DE3629465A1

DE3629465A1 - Peptidantibiotika, verfahren zu deren herstellung und pharmazeutische mittel

Info

Publication number: DE3629465A1
Application number: DE19863629465
Authority: DE
Inventors: Masataka Konishi; Koji Tomita; Masahisa Oka; Ken-Ichi Numata
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1985-08-30
Filing date: 1986-08-29
Publication date: 1987-03-05
Also published as: CA1260859A; CN86105469A; AU593836B2; IT1198023B; MY102800A; GB2179662B; GB8620987D0; KR950005134B1; IT8621557A0; FR2586688B1; IL79858A0; SE8603634D0; BE905350A; DK414586A; ES2002731A6; FR2586688A1; SE8603634L; SE468813B; YU151086A; NL8602199A

Description

Die Erfindung betrifft neue Peptidantibiotika und antimikrobielle und Antitumor-Mittel, die diese Verbindungen enthalten. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung dieser Antibiotika, Zwischenprodukte hierfür und den für ihre fermentative Herstellung verwendeten neuen Mikroorganismus.

Es wurden bereits zahlreiche Mikroorganismen aus Bodenproben isoliert und in einem synthetischen Medium kultiviert. Es hat sich gezeigt, daß diese Mikroorganismen Verbindungen mit antibiotischer Aktivität produzieren. Es wurde nun eine neue Bakterienart, nämlich K481-B101, aus einer Bodenprobe isoliert, die in der Nähe des Parthenons in Athen, Griechenland, genommen wurde. Es hat sich gezeigt, daß dieses Bakterium eine Mischung von Peptiden mit antibiotischer Aktivität produziert.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Peptidantibiotika zu schaffen, die als antifungische und Antitumor- Mittel besonders brauchbar sind.

Weiter liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, Verfahren zur Herstellung dieser Antibiotika sowie pharmazeutische Mittel, die diese Antibiotika enthalten, zur Verfügung zu stellen.

Gelöst werden diese Aufgaben durch die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel: worin R für CH₃-(CH₂)₆, CH₃-(CH₂)₄-CH=CH(CH₂)₂ oder CH₃-(CH₂)₈ steht.

Weiter schafft die Erfindung pharmazeutische Mittel, die eine antifungisch und/oder antitumoral wirksame Menge dieser Verbindungen, einzeln oder in Kombination, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten.

Weiter betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel: worin R für CH₃-(CH₂)₆, CH₃-(CH₂)₄-CH=CH-(CH₂)₂ oder CH₃-(CH₂)₈ steht, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Polyangium brachysporum sp. nov. unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff enthält, das produzierte Myzel abtrennt und die Verbindungen aus dem Nährmedium gewinnt.

Weiter betrifft die Erfindung die Verbindungen der Formeln: und die als Zwischenverbindungen zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen brauchbar sind, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zwischenverbindungen.

Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen das IR-Spektrum jeweils vom Bu-2867T A, B und C.

Die Fig. 4 und 5 zeigen das ¹H-NMR- und ¹³C-NMR- Spektrum von Bu-2867T A.

Die morphologische, kulturelle und physiologische Charakterisierung von K481-B101 erfolgte anhand der Methoden, beschrieben von McCurdy, Jr. H. D.: Studies on the Taxonomy of the Myxobacterales. II, Polyangium and the demise of the Sorangiaceae. Intl. J. Syst. Bacteriol. 20: 283-296, 1970; H. Reichenbach: Nannocystis exedens gen. nov., sp. nov., a new myxobacterium of the family Sorangiacease. Arch. Mikrobiol. 70: 119-138, 1970; P. Christensen und F. D. Cook: Lysobacter, a new Genus of non-fruiting, gliding bacteria with a high base ratio. Intl. J. Syst. Bacteriol. 28: 367-393, 1978: und P. Christensen: Synonymy of Flavobacterium pectinovorum Dorey with Cytophaga johnsonae Stanier. Intl. J. Syst. Bacteriol. 27: 122-132, 1977. Die Erhaltung und die Reinigung erfolgten anhand der Verfahren, beschrieben von J. E. Peterson: Isolation, cultivation and maintenance of the myxobacteria Methods in Microbiology 3 B: 185-210, 1969. Edit. J. R. Norris & D. W. Ribbons. Academic Press (London and New York); und Reichenbach, H & M. Dworkin: The Order Mixobacterales. The Prokaryotes. Band I: 328-355, 1981. Edit. M. P. Starr et al., Springer-Verlag (Berlin, Heidelberg und New York). Die taxonomische Stellung wurde gemäß der Beschreibung in Bergey's Manual, 8th Ed., 1974 und "The Prokaryotes, Band I" bestimmt.

Morphologie:

Casiton-Mg⁺⁺-Agar, Chitinagar, Hefezellenagar und Kaninchendung- Pellets-Wasseragar wurden für die morphologischen Untersuchungen verwendet. K-481-B101 ist ein gram-negatives Bakterium, das nicht den Flagellaten angehört. Die vegetativen Zellen sind zylindrisch (0,6-8,8 mal 2-10 µm) mit stumpfrunden Enden. Die vegetativen Zellen zeigen flexible und langsame Gleitbewegungen auf der feuchten Oberfläche von Agarmedium oder weichem Agarmedium. Die Myxosporen unterscheiden sich klar von den vegetativen Zellen und sind oval oder sphärisch, 0,6-0,8 mal 0,6-1,5 µm, nicht-refraktil oder refraktil und zeigen gelegentlich Paarbildung. K481-B101 bildet auf den meisten descriptiven Agarmedien sessile Sporangia, die die Myxosporen umhüllen. Die Sporangia sind oval, sphärisch oder kissenartig, ziemlich variabel in der Größe, 12 × 20 mal 80 × 120 µm, häufig durch eine übliche Umhüllung oder Schleimschicht gebunden, besitzen Doppelkontur und treten einzeln oder in Clustern (sori) auf. Die Morphologie von K481-B101 ist in Tabelle I zusammengestellt.

Eigenschaften der Kultur

K481-B101 wächst mäßig auf Casiton-Mg⁺⁺-Agar (McCurdy 1969) und Hefezellenagar (Christensen & Cook, 1978) und wächst schlecht auf Bacto-Nährmediumagar oder Bacto-Herzinfusionsagar. Rhizoide oder federige Schwärme beobachtet man auf YP-Weichagar (Hefeextrakt 0,3%, Pepton 0,1%, NaCl 0,01%, Agar 0,3%, pH 6,6-6,8), nicht jedoch auf Casiton-Mg⁺⁺-Agar. Die Kolonien auf Casiton-Mg⁺⁺-Agar sind kreisförmig, transluzent und schwach grün-gelb und ätzen, erodieren oder penetrieren schwach in Agar. Die Kultureigenschaften sind in Tabelle II gezeigt.

Physiologische Eigenschaften:

K481-B101 hydrolysiert Stärke, Chitin, Gelatine und Casein, aber nicht Cellulose und Agar. Es lysiert autoklavierte Hefezellen, nicht jedoch lebende Micrococcus luteus-Zellen. K481-B101 ist mesophil und sensitiv gegenüber 2% NaCl. Die physiologischen Eigenschaften sind in Tabelle III gezeigt.

Konkomitanz von Flagellatbakterien und Auftreten von spontanen Varianten:

Man beobachtete Konkomitanz von gram-negativen, stabförmigen Flagellatbakterien in der ursprünglichen Kultur. Man reinigte K481-B101 ziemlich gut, indem man die üblichen Verdünnungs- und Einzelzellisolierungstechniken mit Schallbehandlung, Hitzeschockbehandlung oder antibiotischer Sensitivierung (z. B. Pipemidinsäure bei 50 mcg(ml) unter Verwendung der Myxosporen oder des Fruchtkörpers kombiniert. Bei einer ungereinigten Kultur von K481-B101 finden sich Mukoidvarianten, die weißliche, domförmige Kolonien mit schwärmendem Halo bilden. Die vegetativen Zellen dieser Mukoidvarianten sind etwas größer als der ursprüngliche Stamm, sie besitzen eine Abmessung von 0,8-1,0 × 2,0-3,5 µm. Die Sporangia-Cluster (Sorus) werden überwiegend durch Mukoidvarianten gebildet.

Taxonomische Stellung:

K481-B101 ist ein fruchtbildendes Gleitbakterium, das aus einer Bodenprobe isoliert wurde. Die wesentlichen Erkennungsmerkmale des Stammes sind folgende:

Vegetative Zellen:

1. Zylindrisch, einheitlicher Durchmesser;
2. die Enden sind nicht spitz zulaufend;
3. in Agarmedium penetrierbar;
4. Kongorot, nicht adsorbiert.

Myxosporen:

1. Differenziert von den vegetativen Zellen;
2. oval oder sphärisch;
3. nicht-refraktil oder refraktil.

Sporangia:

1. Sessil;
2. oval, sphärisch oder irregulär;
3. häufig durch eine übliche Hülle oder Schleimschicht gebunden;
4. Doppelkonturen;
5. Schwach-gelb (eine ausgeprägte Farbe ist nicht vorhanden);
6. treten einzeln oder in Clustern (sori) auf.

Kulturelle und physiologische Eigenschaften:

1. Goldgelbe bis weißliche Kolonie;
2. die Kolonien ätzen, erodieren und penetrieren schwach in Agar;
3. Chitinolytisch aber nicht cellulolytisch
4. lysiert Hefezellen, nicht aber Micrococcus luteus

Die oben beschriebenen morphologischen, kulturellen und physiologischen Eigenschaften von K481-B101 zeigen, daß K481-B101 in die Ordnung Myxobacterales einzuklassifizieren ist. Die zu den Genera Myxobacterales zählenden Genera Myxococcus, Archangium und Cystobacter unterscheiden sich von K481-B101 hinsichtlich der spitz zulaufenden vegetativen Zellen und der Morphologie des Fruchtkörpers. Die Genera Melittangium, Stigmatella und Chondromyces unterscheiden sich von K481-B101 durch die gestelzten Sporangia.

K481-B101 ähnelt den Genera Polyangium und Nannocystis. K481-B101 ähnelt dem Genus Nannocystis in der Bildung ovaler oder sphärischer Myxosporen und ovaler oder sphärischer solitärer Sporangia und unterscheidet sich davon durch die zylindrischen vegetativen Zellen mit gleichmäßigen Durchmesser und durch die mangelnde Fähigkeit in Agar zu ätzen, aerodieren und penetrieren. K481-B101 ähnelt dem Genus Polyangium hinsichtlich der zylindrischen vegetativen Zellen mit stumpfrunden Enden, der überwiegenden Bildung nichtrefraktiler Myxosporen und der ovalen oder sphärischen, doppelt konturierten Sporangia. Auf der Basis von Vergleichsuntersuchungen mit den Genera der Ordnung Myxobacterales wird K481-B101 als Spezies des Genus Polyangium klassifiziert. Unter den Spezien von Polyangium ähnelt P Luteum K481-B101 hinsichtliche der Größe der vegetativen Zellen, der Farbe und Gestalt der Sporangien und der Farbe der vegetativen Kolonie. K481-B101 unterscheidet sich jedoch von P Luteum durch die ovalen oder sphärischen Myxosporen, die stark kontrahiert sind und durch die mangelnde Fähigkeit, lebende Bakterienzellen, wie Micrococcus luteus-Zellen, zu lysieren.

Daraus wird geschlossen, daß K481-B101 eine neue Spezies des Genus Polyangium in der Familie Polyangiaceae der Ordnung Myxobacterales ist. Es wird vorgeschlagen, K481-B101 als Polyangium brachysporum sp. nov. zu bezeichnen. Der Typ des Stammes ist Nr. K481-B101 (Einzelisolat), die Kultur wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nr. ATCC 53 080 hinterlegt.

Tabelle I: Morphologie von K481-B101

Vegetative Zellen:

Gram-negativ. Zylindrisch mit stumpfen runden Enden (0,6-0,8 × 2,0-10 µm). Kongorot wird nicht adsorbiert.

Myxosporen:

Unterscheidbar von den vegetativen Zellen. Stark geschrumpft, werden oval oder sphärisch, 0,6-0,8 × 0,6-1,5 µm, nicht-refraktil. Eine längere Inkubation ergibt refraktile Myxosporen.

Sporangia:

Sessil, treten einzeln oder in Clustern auf. Oval, sphärisch, kissenartig oder gestaltlos. Die Größe ist ziemlich variabel, 12 × 20 × 80 × 120 µm. Durch eine übliche Hülle oder Schleimschicht gebunden. Doppelkonturiert. In Agar eingebettet. Die Größe der Gesamtmasse von Cluster von zwei bis zehn oder mehr Sporangia liegt im Bereich von 50-300 µm.

Mikrokolonie:

Schwach auf Chitinagar nach 2- wöchiger Inkubation. Palisadenförmige oder Zick-Zack-Anordnung von Ketten vegetativer Zellen an der Peripherie. Gleitbewegung von Einzelzellen wird beobachtet, nicht jedoch von Zellenmassen.

Tabelle II:Kulturelle Eigenschaften einer K481-B101-Kolonie auf Casiton-Mg⁺⁺- Agar (McCurdy 1969) bei 28°C und 6 Tagen

Form: Zirkular.
Oberfläche: Glatt, später teilweise faltig.
Elevation: ausgebildet
Ecken: Völlig oder etwas irregulär, ausgeprägte, hervorspringende Teile, wie Zungen, Federn oder Rhizoide, fehlen.
Optische Eigenschaften: Semitransparent oder opak.
Farbe der Kolonie: Schwach grün-gelb.
Diffusibles Pigment: Keines.

Wachstum auf Chitinagar nach 3-wöchiger Inkubation bei 28°C.

Dünn, transluzent, schwach-gelb oder farblos. Dick, opak und gelblich-weiß an den peripheren Teilen. Konzentrische Sporangia-Bildung an der Peripherie. Ätzt, erodiert oder penetriert schwach in Agar.

Tabelle III:Physiologische Eigenschaften von K481-B101

Hydrolyse vonlöslicher Stärke+Kartoffelstärke+CMC Natrium+Cellulose-Agar-Chitin+Natriumalginat-Natriumpolypectat-Gelatine+Casein+

Wachstum aufSimon's Citratagar-Christensen-Citratagar-Glucoseammmoniumsalzagar-Asparaginammoniumsalzagar+

Produktion vonIndol-
H₂S+
Acetoin (VP-Reaktion)-Urease+Oxidase+Katalase+

Lytische Wirkung gegen
lebende Zellen von Micrococcus luteus-Stämmen PCI 1001 & ATCC 9341-autoklavierte Hefezellen+

ReaktionenMilchkoagulation:-Milchpeptonisierung:+
NaCl-Toleranz: Wachstum: 1,0% NaCl oder weniger
Kein Wachstum: 2,0% NaCl oder mehr
pH-Toleranz: Wachstumsbereich pH 5,5-10,5
Geringes Wachstum: pH 5,0
Kein Wachstum: pH 4,5 und 11,5
Wachstumstemperatur: Maximales Wachstum: 37°C
Wachstumsbereich: 15-42°C
Kein Wachstum: 10°C und 45°C
Oxidative oder fermentative Reaktion: Oxidativ
(Hugh und Leifson Medium)

Antibiotika-Produktion

Die Stammkultur von Polyangium brachysporum K481-B101 ließ man sich 3 Tage bei 28°C auf Agarschrägmedium vermehren, das aus 0,5% löslicher Stärke, 0,5% Glucose, 0,1% Fleischextrakt, 0,1% Hefeextrakt, 0,2% Nz-Case, 0,2% NaCl, 0,1% CaCO₃ und 1,6% Agar (pH 7,0) bestand. Eine gutgewachsene Agarschrägkultur wurde dann dazu verwendet, ein vegetatives Medium zu inokulieren, das aus 2% Maisstärke, 3% Sojabohnenmehl, 0,3% MgSO₄ · 7H₂O und 1% CaCO₃ (pH 7,0, vor der Sterilisation) bestand. Nach 3-tägiger Inkubation bei 28°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung (250 Upm) wurden 5 ml der Kultur in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben, der 100 ml des Produktionsmediums der gleichen Zusammensetzung wie das vegetative Medium enthielt.

Die Antibiotika-Produktion wurde mittels der Papierscheibenagardiffusionsmethode unter Verwendung von Candida albicans A9540 als Testorganismus verfolgt. Die Fermentation wurde 4 Tage bei 28°C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung fortgesetzt, wobei die Antibiotika- Produktion einen maximalen Wert von 100 mcg/ml erreichte.

Die Fermentation wurde auch in einem Fermentergefäß mit Rührvorrichtung durchgeführt. 500 ml der durch Fermentation im Kolben erhaltenen Impfkultur wurden dazu verwendet, 10 l des Produktionsmediums in einem 20 l-Gefäß zu inokulieren. Die Fermentation erfolgte bei 28°C unter Rühren mit 250 Upm und unter Belüftung mit 10 l/min. Die Antibiotika-Produktion erreichte ein Maximum von 150 mcg/ml nach 40-stündiger Fermentation.

Isolierung und Reinigung des Antibiotikums:

Die Fermentationsbrühe (48 l) wird mit Hilfe einer Zentrifuge (sharpless centrifuge) abzentrifugiert. Den Myzelkuchen homogenisiert man mit 7 l Methanol und die Mischung rührt man 1 h. Nach Abfiltrieren von unlöslichen Bestandteilen verdampft man den Methanolextrakt zu einer wäßrigen Lösung, die man mit dem Filtrat der Brühe vereinigt und mit n-Butanol (24 l) extrahiert. Der Extrakt wird auf 0,5 ml konzentriert und in n-Hexan (3,5 l) unter Rühren gegossen, wobei das rohe Antibiotikum ausfällt (41 g). Dieser Feststoff wird an einer Silikagel C-200-Säule (760 ml) chromatographiert, wobei mit Ethylacetat und einer steigenden Menge Methanol (0-50%) eluiert wird. Die eluierte Bioaktivität wird mittels Papierscheiben-Assay unter Verwendung von Candida albicans A9540 als Testorganismus bestimmt. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und verdampft, wobei man den Bu-2867T-Komplex als schwach-gelbes Pulver (13 g) erhält. 200 mg dieses Feststoffes werden an einer Umkehrphasensäule (C₁₈, 100 ml) unter Verwendung von Ethanol/Wasser (3 : 7 bis 5 : 5) als Eluierungsmittel chromatographiert. Das Eluat wird mittels eines Bioassays auf antifungische Wirkung und mittels TLC (silanisiert, EtOH : H₂O = 55 : 45) verfolgt. Die ersten aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck verdampft, wobei BU-2867T A rein als weißer Feststoff (61 mg) erhalten wird. Dieser wird aus wäßrigem Methanol umkristallisiert, wobei sich weiße Nadeln (34 mg) abscheiden. Verdampfen der zweiten und dritten aktiven Fraktionen liefert BU-2867T B (1 mg) und C (11 mg). BU-2867T C wird aus Methanol in Form feiner Nadeln kristallisiert. Durch Wiederholen der obigen Umkehrphasenchromatographie erhält man dann insgesamt 3,9 g BU-2867T A, 44 mg BU-2867T B und 342 mg BU-2867T C.

Charakterisierung des Antibiotikums:

Bu-2867T A und C wurden als farblose Nadeln isoliert, wohingegen BU-2867T B als weißes amorphes Pulver erhalten wurde. Diese Verbindungen sind leicht löslich in Methanol, Ethanol, n-Butanol und Dimethylsulfoxid, etwas löslich in Chloroform, Acetonitril und Ethylacetat und praktisch unlöslich in n-Hexan und Wasser. Sie geben eine positive Reaktion auf Rydon-Smith-Reagens und färben sich beim Besprühen mit Jod oder Schwefelsäure auf Dünnschichtchromatographieplatten. Die sind negativ gegenüber der Ninhydrin-, Sakaguchi-, Anthron- und Dragendorff- Reaktion. Mittels Massenspektrometrie und Mikroanalyse wurde für BU-2867T A, B und C jeweils die Summenformel C₂₇H₄₄N₄O₆, C₂₉H₄₆N₄O₆ und C₂₉H₄₈N₄O₆ ermittelt. Die UV- Spektren dieser Verbindungen in Methanol zeigen ein einziges Maximum bei 261 nm, das sich in saurer oder alkalischer Lösung nicht verschiebt. Die physikalisch-chemischen Daten von BU-2867T A, B und C sind in Tabelle IV zusammengestellt. Ihre IR-Spektren in KBr (Fig. 1, 2 und 3) zeigen starke Amidbanden bei ungefähr 1630 und 1540 cm^-1 und OH- und/oder NH-Absorptionen bei 3300 cm^-1. Das ¹H-NMR-Spektrum von BU-2867T A (Fig. 4) zeigt die Anwesenheit von sechs Olefinprotonen (δ: 6,16; 6,20 (2 H); 6,28; 6,49 und 7,09 ppm) und vier Amidprotonen (δ: 7,49; 7,82; 7,87 und 8,72 ppm). Das Spektrum zeigt auch zwei Methylgruppen (δ: 0,93 ppm, t und 1,07 ppm, d). Das ¹³C-NMR-Spektrum von BU-2867T A (Fig. 5) zeigt mehr als 23 Signale für Kohlenstoffatome, einschließlich 4 Carbonylkohlenstoffatome, 6 Olefinkohlenstoffatome und 3 Methylkohlenstoffatome. Die ¹³C-NMR-Spektren von BU-2867T B und C sind demjenigen von BU-2867T A sehr ähnlich, sie zeigen jedoch, im Vergleich zu BU-2867T A, die Anwesenheit von zwei weiteren Olefinkohlenstoffatomen bei BU-2867T B und zwei weitere Methylenkohlenstoffatomen bei BU-2867T C.

BU-2867T A wurde mit 6 N HCL 16 h unter Rückfluß erhitzt. Nach Entfernen des lipophilen Produkts (V) durch Extraktion mit Ethylacetat wurde das Isolat zu einem öligen Rückstand konzentriert, der an Dowex 50 W × 4 Ionenaustauscherharz chromatographiert wurde, wobei mit Pyridin- Ameisensäure-Essigsäure-Puffer (0,1-0,2 M, pH 3,1-5,1) entwickelt wurde. Die Chromatographie wurde mit Ninhydrin- Reagens verfolgt und es wurden die vier Aminosäuren I, II, III und IV, die in dieser Reihenfolge eluiert wurden, isoliert und als Hydrochloride kristallisiert. Die Aminosäure I ([α]@X:25:D°: 12,7° in 5 N HCL) wurde anhand ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften als L-Threonin identifiziert. Das ¹H-NMR-Spektrum und das EI-MS (M⁺ + 1: m/ z 134) der Aminosäure II zeigte, daß es eine Mischung der Diastereoisomeren von 4-Amino-3-hydroxy-n-valeriansäure, war (Konishi, M; K. Saito, K. Numata, T. Tsuno, K. Asama, H. Tsukiura, T. Naito und H. Kawaguchi: Tallysomycin, a new antibiotic complex related to bleomycin. II. Structure determination of tallysomycins A and B. J. Antibiotics 30: 789-805, 1977). Die Identität dieser Verbindung wurde durch Vergleich mit einer authentischen Probe bestätigt. Die Summenformel von III wurde mittels Elementaranalyse und EI-Massenspektrometrie (M⁺: m/z 115) zu C₅H₉NO₂ ermittelt. Das ¹-NMR- Spektrum dieser Verbindung zeigte die Anwesenheit einer Methylgruppe (δ: 1,50 ppm, d, J: 6,0 Hz), eines Methinprotons (δ: 4,0-4,2, m) und zweier trans-Olefinprotonen (δ: 6,05 ppm, d, J: 15,0 Hz und 6,57 ppm, d-d, J: 6,0 und 15,0 Hz). Die Daten dieser Spektren ergaben eindeutig, daß es sich bei III um 4-Amino-2(E)-pentencarbonsäure handelt (Honor´, T.; H. Hjeds, P. Krogsgaard-Larsen und T. R. Christiansen: Synthesis and Structure-Activity Studies of Analogs of γ-amino-butyric Acid (GABA). Eur. J. Med. Chem., 13: 429-434, 1978). Aufgrund der spezifischen Drehung ([α]D ^22,5: -6° in 5N HCl) wird III 2(S)-Konfiguration zugeschrieben. Die Aminosäure IV wurde als 4-Hydroxylysin bestimmt, und zwar auf der Grundlage der Elementaranalyse (C₆H₁₄N₂O₃), EI-MS (M + 1: m/z 163) und ¹H-NMR-Spektrum (δ: 1,8-2,1 ppm, 4 H, m, 3,18 ppm, 2 H, t und 3,6-4,3 ppm, 2 H, m) und der Bildung einer γ-Lactonverbindung (^νC=O: 1770 cm^-1) nach Behandlung mit 6 N HCl (Izumiya, N; Y. Fujita, F. Irreverre und B. Witkop: The Synthesis of Erythro-γ- hydroxy-L-lysine and its Nonoccurrence in Collagen). In Biochemistry 4: 2501-2506, 1965, ist die Mutarotation von 4-Hydroxylysinen beschrieben und die bei IV beobachtete Verschiebung wies auf Erythro-L-Konfiguration hin. Es wurde demnach gezeigt, daß die Aminosäure IV Erythro-4-hydroxy-L-lysin ist.

Die lipophile saure Fraktion (V), die nach der obigen sauren Hydrolyse erhalten wurde, wurde mit Diazomethan behandelt. Nach chromatographischer Reinigung erhielt man einen öligen Methylester (VI), dessen UV- (λ@V:MeOH:max: 26 = nm, ε : 22 000), EI-MS- (M⁺: m/z 210) und ¹H-NMR- (vier -CH=, ein C-CH₃ und sechs -CH₂-) Spektren zeigten, das VI Methyl-2,4-Dodecadienoat war. Die Größe der Kopplungskonstante legte die trans-Konfiguration beider Doppelbindungen nahe. Die ursprüngliche Säure V war demnach 2(E), 4(E)-Dodecadiencarbonsäure, Burden, R. S. und L. Crombie: Amides of Vegetable Origin, Part XII. A new series of alka-2,4-dienoic tyramine-amides from Anacyclus pyrethrum D. C. (Compositae). J. Chem. Soc. (C), 1969: 2477-2481, 1969.

BU-2867T A besitzt die Summenformel C₂₇H₄₄N₄O₆ und zeigt sechs Olefinkohlenstoffatome und vier Amidkohlenstoffatome im ¹³C-NMR-Spektrum. Es war deshalb klar, daß es sich bei der Aminosäure II um ein Artefact handelt, das durch Hydratisierung der natürlichen Aminosäure III während der sauren Hydrolyse produziert wurde. Bei dem Antibiotikum sollte es sich um ein cyclisches Peptid handeln, weil die Ninhydrin-Reaktion negativ war, und weil es keine potentiometrisch titrierbare Funktionen aufwies. Dies wurde darüber hinaus durch die Tatsache gestützt, daß BU-2867T A bei der Acetylierung in Pyridin ein Di-O-acetylderivat (EI-MS: M⁺ = m/z 604, ¹H-NMR: 2,02 ppm, 3 H und 2,08 ppm, 3 H) liefert. Das MS- Spektrum des Acetats zeigte starke Fragmentionen bei m/z 179 und 322, was auf das Vorliegen einer V→I→Sequenz im Antibiotikum hinwies.

BU-2867T A wurde einem enzymatischen Abbau mit Ficin in 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) unterzogen. Nach dem Ansäuern auf pH 2,2 wurde die Reaktionsmischung mit n-Butanol extrahiert, wobei eine saure Verbindung (VII) erhalten wurde. Anschließende Extraktion der wäßrigen Lösung bei pH 10,0 mit n-Butanol lieferte eine Substanz (VIII), die eine positive Reaktion mit Ninhydrin ergab. Mittels IR- (^ν _C=O: 1720 und 1650 cm^-1), EI-MS (M⁺-H₂O: m/z 279 und M⁺ - Thr: m/z 179) und ¹H-NMR-Spektren wurde gezeigt, daß es sich bei Verbindung VII um 2,4-Dodecadienoyl- threonin (V→I) handelt. Diese Struktur wurde weiter durch die Tatsache erhärtet, daß VII bei der Hydrolyse in 6 N HCl I und V liefert. Beim Erhitzen unter Rückfluß in 6 N HCl liefert die Verbindung VIII die Aminosäuren II, III und IV, wie durch Dünnschichtchromatographie (TLC) gezeigt werden konnte. Im EI-MS-Spektrum von VIII war das Molekülion bei m/z 241 zu finden, was für eine cyclische Peptidstruktur spricht. Das ¹H-NMR- Spektrum (270 MHz, in DMSO-d₆) zeigte in Übereinstimmung mit den obigen cyclischen Strukturen zwei Amid-NH-Protonen bei 7,43 ppm (Triplett) und 9,10 ppm (breit). Umfangreiche Entkopplungsversuche zeigten, daß die Aminogruppe von III und die ε-Aminogruppe von IV an Carbonylgruppen unter Bildung von Amiden gebunden waren, wohingegen die α-Aminogruppe von IV in freier Form vorlag. VII und VIII wurden deshalb die folgenden Strukturen zugeschrieben:

Die Verbindungen VII und VIII wurden auch erhalten, wenn BU-2867T A einem enzymatischen Abbau oder einer enzymatischen Hydrolyse mit Papain oder Chymopapain unterzogen wurde. Eine Mischung von BU-2867T A (4 g) und Papain (Sigma P-3375, 50 g) in 20 l 10%igem wäßrigem Methanol wurde 22 h bei 28°C gerührt. Die Mischung wurde dann mit Essigsäure auf pH 3,3 angesäuert und mit Ethylacetat (10 l) extrahiert. Verdampfen des Extraktes lieferte ein Öl (6,3 g), das man an Silikagel (Wakogel C-200, 250 ml) mit einer Mischung aus CH₂Cl₂ und Methanol (9 : 1) chromatographierte, wobei man die halbreine, ölige Verbindung VII (3,3 g) erhielt. Die weitere Chromatographie des Öls an Sephadex LH-20 und die anschließende Kristallisation lieferte reines VII in Form farbloser Nadeln, 1,15 g (Ausbeute 5=%).
Schmp. 90-91°C.
[ α]@X:27:D + 17,4° (C 0,5 MeOH).
Analyse für C₁₆H₂₇NO₄ · H₂O: EI-MS: m/z 279 (M⁺ -H₂O).
UV λ@V:MeOH:max: nm (ε): 260 (28 000).
IR ν _max (KBr) cm^-1: 3520, 3410, 3300, 1720, 1690, 1655, 1630, etc.
¹H-NMR (80 MHz, DMSO-d₆): δ 0,88 (3 H, t); 1,06 (3 H, d); 6,20 (3 H, m); 7,00 (1 H, m), 7,84 (1 H, d, NH) etc.

Nach der Extraktion mit Ethylacetat wurde die saure wäßrige Lösung zur Trockene eingeengt. Der Rückstand (36 g) wurde in 50 ml Wasser gelöst, der pH auf 9,0 eingestellt und auf eine Umkehrphasen-Silikasäule (C₁₈, Merck, 1,6 l) gegeben, die mit Wasser entwickelt wurde. Die die Verbindung VIII enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde an Sephadex LH-20 (250 ml) mit 50%igem wäßrigem Methanol und anschließend an Umkehrphasen- Silika (C₁₈) mit saurem Wasser (pH 3,0, eingestellt mit verdünnter HCl) chromatographiert. Man erhielt reines VIII-Hydrochlorid.
747 mg (Ausbeute 35%); Schmp. 190°C (Zers.).
[α]@X:26:D -113° (c 0,5, H₂O).
EI-MS: m/z 241 (M⁺).
UV: Endabsorption.
IR ν _max (KBr) cm^-1: 3400, 1660, 1620, 1530 etc.
¹H-NMR (8= MHz, DMSO-d₆): δ 1,27 (3 H, d); 1,4-1,8 (4 H); 2,98 (2 H, m); 4,52 (1 H, m); 6,19 (1 H, d); 6,45 (1 H, d-d); 7,43 (1 H, t, NH); 9,46 (1 H, d, NH).
Analyse für C₁₁H₉N₃O₃ · HCl · H₂O:

Da BU-2867T A gegenüber Ninhydrin negativ war und keine titrierbaren Gruppen zeigte, mußte seine Struktur logischerweise auf einer Verknüpfung von VII und VIII mittels einer Peptidbindung beruhen.

Beim Erhitzen mit 6 N HCl lieferten BU-2867T B und C den gleichen Aminosäurekomplex wie BU-2867T A. Die Fettsäureeinheiten der beiden Antibiotika wurden aus dem Hydrolysat extrahiert, mit Diazomethan behandelt und als Methylester isoliert, IX (aus BU-2867T B) und X (aus BU-2867T C). Sie haben das für ihre Stammantibiotika beobachtete charakteristische UV-Maximum (λ@V:MeOH:max: 260 nm) beibehalten. Das EI-MS von IX zeigte ein Molekülion bei m/z 236, was für einen C₁₄-Carbonsäureester mit drei Doppelbindungen spricht. Das UV- und ¹H-NMR-Spektrum zeigten eindeutig, daß 2(E), 4(E)-Diencarbonsäure-Struktur vorlag und daß die dritte Doppelbindung isoliert in IX vorlag. Ozonolyse von IX und anschließender reduktiver Abbau des Ozonids ergaben n-Hexanal, das isoliert und als 2,4-Dinitrophenyl-hydrazon (EI-MS M⁺: m/z 280) identifiziert wurde. Diese Befunde bestätigen, daß es sich bei IX um Methyl-2(E), 4(E), 8-Tetradecatrienoat handelt. Das Molekulargewicht des Esters X (EI-MS: M⁺ m/z 238) war 28 Einheiten (C₂H₄) höher als das von VI. Dies gibt den Unterschied in der Summenformel zwischen BU-2867T A und C wieder. In Kombination mit den ¹H-NMR- und UV-Daten zeigte dies, daß es sich bei X um Methyl-2(E), 4(E)-Tetradecadienoat handelt. Aufgrund der anhand der obigen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse besitzen BU-2867T A, B und C folgende Strukturformeln: BU-2867T A : R = CH₃-(CH₂)_6-
BU-2867T B : R = CH₃-(CH₂)₄-CH=CH-(CH₂)_2-
BU-2867T C : R = CH₃-(CH₂)_8-

Tabelle IV

Physikalisch-chemische Eigenschaften von BU-2867T A, B und C

Der enzymatische Abbau von BU-2867T mit Pseudomonas acylase ergab Produkte, die von den durch die oben beschriebene Hydrolyse mit Ficin oder Papain erhaltenen Produkte verschieden waren. Der Pseudomonas-Stamm Pa-129 wurde 3 Tage bei 37°C in 10 l eines Mediums fermentiert, das 2% lösliche Stärke, 0,2% Glucose, 3% Sojabohnenmehl, 1% CaCO₃ und 0,3% MgSO₄ · 7H₂O enthielt. Die Zellen wurden dann abzentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen mit Kochsalzlösung (1 l) wurden die Zellen erneut in 0,75 l Kochsalzlösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde mit einer vorautoklavierten Suspension (1,5 l) von Natriumalginat (75 g) und CM-Cellulose (75 g) gemischt. Die Mischung wurde unter Rühren in 30 l 0,1 M CaCl₂-Lösung gegossen. Das in die Zellen eingeschlossene Gel wurde durch Rühren mit 25%iger Glutaraldehydlösung steifer gemacht und in eine Säule (4,0 × 175 cm) gepackt. Eine Lösung von BU-2867T A (1,5 g) in 20%igem wäßrigem Methanol (30 l) wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,4-0,8 l/h über die Säule gegeben. Das vereinigte Effluenz wurde dann nacheinander über eine Amberlite IRC-50- (70% NH₄⁺- Form, pH 6,7; 100 ml) und HP-20-Säule (300 ml) gegeben. Die IRC-Säule wurde mit Wasser gewaschen und anschließend mit 1,5 N NH₄OH entwickelt. Die Ninhydrinpositiven Fraktionen wurden zusammengegeben, konzentriert und lyophilisiert, wobei ein schwachgelber Feststoff (800 mg) erhalten wurde, der auf eine Umkehrphasen- Silikasäule (C₁₈, 250 ml) gegeben wurde. Die Säule wurde mit Wasser unter mittlerem Druck entwickelt und die Ninhydrin-positiven Eluate wurden zusammengegeben und konzentriert, wobei die L-Threonylform des cyclischen Amins (XI, 612 mg) erhalten wurde. Ausbeute 62%; Schmp. 170°C.
[α]@X:27:D - 157° (c 0,5, H₂O).
EI-MS: m/z 342 (M⁺).
UV: Endabsorption.
IR ν _max (KBr) cm^-1: 3350, 3280, 1650, 1620, 1530 etc.
¹H-NMR (80 MHz, DMSO-d₆) δ 1,05 (3 H, d); 1,21 (3 H, d); 1,4-2,2 (4 H; 4,35 (2H, m); 4,47 (1 H, m, OH); 4,62 (1 H, d, OH); 6,16 (1 H, d); 6,42 (1 H, d-d); 7,36 (1 H, t, NH); 7,97 (1 H, d, NH); 8,62 (1 H, d, NH).

Die obige HP-Säule wurde mit Wasser (1 l) und anschließend mit einer Mischung von 0,1 N NaOH und Methanol (1 : 2) entwickelt. Die 2,4-Dodecadiencarbonsäure (V) enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben, auf 300 ml konzentriert und auf pH 2,0 angesäuert. Diese Lösung wurde mit Ethylacetat (300 ml) und n-Butanol (100 ml) extrahiert. Verdampfen des Ethylacetatextraktes ergab einen öligen Rückstand, den man an einer Sephadex LH-20-Säule (800 ml) chromatographierte. Nach Eluieren mit Methanol und Verfolgen der Eluate anhand der UV- Absorption bei 260 nm konzentrierte man die entsprechenden Eluate, wobei man reines V (259 mg) als farblose Platten erhielt. Ausbeute: 53%. Schmp. 48-49°C.
UV λ@V:MeOH:max: nm (ε): 258 (24 000);
IR ν _max (KBr) cm^-1: 1680, 1630, 1605, 1410, 1300 etc.
¹H-NMR (80 MHz, CD₃OD): δ 0.89 (3 H, t); 2,0 (10 H); 2,12 (2 H, m); 5,75 (1 H, d); 6,16 (2 H, m); 7,21 (1 H, m).

Diese Verbindung war mit der durch saure Hydrolyse von BU-2867T A erhaltenen 2,4-Dodecadiencarbonsäure identisch. Der n-Butanolextrakt wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, um das Ausgangsmaterial BU-1867T A (160 mg, 11%) zurückzugewinnen.

Aus der obigen Beschreibung ist ersichtlich, daß die Verbindungen VIII und XI wertvolle Zwischenverbindungen sind, die zur Herstellung der verschiedenen erfindungsgemäßen antibiotischen Verbindungen brauchbar sind. Eine übliche Acylierung, beispielsweise mit einem gemischten Anhydrid einer Carbonsäure mit einem Kohlensäurealkylester (HOCOOR), ergibt die erforderliche Peptidbindung (Advanced Organic Chemistry, Fieser & Fieser, Seiten 1039-1046, Reinhold Publishing Corporation, New Yor, 1965). Die Hydroxygruppen kann man in üblicher Weise schützen, beispielsweise als Tetrahydropyranyl- oder t-Butylether. Die Acylierung der Amingruppe von VIII mit den Säuren liefert BU-2867T A, B und C. BU-2867T A wird beispielsweise durch Umsetzen von VII und VIII herstgestellt. Eine Mischung von VII (15 mg), N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid (10 mg) und 1-Hydroxy-1,2,3-benzotriazol (8 mg) in 2 ml Dimethylformamid wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend gab man Verbindung VIII (10 mg) zu der Mischung und setzte das Rühren über Nacht fort. Die Lösung wurde zu einem Rückstand konzentriert, der an Umkehrphasen- Silika (C₁₈, 40 ml) unter Eluieren mit 80%igem Methanol chromatographiert wurde. Die aktiven Eluate wurden verdampft und der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC (Säule: SSD-ODS-842, mobile Phase: 90%iges wäßriges Methanol) gereinigt. Verdampfen der aktiven Peak-Fraktion ergab BU-2867T A (7,4 mg; Ausbeute 28%), das in allen Belangen mit dem natürlichen Antibiotikum identisch war. TLC (silanisiert EtOH-H₂O = 55 : 45); R_f: 0,45; HPLC (Lichrosorb RP-18, EtOH-H₂O = 65 : 35) Rt: 6,43 min.

BU-2867T A kann auch durch Umsetzen von V mit XI hergestellt werden. Eine Dimethylformamidlösung (1 ml) von V (3,4 mg), N,N′Dicyclohexylcarbodiimid (3,7 mg) und 1-Hydroxy-1,2,3-benzotriazol (2,8 mg) wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Zu der Lösung gibt man XI (5 mg), man rührt die Mischung weitere 3 h und konzentriert dann im Vakuum. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und mittels präparativer HPLC unter Verwendung der gleichen Säule und der gleichen mobilen Phase wie oben beschrieben gereinigt. Man erhält 4 mg BU-2867T A, Ausbeute 45%. Die Identität mit natürlichem BU-2867T A wurde durch einen direkten Vergleich bestätigt.

Die Verbindung XI kann aus Verbindung VIII unter Anwendung üblicher Verfahren hergestellt werden. Zu einer Mischung von N-t-Butoxycarbonyl-L-threonin (44 mg), N,N′-Dicyclohexylcarbodiimid (40 mg) und 1-Hydroxy- 1,2,3-benzotriazol (30 mg) in Dimethylformamid (4 ml) gab man bei Raumtemperatur unter Rühren VIII (40 mg). Die Mischung wurde im Vakuum zu einem Rückstand eingeengt, der an einer Umkehrphasen-Silikasäule (C₁₈, 40 ml) mit einer Methanol/Wasser-Mischung (Mischungsverhältnisse: 1 : 9 bis 2 : 3) chromatographiert wurde. Die entsprechenden Fraktionen wurden zusammengegeben, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man N-BOC-L-Threonyl-VIII (= BOC-XI) erhielt. Ausbeute 51 mg, 69%.
ν@V:KBr:c=o: 1690 und 1640 cm^-1.
¹H-NMR (8= MHz): δ _ppm in DMSO-d₆: 1,00 (3 H, d); 1,22 (3 H, d); 1,35 (9 H, s); 6,11 (1 H, d); 6,33 (1 H, d-d) etc.

Eine Mischung von BOC-XI (36 mg) und Ameisensäure (1 ml) wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Mischung konzentriert, mit Wasser (1 ml) verdünnt, der pH auf 10,0 eingestellt und die Mischung auf eine Umkehrphasen-Silikasäule (C₁₈, 20 ml) gegeben. Nach dem Entwickeln mit Wasser, wobei das Eluat mittels Ninhydrin-Test verfolgt wurde, wurden die entsprechenden Eluate vereinigt und gefriergetrocknet, wobei man XI als weißen Feststoff erhielt. Ausbeute 25 mg, 88%.
ν@V:KBr:c=o: 1650 cm^-1.
¹H-NMR δ _ppm in DMSO-d₆: 1,04 (3 H, d); 1,22 (3 H, d); 6,14 (1 H, d); 6,42 (1 H, d-d); 7,35 (1 H, t, NH); 7,98 (1 H, d, NH); 8,65 (1 H, d, NH) etc.
EI-MS: M⁺ m/z 342.

Es ist demnach möglich, die erfindungsgemäßen antibiotischen Verbindungen durch Umsetzung der Verbindungen VIII und XI mit den entsprechenden Säuren, gleich welcher Herkunft, herzustellen. Weiter kann man unter Benutzung der Verbindungen VIII und XI erfindungsgemäße Verbindungen, insbesondere die in höherer Ausbeute erhältlichen Verbindungen, zur Herstellung anderer erfindungsgemäßer Verbindungen verwenden. Beispielsweise kann man BU-2867T A, das durch Fermentation in höherer Ausbeute erhalten wird, zur Herstellung von BU-2867T B und BU-2867T C, wie oben erläutert, durch enzymatische Hydrolyse und Umsetzung mit der gewünschten Säure verwenden.

Die Ausbeute an BU-2867T und die Verteilung der, wie oben beschrieben, durch Fermentation erhaltenen Fraktionen A, B und C kann modifiziert werden, indem man verschiedene Fette und Öle und bestimmte grenzflächenaktive Mittel zu dem Medium gibt, in dem Polyangium brachysporum K481-B101 kultiviert wird. So erhöht beispielsweise die Zugabe von Sojabohnenöl, Maisöl, Olivenöl, hydriertem Pflanzenöl, Schweinefett und, in geringem Ausmaß, Talg die Gesamtausbeute von BU-2867T. Fette und Öle mit einem hohen Gehalt an Linolsäure (C_{18 : 2}), wie Sojabohnenöl, Maisöl und Schweinefett führen zu einer Vermehrung des bei der Herstellung gebildeten BU-2867T B. Öle, wie Olivenöl, mit einem hohen Gehalt an Oleinsäure (C_{18 : 1}) führen zu einer Erhöhung des BU-2867T C-Anteils. Hydrierte Pflanzenöle, die reich an Stearinsäure (C_{18 : 0}) sind, erhöhen lediglich die Menge an gebildetem BU-2867T A.

Antimikrobielle Aktivität

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von BU-2867T A, B und C wurden gegenüber verschiedenen Mikroorganismen anhand der Reihen-Agar-Verdünnungsmethode bestimmt. Für Bakterien verwendete man Nähragar (Eiken) und für Pilze Sabourauddextroseagar (Difco). Die Inokulumgröße wurde für Bakterien auf 10⁴ CFU/ml für Pilze auf 10⁵-10⁷ CFU/ml eingestellt.

Tabelle 5 zeigt die in vitro antibakteriellen Aktivitäten von BU-2867T A, B und C. Die Komponenten A und C inhibierten das Wachstum sowohl vom gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien bei 50 mcg/ml nicht, während die Komponente B mäßige Aktivität gegenüber einigen gram-positiven Bakterien zeigte.

Die antifungische Aktivität der BU-2867T-Komponenten ist in Tabelle 6 zusammengestellt. Die Komponente C zeigte starke antifungische Aktivität gegenüber klinisch wichtigen pathogenen Pilzen, wie Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Trichophyton mentagrophytes und Mucor spinosus. Die Komponenten A und B waren etwas weniger aktiv als die Komponente C, ihr antifungisches Spektrum war jedoch ähnlich dem der Komponente C.

Tabelle V

Antibakterielles Spektrum der BU-2867T-Komponenten

Tabelle VI

Antibakterielles Spektrum der BU-2867T-Komponenten

Antitumoraktivität

Die Antitumoraktivität von BU-2867T A, B und C wurde bei weiblichen CDF₁- und männlichen BDF₁-Mäusen bestimmt. Lymphozytische Leukämiezellen P388 (CDF₁- und BDF₁-Mäuse) und lymphoide Leukämiezellen L1210 (BDF₁-Mäuse) wurden durch intraperitoneale Injektion von 0,8 ml verdünnter Ascites-Flüssigkeit, die 10⁶ bzw. 10⁵-Zellen pro Maus enthielt, inokuliert. Melatonisches Melanom B16 (BDF₁-Mäuse) wurde mittels 0,5 ml eines 10%-igen Tumorbreis intraperitoneal implantiert. Die Testmaterialien wurden in 0,9%-iger Kochsalzlösung, die 10% Dimethylsulfoxid enthielt, gelöst. Bestimmte Dosen dieser Lösung wurden den Mäusen intraperitoneal 24 h nach der Tumorimplantation verabreicht. Als Vergleichsverbindungen wurden in diesen Versuchen Olivomycin (NSC 38270) oder Mitomycin C herangezogen. BU-2867T A, B und C zeigen nach dem Behandlungschema 1 (einmalige tägliche Verarbreichung an den Tagen 1, 4, und 7) Antitumoraktivität gegen P388-Leukämie. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt, ausgedrückt als prozentuales Verhältnis der Erhöhung der mittleren Überlebenszeit (MST) der Testtiere (T) und der Kontrolltiere (C) bei verschiedenen Dosierungen. Werte für das prozentuale Verhältnis von 125 und höher bedeuten signifikante Antitumorwirkung.

Tabelle VII

Antitumor-Aktivität der BU 2867 T-Komponenten gegen P388-Leukämie

BU-2867T A und C waren im Behandlungschema 2 (Verabreichung einmal täglich an den Tagen 1 bis 9) hoch wirksam gegen P388-Leukämie. BU-2867T A war weniger aktiv gegen L1210-Leukämie und B16-Melanom. In Tabelle VIII sind die erhaltenen Ergebnisse für verschiedene Dosierungen zusammengestellt, ebenfalls ausgedrückt als prozentuales Verhältnis der Erhöhung der mittleren Überlebenszeit, wobei Werte von 125 und höher signifikante Antitumorwirkung bedeuten.

Tabelle VIII

Antitumor-Aktivität von BU2867T A und C

Die akute Toxizität von BU-2867T A und C wurde bei männlichen ddY-Mäusen durch intraperitoneale Einzelverabreichung bestimmt. Die LD₅₀-Werte waren 8,1 mg/kg und 25 mg/kg.

Die pharmakologisch wirksamen erfindungsgemäßen Verbindungen können anhand herkömmlicher Methoden der pharmazeutischen Technik in pharmazeutische Präparate zur oralen oder parenteralen Verabreichung an z. B. Säugetieren einschließlich des Menschen verarbeitet werden. Übliche Exzipientien sind pharmazeutisch verträgliche organische oder anorganische Trägersubstanzen, die geeignet sind zur parenteralen, enteralen oder topischen Verabreichung und die mit den Wirkstoffen nicht nachteilig reagieren. Geeignete pharmazeutische verträgliche Träger umfassen beispielsweise und ohne darauf beschränkt zu sein, Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Gummi arabikum, Pflanzenöle, Polyethylenglykole, Gelatine, Lactose, Amylose, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, Petrolatum, Parfümöle, Fettsäuremonoglyceride und -diglyceride, Pentaerythrit-Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Polyvinylpyrrollidon und dergleichen. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert und gewünschtenfalls mit Hilfsstoffen vermischt werden, wie Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisierungsmitteln, Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflußung des osmotischen Drucks, Puffern, Farbstoffen, Geschmacksstoffen und/oder aromatischen Substanzen und dergleichen, die die Wirkstoffe nicht nachteilig beeinflussen.

Für die parenterale Verabreichung besonders geeignet sind injizierbare sterile Lösungen, vorzugsweise ölige oder wäßrige Lösungen, wie Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, einschließlich Suppositorien. Ampullen sind zweckmäßige Dosiseinheiten.

Zur enteralen Verabreichung besonders geeignet sind Tabletten, Dragees, Suppositorien oder Kapseln mit Talk und/oder einem Kohlehydrat als Träger oder Bindemittel oder dergleichen, wobei der Träger vorzugsweise Lactose und/oder Maisstärke und/oder Kartoffelstärke ist. Man kann auch einen Sirup, ein Elixier oder dergleichen verwenden, wobei ein gesüßter Träger zur Anwendung kommt. Man kann auch Zusammensetzungen mit verzögerter Wirkstofffreigabe, einschließlich derjenigen, bei denen der Wirkstoff durch unterschiedlich abbaubare Überzüge geschützt ist, formulieren, z. B. durch Mikroverkapselung, Mehrfachbeschichtung usw. Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Einheitsdosisform in einem pharmazeutischen verträglichen Träger, der die jeweilige Dosierung enthält, gegeben. Die Dosierung der Verbindungen beträgt erfindungsgemäß im allgemeinen 5 bis 250 mg/Tag bei Verabreichung an Patienten, beispielsweise Menschen, mit einem Gewicht von 75 kg. Geeignete Dosierungen und Dosierungspläne bei einem bestimmten Wirt kann man anhand üblicher Betrachtungen erstellen, beispielsweise durch den Vergleich der unterschiedlichen Aktivitäten der jeweiligen Verbindung und eines bekannten Antibiotikums oder Antitumormittels beispielsweise anhand eines geeigneten, üblichen pharmakologischen Protokolls.

Anhand der obigen Beschreibung kann der Fachmann das Wesen der Erfindung leicht feststellen und zur Anpassung an verschiedene Anwendungsgebiete und -bedingungen Veränderungen und Modifizierungen vornehmen, ohne den Bereich der vorliegenden Verbindung zu verlassen.

Claims

1. Verbindungen der allgemeinen Formel: worin R für CH₃-(CH₂)₆, CH₃-(CH₂) ₄-CH=CH-(CH_-2)₂ oder CH₃-(CH₂)₈ steht.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R für CH₃-(CH₂)₆ steht.

3. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R für CH₃-(CH₂)₄-CH=CH-(CH₂)₂ steht.

4. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R für CH₃-(CH₂)₈ steht.

5. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der allgemeinen Formel: worin R für CH₃-(CH₂)₆, CH₃-(CH₂)₄-CH=CH-(CH₂)₂ oder CH₃-(CH₂)₈ steht,
dadurch gekennzeichnet, daß man Polyangium brachysporum sp. nov. unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert, das eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff enthält, das gebildete Myzel abtrennt und die Verbindungen aus dem Nährmedium gewinnt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei Polyangium brachysporum sp. nov. um den Stamm K481-B101 handelt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Stamm K481-B101 zusätzlich als ATCC 53080 gekennzeichnet ist.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Fett oder ein Öl zu dem Nährmedium gibt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man das abgetrennte Myzel mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und den Extrakt mit dem Nährmedium vor der Gewinnung der Verbindungen vereinigt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindungen aus dem Nährmedium durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel gewinnt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Produktion der Verbindungen unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus verfolgt.

12. Mikroorganismus Polyangium brachysporum sp. nov.

13. Polyangium brachysporum Stamm K-481-B101.

14. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Polyangium brachysporum sp. nov.

15. Verbindung der Formel:

16. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel: dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel: worin R für CH₃-(CH₂)₆, CH₃-(CH₂)₄-CH=CH-(CH₂)₂ oder CH₃-(CH₂)₈ steht, in Gegenwart von Ficin, Papain oder Chymopapain hydrolysiert.

17. Verbindung der Formel:

18. Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel: dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der allgemeinen Formel: worin R für CH₃-(CH₂)₆, CH₃-(CH₂)₄-CH=CH-(CH₂)₂ oder CH₃-(CH₂)₈ steht,
in Gegenwart von Pseudomonas acylase hydrolysiert.

19. Antifungisches Mittel, enthaltend eine antifungisch wirksame Menge wenigstens einer Verbindung der Ansprüche 1 bis 4, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

20. Antitumormittel, enthaltend eine antitumoral wirksame Menge wenigstens einer Verbindung der Ansprüche 1 bis 4 in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.