LU86564A1 - Antibiotiques peptidiques - Google Patents

Description

t Λ

Arriêre-plan de l'invention

La présente invention concerne de nouveaux antibiotiques peptidiques et leur utilisation comme agents antimicrobiens et antitumoraux. La présente invention concerne aussi des procédés pour préparer ces antibiotiques et leurs intermédiaires, outre le nouveau

CD.MdC. 3F — 1 — cv.imnA

* micro-organisme utilisé pour les préparer par fermentation.

Différents micro-organismes ont déjà été isolés d'échantillons de sol et mis en culture dans un milieu synthétique et se sont révélés élaborer des produits qui manifestent de l'activité antibiotique. La Demanderesse a isolé une nouvelle espèce de bactérie, à savoir K481-B101, d'un échantillon de sol recueilli à proximité du Parthênon à Athènes en Grèce et a découvert qu'elle produit un mélange de peptides qui ont de l'activité antiobiotique.

Un but principal de la présente invention est de procurer de nouveaux antibiotiques peptidiques particulièrement utiles comme agent antifongiques et antitumoraux.

Un autre but de la présente invention est de procurer des procédés avantageux pour préparer ces antibiotiques.

Un autre but encore de l'invention est de procurer des compositions pharmaceutiques contenant ces antibiotiques.

Aperçu de l'invention

Aux différentes fins ci-dessus, l'invention a pour objet un composé de formule : ch3 oh h

E E f-°H

r-ch=ch-ch=ch-co-nh-ch-co-nh-< n >=o 0 CH3 où R représente CH3-(CH2)6f CH3-(CH2)4-*CH=CH(CH2)2 ou CH3-(CH2)8·

Suivant un autre aspect, l'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques contenant ces

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♦ composés, isolément ou en combinaison, en une quantité efficace comme agent antifongique et/ou antitumoral, conjointement avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.

Sous l'aspect de la préparation, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un composé de formule : Çh3 OH h

E E f-°H

R-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CO-NH< M >=0 VHyV^ ch3 oü R représente CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 ou CH3-(CH2)8' suivant lequel on cultive Polyangium brachvsporum sp.nov. dans un milieu nutritif contenant une source assimilable de carbone et d'azote dans des conditions d'aêrobiose, on sépare le mycélium formé et on isole le composé du milieu nutritif.

Sous un autre aspect de la préparation, la présente invention a pour objet les composés

OH E

V-0

2 VNV

ο H I E

CH

3 et

OH H

CH3-CH-CH-CO-NH-/ \-° ÔH Ah2 ° CH 3

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* utiles comme intermédiaires pour la préparation des composés de l'invention, outre les procédés pour préparer ces intermédiaires.

Brève description des dessins

Fig. lr 2 et 3 sont les spectres IR des Bu-2867T A, B et C, respectivement.

Fig. 4 et 5 sont les spectres RMN de et RMN de 13c du BU-2867T A.

Description détaillée de l'invention

Les caractéristiques de morphologie, de culture et de physiologie de K481-B101 ont été établies suivant les procédés décrits par McCurdy, Jr. H.D. : Studies on the Taxonomy of the Myxobacterales. II, Polyangium and the demise of the Sorangiaceae. Intl. J. Syst. Bacteriol. 20^ : 283-296, 1970; Reichenbach, H. : Nannocystis exedens gen. nov., sp. nov., a new myxobac-terium of the family Sorangiaceae. Arch. Mikrobiol. 70 : 119-138, 1970; Christensen, P. et F.D. Cook :

Lysobacter, a new Genus of nonfruiting, gliding bac-teria with a high base ratio. Intl. J. Syst. Bacteriol. 28 ; 367-393, 1978; et Christensen, P. s Synonymy of

Flavobacterium pectinovorum Dorey with Cytophaga johnsonae Stanier. Intl. J. Syst. bacteriol. J27 : 122-132, 1977. L'entretien de la culture et sa purifi cation ont été effectués suivant les modes opératoires décrits par Peterson, J.E. : Isolation, cultivation and maintenance of the myxobacteria. Methods in Microbio-logy 3B : 185-210, 1969. Edit. J.R. Norris and D.W. Ribbons. Academie Press (Londres et New York); et Reichenbach, H et M. Dworkin : The Order Mixobac- terales. The Prokaryotes. Volume I : 328-355, 1981.

Edit. M.P. Starr et al. Springer-Verlag (Berlin, Heidelberg et New York). La position taxonomique a été déterminée conformément aux descriptions du Bergey's Manual, 8ême édition, 1974 et de "The Prokaryotes,

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*

Volume 1".

Morphologie

La gélose à la casitone Mg++, la gélose à la chitine, la gélose à la levure et la gélose â la déjection de lapin ont été utilisées pour l'étude morphologique. K-481-B101 est une bactérie non flagellée Gram-négative. Les cellules végétatives sont cylindriques (0,6-0,8 sur 2-10 ymm) avec extrémités arrondies mousses. Les cellules végétatives ont des mouvements de glissement flexibles et lents sur la surface humide d'un milieu à la gélose ou sur un milieu gélosé mou. Les myxospores différent nettement des cellules végétatives, sont ovales ou sphériques, ont des dimensions de 0,6-0,8 sur 0,6-1,5 jm, sont réfringentes ou non réfringentes et forment occasionnellement des paires. K481-B101 forme sur la plupart des milieux descriptifs à la gélose des sporanges sessiles enveloppant les myxospores. Les sporanges sont ovales, sphériques ou en coussinets, de dimensions largement variables, 12x20 à 80x120 jm, souvent délimités par une enveloppe commune ou couche gluante, présentent un contour double et se présentent soit isolément, soit en amas (sores). La morphologie de K481-B101 est détaillée au tableau X.

Caractéristiques de culture K481-B101 croît modérément sur la gélose à la casitone Mg++ (McCurdy, 1969) et la gélose à la levure (Christensen and Cook, 1978), mais médiocrement sur la gélose nutritive Bacto ou la gélose â l'infusion de coeur Bacto. Des essaims rhizoïdes ou duveteux sont observés sur la gélose molle YP (extrait de levure 0,3%, peptone 0,1%, NaCl 0,01%, gélose 0,3%, pH 6,6-6,8), mais non sur la gélose à la casitone Mg++. Les colonies sur gélose à la casitone Mg++ sont circulaires, translucides et jaune verdâtre pâle et donnent

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« lieu à une attaque, une érosion ou une pénétration faible dans la gélose. Les caractéristiques de culture sont reprises au tableau II.

Caractéristiques physiologiques K481-B101 hydrolyse l'amidon, la chitine, la gélatine et la caséine, mais n'hydrolyse pas la cellu-lose et la gélose. Les cellules de levure autoclavëes sont lysées, mais non les cellules vivantes de Micro-coccus luteus. K481-B101 est mésophile et sensible au NaCl à 2%. Les caractéristiques physiologiques sont détaillées au tableau III.

Concomittance de bactéries flagellées et existence de variants spontanés

La concomittance de bactéries Gram-négatives en forme de bâtonnets flagellés a été observée dans la culture d'origine. K481-B101 se purifie relativement bien par combinaison des techniques habituelles de dilution et d'isolement d'une cellule unique avec exposition aux ultrasons, de traitement par choc thermique ou de sensibilité aux antibiotiques (par exemple l'acide pipémidique à 50 yug/ml) s'appliquant au myxospore ou corps fructifère. La culture non purifiée de K481-B101 contenait des variants mucoïdes formant une colonie en dôme blanchâtre avec un halo en essaim. Les cellules végétatives de ces variants mucoïdes sont un peu plus grandes que la souche d'origine et ont des dimensions de 0,8-1,0 sur 2,0-3,5 fixa. L'amas de sporanges (sores) est formé principalement par les variants mucoïdes.

Position taxonomique K481-B101 est une bactérie fructifère glissante isolée d'un échantillon de terre. Les caractéristiques diagnostiques principales de la souche sont les suivantes :

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»

Cellules végétatives : 1) cylindriques, de diamètre uniforme 2) non effilées aux extrémités 3) capables de pénétrer dans les milieux gélosés 4) n'adsorbent pas le rouge Congo Myxospores : 1) différenciées à partir des cellules végétatives 2) ovales ou sphériques 3) réfringentes ou non réfringentes Sporanges : 1) sessiles 2) ovales, sphériques ou irréguliers 3) souvent entourés d'une enveloppe commune ou couche gluante 4) à double contour 5) jaune pâle (absence de coloration distinctive) 6) se présentent isolément ou en amas (sores) Caractéristiques de culture et de physiologie : 1) colonie jaune or à blanchâtre 2) les colonies attaquent, érodent ou pénètrent faiblement la gélose 3) chitinolytique, mais non cellulolytique 4) lyse des cellules de levure, mais pas de lyse de Micrococcus luteus.

Les caractéristiques de morphologie, de culture et de physiologie précitées de K481-B101 indiquent que ce dernier appartient S l'ordre des Myxobacterales. Parmi les genres des Myxobacterales, les genres Myxococcus, Archangium et Cystobacter se différentient de K481-B101 par la forme effilée des cellules végétatives et la morphologie du corps fructifère, Les genres Melittangium, Stiqmatella et Chondro-myces diffèrent de K481-B101 par les sporanges sur tige.

K481-B101 ressemble aux genres Polyangium et CD.MdC.3F - 7 - SY-1820A

*

Nannocystis. K481-B101 ressemble au genre Nannocystis par la formation de myxospores ovales ou sphériques et des sporanges ovales ou sphériques solitaires, mais diffère de ce dernier genre par les cellules végétatives cylindriques de diamètre uniforme et l'absence de . capacité à attaquer, éroder ou pénétrer la gélose.

K481-B101 ressemble au genre Polyangium par les cellules végétatives cylindriques avec extrémités arrondies mousses, la formation prépondérante de myxospores non réfringentes et les sporanges ovales ou sphériques à double contour. Sur base des résultats des études comparées avec les genres de l'ordre des Myxobacte-rales, K481-B101 est considéré comme étant une espèce du genre Polyangium. Parmi les espèces de Polyangium, P. luteum est semblable à K481-B101 par la dimension des cellules végétatives, la coloration et la forme des sporanges, de même que la coloration de la colonie végétative. Néanmoins, K481-B101 diffère de P^ luteum par les myxospores ovales ou sphériques qui sont beaucoup plus contractées et par l'absence d'aptitude â lyser les cellules bactériennes vivantes, par exemple les cellules de Micrococcus luteus.

Dès lors, K481-B101 apparaît comme étant une nouvelle espèce du genre Polyangium dans la famille des Polyangiaceae, de l'ordre des Myxobacterales, et est proposé pour recevoir la désignation Polyangium bra-chysporum sp., nov. La souche type est K481-B101 ^ (isolat unique) et la culture déposée à 1'American Type

Culture Collection a reçu le n° ATCC 53080.

TABLEAU I

Morphologie de K481-B101

Cellules végétatives : Gram-négatives, cylindriques avec extrémités arrondies mousses (0,6-0,8 sur 2,0-10 yuun). Pas d'adsorption du rouge

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t *

Congo.

Myxospores : Discernables des cellules végé tatives. Beaucoup contractées, devenant ovales ou sphériques, 0,6-0,8 sur 0,6- 1,5 j&n, non réfringentes. Une incubation plus longue donne des myxospores réfringentes.

Sporanges : Sessiles, se présentant isolé ment ou en amas. Ovales, sphériques, en coussinets ou amorphes. Très variables en dimensions, 12x20 à 80x120 yan. Enfermées dans une enveloppe commune ou couche gluante. Double contour. Enfoncées dans la gélose. Les amas de 2 à 10 sporanges ou davantage ont une dimension de 50 à 300 jm de masse totale.

Microcolonie : Sur gélose à la chitine après 2 semaines d'incubation. Agencement en palissade ou zigzag de chaînes de cellules végétatives sur la périphérie. Mouvement de glissement de cellules isolées observable, mais non celui de masses de cellules.

TABLEAU II

Caractéristiques de culture de K481-B101 en colonie sur gélose à la casitone Mg++ (McCurdy, 1969) à 28°C pendant 6 jours

Forme : circulaire

Surface i lisse, ultérieurement partiellement plis- sée

Elévation î en relief

Bord : entier ou quelque peu irrégulier, absence de saillies distinctes telles que formes de langues, plumes ou rhizoïdes

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Propriété optique : semi-transparente ou optique

Couleur de la colonie : jaune verdâtre pâle Pigment diffusible s néant

Croissance sur gélose à la chitine après incubation de 3 semaines à 28°C.

Mince, translucide, jaune pâle ou incolore. Epaisse, opaque et blanc jaunâtre à la périphérie. Formation concentrique de sporanges à la périphérie. Attaque, érode ou pénétre faiblement la gélose.

TABLEAU III

Caractéristiques physiologiques de K481-B101 Hydrolyse de

Amidon soluble +

Amidon de pomme de terre +

Carboxyméthylcellulose sodique +

Cellulose - Gélose

Chitine +

Alginate de sodium -

Polypectate de sodium Gélatine +

Caséine +

Croissance sur Gélose au citrate de Simon Gélose au citrate de Christensen Gélose aux sels d'ammonium et glucose Gélose aux sels d'ammonium et asparagine +

Production de

Indole - H2S +

Acétoxne (réaction de VP)

Uréase +

Oxydase +

Catalase +

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»

Action lytique sur

Cellule vivante de souche de Micrococcus luteus PCI 1001 et ATCC 9341

Cellule de levure autoclavée + Réactions

Coagulation du lait : -Peptonisation du lait : +

Tolérance au NaCl : Croissance : NaCl à 1,0% et moins.

Pas de croissance sNaCl à 2,0% et plus

Tolérance au pH î Intervalle de croissance : pH 5,5-10,5.

Croissance faible : pH 5,0,

Pas de croissance ï pH 4,5 et 11,5

Température de croi-

sance : Croissance maximale : 37°C

Intervalle de croissance : 15-42°C

Pas dè croissance ; 10 et 45°C

Réaction d'oxydation ou fermentation : Oxydation (milieu de Hugh et Leifson)

Production d'antibiotique

La culture d'origine de Polyangium brachy-sporum K481-B101 a été propagée à 28°C pendant 3 jours sur un milieu gélose incliné composé de 0,5% d'amidon soluble, de 0,5% de glucose, de 0,1% d'extrait de viande, de 0,1% d'extrait de levure, de 0,2% de Nz-' case, de 0,2% de NaCl, de 0,1% de CaCOß et de 1,6% de gélose (pH 7,0). Une culture sur gélose inclinée ayant eu une bonne croissance a été utilisée pour inoculer le milieu végétatif consistant en 2% d'amidon de maïs, 3% de farine de soya, 0,3% de MgSO4.7H20 et 1% de CaCC>3

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r (pH 7,0 avant stérilisation). Après 3 jours d’incubation à 28°C sur une secoueuse rotative (250 tours par minute), 5 ml de la culture ont été transférés dans un Erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml du milieu de production ayant la même composition que le milieu végétatif.

La production d'antibiotique a été observée par diffusion dans la gélose à partir de disques de * papier au moyen de Candida albicans A9540 comme orga nisme d'épreuve. La fermentation a été poursuivie pendant 4 jours à 28°C sur une secoueuse rotative et la production d'antibiotique a atteint un maximum de 100 jug/ml.

La fermentation a été exécutée aussi dans une cuve de fermentation â agitateur. Une aliquote de 500 ml de la culture d'ensemencement, obtenue par fermentation en flacon, a été utilisée pour inoculer 10 litres du milieu de production dans une cuve de 20 litres. La fermentation a été exécutée à 28°C sous agitation â 250 tours par minute et aération à 10 litres par minute. La production d'antibiotique a atteint un maximum de 150 yug/ml après 48 heures de fermentation.

Isolement et purification de l'antibiotique

Le bouillon de fermentation (48 litres) a été centrifugé dans une centrifugeuse Sharpless. Le gâteau mycélien a été homogénéisé avec 7 litres de méthanol et le mélange a été agité pendant 1 heure. Après séparation des insolubles par filtration, l'extrait métha-nolique a été évaporé en une solution aqueuse qui a été combinée avec le filtrat du bouillon et l'extrait n-butanolique (24 litres). L'extrait a été concentré à 0,5 litre, puis versé dans du n-hexane (3,5 litres) sous agitation pour faire précipiter l'antibiotique brut (41 g). Ce solide a été chromatographié sur une

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colonne de gel de silice 0200 (760 ml) ëluée à l'acétate d'éthyle avec une quantité croissante de méthanol (0-50%). L'activité biologique êluée a été détectée par dosage avec disques de papier au moyen de Candida albicans 08540 comme organisme d'épreuve. Les fractions actives ont été combinées et évaporées pour donner une poudre jaune pâle (13 g) du complexe BU-2867T. Une fraction de 200 mg de ce solide a été chromatographiée ~ sur une colonne â inversion de phase (C^ß, 100 mU

éluée avec de l'éthanol-eau (3:7 à 5:5). L'élution a été suivie par dosage antifongique et CCM (silanée, éthanol: eau=55:45). Les premières fractions actives ont été combinées et évaporées sous pression réduite pour donner un solide blanc pur formé de BU-2867T A (61 mg) dont la cristallisation dans le méthanol aqueux a donné un dépôt d'aiguilles incolores (34 mg). La seconde fraction active et la troisième ont donné par évaporation le BU-2867T B (1 mg) et C (11 mg), respectivement. Cristallisé dans le méthanol, le BU-2867T C a donné des aiguilles fines. La répétition de la chromatographie avec inversion de phase comme ci-dessus a donné au total 3,9 g de BU-2867T A, 44 mg de BU-2867T B et 342 mg de BU-2867T C.

Caractérisation de l'antibiotique

Le BU-2867T A et le BU2867T C ont été isolés à l'état d'aiguilles incolores, tandis que le BU2867T B a été isolé à l'état de poudre amorphe blanche. Ils sont aisément solubles dans le méthanol, l'éthanol, le n-butanol et le diméthylsulfoxyde, faiblement solubles dans le chloroforme, l'acétonitrile et l'acétate d'éthyle et pratiquement insolubles dans le n-hexane et l'eau. Ils donnent une réaction positive avec le réactif de Rydon-Smith et une coloration par pulvérisation d'iode ou d'acide sulfurique sur une plaque CCM. Ils donnent une réaction négative à la ninhydrine, de

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t ! : i I ! . ; u

Sakaguchi, à 1'anthrone et de Dragendorff. L'analyse de BU-2867T A, B et C par spectrométrie de masse et microdosage indiquent C27H44N406* C29H46N4O6 et C29H48N4°6' respectivement. Les spectres UV des trois composants dans le méthanol comprennent un maximum unique à 261 nm, qui n'est pas déplacé en solution acide ou alcaline. Les propriétés physicochimiques des BU-2867T A, B et C sont résumées au tableau IV. Leurs ^ spectres IR dans le KBr (Fig. 1, 2 et 3) comprennent des bandes intenses d'amide au voisinage de 1630 et 1540 cm-l et une absorption OH et/ou NH à 3300 cm“1. Le spectre RMN de !h de BU-2867T A (Fig. 4) révèle la présence de six protons oléfiniques ( 6: 6,16, 6,20 (2H), 6,28f 6,49 et 7,09 ppm) et de quatre protons d'amide (6 : 7,49, 7,82, 7,87 et 8,72 ppm). Deux radicaux méthyle (6 î 0,93 ppm, t et 1,07 ppm, d) sont également observables dans le spectre. Le spectre RMN de 1 de BU-2867T A (Fig. 5) comprend plus de 23 signaux du carbone, notamment quatre atomes de carbone carbonyliques, six atomes de carbone olêfiniques et trois atomes de carbone mêthyliques. Les BU-2867T B et C ont des spectres RMN de très sembla bles à celui de BU-2867T A, sauf la présence de deux atomes de carbone oléfiniques de plus dans BU-2867T B et de deux atomes de carbone méthyléniques de plus dans BÜ-2867T C que dans BU-2867T A.

Le BU-2867T A a été chauffé au reflux dans le HCl 6N pendant 16 heures. Après élimination du produit lipophile (V) par extraction dans l'acétate d'éthyle, l'hydrolysat a été concentré en un résidu huileux qui a été Chromatographiê sur résine êchangeuse d'ions Dowex 50W x 4 développée au moyen du tampon pyridine-acide formique-acide acétique (0,1-0,2M, pH 3,1-5,1). Sous observation par réaction avec la ninhydrine, quatre aminoacides I, II, III et IV, élués dans l'ordre

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indiqué, ont été isolés et cristallisés à l'état des chlorhydrates. L'aminoacide I : -12,7° dans HCl 5N) a été identifié comme étant la L-thréonine d'après ses propriétés physicochimiques. Le spectre RMN de 1h et le spectre SM IE (M++l:m/z 134) de l'aminoacide Il ont indiqué qu'il consiste en un mélange des diastérëoisomêres de l'acide 4-amino-3-hydroxy-n-valé-rique, Konishi, Μ.; K. Saito, K. Numata, T. Tsuno, ^ K. Asama, H. Tsukiura, T. Naito et H. Kawaguchi î

Tallysomycin, a new antibiotic complex related to bleomycin. II. Structure détermination of tallysomycins A and B. J. Antibiotics 30 : 789-805, 1977, et son identité a été confirmée par comparaison directe avec l'échantillon authentique. L'analyse élémentaire et la spectrométrie de masse par ionisation électronique (M+:m/z 115) attribuent la formule moléculaire C5H9NO2 à l'acide III. Son spectre RMN de révèle la présence d'un proton méthylique (6: 1,50 ppm, d, J:6,0 Hz), d'un proton méthinique (6: 4,0-4,2, m) et deux protons trans oléfiniques (6 : 6;05 ppm, d, Jï15,0 Hz et 6,57 ppm, d-d, J:6,0 et 15,0 Hz). Ces données spectroscopiques indiquent clairement que l'acide III est l'acide 4-amino-2(E)-penténoïque, Honoré, T.; H. Hjeds, P. Krogsgaard-Larsen et T.R. Christiansen: Synthesis and Structure-Activity Studies of Analogs of /-amino-butyric Acid (GABA). Eur. J. Med. Chem., 13:429-434, 1978. La rotation spécifique 5:-6° dans HCl 5N) attribue la configuration 2(S) à l'acide III. L'analyse élémentaire (C5H14N2O3), le spectre de masse par ionisation électronique (M + l:m/z 163) et le spectre RMN de ^H (8 : 1,8-2,1 ppm 4H, m, 3,18 ppm, 2H, t et 3,6-4,3 ppm, 2H, m) et la formation d'une X~ lactone ( 1) C=0 : 1770 cm_l) par réaction avec HCl 6N indiquent que l'aminoacide IV est la 4-hydroxy-lysine, Izumiya, N.; Y. Fujita, F. Irreverre et B. Witkop: The

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Synthesis of Erythro-Y-hydroxy-L-lysine and its Nonoc-currence in Collagen. La mutarotation des 4-hydroxy-lysines est mentionnée dans Biochemistry jï: 2501-2606, 1965, et le déplacement observé pour IV indique la configuration ërythro-L. Par conséquent, l'aminoacide IV est l'érythro-4-hydroxy-L-lysine.

La fraction acide lipophile (V) obtenue au cours de l'hydrolyse acide ci-dessus a été traitée au moyen de diazomëthane pour donner l'ester mêthylique huileux (VI) après purification chromatographique. Son spectre UV (Amax^* : ^60 nm' £ :22000), son spectre de masse par ionisation électronique (M+ : m/z 210) et son spectre RMN de 1h (quatre -CH=, un C-CH3 et six -CH2-) indiquent que le composé Vi est le 2,4-dodécadiénoate de méthyle. La valeur de la constante de couplage rend évident que les deux doubles liaisons sont de type trans. L'acide V d'origine est donc l'acide 2(E),4(E)-dodécadiénoïque, Bürden, R.S. et L. Crombie : Amides of Vegetable Origin, Part XII. A new sériés of alka-2,4-dienoic tyramine-amides from Anacyclus pyrethrum D.C. (Compositae). J. Chem. Soc. (C), 1969: 2477-2481, 1969).

I : L-thrëonine CH 3-CH-CH-C00H I I OH NH2 II : Acide 4-amino-3-hydroxy-n-valêrique

CH3-CH-CH-CH2-COOH

nh2oh III : Acide 4(S)-amino-(2-E)-penténoïque ch3-ch-ch=ch-cooh nh2

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IV : Erythro-4-hydroxy-lysine NH 2-CH2-CH 2-CH-CH 2“ÇH-COOH OH NH 2 V : Acide 2(E),4(E)-dodécadiénoïque

CH3-(CH2)6“CH=CH-CH=CH-COOH

Le BU-2867T A répond à la formule moléculaire " c27h44n4°6 et son spectre RMN de -^C révèle six atomes de carbone oléfiniques et quatre atomes de carbone amidiques. Il est ainsi apparent que l'aminoacide II est un produit non significatif résultant de l'hydratation de l'aminoacide III naturel pendant l'hydrolyse acide. L'antibiotique devrait être un peptide cyclique du fait qu'il donne une réaction négative avec la ninhydrine et ne manifeste aucune fonction titrable lors du titrage potentiométrique. Cette proposition est confirmée par le fait que le BU-2867T A donne un dérivé di-O-acêtylê (SM IE : M+=m/z 604, RMN de 1® : 2,02 ppm, 3H et 2,08 ppm, 3H). Le spectre de masse de l'acétate indique aussi de fortes intensités d'ions fragmentaires à m/z 179 et 322 suggérant la présence d'un système V-?I-*séquence dans l'antibiotique.

Le BU-2867T A a été soumis à la dégradation enzymatique par la ficine dans du tampon au phosphate 0,01M (pH 7,0). Après acidification jusqu'à pH 2,2, le mélange de réaction a été extrait au n-butanol pour l'isolement d'un composé acide (VII). L'extraction ultérieure de la solution aqueuse à pH 10,0 au moyen de n-butanol a donné une substance (VIII) positive à la ninhydrine. Le spectre IR (^c=o;1720 et 1650 cm"l), le spectre de masse par ionisation électronique (M+-H20ïm/z 279 et M+-Thr;m/z 179) et le spectre RMN de 1h indiquent que le composé VII est la 2,4-dodécadiénoyl-thréonine (V-^I). Cette structure est confirmée par le

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fait que le composé VII donnent les composés I et V par hydrolyse dans le HCl 6N. Par chauffage au reflux dans le HCl 6N, le composé VIII donne les aminoacides II, III et IV, comme indiqué par la CCM. Dans le spectre de masse par ionisation électronique du composé VIII, l'ion moléculaire apparaît à m/z 241, ce qui indique une structure cyclique du peptide. Le spectre RMN de ^H (270 MHz dans le DMSO-dg) révèle deux protons d'amide - NH à 7,43 ppm (triplet) et 9,10 ppm (large) en accord avec la structure cyclique précitée. Le découplage expérimental approfondi révèle que le radical amino du composé III et le radical é-amino du composé IV sont unis à des radicaux carbonyle formant des radicaux amide, tandis que le radical ^-amino du composé IV est libre. Par conséquent, les structures des composés VII et VIII sont les suivantes : çh3

E E CHOH

VII ch3- ( CH 2 ) 6 "CH =CH”CH =CH "C0“NH"CH “C00*1

OH H

vni NH2~Ç\^X^ 0 ch3

Les composés VII et VIII ont été obtenus aussi à partir de BU-2867T A par dégradation enzymatique ou bien hydrolyse au moyen de papaïne ou de chymopapaïne. Un mélange de BU-2867T A (4 g) et de papaïne (Sigma P-3375, 50 g) dans 20 litres de mëthanol aqueux à 10% a été agité pendant 22 heures à 28°C. Le mélange a ensuite été acidifié jusqu'à pH 3,3 au moyen d'acide

CD.MdC.3F - 18 - SY-1820A

acétique et extrait au moyen d'acétate d'éthyle (10 litres). L'évaporation de l'extrait a donné une huile (6,3 g) dont la chromatographie sur gel de silice (Wakogel C-200, 250 ml) au moyen d'un mélange de chlorure de méthylène et de mêthanol (9:1) a donné un composé VII huileux (3,3 g) semi-pur. La poursuite de la chromatographie de l'huile sur Sephadex LH-20, puis la cristallisation ont donné des aiguilles incolores du t composé Vil pur en quantité de 1,15 g (rendement de 50%). P.F. 90-91°C. £·<_727ο17,4° (C 05, MeOH), analyse pour C16H27N04.H20, calculé C 60,93, H 9,27, N 4,44, trouvé C 61,34, H 9,03, N 4,20. SM-IE:m/z 279 (M+-H20). UVAMeOIi nm (£). 260 (28.000). IR l^max (KBr) cnT1: 3520, 3410, 3300, 1720, 1690, 1655, 1630, etc. RMN de J-H (80 MHz, DMSO-dg) fc 0,88 (3H, t), 1,06 (3H, d), 6,20 (3H,m), 7,00 (1H, m), 7,84 (1H, d, NH), etc.

Après extraction à l'acétate d'éthyle, la solution aqueuse acide a été concentrée ä siccité. Le résidu (36 g) a été dissous dans 50 ml d'eau, ajusté à pH 9,0 et appliqué sur une colonne de silice â inversion de phase (Ciß* Merck, 1,6 litre) développée à l'eau. Les fractions contenant le composé VIII ont été rassemblées et concentrées sous vide. Le résidu a été Chromatographié sur du Sephadex LH-20 (250 ml) au moyen de mêthanol aqueux à 50%, puis sur de la silice à inversion de phase (Cis) avec de l'eau acidulée (pH 3,0 avec HCl dilué) et a donné à l'état de pureté le chlorhydrate du composé VIII en quantité de 747 mg (rendement de 35%). P.F. 190°C. (déc.). ^7^-113° (c 0,5, H20). SM-IEîm/z 241 (M+). UV: absorption nulle à >220 nm. IR ^max (KBr) cm“3-: 3400, 1660, 1620, 1530, etc. RMN de J-H (80 MHZ, DMSO-dg) 1,27 (3H, d), 1,4-1,8 (4H), 2,98 (2H, m), 4,52 (1H, m), 6,19 (1H, d), 6,45 (1H, d-d), 7,43 (1H, t, NH), 9,46 (1H, d, NH). Analyse pour CiiH9N3C>3.HCl.H20, calculé C 44,67, H 7,50,

CD.MdC.3F - 19 - SY-1820A

N 14,21, Cl 11,99, trouvé C 45,04, H 7,82, N 13,81, Cl 12,55.

Du fait que le BU2867T A donne une réaction négative â la ninhydrine et apparaît exempt de radicaux titrables, sa structure est logiquement celle résultant de l'assemblage des composés Vil et VII par une liaison peptidique.

Par chauffage avec le HCl 6N, le BU2867T B et - le BU-2867T C donnent tous deux le même complexe d'aminoacides que celui issu de BU-2867T A. Les acides gras constitutifs des deux antibiotiques ont été extraits du produit d'hydrolyse, mis à réagir avec le diazomêthane et isolés à l'état des esters méthyliques, IX (de BU-2867T B) et X (de BU-2867T C). Ils conservent le maximum caractéristique dans l'UV -260 nm) observé sur les antibiotiques d'origine. Le spectre de masse par ionisation électronique du composé IX révèle un ion moléculaire à m/z 236, suggérant un ester d'acide en C^4 comprenant trois doubles liaisons. Les spectres UV et RMN de % révèlent distinctement la structure de l'acide 2(E),4(E)-diénoïque et montrent que la troisième double liaison est isolée dans le composé IX. L’ozonolyse du composé IX, suivie de la dégradation de l'ozonide par réduction donne du n-hexanal isolé et identifié sous la forme de sa 2,4- dinitrophênyl-hydrazone (SM-IE M+:m/z 280). Ces résultats établissent que le composé IX est le 2(E),4(E)8-tëtradêtriénoate de méthyle. Le poids moléculaire de l'ester X (SM-IE; M+ m/z 238) se révèle supérieur de 28 unités (C2H4) à celui du composé VI, traduisant " ainsi la différence de formule moléculaire observée entre BU-2867T A et C. Ce résultat combiné avec les données des spectres RMN et UV indique que le composé X est le 2(E),4(E)-tétradëcadiénoate de méthyle. Les résultats des expériences ci-dessus

CD.MdC.3F - 20 - SY-1820A

révèlent les structures suivantes pour les BU-2867T A, B et C î ch3 CH-OH Jiï R-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CO-NHn · N V=° ΥΗΥ1 0 ch3 BU-2867T A : R = CH3-{CH2)6- BU-2867T B : R = CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2" BU-2867T-C : R = CH3-(CH2)8-

CD.MdC.3F - 21 - SY-1820A

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,CD. MdC. 3F T 22 - ν5Υ-1820Α

La dégradation enzymatique de BU-2867T par l'acylase de Pseudomonas donne des produits différents de ceux auxquels conduit l'hydrolyse par la ficine ou la papaïne décrite ci-dessus. La souche Pa-129 de Pseudomonas a été mise à fermenter dans 10 litres d'un milieu contenant 2% d'amidon soluble, 0,2% de glucose, 3% de farine de soya, 1% de CaC03 et 0,3% de MgS04.7H20 " pendant 3 jours à 37°C, puis les cellules ont été collectées par centrifugation. Après deux lavages avec de la solution physiologique salée (1 litre), les cellules ont été remises en suspension dans 0,75 litre de solution physiologique salée. La suspension des cellules a été mélangée avec une suspension (1,5 litre) préautoclavêe d'alginate de sodium (75 g) et de carbo-xyméthylcellulose (75 g), puis le mélange a été versé sous agitation dans 30 litres de solution de CaCl2 0,1M. Le gel contenu dans les cellules a été affermi par agitation avec une solution à 25% de glutaraldëhyde et tassé dans une colonne (4 cm x 175 cm). Une solution de BÜ-2867T A (1,5 g) dans du méthanol aqueux à 20% (30 litres) a été passée â travers la colonne au débit de 0,4-0,8 litre par heure. L'effluent collecté a été passé ensuite sur une colonne d'Amberlite IRC-50 (70% de forme NH4+, pH 6,7, 300 ml) et une colonne de HP-20 (300 ml) en succession. La colonne d'IRC-50 a été lavée à l'eau, puis développée avec du NH4OH 1,5N. Les fractions positives à la ninhydrine ont été rassemblées, concentrées et lyophilisées pour donner un solide jaune pâle (800 mg) qui a été déposé sur une colonne de silice à inversion de phase (Cxg, 250 ml). La colone a été développée à l'eau sous pression moyenne et les êluats positifs à la ninhydrine ont été rassemblés et concentrés pour donner un solide blanc consistant en amine L-thréonylcyclique (XI, 612 mg). Rendement 62%. P.F. 170°C, (c 0,5, H20).

CD.MdC.3F - 23 - SY-1820A

SM-IE:m/z 342 (M+). UV: adsorption nulle à > 220 nm.

IR max (KBr) cm-1: 3350, 3280, 1650, 1620, 1530, etc. RMN de lH (80 MHZ, DMSO-dô) 6 1,05 (3H, d), 1,21 (3H, d), 1,4-2,2 (4H), 4,35 (2H, m), 4,47 (lH, m, OH), 4,62 (1H, d, OH), 6,16 (1H, d), 6,42 (1H, d-d), 7,36 (1H, t, NH), 7,97 (1H, d, NH), 8,62 (1H, d, MH).

OK ? « : CHs-ÇH-fH-CO-NB/ ohnh2 ιγγ H CH3

La colonne HP-20 obtenue ci-dessus a été développée avec de l'eau (1 litre), puis un mélange de NaOH 0,1N et de méthanol (1:2). Les fractions contenant l'acide 2.4- dodécadiénoïque (V) ont été rassemblées, concen trées à 300 ml et acidifiées jusqu'à pH 2,0. Cette solution a été extraite à l'acétate d'éthyle (300 ml) et au n-butanol (100 ml). L'évaporation de l'extrait dans l'acétate d'éthyle a donné un résidu huileux qui a été Chromatographié sur une colonne de Sephadex LH-20 (800 ml). L'élution étant faite au moyen de méthanol et les êluats étant observés par absorption dans l'UV à 260 nm, les êluats appropriés ont été concentrés pour donner des plaquettes incolores du composé V pur (259 mg). Rendement 53%. P.F. 48-49°C. UVAJJfOH nm (£): 258 (24.000). IR l)max (KBr) cm“1: 1680, 1630, 1605, 1410, 1300, etc. RMN de % (80 MHz; CD3OD) 6 0,89 (3H, t), 2,0 ( 10H ), 2,12 (2H, m), 5,75 (lH, d), 6,16 (2H, m), 7,21 (1H, m). Ce composé est identique à l'acide 2.4- dodécadiénoïque que donne l'hydrolyse acide du BU-2867T A. L'extrait n-butanolique concentré sous vide et

M

lyophilisé donne le* composé de départ BU-2867T A (160 mg, 11%),

CD.MdC.3F - 24 - SY-1820A

Il ressort à l'évidence de la discussion ci-dessus que les composés VIII et XI sont de précieux intermédiaires pour la préparation des divers antibiotiques faisant l'objet de l'invention. L'acylation de la façon habituelle, par exemple S l'aide d'un anhydride mixte issu d'un acide carboxylique et d'un carbonate acide d'alcoyle, forme la liaison peptidique requise, voir Advanced Organic Chemistry, Fieser and Fieser, pages 1039-1046, Reinhold Publishing Corporation, New York, 1965. Les radicaux hydroxyle peuvent être protégés de toute manière appropriée, par exemple sous forme de l'éther tétrahydropyrannylique ou t-butylique. L'acylation du radical amine du composé VIII au moyen des acides CH3-(CH2)6-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CHOH-CH3

COOH

CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CHOH-CH3

COOH

et CH3-(CH2)8“CH=CH-CH=CH-CH-CO-NH-CH-CHOH-CH3

COOH

donne les BU-2867T A, B et C, respectivement. Par exemple, le BU-2867T A s'obtient par condensation des composés VII et VIII. Un mélange du composé VII (15 mg), de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (10 mg) et de 1-hydroxy-l,2,3-benzotriazole (8 mg) dans 2 ml de DMF a été agité pendant 2 heures à la température ambiante. Le composé VIII (10 mg) a été ajouté ensuite au mélange, l'agitation étant poursuivie jusqu'au lendemain. La solution a été concentrée en un résidu et a été chromatographiëe sur silice à inversion de phase

CD.MdC.3F - 25 - SY-1820A

(Ci8f 40 ml) avec ëlution au moyen de méthanol à 80%. Les ëluats actifs ont été évaporés et le résidu purifié par chromatographie liquide sous haute pression (CLPH) préparative (colonne: SSD-ODSS-842, phase mobile: méthanol aqueux à 90%). L'évaporation des fractions actives a donné le BU-2867T A (7,4 mg), rendement de - 28%), identique sous tous rapports à l'antibiotique

• naturel. CCM (silané, éthanol-eau=55;45) Rf: 0,45. CLPH

(Lichrosorb RP-18, ethanol-eau=65:35) Rt: 6,43 minutes.

Le BU-2867T A peut être préparé aussi par condensation des composés V et XI. Une solution du composé V (3,4 mg), de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (3,7 mg) et de 1-hydroxy-l,2,3-benzotriazole (2,8 mg) dans du diméthylformamide (1 ml) a été agitée pendant 2 heures à la température ambiante. Du composé XI (5 mg) a été ajouté â la solution et le mélange a été agité pendant encore 3 heures, puis concentré sous vide. Le résidu a été dissous dans du méthanol et purifié par CLHP préparative avec la même colonne et la même phase mobile que décrit ci-dessus. Production 4 mg de · BU-2867T A, soit un rendement de 45%. L'identité avec le BU-2867T A a été confirmée par comparaison directe.

Le composé XI peut être préparé à partir du composé VIII suivant les techniques habituelles. Un mélange agité de N-t-butoxycarbonyl-L-thréonine (44 mg), de N,N'-dicyclohexylcarbodiimide (40 mg) et de 1-hydroxy-l,2,3-benzotriazole (30 mg) dans du diméthyl-formamide (4 ml) a été additionné du composé VIII (40 mg) à la température ambiante. Le mélange a été concentré sous vide en un résidu qui a été chromato-graphié sur une colonne de silice à inversion de phase (Ci8/ 40 ml) au moyen d'un mélange de méthanol et d'eau (rapport 1:9 à 2:3). Les fractions appropriées ont été rassemblées, concentrées sous vide et lyophilisées pour

CD.MdC.3F - 26 - SY-1820A

donner le N-BOC-L-théronyl-VIII (=BOX-XI ) en quantité de 51 mg. Rendement de 69%, 1690 et 1640 cm“*.

RMN de J-H (80 MHz) 6 ppm dans DMSO-dg: 1,00 (3H, d), 1,22 (3H, d), 1,35 (9H, s), 6,11 (1H, d), 6,33 (1H, d- d), etc. Un mélange de BOC-XI (36 mg) et d'acide formique (1 ml) a été agité pendant 1 heure à la ~ température ambiante. Ce mélange a été concentré, dilué i à l'eau (1 ml), ajusté ä pH 10,0 et appliqué sur une colonne de silice à inversion de phase (C^g, 20 ml). Le développement étant effectué au moyen d'eau et la réaction de l'éluat avec la ninhydrine étant vérifiée, les fractions éluëes appropriées ont été combinées et lyophilisées pour donner un solide blanc consistant en le composé XI en quantité de 25 mg. Rendement de 88%.

1650 cm“l. RMN de ^H ppm dans DMSO-dg: 1,04 (3H, d), 1,22 (3H, d), 6,14 (1H, d), 6,42 (1H, d-d), 7,35 (1H, t, NH), 7,98 (1H, d, NH), 8,65 (1H, d, NH), etc. SM-IE: M+m/z 342.

Par conséquent, il est possible de préparer les composés antibiotiques de l'invention par réaction des composés VIII et XI avec les acides appropriés, quelle que soit leur origine. De plus, en prenant les composés VIII et XI, il est possible d'utiliser les composés conformes à l'invention, en particulier ceux obtenus avec des rendements supérieurs, pour préparer d'autres composés de l'invention. Par exemple, le BU-2867T A, qui est obtenu avec des rendements supérieurs par fermentation, peut être utilisé pour préparer le BU-2867T B et le BU-2867-T C par hydrolyse enzymatique et condensation avec l'acide souhaité, comme illustré ci-dessus.

Le rendement en BU-2867T et la répartition des fractions A, B et C que donne la fermentation, comme décrit ci-dessus, peuvent être modifiés par addition de différentes huiles et graisses et de certains agents

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tensioactifs au milieu dans lequel Polyangium brachy-sporum K481-B101 est cultivé. Par exemple, l'addition d'huile de soya, d'huile de maïs, d'huile d'olive, d'huile végétale hydrogénée, d'axonge ou de suif dans une moindre mesure, augmente le rendement total en BU-2867T. Les graisses et huiles ayant une teneur élevée en acide linoléique (Ci8:2)f comme l'huile de soya, l'huile de maïs et l'axonge conduisent â une augmentation de la proportion de BU-2867T B qui est formé. Les huiles telles que l'huile d'olive qui ont une teneur élevée en acide oléique (C^q;1) conduisent à une augmentation de la proportion de BU-2867T C qui est formé. Les huiles végétales hydrogénées riches en acide stéarique (CiSîO) augmentent uniquement la quantité de BU-2867T A qui est formé.

Activité antimicrobienne

Les concentrations minima inhibitrices (CMI) des BU-2867T A, B et C ont été déterminées à l'égard de différents micro-organismes suivant la technique de dilution en série dans la gélose. La gélose nutritive (Eiken) a été utilisée pour les bactéries et la gélose au dextrose de Sabouraud (Difco) pour les champignons. L'inoculum a été ajusté à 10^ unités formant colonie par ml pour les bactéries et à 105-107 unités formant colonie par ml pour les champignons.

Le tableau V indique les activités antibactériennes in vitro pour les BU-2867T A, B et C, Les composants A et C n'inhibent pas la croissance des bactéries Gram-positives et Gram-négatives à 50 jug/ml, mais le composant B manifeste une activité modérée contre certaines bactéries Gram-positives.

Le tableau VI indique les activités antifongiques des composants du BU-2867T. Le composant C manifeste une activité antifongique puissante contre des champignons pathogènes cliniquement importants tels

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que Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumagatus, Trichophyton mentagrophytes et Mucor spinosus. Les composants A et B sont quelque peu moins actifs que le composant C, mais leurs spectres antifongiques sont semblables à celui de ce dernier.

t TABLEAU V

y Spectres antibactëriens des composants de BU-2867T

; CMI (Mq/rnl)

BU-2867TA BU-2867TB BU-2867TC

Organisme Gram-positif

Staphylococcus aureus 209 >50 25 >50 " " Smith >50 3,1 >50 " " Bx-1633 >50 50 >50

Staphylococcus epidermidis D153 > 50 6,3 >50 " A22152 >50 50 >50

Streptococcus faecalis A9612 >50 >50 >50

Micrococcus luteus PCI-1001 >50 50 > 50

Bacillus subtilis FCI-210 > 50 50 > 50

Organisme Gram-positif

Escherichia coli NIHJ >50 >50 >50

Klebsiella pneumoniae D-ll >50 >50 >50

Proteus mirabilis A9554 >50 >50 >50

Proteus vulgaris A9436 >50 >50 >50

Morganella morganii A9553 >50 >50 >50

Serratia marcescens A20222 >50 >50 >50

Enterobacter cloacae A9659 >50 >50 >50

Pseudomonas aeruginosa A9930 >50 >50 >50

Milieu :gélose nutritive

CD.MdC.3F r 29 - SY-1820A

TABLEAU VI

Spectres antifongiques des composants de BU-2867T Organisme d'épreuve CMI (j>q/ml) BU-2867TA BÜ-2867TB BU-2867TC Candida albicans ΙΑΜ 4888 3,1 3,1 1,6 " A9540 1,6 1,6 0,8

Cryptococcüs neoformans D49 25 25 3,1 > " " IAM 4514 25 25 3,1

Aspergillus fumigatus IAM 2530 1,6 3,1 0,8 " " IAM 2034 1,6 3,1 0,8

Aspergillus flavus FA 21436 25 25 50

Fusarium monoliforme A2284 >50 >50 >50

Piricularia oryaze D 91 >50 >50 >50

Trichophyton mentagrophytes D 155 25 12,5 1,6 n° 4329 25 12,5 6,3

Blastomyces dermaditis IFO 8144 50 50 > 50

Sporothrix schenckii IFO 8158 >50 >50 >50

Petriellidium bcydii IFO 8073 >50 > 50 50

Nuoor spinosus IFO 5317 1,6 0,8 0,2

Milieu : gélose au dextrose de Sabouraud Activité antitumorale L'activité antitumorale de BU-2867T A, B et C a été déterminée sur des souris CDFi femelles et BDFj_ mâles. La leucémie lymphocitaire P388 (souris CDF^ et BDFi) et la leucémie lymphoïde L1210 (souris BDFi) ont s. été inoculées par injection intrapéritonéale de 0,8 ml de liquide d'ascite dilué apportant 10^ et 10^ cellules par souris, respectivement. Le mélanome mélanotique B16 (souris DBFi) a été implanté par voie intrapéritonéale sous la forme de 0,5 ml d'une fine dispersion à 10% de tissu de la tumeur. Les composés expérimentaux, dissous dans de la solution physiologique salée à 0,9% conte

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nant 10% de dimëthylsulfoxyde, ont été administrés en doses échelonnées aux souris par voie intrapéritonéale 24 heures après l'implantation de la tumeur. L'olivo-mycine (NSC 38270) ou la mitomycine C ont été administrées comme composés de référence pour les expériences.

Les BÜ-2867T A, B et C manifestent de l'activité antitumorale contre la leucémie P388 dans le schéma posologique 1 (une fois par jour aux jours 1, 4 et 7). Le tableau VII présente les résultats obtenus sous la forme de l'augmentation du temps de survie moyen (TSM) des animaux de test (T) et de contrôle (C) pour différents régimes posologiques, sous la forme du rapport en pourcentage. Les rapports en pourcentage de 125 et davantage indiquent un effet antitumoral significatif.

TABLEAU VII

Activité antitumorale des composants de BU-2867T contre la leucémie P388

T/C % de TSM

Dose, mg/kg et par jour, ip 3 1 (V3 0,1 BU-2867T A 140 130 120 BU-2867T B 165 140 120

Bu-2867T C 155 130

Olivomycine A 140 135 100

Les BU-2867T A et C sont très actifs contre la leucémie P388 dans le schéma posologique 2 (une fois par jour aux jours 1 à 9). Le BU-2867T A est moins actif contre la leucémie L1210 et le mélanome B16. Le tableau VIII rassemble les résultats obtenus pour différents schémas posologiques, sous la forme du rapport en pourcentage d'augmentation du temps de survie moyen, les valeurs de 125 et davantage indiquant

CD.MdC.3F - 31 - SY-1820A

un effet antitumoral significatif.

TABLEAU VIII

Activité antitumorale des BU-2867T A et C T/C % de TSM

Dosey mg/kg et Par jour» ip 2 1 0,5. 0f 25 0 y 13 0y063 0,031

Leucémie P388 BU-2867T A 67 228 186 156 147 136 109 BU-2867T C 234 189 175 159 153 123 100

Mitomycine C 290 240 170 150 130 115

Leucémie L1210 BU-2867T A 129 118 118 106

Mytomicine C 140 141 129 129 106 Mélanome B16 BU-2867T A Tox. 125 116 113 100

Mitomycine C 63 181 163 141 131

La toxicité aiguë des BU-2867T A et C a été déterminée sur des souris mâles ddY par administration intrapéritonéale unique. Les DL50 sont de 8,1 mg/kg et 25 mg/kg, respectivement.

Les composés pharmacologiquement actifs de l'invention peuvent être convertis suivant les procédés traditionnels de la pharmacie galénique en préparations pharmaceutiques se prêtant à l'administration par voie orale ou parentérale, par exemple aux mammifères y compris l'être humain. Des excipients traditionnels sont des substances de support organiques ou inorganiques pharmaceutiquement acceptables se prêtant â l'administration parentérale, digestive ou topique et ne réagissant pas de façon nuisible avec les principes actifs. Des excipients pharmaceutiquement acceptables appropriés sont non limitativement l'eau, les solutions

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de sel, les alcools, la gomme arabique, les huiles végétales, les polyéthylêneglycols, la gélatine, le lactose, l'amylose, le stéarate de magnésium, le talc, l'acide silicique, la vaseline, les huiles essentielles, les monoglycérides et diglycérides d'acides gras, les esters du pentaêrythrytol avec les acides gras; l'hydroxymêthylcellulose, la polyvinylpyrro-^ lidone, etc. Les compositions pharmaceutiques peuvent être stérilisées et, si la chose est souhaitée, mélangées avec des substances auxiliaires, par exemple des lubrifiants, des conservateurs, des stabilisants, des mouillants, des émulsionnants, des sels modifiant la pression osmotique, des tampons, des colorants, des aromatisants et/ou des parfums ou analogues qui ne réagissent pas de façon nuisible avec les principes actifs.

Les solutions stériles, de préférence les solutions aqueuses ou huileuses stériles injectables, de même que les suspensions, émulsions ou implants, y compris les suppositoires, conviennent pour l'administration parentérale. Des formes dosées unitaires commodes sont les ampoules.

Pour l'administration par voie digestive, les comprimés, dragées, suppositoires ou capsules comprenant du talc et/ou un hydrate de carbone ou analogue comme excipient ou liant, conviennent particulièrement bien, l'excipient étant, de préférence, le lactose et/ou l'amidon de maïs et/ou l'amidon de pomme de terre. Un sirop, un élixir ou un excipient analogue - convient lorsqu'il faut un véhicule édulcoré. Il est possible de préparer des compositions â dégagement progressif, notamment celles dont le principe actif est protégé par des enrobages à dégradation différentielle, par exemple suivant les techniques du microencapsu-lement, de l'enrobage multiple, etc.

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De façon générale, les composés de l'invention sont présentés sous des formes dosées unitaires contenant la dose requise dans un excipient pharmaceuti-quement acceptable. La dose des composés de l'invention est généralement de 5 à 250 mg par jour, par exemple pour l'être humain d'un poids de 75 kg. Les doses et schémas posologiques appropriés peuvent être déterminés ^ sur base des considérations habituelles, par exemple par comparaison des effets différentiels du composé envisagé et d'un agent antibiotique ou antitumoral connu, par exemple suivant les techniques d'évaluation pharmacologiques habituelles appropriées.

Bien que divers modes et détails de réalisation aient été décrits pour illustrer l'invention, il va de soi que celle-ci est suceptible de nombreuses variantes et modifications sans sortie de son cadre.

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Claims (11)

1, - Composés de formule CH-OH ysî/X N r-ch=ch-ch*ch-co-nh-ch-co-nh/^ \ ° H CH3 E où R représente CH3-(CH2)6# CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 ou CH3-(CH2)8» 2, - Composé suivant la revendication 1, dans la formule duquel R représente CH3-(CH2)$. 3, - Composé suivant la revendication 1, dans la formule duquel R représente CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2· 4, - Composé suivant la revendication 1, dans la formule duquel R représente CH3-(CH2)8· 5, - Procédé de préparation d'un composé de formule ; ^3 ÇH h ch-oh R-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CO-NH-/ \_Q 0 <*3 où R représente CH3-(CH2)6f CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 ou CH3“(CH2)8* caractérisé en ce qu'on cultive Polyangium brachysporum sp. nov. dans un milieu nutritif contenant une source assimilable de carbone et d'azote dans les conditions de l'aérobiose, on sépare le mycélium formé et on isole le composé du milieu nutritif. 6, - Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que Polyangium brachysporum sp. nov. CD.MdC.3F - 35 - SY-1820A est la souche 481-B101.

7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que la souche K481-B101 est la souche ATCC 53080. 8, - Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'une graisse ou une huile est ajoutée au milieu nutritif.

9. Procédé suivant la revendication 5, ; caractérisé en ce que le mycélium séparé est soumis à l'extraction au moyen d'un solvant organique et l'extrait est combiné avec le milieu nutritif avant l'isolement du composé.

10. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que le composé est isolé du milieu nutritif par extraction à l'aide d'un solvant organique.

11. Procédé suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la production du composé est surveillée au moyen de Candida albicans comme organisme d'épreuve.

12. Le micro-organisme Polyangium brachy-sporum sp. nov.

13. La souche K481-B101 de Polyangium bra-chysporum.

14. Culture biologiquement pure de Polyangium brachysporum sp. nov.

15. Composé de formule s ch3 1 CD.MdC.3F - 36 - SY-1820A - Procédé de préparation d'un composé de formule : OH H m2-< S)*=0 \ E ° CH, &5* caractérisé en ce qu'on hydrolyse un composé de formule : f3 OH H f-08 R-CH=CH-CH»=CH=CO-NH-CH-CO-NH-(< ^ ^ \—0 CH 3 où R représente CH3-(CH2)6» CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2r ou CH3-(CH2)8f présence de ficine, de papaïne ou de chymopapaïne. f

17. Composé de formule : °H N OH NH2 ^ hN^ E CH3 18, - Procédé de préparation d'un composé de formule : OH H ch,-çh-çh-co-nh< „ >=0 u, Vvr 0 ch3 CD.MdC.3F - 37 - SY-1820A * caractérisé en ce qu’on hydrolyse un composé de formule : -, ?H-0H R-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CO-NH-C >=o >;:r * ch3 où R représente CH3-(CH2)6f CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 ou CH3“(CH2)8' en présence d'acylase de Pseudomonas. 19, - Composition antifongique, caractérisée en ce qu'elle comprend, en quantité antifongique efficace, au moins un composé de formule : CH3 < H-OH 9®. 5 R-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CO-NH-<f ^ \=0 CH3 où R représente CH3(CH2)6f CH3~(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 on CH3-(CH2)8f conjointement avec un excipient pharmaceu-tiquement acceptable.

20. Composition antitumorale, caractérisée en ce qu’elle comprend une quantité d'au moins un composé de formule : CD.MdC.3F - 38 - SY-1820A * Çh3 T h E E Γ0Η R-CH=CH-CH*CH-CO-NH-CH-CO-NH< .. \ i CH3 oü R représente CH3-(CH2)6f CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 ou CH3-(CH2)8' efficace comme agent antitumoral dans un excipient pharmaceutiquement acceptable. « CD.MdC.3F - 39 - SY-1820A