das ein schnelles Wachstum des Mikroorganismus unterstützt oder durch direktes Beimpfen mit gefrorener Biomasse.
Die Ausdrücke "Saat-" und "Bildungs-" bzw. "produktions"-Medium werden als übliche Ausdrücke angewandt. Allgemein unterstützt ein Saatmedium das rasche Wachstum des Mikroorganismus und ein Anteil (Saat) dieses Mediums wird angewandt, um ein Produktionsmedium für eine Fermentation im großen Maßstab zu beimpfen.
Nach der Fermentation werden das angesammelte Virginiamycin M&sub1; und die Verbindungen der Formeln I, III und IV aus der Kulturbrühe durch übliche chromatographische Maßnahmen gewonnen. Die einzelnen Verbindungen werden durch Phasenumkehr-Hochleistungschromatographie getrennt.
Virginiamycin M&sub1; und Verbindungen der Formeln I, III und IV werden aus der gesamten Fermentationsbrühe isoliert durch Zugabe eines nahezu gleichen Volumens eines mäßig polaren, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels. Derartige Lösungsmittel umfassen Chloroform, Ethylacetat, Methylethylketon und ähnliches, wobei Methylethylketon bevorzugt ist. Die Schichten können sich absetzen und die organische Schicht wird gesammelt. Die organische Schicht enthält Virginiamycin M&sub1; und die Verbindungen der Formeln I, III und IV.
Die Isolierung der verschiedenen Verbindungen aus der Fermentationsbrühe beruht auf der spezifischen biologischen Aktivität. Die aus der chemischen Umwandlung von Virginiamycin M&sub1; zur Verbindung III und anschließend zu den Verbindungen I und II entstehenden Produkte werden ebenfalls auf ihre biologische Aktivität untersucht. Die biologischen Untersuchungen umfassen die Bindung von Gastrin an die Magendrüsen von Säugetieren, vorzugsweise Meerschweinchen, und die Bindung von CCK an das Hirn von Säugetieren, vorzugsweise Meerschweinchen, oder die Bauchspeicheldrüse von Säugetieren, vorzugsweise Ratten.
Die von der Kulturbrühe isolierte aktive organische Schicht wurde unter vermindertem Druck, einer Temperatur von etwa 30ºC bis etwa 50ºC, wobei 40ºC bevorzugt sind, schnell verdampft und zwischen einem gesättigten Kohlenwasserstoff, wie Hexan, und einem Alkohol, wie Methanol, aufgetrennt. Die Methanolschicht wurde bei etwa 30ºC bis etwa 50ºC, wobei 40ºC bevorzugt sind, unter Druck schnell verdampft und über Silicagel unter Verwendung einer mobilen Phase aus etwa 50 % bis etwa 75 % Aceton in Hexan chromatographiert. Die aktive Fraktion wurde durch Phasenumkehr-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt.
Virginiamycin M&sub1; wird in die Verbindung der Formel III umgewandelt durch Zugabe von etwa 1 Moläquivalent Methansulfonylchlorid zu einer wasserfreien Pyridinlösung von Virginiamycin M&sub1;. Die Mesylierungsreaktion kann etwa 20 Minuten bei etwa 25ºC ablaufen und das Pyridin wird durch Schnellverdampfen entfernt. Der Rückstand wird aufgeteilt zwischen etwa 1 %iger wäßriger NaCl- Lösung und Dichlormethan. Die organische Schicht wird dann getrocknet und durch Phasenumkehr-HPLC chromatographiert. Die Verbindung der Formel III wird zu den Verbindungen der Formeln II und I reduziert mit Natriumborhydrid. Zu einer methanolischen Lösung der Verbindung der Formel III wird ein leichter Uberschuß von 1 Moläquivalent einer NaBH&sub4;/Methanol-Lösung mit etwa 10 mg/ml zugegeben. Die Reinigung ist ähnlich derjenigen für die Fermentationsprodukte.
Die biologische Aktivität von Virginiamycin M&sub1; und den Verbindungen der Formeln I, II, III und IV wurde bestimmt durch Gastrinrezeptorbindung, Pancreas-CCK-Rezeptorbindung, Hirn-CCK- Bindung und die Hemmung von mikrobiologischem Wachstum.
Virginiamycin M&sub1; und die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV können an Säugetiere einschließlich Menschen, entweder allein oder vorzugsweise in Kombination mit pharmazeutisch annehmbaren Trägern oder Verdünnungsmitteln,in einem pharmazeutischen Mittel nach pharmakologischer Standardpraxis verabreicht werden. Die Verbindungen können oral oder parenteral verabreicht werden. Die parenterale Verabreichung umfaßt die intravenöse, intramuskuläre, intraperetoneale, subkutane und topische Verabreichung.
Bei der oralen Verwendung als CCK- oder Gastrin-Antagonisten oder als Antibiotika kann die ausgewählte Verbindung zum Beispiel in Form von Tabletten oder Kapseln oder als wäßrige Lösung oder Suspension verabreicht werden. Im Falle von Tabletten zur oralen Verabreichung werden häufig Träger, wie sie üblicherweise angewandt werden und die Lactose und Maisstärke umfassen, und Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, zugesetzt. Zur oralen Verabreichung in Form von Kapseln sind geeignete Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke. Wenn wäßrige Suspensionen zur oralen Verabreichung erforderlich sind, wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln zusammengebracht. Zur oralen Verwendung als Antibiotika bei Haustieren werden die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV zu dem Tierfutter zugesetzt. Wenn dies erwünscht ist, können bestimmte Süß- und/oder Geschmacksstoffe zugesetzt werden. Zur intramuskulären, intraperitonealen, subkutanen und intravenösen Verwendung werden üblicherweise sterile Lösungen des Wirkstoffs hergestellt und der pH-Wert der Lösung sollte auf einen geeigneten Wert eingestellt und abgepuffert werden. Zur intravenösen Anwendung sollte die Gesamtkonzentration an gelösten Stoffen so eingestellt werden, daß sie die Zubereitung isotonisch macht.
Wenn Virginiamycin M&sub1; und die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV als CCK- oder Gastrin-Antagonisten oder als Antibiotika beim Menschen verwendet werden, wird die tägliche Dosis üblicherweise bestimmt durch den verschreibenden Arzt. Darüberhinaus variiert die Dosis entsprechend dem Alter, Gewicht und dem Ansprechen des einzelnen Patienten sowie der Schwere der Symptome des Patienten. In den meisten Fällen liegt eine wirksame tägliche Dosis jedoch im Bereich von etwa 1 mg bis etwa 1500 mg und vorzugsweise 10 mg bis 500 mg in einer einzigen oder einzelnen aufgeteilten Dosis. Andererseits kann es in einigen Fällen notwendig sein, Dosen außerhalb dieser Grenzen anzuwenden.
Wenn die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV als orale Antibiotika für Haustiere verwendet werden, wird die tägliche Dosis entsprechend dem Alter, Gewicht und der Art des zu behandelnden Tieres gewählt. Die wirksame Dosis liegt im Bereich von etwa 5 bis 200 ppm pro Volumen Nahrung.
Virginiamycin M&sub1; und die Verbindungen der Formeln I, II, III und IV werden sowohl an CCK- als auch Gastrinrezeptoren gebunden. So können Virginiamycin M&sub1; und die vier Analogen eine einzigartige Wirkung in der Appetitregulierung, der Behandlung von CCK-abhängigen Störungen des Gastrointestinaltrakts und des zentralen Nervensystems ausüben. Die einzigartige Wirkung von Virginiamycin M&sub1; und den vier Analogen als Gastrin-Antagonisten erlaubt ihre Verwendung zur Behandlung und Verhinderung von gastrinabhängigen Störungen, wie Ulcus, Zollinger-Ellison-Syndrom und Antral-G-Zellenhyperplasie. Die vier Analogen wirken auch als antibiotische Mittel und können zur Behandlung mikrobieller Infektionen verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie jedoch in irgendeiner Weise einzuschränken.

Beispiel 1

Fermentation

Eine lyophilisierte Probe des Streptomyces-Stammes ATCC Nr. 53527 wurde unter aseptischen Bedingungen zu 54 ml eines Saatmediums in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben mit Einsätzen gegeben. Das Saatmedium enthielt die folgenden Bestandteile: Dextrose 1 g/l; lösliche Stärke 10 g/l; Rinderextrakt 3 g/l; Ardamin pH 5 g/l; NZ-Amin 5 g/l; MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,08 g/l; Phosphatpuffer 2 ml/l und CaCO&sub3; 0,5 g/l. Der pH-Wert des Mediums lag zwischen 7,0 und 7,2. Der Kolben wurde 48 Stunden bei 28ºC in einem Rotationsschüttler mit 220 Upm gehalten. 10 ml der 48 Stunden-Kultur wurden aseptisch in 500 ml in einen 2 l-Kolben mit Einsätzen überführt und 24 Stunden bei 28ºC in einem Rotationsschüttler mit 220 Upm inkubiert. 500 ml Inokulum von der zweiten Saatkultur wurden zu 10 l Produktionsmedium in einen 14 l-Fermentor gegeben. Das Produktionsmedium enthielt Maisglutenmehl 5 g/l; Primaton HS 2,5 g/l; Hefeextrakt (Difco) 1,0 g/l; Malzextrakt 10,0 g/l, Saccharose 5,0 g/l; CaCO&sub3; 5,0 g/l und P-2000 2,0 ml. Der pH-Wert des Produktionsmediums lag zwischen 7,2 und 7,4. Das beimpfte Produktionsmedium wurde 64 Stunden bei 28ºC inkubiert und mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 3 l/min belüftet und mit 400 Upm gerührt.

Beispiel 2

Isolierung und Charakterisierung von Virginiamycin M&sub1; und Verbindungen der Formeln I, III und IV

40 l komplette Kulturbrühe aus Beispiel 1 wurden mit 48 l Methylethylketon extrahiert. Die organische Schicht enthielt die biologische Aktivität und wurde unter vermindertem Druck bei 40ºC schnell verdampft und ergab einen Rückstand. Der Rückstand wurde aufgeteilt zwischen 1 l Hexan und 1 l Methanol, wobei die Hexanschicht verworfen wurde. Die aktive Methanolschicht wurde unter vermindertem Druck bei 40ºC schnell verdampft und ergab eine Probe von 50 g Trockengewicht. Die Schnellchromatographie dieses Materials in 5 Durchgängen über 500 g Silicagel 60 (4 um) unter Verwendung von 50 % Aceton/Hexan und anschließend 75 % Aceton/Hexan als mobile Phase, ergab aktive Fraktionen mit einem Gesamttrockengewicht von 3 g. Die anschließende präparative Phasenumkehr-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie dieses Materials in drei Durchgängen über eine Zorbax C-8 2,12 x 25 cm-Säule unter Verwendung von 40 % Acetonitril/Wasser als isokratische mobile Phase bei Raumtemperatur und 15 ml/min ergab 92 mg Virginiamycin M&sub1;, 5,2 mg Verbindung der Formel I, 16,4 mg der Verbindung der Formel III und 25,9 mg der Verbindung der Formel IV.
Die physikalisch-chemische Charakterisierung des bei der Fermentation isolierten Virginiamycins M&sub1; wurde durchgeführt durch Vergleich mit EI-MS und ¹H-NMR-Daten (M&spplus; = 525) aus der Literatur, Kingston et al., J. Chem. Soc., 19: 1669 (1966), und mit einer authentischen Probe, die erhalten worden war durch Reinigen eines handelsüblichen Virginiamycins. Die anschließende biologisch/biochemische Untersuchung von Virginiamycin M&sub1; wurde an dieser authentischen Probe durchgeführt. Beide Proben zeigten identische HPLC-Retentionszeiten und UV-Spektren (λmax = 210,5 nm; E% = 535). Ein 300 MHz H¹-H¹-homonukleares Korrelations-NMR-Spektrum wurde aufgezeichnet für die erste Charakterisierung.
Daten der Massenspektroskopie mit hoher Auflösung der Verbindung der Formel I ergaben eine molekulare Formel von C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub5;N&sub3;O&sub6; (berechnet: 509,2526; gefunden: 509,2528). Sein 300 MHz H¹-NMR-Spektrum, siehe Figur 1, in CD&sub2;Cl&sub2; bestätigte ferner die Reinheit und Identität zur Verbindung. Entkuppeltes Breitband C¹³-NMR- Spektrum in CD&sub2;Cl&sub2; zeigte Resonanzen bei 12,11; 18,82; 19,77; 20,34; 29,91; 30,13; 36,77; 38,87; 42,26; 51,08; 70,93; 82,46; 123,77; 123,85; 125,78; 126,46; 127,11; 127,72; 129,20; 132,85; 132,93; 135,20; 137,13; 143,29; 143,58; 161,37; 161,86; 167,13 ppm. Sein UV-Spektrum in Methanol zeigte Absorptionsmaxima bei 212 nm (E% = 557) und 274,5 nm (E% = 764). Sein Infrarotspektrum in CH&sub2;Cl&sub2;-Lösung zeigte Absorptionsbanden bei 3595, 3375, 1730, 1670 und 1620 cm&supmin;¹. Die natürliche und halbsynthetische Verbindung, Beispiel 4, zeigte identische Massen,- H¹-NMR- und UV-Spektren und HPLC-Retentionszeiten und erlaubten die Zuordnung der folgenden Struktur:
Daten von hoch auflösenden Massenspektren für die Verbindung der Formel III bestätigten eine Molekularformel C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub3;N&sub3;O&sub6; (berechnet: 507,2369; gefunden: 507,2369). Das 300 MHz H¹-NMR-Spektrum, siehe Figur 3, in CD&sub2;Cl&sub2; bestätigte ferner die Reinheit und Identität dieses Produkts. Sein entkuppeltes Breitband C¹³- NMR-Spektrum in CD&sub2;Cl&sub2; zeigte Resonanzen bei 12,19; 18,78; 1960; 21,37; 30,10; 30,22; 37,60; 40,65; 42,04; 52,33; 81,18; 125,38; 126,56; 126,79; 127,25; 129,46; 131,85; 136,98; 142,91; 143,20; 143,32; 146,19; 160,28; 160,54; 167,12 und 192,78 ppm. Sein UV- Spektrum in Methanol zeigte Absorptionsmaxima 212 nm (E% = 545,5) und 325 nm (E% = 417). Sein IR-Spektrum in CH&sub2;Cl&sub2;-Lösung zeigte Absorptionsbanden bei 3380, 1730, 1662 und 1625 cm&supmin;¹. Die natürliche und halbsynthetische Verbindung des Beispiels 3 zeigte identische Massen-, H¹-NMR- und UV-Spektren sowie HPLC-Retentionszeiten und erlaubte die Zuordnung der folgenden Struktur:
Die Daten des hoch auflösenden Massenspektrums für die Verbindung der Formel IV an dem Bis-trimethylsilylderivat zeigte eine Molekularformel von C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub5;N&sub3;O&sub6; + T&sub2; (berechnet: 653,3316; gefunden: 653,3452). Sein 300 MHz H¹-NMR-Spektrum, siehe Figur 4, in CD&sub2;Cl&sub2; bestätigte ferner die Reinheit und Identität dieses Produktes. Sein UV-Spektrum in Methanol ist nahezu identisch mit demjenigen von Virginiamycin M&sub1; und zeigt ein Absorptionsmaximum bei 213 nm (E% = 542) und erlaubt die Zuordnung der folgenden Struktur:

Beispiel 3

Synthese der Verbindung der Formel III

Virginiamycin M&sub1; nach Beispiel 2, oder im Handel erhältlich, wurde in die Verbindung der Formel III umgewandelt durch Zugabe von Methansulfonylchlorid,0,2 ml zu 199,36 mg Virginiamycin M&sub1; in wasserfreier Pyridinlösung,5 ml. Die Mesylierungsreaktion konnte 20 Minuten bei Raumtemperatur ablaufen. Beim Schnellverdampfen des Lösungsmittels Pyridin unter vermindertem Druck und bei 40ºC erhielt man einen Rückstand. Beim Aufteilen dieses Rückstandes zwischen 1 %iger wäßriger NaCl-Lösung, 20 ml und Dichlormethan (2 x 25 ml) und anschließendes Trocknen der organischen Schichten mit wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; und Schnellentfernung des Lösungsmittels unter vermindertem Druck bei 40ºC erhielt man 245 mg eines rohes Produkts. Die analytische Hochleistungsflüssigkeitschromatographie dieses Produkts zeigte das Vorhandensein der Verbindung III als überwiegendes Produkt und die Abwesenheit von Virginiamycin M&sub1;. Die präparative Phasenumkehr-Chromatographie des rohen Produkts über eine Zorbax-ODS-Säule mit 40 %igem wäßrigem MeCN als mobile Phase mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/min ergab 88,15 mg der reinen Verbindung III.

Beispiel 4

Synthese der Verbindungen der Formeln I und II

Die Verbindung III wurde in Verbindungen der Formeln I und II umgewandelt. Zu einer methanolischen Lösung, 10 ml der Verbindung III nach Beispiel 1 oder Beispiel 3 wurden 0,5 ml einer 10 mg/ml NaBH&sub4;/MeOH-Lösung zugegeben. Die Analyse des Reaktionsgemisches durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie zeigte, daß die Reaktion sofort stattfand und die Produkte Verbindung I und ihr Epimer Verbindung II waren. Das Reaktionsgemisch wurde dann aufgearbeitet. Die Zugabe von Aceton, 1 ml, zum Reaktionsgemisch zerstörte etwaiges überschüssiges Reagens. Aufteilen des Gemisches zwischen 1 %iger wäßriger NaCl-Lösung, 50 ml, und CH&sub2;Cl&sub2;, 2 x 50 ml, und anschließendes Trocknen der organischen Schichten mit wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; und Schnellverdampfen unter vermindertem Druck bei 30ºC ergab 54,8 mg Material. Die Reinigung dieses Materials auf einer präparativen Sorbax-ODS- Säule, 2,12 x 25 cm, mit 35 %igem wäßrigem MeCN als isokratische mobile Phase bei 15 ml/min und Raumtemperatur ergab 27,69 mg Verbindung I und 15,7 mg des Epimers der Verbindung der Formel II.
Die physikalisch-chemische Charakterisierung der Verbindung der Formel I ist in Beispiel 2 angegeben.
Die Daten von hoch auflösenden Massenspektren der Verbindung der Formel II zeigten eine Molekularformel C&sub2;&sub8;H&sub3;&sub5;N&sub3;O&sub6; (berechnet: 509,2526; gefunden: 509,2528). Das 300 MHz H¹-NMR-Spektrum, siehe Figur 2, in CD&sub2;Cl&sub2; bestätigte ferner die Reinheit und Identität dieser Verbindung. Das entkuppelte Breitband C¹³-NMR-Spektrum in CD&sub2;Cl&sub2; zeigte Resonanzen bei 12,03; 18,83; 19,67; 20,47; 30,07; 35,95; 39,10; 42,06; 51,04; 69,88; 81,75; 124,39; 124,47; 125,52; 126,98; 127,51; 127,57; 129,60; 129,62; 132,61; 135,19; 137,19; 143,22; 143,50; 161,23; 161,90 und 167,04 ppm. Das UV- Spektrum in Methanol zeigte Absorptionsmaxima bei 212 nm (E% = 522) und 274,5 nm (E% = 701). Das IR-Spektrum in CH&sub2;Cl&sub2;-Lösung zeigte Absorptionsbanden bei 3600, 3375, 1730, 1670 und 1625 cm&supmin;¹. Diese Charakteristika erlauben die Zuordnung der folgenden Struktur.

Beispiel 5

Gastrinrezeptorbindung in den Magendrüsen von Meerschweinchen

Drüsen der Magenschleimhaut von Meerschweinchen wurden nach dem Verfahren von Praissman et al., J. Receptor Res. 3:647 (1983) präpariert. Mägen von männlichen Hartley-Meerschweinchen (250- 400 g Körpergewicht) wurden gründlich gewaschen und mit feinen Scheren zerkleinert in HEPES-Puffer, bestehend aus 130 mMol NaCl, 12 mMol NaHCO&sub3;, 3 mMol NaH&sub2;PO&sub4;, 3 mMol Na&sub2;HPO&sub4;, 3 mMol K&sub2;HPO&sub4;, 2 mMol MgSO&sub4;, 1 mMol CaCl&sub2;, 5 mMol Glucose und 4 mMol L-Glutamin, 25 mMol HEPES bei 7,4. Das zerkleinerte Gewebe wurde gewaschen und 40 Minuten in einem Schüttelbad von 37ºC inkubiert, mit HEPES- Puffer, enthaltend 0,1 % Collagenase und 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA), und 95 % O&sub2; und 5 % CO&sub2;, durchgeblasen. Das Gewebe wurde zweimal durch eine 5 ml-Glasspritze geleitet, um die Magendrüsen freizusetzen, und dann durch 200 mesh Nylon filtriert. Die filtrierten Drüsen wurden mit 270 g 5 Minuten zentrifugiert und zweimal durch erneutes Suspendieren und Zentrifugieren gewaschen.
Die gewaschenen Magendrüsen von Meerschweinchen wurden wieder in 25 ml HEPES-Puffer, enthaltend 0,25 mg/ml Bacitracin, suspendiert. Für Bindungsuntersuchungen wurden 14,2 ul 50 % MeOH/H&sub2;O (für die Gesamtbindung) oder Gastrin (1 uMol Endkonzentration für nicht spezifische Bindung) oder (Fermentations)brühe oder Testverbindung aus den Beispielen 2, 3 oder 4 und 20 ul ¹²&sup5;I-Gastrin (New England Nuclear [NEN], 20 000 cpm 20 ul) zu 220 ul Magendrüsen in Dreifachröhrchen gegeben, wo sie mit 95 % O&sub2; und 5 % CO&sub2; belüftet und mit Kappen verschlossen wurden. Die Reaktionsgemische wurden nach 30 Minuten langer Inkubation bei 25ºC in einem Schüttelwasserbad unter vermindertem Druck durch Glas- GF/B-Filter (Whatman) filtriert und sofort mit 3 x 4 ml HEPES- Puffer, enthaltend 0,1 % BSA Fraktion V, gewaschen. Die Radioaktivität der Filter wurde mit Hilfe eines Beckman 5500 Gamma- Zählers für ¹²&sup5;I-Gastrin gemessen.
Die Ergebnisse der Gastrin-Bindungsuntersuchung sind in der folgenden Tabelle angegeben: TABELLE IV Gastrin-Rezeptor-Bindung Verbindung Virginiamycin M&sub1;

Beispiel 6

Pancreascholecystokinin-Rezeptorbindungsuntersuchung

Radioaktiv markiertes CCK-8 wurde von New England Nuclear als ¹²&sup5;I-CCK-8 gekauft. Die Rezeptorbindung wurde durchgeführt nach Innis und Snyder, Proc. Natl. Acad. Sci., 77: 6917 (1980) mit der kleinen Modifizierung, daß die zusätzlichen Proteaseinhibitoren Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und o-Phenanthrolin zugegeben wurden, die keine Einwirkung auf die ¹²&sup5;I-CCK-Rezeptorbindungsuntersuchung hatten. Alle Untersuchungen wurden dreifach durchgeführt. Pancreasrezeptormembranen wurden präpariert durch Homogenisieren von 1 g frischem Rattenpancreasgewebe in 30 ml TRIS-HCl (50 mMol), pH 7,7, unter Anwendung eines Brinkman-Polytron PT10 (Brinkman). Das Homogenat wurde zweimal gewaschen und durch Zentrifugieren mit 48 000 x g während 10 Minuten bei 4ºC gesammelt. Die Membranen wurden in Untersuchungspuffer, bestehend aus 5 mMol Dithiothieitol, 0,1 mMol Bacitiacin, 5 mMol MgCl&sub2;.H&sub2;O, 0,2 % durch Wärme denaturiertes BSA, 1,2 mMol PMSF und 0,5 mMol O-Phenanthrolin, in einer Konzentration von 100 ml pro Gramm Pancreas, suspendiert. Zu jedem Inkubationsröhrchen in einem Eisbad, enthaltend 0,45 ml Membranzubereitung, wurden 25 ul Untersuchungspuffer (für die Gesamtbindung) oder nicht markiertes CCK 26-33 (für die nicht spezifische Bindung) oder (Fermentations)brühe oder Testverbindung aus den Beispielen 2, 3 oder 4 zugegeben, um die Hemmung der spezifischen CCK-Bindung durch die Kulturbrühen zu bestimmen, und es wurden 25 ul ¹²&sup5;I-CCK zugegeben. Die Reaktionsgemische wurden kurz vermischt und in ein Wasserbad von 37ºC unter leichtem Schütteln während 30 Minuten gestellt. Die Reaktionsgemische wurden dann mit 4 ml eiskaltem TRIS-Puffer, pH 7,7, enthaltend 1 mg/ml Rinderserumalbumin, verdünnt und sofort durch Watman G F/B-Filter filtriert. Die Filter wurden mit 3 x 4 ml des gleichen Puffers gewaschen und die mit den Filtern verbundene Radioaktivität in einem Beckman 5500-Gamma-Zähler gemessen. Brühen wurden hergestellt durch Zugabe von 2 Volumina Aceton zu der ursprünglichen Brühe. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden nach 10 Minuten langem Zentrifugieren mit 1500 g gefriergetrocknet. Die getrockneten Proben wurden dann in Methanol/H&sub2;O (1:1) gebracht und waren fertig für die Untersuchung.
Die Ergebnisse der Pancreas-CCK-Bindungsuntersuchung sind in der folgenden Tabelle angegeben: TABELLE V Pancreas-CCK-Rezeptor-Bindung Verbindung Virginiamycin M&sub1;

Beispiel 7

Hirncholecystokinin-Rezeptorbindungsuntersuchung

Die CCK-8-Bindung wurde durchgeführt nach der Beschreibung für die Pancreas-Methode mit Modifizierungen entsprechend Saito et al., J. Neurochem., 37: 483 (1981).
Die Gehirne von männlichen Hartley-Meerschweinchen (300 bis 500 g) wurden entfernt und in eiskaltes 50 mMol Tris-HCl plus 7,58 g/l Trizma-7,4 (pH 7,4 bei 25ºC) gegeben. Die Großhirnrinde wurde herausgeschnitten und als Rezeptorquelle verwendet und jedes Gramm frisches Meerschweinchenhirngewebe wurde in 10 ml Tris/Trizma-Puffer, pH 7,4, mit einem Brinkman-Polytron PT-10 homogenisiert. Die Homogenisate wurden mit 42 000 x g 15 Minuten zentrifugiert und die erhaltenen Perlen erneut in 200 Volumina Bindungsuntersuchungspuffer (10 mMol N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethan-sulfonsäure (HEPES), pH 7,7 bei 25ºC, mMol MgCl2, 1 mMol Ethylenglykol-bis-(β-aminoethylether-N,N'- tetraessigsäure (EGTA), 0,4 % BSA und 0,25 mg/ml Bacitracin, pH 6,5) suspendiert.
Der Rest der Bindungsuntersuchung war wie für das Pancreas-Verfahren in Beispiel 6 beschrieben, mit der Ausnahme, daß die Reaktionsgemische 2 Stunden bei 25ºC inkubiert wurden vor dem Filtrieren und die Filter mit HEPES-Puffer gewaschen wurden.
Die Ergebnisse der Hirn-CCK-Bindungsuntersuchung sind in der folgenden Tabelle angegeben: TABELLE VI Hirn-CCK-Rezeptor-Bindung Verbindung Virginiamycin M&sub1;

Beispiel 8

Antibiotische Aktivität

Die Verbindungen der Formeln I, II und IV sowie Virginiamycin M&sub1; nach Beispiel 2 wurden auf die antibiotische Wirkung untersucht nach dem Verfahren von Matsen und Barry, Manual of Clinical Microbiology, Lennette, Spaulding, und Truant, Hrsg., American Society for Microbiology, Washington, D.C., S. 418 (1974). Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) wurden bestimmt durch Aufbringen von Reihenverdünnungen der Verbindungen der Formeln I, III und IV sowie von Virginiamycin M&sub1; auf Standardfilterpapierscheiben. Die Konzentration der Testverbindung lag im Bereich von 0,05 ug bis 3,0 ug pro Scheibe in 20 ml Verdünnungsmittel. Der Testorganismus, Micrococcus luteus, wurde auf die Oberfläche eines Nährmediums auf Agarbasis in Petrischalen aufgeimpft und die Scheiben auf die Oberfläche des Mediums gelegt. Das Nährmedium bestand aus Nährbrühe, ergänzt mit 0,2 % Hefeextrakt und 1,5 % Agar. Die beimpften Platten wurden 15 Stunden bei 28ºC inkubiert und die Hemmzonen bestimmt. Die MIC jeder Verbindung wurde bestimmt nach dem Verfahren, wie es beschrieben ist von Matsen und Barry, oben. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben: TABELLE IV Minimale Hemm-Konzentration Verbindung Virginiamycin M&sub1;

Claims

1. Verbindung der Formel I:

2. Verbindung der Formel II:

3. Verbindung der Formel III:

4. Verbindung der Formel IV:

5. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, 3 und 4, umfassend die kontrollierte aerobe Fermentation eines Stammes von Streptomyces olivaceus in einem assimilierbaren wässrigen Nährstoffmedium.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Stamm von Streptomyces olivaceus ATCC 53527 ist.

7. Biologisch reine Kultur des Organismus Streptomyces olivaceus ATCC 53527.

8. Verfahren zur Umwandlung von Virginiamycin M&sub1; in die Verbindung nach Anspruch 3, umfassend die Dehydratisierung von Virginamycin M&sub1; in Gegenwart von Methansulfonylchlorid und Pyridin.

9. Verfahren zur Umwandlung der Verbindung, wie in Anspruch 3 angegeben, in die Verbindungen der Ansprüche 1 und 2, umfassend die Reduktion der Verbindung nach Anspruch 3.

10. Pharmazeutisches Mittel, das geeignet ist zur Behandlung von gastrointestinalen Störungen, Störungen des zentralen Nervensystems und zur Regulierung des Appetits bei Säugetieren, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge von Virginamycin M&sub1; und einen annehmbaren pharmazeutischen Träger.

11. Pharmazeutisches Mittel, das geeignet ist zur Behandlung von gastrointestinalen Störungen, Störungen des zentralen Nervensystems und zur Regulierung des Appetits bei Säugetieren, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und einen annehmbaren pharmazeutischen Träger.

12. Verwendung von Virginamycin M&sub1; zur Herstellung eines Arzneimittels, das geeignet ist zur Behandlung von gastrointestinalen Störungen, Störungen des zentralen Nervensystems und zur Regulierung des Appetits bei Säugetieren.

13. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels, das geeignet ist zur Behandlung von gastrointestinalen Störungen, Störungen des zentralen Nervensystems und zur Regulierung des Appetits bei Säugetieren.

14. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Herstellung eines Arzneimittels, das geeignet ist zur Behandlung bakterieller Infektionen bei Säugetieren.