SE468813B - Nya peptidantibiotika, framstaellning av och nya mellanprodukter, foerfarande foer antibiotikaframstaellningen med polyangium brachysporum sp.nov. samt en antifungal- och en antitumoerberedning - Google Patents

Nya peptidantibiotika, framstaellning av och nya mellanprodukter, foerfarande foer antibiotikaframstaellningen med polyangium brachysporum sp.nov. samt en antifungal- och en antitumoerberedning

Info

Publication number
SE468813B
SE468813B SE8603634A SE8603634A SE468813B SE 468813 B SE468813 B SE 468813B SE 8603634 A SE8603634 A SE 8603634A SE 8603634 A SE8603634 A SE 8603634A SE 468813 B SE468813 B SE 468813B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
compound
formula
preparation
antibiotics
nutrient medium
Prior art date
Application number
SE8603634A
Other languages
English (en)
Other versions
SE8603634D0 (sv
SE8603634L (sv
Inventor
M Konishi
K Tomita
M Oka
K-I Numata
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bristol Myers Squibb Co filed Critical Bristol Myers Squibb Co
Publication of SE8603634D0 publication Critical patent/SE8603634D0/sv
Publication of SE8603634L publication Critical patent/SE8603634L/sv
Publication of SE468813B publication Critical patent/SE468813B/sv

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12PFERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C07K5/0215Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing natural amino acids, forming a peptide bond via their side chain functional group, e.g. epsilon-Lys, gamma-Glu
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

25 30 35 468 813 - Enligt en ytterligare aspekt avser uppfinningen farmaceutiska beredningar, som innehåller en mängd av dessa föreningar, separat eller i kombination och vilka föreningar är effekti- va som antifungala medel och/eller antitumörmedel, jämte en farmaceutiskt godtagbar bärare.
Uppfinningen avser även ett förfarande för framställning av en förening med formeln CH3 -Og OH H n z \/N R-CH=CH-CH=CH-CO~NB- H-CO-NH 0 N \_ H E C33 vari R är CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 eller CH3-(CH2)8, vilket förfarande utmärkes av att man odlar Polyangium brachysporum sp. nov. i ett närmedium, som innehåller en assi- milerbar kolkälla och kvävekälla, under aeroba betingelser, separerar det bildade myceliet och utvinner föreningen från närmediet.
Enligt en annan aspekt avser uppfinningen föreningarna OH 3 “\l//~\\,fN NH \ H O E och H C 3 H á \\~//N CH3-cH- H-co-NH 0 ÄH H \ 2 E _. C 3 H ° 1-1 10 15 20 25 30 35 1168 813 vilka är användbara som mellanprodukter vid framställning av föreningarna enligt uppfinningen, samt metoder för fram- ställning av dessa mellanprodukter.
Kort beskrivning av ritningarna Fig. 1, 2 och 3 är IR-spektra för Bu-2867T A, B respektive C.
Fig. 4 och 5 är 'H-NMR- och 13C-NMR-spektra för Bu-2867T A.
Detaljerad beskrivning De morfologiska egenskaperna, odlingsegenskaperna och de fy- siologiska egenskaperna hos K481-B101 har fastställts medelst de metoder som beskrives av McCurdy, Jr. H.D.: Studies on the Taxonomy of the Myxobacterales. II, Polyangium and the demise of the Sorangiaceae. Intl. J.Syst. Bacteriol. gg: 283-296, 1970; Reichenbach, H.: Nannocvstis exedens gen. nov., sp. nov., a new myxobacterium of the family Sorangiaceae. Arch. Mikro- biol. 12: 119-138, 1970; Christensen, P. och F.D. Cook: Ligg- bacter, a new Genus of non-fruiting, gliding bacteria with a high base ratio. Intl. J. Syst. Bacteriol. gå: 367-393, 1978; och Christensen, P.: Synonymy of Flavobacterium pectinovorum Dorey with Cytophaga johnsonae Stanier. Intl. J. Syst. Bacter- iol. ål: 122-132, 1977. Vidmakthållande och rening åstadkom- mes medelst de förfaranden som bbeskrivits av Peterson, J.E.: Isolation, cultivation and maintenance of the myxobacteria.
Methods in Microbiology åâz 185-210, 1969. Edit. J.R. Norris & D.W. Ribbons. Academic Press (London och New York); och Reichenbach, H & M. Dworkin: The Order Mixobacterales. The Prokaryotes, Volume I: 328-355, 1981. Edit. M.P. Starr et al.
Springer-Verlag (Berlin, Heidelberg and New York). Den taxo- noma positionen bestämdes enligt beskrivningarna i Bergeys Manual, 8:de upplagan, 1974 och "The Prokaryotes, Vol. I". 10 15 20 25 30 35 ON OO OO __.\ OJ I Morfologi CHSitOIIS-Mftagar, chitin-agar, jästcellsagar och kaninlort- -vatten-agar användes för den morfologiska undersökningen.
K481-B101 är en gramnegativ, icke gisselförsedd bakterie. De vegetativa cellerna är cylindriska (0,6-0,8 x 2-10 mikrome- ter) med trubbiga rundade ändar. De vegetativa cellerna upp- visar flexibla och långsamglidande rörelser på en fuktig yta av agarmedium eller mjukt agarmedium. Myxosporer skiljer sig klart från de vegetativa cellerna, är ovala eller sfäriska, 0,6-0,8 x 0,6-1,5 mikrometer, icke-refraktila eller refrak- tila och tillfälligtvis ordnade parvis. K481-B101 bildar på de flesta beskrivna agarmedierna sessila sporangieinneslutna myxosporer. Sporangierna är ovala, sfäriska eller kuddliknan- de och relativt varierande till storleken, 12 x 20-80 x 120 mikrometer, och ofta bundna medelst ett gemensamt hölje el- ler slemskikt, dubbelkonturerade och uppträder enstaka eller i klungor (sori). Morfologin hos K481-B101 representeras i tabell 1.
Odlingskarakteristika K481-B101 växer måttligt på casitone-Mg++-agar (McCurdy, 1969) och jästcellsagar (Christensen & Cook, 1978) men dåligt på Bacto-näringsagar eller Bacto-hjärtinfusionsagar. Rotliknan- de eller fjäderformade svärmar observeras på YP-mjukagar (jästextrakt 0,3 %, pepton 0,1 %, NaCl 0,01 %, agar 0,3 %, pH 6,6-6,8) men ej på casitone-Mg++-agar. Kolonierna på ca- sitone-Mg++-agar är cirkelformade, translucenta och blekak- tigt gröngula och uppvisar svag etsning av, erosion av el- ler penetration i agarn. Odlingskarakteristika visas i tabell 2.
Fysiologiska egenskaper K481-B101 hydrolyserar stärkelse, chitin, gelatin och kasein men ej cellulosa och agar. Den lyserar autoklaverade jästcel- 10 15 20 25 30 35 '468 813 ler men ej levande celler av Micrococcus luteus. K481-B101 är mesofilisk och känslig för 2 % NaCl. De fysiologiska egen- skaperna visas i tabell 3.
Närvaro av gisselförsedda bakterier och upptrâdandet av spon- tan variant Närvaron av gramnegativa, stavformade gisselförsedda bakteri- er observerades i den ursprungliga kulturen. K481-B101 rena- des relativt väl genom att man kombinerade den sedvanliga tek- niken med spädning och enkelcellsisolering med ultraljudbe- handling, värmechockbehandling eller antibiotisk sensitivi- tetsbehandling (exempelvis pipemidinsyra vid 50 pg/ml) under användning av myxosporen eller frukkropp. Orenad kultur av K481-B101 uppvisade mukoida varianter, som bildar en vitak- tig kupolformad koloni med omgivande halo. De vegetativa cel- lerna av dessa mukoida varianter är något större än hos mo- derstammen och har måtten 0,8-1,0 x 2,0-3,5 mikrometer. Klung- orna av sporangier (sorus) bildas i huvudsak av mukoida va- rianter.
Taxonomisk position K481-B101 är en.fruktavkästanåeglidande bakterie, som har iso- lerats ur ett jordprov. De diagnostiska huvudkarakteristika hos stammen är följande.
Vegetativa celler: 1) cylindriska med enhetlig diameter 2) ej avsmalnande mot ändarna 3) kan penetrera in i agarmedier 4) Kongorött, adsorberas ej Myxosporer: 1) differentierade från vegetativa celler 2) ovala eller sfäriska 3) icke-refraktila eller refraktila 10 15 20 25 30 35 -lï oxo CO .
CO -n-Å (JJ I Sporangier: 1) sessila 2) ovala, sfäriska eller oregelbundna 3) ofta sammanbundna medelst ett gemensamt hölje eller slemskikt 4) dubbelkonturerade 5) blekgula (i avsaknad av bestämd färg) 6) förekommer enstaka eller i klungor (sori) Odlingskarakteristika och fysiologiska egenskaper: 1) koloni, gyllengul till vitaktig 2) kolonier som i viss utsträckning etsar, erroderar och penetrerar agar 3) chitinolytisk men ej cellulolytisk 4) lyserar jästceller men ej Micrococcus luteus Ovannämnda morfologiska egenskaper, odlingskarakteristika och fysiologiska egenskaper hos K481-B101 antyder att K481-B101 kan klassificeras inom ordningen Myxobacterales.
Bland släktena tillhörande Myxobacterales skiljer sig släk- tena Myxococcus, Archangium och Cystobacter från K481-B101 på grundval av de avsmalnande vegetativa cellerna och frukt- kroppsmorfologin. Släktena Melittangium, Stigmatella och Chondromyces skiljer sig från K481-B101 genom de stjälkför- sedda sporangierna.
K481-B101 liknar släktena Polyangium och Nannocystis. K481- -B101 liknar släktet Nannocystis genom bildningen av ovala eller sfäriska mixosporer och ovala eller sfäriska enstaka sporangier men skiljer sig från sistnämnda genom de cylind- riska vegetativa cellerna med enhetlig diameter och avsakna- den av förmågan att etsa, errodera och penetrera agar.
K401-B101 liknar släktet Polyangium genom de cylindriska ve- getativa cellerna med trubbiga rundade ändar, den domineran- de bildningen av icke-refraktila myxosporer och de ovala el- ler sfäriska dubbelkonturerade sporangierna. Baserat på re- sultat av jämförande undersökningar med släktena tillhörande 10 15 20 25 30 35 '468 815 ordningen Myxobacterales anses att K481-B101 skall klassi- ficeras som en art tillhörande släktet Polyangium. Bland arterna tillhörande Polyangium liknar P.luteum K481-B101 vad gäller storleken av de vegetativa cellerna, färgen och formen hos sporangierna och färgen hos vegetativa kolonier.
K481-B101 skiler sig emellertid från 2. luteum genom de ovala eller sfäriska myxosporerna som är mycket mera samman- dragna och saknar förmågan att lysera levande bakterieceller, såsom celler av Micrococcus luteus.
Sålledes blir slutsatsen den att K481-B101 är en ny art av släktet Polyangium inom familjen Polyangiaceae, ordningen Myxobacterales, och det är föreslaget att beteckna arten P01yangium brachysporum sp., nov. Typstammen är nummer K481- B101 (enkelt isolat) och kulturen har deponerats hos The Ameri- can Type Culture Collection under depositionsnumret ATCC 53080.
Tabell 1 Morfologi hos K481-B101 Gramnegativa. Cylindriska med trub- biga rundade ändar (0,6 - 0,8 x 2,0- 10 mikrometer. Kongorött adsorberas Vegetativa celler: ej.
Myxosporer: Kan särskiljas från vegetativa celler.
Mycket krympta, med oval eller sfärisk form, 0,6-0,8 x 0,6-1,5 mikrometer, icke-refraktila. Längre inkubation ger refraktila myxosporer.
Sessila, uppträder enstaka eller i klungor. Ovala, sfäriska, kuddformade Sporangier: eller formlösa. varierar avsevärt i storleken, 12 x 20-80 x 120 mikrometer.
Sammanbundna medelst ett gemensamt höl- je eller slemskikt. Dubbelkonturerade.
Inbäddade i agar. Klungor av tvâ till tio eller flera sporangier med en stor- lek av 50 - 300 mikrometer hos den to- 10 15 20 25 30 35 Jb O\ CO CO _..>.
CN Mikrokoloni: Tabell 2 Form: Yta: Elevationz Kant: Optisk egenskap: Kolonifärg: tala massan.
På chitinagar efter inkubation under 2 veckor. Pallisad- eller sick-sackarr- angemang av kedjor av vegetativa celler i periferin. Glidande rörelse hos en- staka celler observeras men en sådan rörelse hos cellmassor observeras ej.
Odlingskarakteristika hos K481-B101-koloni på casitone-Mg++-agar (McCurdy, 1969) vid 28°C under 6 dagar cirkulär slät, senare partiellt rynkad upphöjd helt eller något oregelbunden och saknar distinkta utskjutande delar såsom tungor, fjädrar eller rötter halvtransparent eller opak blekt gröngul Diffuenderbart pigment: inget Växt på chitinagar efter inkubation vid 28°C under 3 veckor Tunn, translucent, blekgul eller färglös. Tjock, opak och gulaktigt vit vid perifera delen. Koncentrisk formation av sporangier vid periferin. Etsar, erroderar eller penetrerar agarn i ringa utsträckning.
Tabell 3 Löslig stärkelse Potatisstärkelse CMC-natrium Cellulosa Fysiologiska egenskaper hos K481-B101 Hydrolys av í I 10 15 20 25 30 35 '468 8 __.\ 5 Tabell 3 (fortsättning) Fysiologiska egenskaper hos K481-B101 Agar - Chitin + Alginat-natrium - Polypektat-natrium - Gelatin + Kasein Växer Eå Simons citratagar Christensens citratagar - Glukos-ammoniumsaltagar - Asparagin-ammoniumsaltagar + Produktion av Indol - H25 + Acetoin (VP-reaktion) - Ureas Oxidas Katalas Lytisk verkan gå Levande celler av Micrococcus - luteus-stammar PCI 1001 & ATCC 9341 Autoklaverade jästceller + Reaktioner Mjölkkoagulation: - Mjölkpeptonisering: + Växt: 1,0% NaCl eller där- NaCl-tolerans: under 10 15 20 25 30 35 468 813 10 - Tabell 3 (fortsättning) Fysiologiska egenskaper hos K481-B101 Ingen växt: 2,0% NaCl eller där- över pH-tolerans: Växtintervallz pH 5,5-10,5 Sparsam växt: pH 5,0 Ingen växt: pH 4,5-11,5 Tillväxttemperatur: Maximal växt: 37°C växt1nterva11= 15-42°c Ingen växt: 1o°c och 45°c Oxidativ (Hugh och Leifson-medium) Oxidativ eller fermentativ reaktion Antibiotikaproduktion Förrådskulturen av Polyangium brachysporum K481-B101 fick växa vid 28°C under 3 dagar på snedagarmedium bestående av 0,5 % löslig stärkelse, 0,5 % glukos, 0,1 % köttextrakt, 0,1 % jästextrakt, 0:2% Nz-case, 0,2 % NaCl, 0,1 % kalcium- karbonat och 1,6 % agar (pH 7,0). En välväxt snedagar använ- des för ympning avdetvegetativa mediet bestående av 2 % majs- stärkelse, 3 % sojabönmjöl, 0,3 % MgSO4-7H2O och 1 % CaCO3 (pH 7,0, före sterilisering). Efter inkubation vid 28°C un- der tre dagar i rotationsskakare (250 varv/min.) överfördes 5 ml av växten till en 500-ml Erlenmeyerkolv innehållande 100 ml av produktionsmediet med samma sammansättning som det vegetativa mediet.
Antibiotikaproduktionen övervakades medelst pappersskive- agardiffusionsmedtoden under användning av Candida albicans A9540 som testorganism. Jäsningen fortsattes under 4 dagar vid 28°C i en rotationsskakare och antibiotikaproduktionen nåddes ett maximum av 100 pg/ml.
Jäsningen utfördes även i en fermentor med omröring. 500 ml 10 15 20 25 30 35 11 -468 815 av ympkulturen, som hade erhållits genom kolvjäsning, använ- des för att ympa 10 liter av produktionsmediet i ett 20-11- ters-kärl. Jäsningen utfördes vid 28°C under omröring vid 250 varv/min. och luftning med en hastighet av 10 liter/min.
Antibiotikaproduktionen nådde ett maximum av 150 pg/ml efter 40 timmars jäsning.
Isolering och rening av antibiotikum Jäsningsvätskan (48 l) centrifugerades med hjälp av en centri- fug. Myceliekakan homogeniserades med 7 liter metanol och blandningen omrördes en timme. Efter avlägsnande av olösligt material genom filtrering indunstades metanolextraktet till en vattenhaltig lösning, som kombinerades med jäsningsvät- skefiltratet och extraherades med 24 liter n-butanol. Extrak- tet koncentrerades till 0,5 liter och hälldes i 3,5 liter n- -hexan under omröring för utfällning av 41 g av råantibioti- kumet. Detta fasta material kromatograferades på en kolonn av 760 ml silikagel C-200 under eluering med etylacetat och en ökande mängd metanol (0-50 %). Den eluerade bioaktivite- ten pâvisades medelst pappersskiveanalys under användning av Candida albicans A9540 som testorganism. De aktiva frak- tionerna kombinerades och indunstades för erhållande av ett blekgult pulver (13 g) av Bu-2867T-komplex. 200 mg av detta fasta material krcmatograferades på en reversfaskolonn (C18, 100 ml) under användning av etanol-vatten (3:7 till 5:5) som elueringsmedel. Eluatet övervakades medelst antifungal bio- analys och TLC (silaniserad, etanolzvatten = 55:45). De för- sta aktiva kombinationerna kombinerades och indunstades un- der reducerat tryck, varvid man erhöll ett vitt fast material av BU-2867T A (61 mg), som kristalliserades ur vattenhaltig metanol under bildning av färglösa nålar (34 mg). Indunst- ning av de andra och tredje aktiva fraktionerna gav 1 mg BU-2867T B respektive 11 mg C. BU-2867T C kristalliserades ur metanol i form av fina nålar. En upprepning av ovan angivna reversfaskromatografering gav totalt 3,9 g BU-2867T A, 44 mg BU-2867T B Och 342 mg BU-2867T C. 10 15 20 25 30 35 468 813 - 12 Karakterisering av antibiotikum BU-2867T A och C isolerades som färglösa nålar medan BU-2867T B erhölls som ett vitt amorft pulver. De är lättlös- liga i metanol, etanol, n-butanol och dimetylsulfoxid, ringa lösliga i kloroform, acetonitril och etylacetat och praktiskt taget olösliga i n-hexan och vatten. De gav positivt svar på Rydon-Smith-reagenset och färgades vid sprayning med jod el- ler svavelsyra på TLC-platta. De var negativa med avseende på ninhydrin-, Sakaguchi-, antron- och Dragendorff-reaktionen.
BU-2867T A, B och C analyserades som C27H44N4O6, C29H46N4O6 respektive C29H48N4O6 genom aspektrometri och mikroanalys.
UV-spektra för de tre komponenterna i metanol uppvisade ett en- da maximum vid 261 nm, som ej skiftades i sur eller alkalisk lösning. Fysikalisk-kemiska data för BU-2867T A, B och C är sammanfattade i tabell 4. Deras IR-spektra i KBr (fig. 1, 2 cch s) visade kraftiga amiaband runt 1s3o cch 1s4o cm” cch OH- och/eller NH-absorption vid 3300 cm-1. 1H-NMR-spektrumet för BU-2867T A (fig. 4) avslöjade närvaron av sex olefiniska protoner (5:6,16, 6,20 (2H), 6,28, 6,49 och 7,09 ppm) och fyra amidprotoner (5:7,49, 7,82, 7,87 och 8,72 ppm). Två met- ylgrupper (6:0,93 ppm, t och 1,07 ppm, d) observerades även i spektrumet. 13C-NMR-spektrumet för BU-2867T A (fig. 5) vi- sade mer än 23 kolsignaler innefattande fyra karbonylkol, sex olefiniska kol och tre metylkol. BU-2867T B och C uppvisade 13C-NMR-spektra som mycket liknade spektrumet för BU-2867T A med undantag av närvaron av två ytterligare olefiniska kol i BU-2867T B och tvâ ytterligare metylenkol i BU-2867T C än i BU-2867T A.
BU-2867T A återloppskokades med 6N saltsyra under 16 timmar.
Efter avlägsnande av den lipofila produkten (V) genom etyl- acetatextraktion koncentrerades hydrolysatet till en oljig återstod, som kromatograferades på Dowex 50W x 4 jonbytar- harts genom framkallaning med pyridin-myrsyra-ättiksyra-buf- fert (0,1-0,2M, pH 3,1-5,1).Üflderövervakning med ninhydrin- reagens isolerades fyra aminosyror I, II, III och IV, som elu- 10 15 20 25 30 35 46% 813 13 erades i denna ordning, och kristalliserades som hydroklo- rider. Aminosyra I (ŧ725° : - 12,70 i SN HCl) identifiera- des som L-treonin by grugdval av dess fysikaliska/kemiska egenskaper. 1H-NMR-spektrumet och EI-MS (M+ +1:m/z 134) för aminosyran II visade att den var en blandning av diastereo- isomerer av 4-amino-3-hydroxi-n-valeriansyra, Konishi, M.; K. Saito, K. Numata, T. Tsuno, K. Asama, H. Tsukiura, T.
Naito & H. Kawaguchi: Tallysomycin, a new antibiotic complex related to bleomycin. II. Structure determination of tally- somycins A and B. J. Antibiotics 30: 789-805, 1977 och dess identitet bekräftades genom en direkt jämförelse med ett autentiskt prov. Föreningen III tillskrevs molekylformeln C5H9NO2 genom elementaranalys och EI-masspektrometri (M+ : m/z 115). Dess 1H-NMR visade närvaron av en metyl (5=1,5o ppm, a, J 6,0 Hz), en metin <5=4,o-4,2, m) och två trans-olefiniska protoner (ß:6,05 ppm, d, J:15,0 Hz och 6,57 ppm, d-d, J:6,0 och 15,0 Hz). Dessa spektraldata visade klart att III var 4-amino-2(E)-pentensyra, Honore, T.; H. Hjeds, P. Krogsgaard-Larsen & T.R. Christiansen: Synthesis and Structure-Activity Studies of Analogs of'Faminobutyric Acid (GABA). Eur. J. Med. Chem., 13:429-434, 1978. Föreningen III tillskrevs 2(S)-konfigurationen på grundval av dess specifika vridning (ÅK7D22'5:-60 i 5N HCl). Aminosyran IV fastställdes vara 4-hydroxilysin på grundval av dess elementaranalys (c6H14N2o3), EI-Ms (M + 1 = m/z 163) *H-NMR-spektrum (S= 1,8- -2,1 ppm 4H, m, 3,18 ppm, 2H, t och 3,6-4,3 ppm, 2H, m) och bildningen av en'Y3laktonförening ( C=O : 1770 cm-1) vid be- handling med 6N klorvätesyra. Izumiya, N.; Y. Fujita, F. Irre- verre & B. Witkop: The Synthesis of Erythro-Yïhydroxy-L-lysine and its Nonocurrence in Collagen. Biochemistry 4: 2501-2506, 1965 har rapporterat mutarotation av 4-hydroxi-lysiner och den för IV observerade förskjutningen antydde erytro-L-konfi- guration. Således fastställdes strukturen för aminosyran IV till erytro-4-hydroxi-L-lysin.
Den lipofila sura fraktion (V) som erhölls vid ovan angivna syrahydrolys behandlades med diazometan för erhållande av en 10 15 20 25 30 35 468 815 14 - oljig metylester (VI) efter kromatografisk rening. Dess UV (Ameon: 260 nm,g= 22,000), EI-Ms m* = m/z 210) och 1H-NMR max (fyra -CH=, en C-CH3 och sex -CH2-) antydde att IV var met- yl-2,4-dodekadienoat. Storleksordningen för kopplingskon- stanten gjorde det troligt att båda dubbelbindningarna hade trans-geometri. Den ursprungliga syran V var således 2(E), 4(E)-dodekadiensyra, Burden, R.S. & L. Crombie: Amides of Vegetable Origin, Part XII. A new series of alka-2,4-dienoic tyramine-amides from Anacyclus pyrethrum D.C. (Compositae).
Q. ghgm. êgg. (C), 1969: 2477-2481, 1969.
I :L-treonin CH3-CH-CH-COOH OH NH2 II :4-amino-3-hydroxi-n-valeriansyra CH3-CH-DH-CH2-COOH NH2OH III :4(S)-amino-2(E)-pentensyra CH3-CH-CH=CH-COOH NH2 IV :ERYTRO-4-hydroxi-L-lysin NH2-CH 2 2 | 2 ' OH NH2 V :2(E),4(E)-dodekadiensyra BU-2867T har molekylformeln C27?%4N4O6 och uppvisade sex ole- finiska kol och fyra amidkol i C-NMR. Det var därför uppen- bart att aminosyran II var en artifakt bildad genom hydratise- ring av den naturliga aminosyran III under syrahydrolysen. An- tibiotikumet bör vara en cyklisk peptid eftersom det var ne- gativt med avseende pâ ninhydrin-reaktionen och ej uppvisade någon titrerbar funktion vid potentiometrisk titrering. Detta underbyggdes ytterligare av det faktum att BU-2867T A gav ett di-0-acetylderivat (EI-MS : M+ =m/z 604, 1H-NMR: 2,02 ppm, 3H och 2,08 ppm, 3H) vid acetylering i pyridin. MS för ace- tatet antydde även kraftiga fragmentjoner vid m/z 179 och 322, -CH -CH-CH -CH-COOH CH3-(CH2)6-CH=CH-CH=CH-COOH 10 15 20 25 30 35 15 46:: 813 vilket antydde närvaron av sekvensen V -9 I ->' i anti- biotikumet. BU-2867T A underkastades enzymatisk nedbryt- ning med ficin i 0,01M fosfatbuffert (pH 7,0). Efter sur- göring till pH 2,2 extraherades reaktionsblandningen med n-butanol för erhållande av en sur förening (VII). Efter- följande extraktion av vattenlösningen vid pH 10,0 med n- -butanol gav en ninhydrinpositiv substans (VIII). Förening- en VII visade sig vara 2,4-dodekadienoyl-treonin (V -è>I) enligt IR (Vcæmzo s. 1650 cmq), EI-Ms m* - H20 = m/z 279 och M+ - Thr : m/z 179) och 1H-NMR-spektrum. Strukturen underbyggdes ytterligare av det faktum att VII gav I och V vid hydrolys i 6N saltsyra. Vid âterloppskokning i 6N salt- syra gav föreningen VIII aminosyrorna II, III och IV såsom avslöjades genom TLC. I EI-MS av VIII återfanns molekyljo- nen vid m/z 241, vilket antydde en cyklisk peptidstruktur. 1H-NMR (270 MHz, i DMSO-dö) visade två amid-NH-protoner vid: 7,43 ppm (triplett) och 9,10 ppm (bred) i överensstämmelse med ovan angivna cykliska struktur. Omfattande avkopplings- försök avslöjade att aminogruppen i III ochui-aminogruppen i IV var kopplade till karbonyler under bildning av amider me- dan|¿-aminogruppen i IV var fri. Föreningarna VII och VIII tillskrevs således nedan angivna strukturer: CH3 CHOH E E 1 vn cH3- (cnz) 6-cH=cH-cH=cH-co-NH-cH-coon VIII Föreningarna VII och VIII erhölls även när BU-2867T A under- kastades enzymatisk nedbrytning eller hydrolys med papain el- 10 15 20 25 30 35 466 813 16 - ler chymopapain. En blandning av BU-2867T A (4 g) och papa- in (Sigma P-3375, 50 g) i 20 liter av en tioprocentig vat- tenlösning av metanol omrördes 22 timmar vid 28°C. Bland- ningen surgjordes därefter till pH 3,3 med ättiksyra och extraherades med 10 liter etylacetat. Indunstning av extrak- tet gav en olja (6,3 g), som kromatograferades på silikagel (vakogel C-200, 250 ml) med en 9:1-blandning av metylenklo- rid och metanol under erhållande av en halvren oljig fören- ing VII (3,3 g). Ytterligare kromatografering av oljan på Sephadex LH-20 och efterföljande kristallisation gav färg- lösa nålar av ren VII. 1,15 g (utbyte 50 %). Smältpunkt 90- -91°c. AaVš7+ 17,4° (c 0,5, meon). Analys: Ber. för N04-H20 : C 60,93, H 9,27, N 4,44. Funnet: C 61,34, MeOH H 9,03, N 4,20. EI-Ms; m/z 279 (M*-H20). uv,\max nm (e)= 260 (28,000). IR\fmax (KBr) cm_1 : 3520, 3410, 3300, 1720, 1690, 1655, 1630, etc. 1H-NMR (80 MHZ, DMSO-d6) 0,88 (3H, t), 1,06 (3H, d), 6,20 (3H, m), 7,00 (1H, m), 7,84 (1H, d, NH), etc. °16H27 Efter etylacetatextraktion koncentrerades den sura vattenlös- ningen till torrhet. Aterstoden (36 g) upplöstes i 50 ml vat- ten, inställdes på pH 9,0 och applicerades på en reversfas- kolonn innehållande kiseldioxid (C18, Merck, 1,6 liter), som framkallades med vatten. De fraktioner som innehöll förening- en VIII sammanfördes och koncentrerades i vakuum. Återstoden kromatograferades på Sephadex LH-20 (250 ml) med en 50%-ig vattenlösning av metanol och därefter på reversfaskiseldioxid (C18) med surt vatten (pH 3,0 med utspädd saltsyra), vilket gav ren VIII-hydroklorid. 747 mg (utbyte 35 %), smältpunkt 190°c (sönaeraelning). Åšjšö -113° (c 0,5, H20). EI-Ms = m/Z 241 (M*). mv: and-absorption. Inlâax (xer) cm'1= 3400. 1660, 1620, 1530 etc. 1H-NMR (so MHZ, nmso-66) 511,27 (3H, a), 1,4-1,8 (4H), 2,98 (2H, m), 4,52 (1H, m), 6,19 (1H, d), 6,45 (1H, d-d), 7,43 (1H, t, NH), 9,46 (1H, d, NH). Analys: ber. för C H N O -HCl-H20 : C 44,67, H 7,50, N 14,21, Cl 11,99. 11 9 3 3 Funnet: C 45,04, H 7,82, N 13,81, Cl 12,55. 10 15 20 25 30 35 17 '468 813 Eftersom BU-2867T A var negativ med avseende på ninhydrin och ej uppvisade någon titrerbar grupp var det logiskt att dess struktur var en sådan som erhölls genom koppling av VII och VIII medelst en peptidbindning.
Vid upphettning med 6N saltsyra gav både BU-2867T B och C samma aminosyrakomplex som erhölls från BU-2867T A. Fettsy- ragrupperna i de tvâ antibiotika extraherades från hydroly- satet, behandlades med diazometan och isolerades som metyl- estrar, IX (från BU-2867T B) och X (från BU-2867T C). De bi- behöll det karakteristiska UV-maximum (åMe0H : 260 nm) som observerades för deras moderantibiotika.mÉï-MS av IX gav en molekyljon vid m/z 236, vilket antydde en C14-syraester med tre dubbelbindningar. UV- och 1H-NMR-spektra visade klart 2(E), 4(E)-diensyrastruktur och den tredje dubbelbindningen isolerade i IX. Ozonolys av IX följt av reducerande nedbryt- ning av ozoniden, gav n-hexanal, som isolerades och identifie- rades som 2,4-dinitrofenyl-hydrazon (EI-MS M+ : m/z 280). Des- sa fakta visade att IX var metyl-2(E), 4(E), 8-tetradekatri- enoat. Molekylvikten för estern X (EI-MS; M+ m/z 238) visa- de sig vara 28 enheter (CZH4) större än för VI, vilket åter- speglade den molekylformelskillnad som konstaterades mellan BU-2867T A och C. Detta, i kombination med 1H-NMR- och UV- -data, visade att X var metyl-2(E), 4(E)-tetradekadienoat.
Resultaten av ovan angivna försök gav följande strukturer för BU-2867T A, B och C: CB3 H-OH E E ï n-cH=cH-cH=cH-co-NH- H-co-NH\\¶, O-CHB su-zssvr A = R = cu3-(cn¿)6_ nu-zesvæ B = R = cH3-(cH2)4-cH=cH-2- BU-2a67T c : R = CH3-(CH2)8- mm.~P vm.o Aooo_wm. Pom få Sa mP.o~Z _Pm.wE ~wv_mwU 8 1._~_@P z .~w.wm _@«_m@u vÖ Åfll 4658 wOwZwwmmNU o«oF| uomßw | mßw Hmflmfl mmßfimumm U Hßwæmlbm mm.ß Pw~o .o°o_w~. ,w~ ^+z. wvm m~.mz ..m.æm .mw.o@o >>.mz _P@_wm .P>.owu o~m~\~.wo«z@«mm~u o~m| uowmm | Nmw H0>Hsm uuH> m Bßwwmlbm mv.m mv.o .ooo_mm. Pww ^+2. owm >«.oPz .m@.æm _o@.o@u wm_oPz .@m_wm .-.F@o o~m~\P.@o«z««m>~o øF_P| uo.@~ 1 mm~ Hmfiwn mmßfimnmm 4 BßwwN|Dm N Ammnmw. c mlmoøm um æfinmm Qnomonnoflq uqmm Amvumm. o~m|mo»m um muumfim wmwwmflcøfiflm UQB vnßE fiw. en mom: N\E w2|HW ,«>n Uumccsm Hmm .Hmm umæfimcmouxflä .moms m.o 0. nwwfl oqw | .mëm ÜHZHUÜW UD U nuo m »<_e>ww~|Dm mo: ußmmxmdwmm mxmfiëmxnuxmflfldxflmæm ">H Hfiwnma mv or 10 15 20 25 30 35 19 '468 813 Enzymatisk nedbrytning av BU-2867T med Pseudomonas-acylas gav andra produkter än de som hade erhållits genom hydrolys med ficin eller papain såsom har beskrivits ovan. Pseudomo- gas-stammen Pa-129 fermenterades i 10 liter av ett medium innehållande 2 % löslig stärkelse, 0,2 % glukos, 3 % soja- bönmjöl, 1 % kalciumkarbonat och 0,3 % MgSO4-7H2O vid 37°C under 3 dagar och cellerna tillvaratogs genom centrifugering.
Efter tvättning med 1 liter saltlösning två gånger âtersus- penderades cellerna i 0,75 liter saltlösning. Cellsuspensio- nen blandades med en i förväg autoklaverad suspension (1,5 liter) av 75 g natriumalginat och 25 g CM-cellulosa och bland- ningen hälldes i 30 liter av en 0,1M kalciumkloridlösning under omröring. Den gel som inneslöts i cellerna gjordes styv genom omröring med 25%-ig glutaraldehydlösning och packades i en kolonn (4,0 x 175 cm). En lösning av 1,5 g BU-2867T A i 30 liter av en 20%-ig vattenlösning av metanol fick pas- sera genom kolonnen med en flödeshastighet av 0,4 - 0,8 li- ter/timme. Den poolade effluenten fick därefter i tur och ordning passera en Amberlite IRC-50-kolonn (70 % NH4+-form, pH 6,7, 300 ml) och en HP-20-kolonn (300 ml). IRC-50-kolon- nen tvättades med vatten och framkallades därefter med 1,5 N ammoniumhydroxid. De ninhydrinpositiva fraktionerna poolades, koncentrerades och lyofiliserades för erhållande av ett blek- gult fast material (800 mg), som applicerades på en kolonn av reversfaskiseldioxid (C18, 250 ml). Kolonnens framkallades med vatten under måttligt tryck och de ninhydrinpositiva elu- aten poolades och koncentrerades för att ge ett vitt fast material av L-treonylcyklisk amin (XI, 612 mg). Utbyte 62 %. smältpunkt 170°c, ¿;ç]š7 -157° (c 0,5, H20). EI-Ms= m/Z 342 (M*). vv; Siutaasorption. IR uhax (nar) cm'1= 3350, 3280, 1550, 1520, 1530, etc. 1H-NMR (ao MHZ, nmso-a6) 5 1,05 (an, d), 1,4-2,2 (4H), 4,35 (2H, m), 4,47 (1H, m, OH), 4,62 (1H, d, OH), 6,16 (1H, d), 6,42 (1H, d-d), 7,36 (1H, t, NH), 7,97 (1H, d, NH), 8,62 (1H, d, NH). os T XI : CH -CH-CH-CO-N Q 3 [OH IIIB N \ 2 o L E 10 15 20 25 30 35 43 O\ OÛ CD .__\ OJ | 20 Den ovan erhållna HP-20-kolonnen framkallades med 1 liter vatten och därefter med en 1:2-blandning av 0,1N natrium- hydroxid och metanol. Fraktioner, som innehöll 2,4-dode- kadiensyra (V), poolades, koncentrerades till 300 ml och surgjordes till pH 2,0. Denna lösning extraherades med 300 ml etylacetat och 100 ml n-butanol. Indunstning av etylace- tatextraktet gav en oljig återstod, som kromatograferades pâ en kolonn av Sephadex LH-20 (800 ml). Vid eluering med metanol och övervakning av eluaten genom UV-absorptionen vid 260 nm koncentrerades de lämpliga eluaten för att ge färg- lösa plattor av ren V (259 mg). Utbyte 53 %. Smältpunkt 4a-49°c. uv,\ nm (e) = :se (24,ooo). IR vmax (xßr) cm' = 1680, 1630, 1605, 1410, 1300 etc. 1H-NMR (80 MHz, CD30D) 3 0,89 (3H, t), 2,0 (1OH), 2,12 (2H, m), 5,75 (1H, d), 6,16 (2H, m), 7,21 (1H, m). Denna förening var identisk med den 1 2,4-dodekadiensyra som erhölls genom syrahydrolys av BU-2867T A. n-butanolextraktet koncentrerades i vakuum och lyofiliserades för återvinning av utgângsmaterialet, BU-2867T A (160 mg, 11 %).
Av diskussionen ovan framgår att föreningarna VIII och XI är värdefulla mellanprodukter, som är användbara för framställ- ning av de olika antibiotiska föreningarna enligt föreliggan- de uppfinning. Konventionell acylering, exempelvis med en blandanhydrid av en karboxylsyra mett ett alkylsyrakarbonat (HOCOOR), ger den erforderliga peptidbindningen, Advanced Organic Chemistry, Fieser & Fieser, sid. 1039-1046, Rein- hold Publishing Corporation, New York, 1965. HYÖr0XY19ruP' per kan skyddas på vilket lämpligt sätt som helst, exempel- vis mmntetrahydropyranyl- eller t-butyletrar. Acylering av amingruppen i VIII med syrorna CH3-(CH2)6-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CHOH-CH3 I OOH C33- (C112) 4-cH=cH- (C32) 2-cs=ca-czßcx-mco-NH-ïfi-cnon-caa COOH och C33-(CH2)8-CH=CH-CH=CH=C0-NH-íH-CHOH-CH3 OCH 10 15 20 25 30 35 21 -468 sis ger BU-2867T A, B respektive C. Sá exempelvis framställes BU-2867T A genom koppling av VII och VIII. En blandning av 15 mg VII, 10 mg N,N'-dicyklohexylkarbodiimid och 8 mg 1- -hydroxi-1,2,3-bensotriazol i 2 ml dimetylformamid omrör- des 2 timmar vid rumstemperatur. Föreningen VIII (10 mg) sattes därefter till blandningen och omröringen fortsattes över natten. Lösningen koncentrerades till en återstod, som kromatograferades på reversfaskiseldioxid (C18, 40 ml) med eluering med 80 % metanol. De aktiva elueaten indunstades och återstoden renades medelst preparativ HPLC (kolonn: SSD-ODS-842, mobil fas: 90% i vattenlösning av metanol). In- dunstning av den aktiva toppfraktionen gav BU-2867T A (7,4 mg, utbyte 28 %), som i alla avseenden var identisk med det naturliga antibiotikumet. TLC (silaniserad, EtOH-H20 = 55=45) RF: 0,45. HPLC (Lichrosorb RP-18, EtOH-H20 = 65:35) Rt: 6,43 minuter.
BU-2867T A kan alltså framställas genom koppling av V med IX. En dimetylformamidlösning (1 ml) av V (3,4 mg), 3,7 mg N,N'-dicyklohexylkarbodiimid och 2,8 mg 1-hydroxi-1,2,3- -bensotriazol omrördes 2 timmar vid rumstemperatur. Till lös- ningen sattes 5 mg XI och blandningen omrördes ytterligare 3 timmar och koncentrerades i vakuum. Återstoden upplöstes i metanol och renades genom preparativ HPLC under användning av samma kolonn och mobila fas som beskrivits ovan. BU-2867 T A 4 mg, utbyte 45 %. Identiteten med naturlig BU-2867T A bekräf- tades genom en direkt jämförelse.
Föreningen XI kan framställas utgående från förening VIII un- der användning av konventionella förfaranden. Till en omrörd blandning av 44 mg N-t-butoxikarbonyl-L-treonin, 40 mg N,N'- -dicyklohexylkarbodiimid och 30 mg 1-hydroxi-1,2,3-bensotria- zol i 4 ml dimetylformamdid sattes 40 mg VIII vid rumstempe- ratur. Blandningen koncentrerades i vakuum till en återstod, som kromatograferades på en kolonn av reversfaskiseldioxid (C18, 40 ml) med en blandning av metanol och vatten (förhål- landen: 1:9 till 2:3). De lämpliga fraktionerna poolades, koncentrerades i vakuum och lyofiliserades för erhållande av 10 15 20 25 30 35 468 813 - 22 N-BOC-L-treonyl-VIII (=BOC-XI). 51 mg. Utbyte: 69 %.
KBI' vc=c = 1690 och 1640 cm'1. 1n-NMR (so Mraz) Sppm i nMso-as = 1.00 (3H, d), 1,22 (3H, d), 1,35 (9H, s), 6,11 (1H, d), 6,33 (1H, d-d), etc. En blandning av 36 mg BOC-XI och 1 ml myrsyra omrördes 1 timme vid rumstemperatur. Blandningen koncentrerades, späddes med 1 ml vatten, inställdes på pH 10,0 och applicerades på en kolonn av reversfaskiseldioxid (C18, 20 ml). Efter framkallaning med vatten och övervakning av eluatet medelst ninhydrintestet kombinerades de lämpliga eluaten ifråga och frystorkades för erhållande av XI i form av ett vitt fast material. 25 mg. Utbyte 88 %. yâïâ : 1650 cm”. 1H-NMRgppm i Dmso-aö = 1,04 (an, a), 1,22 (an, a), 6,14 (1H, d), 6,42 (1H, d~d), 7,35 (1H, t, NH), 7,98 (1H, d, NH), 8,65 (1H, d, NH) etc. sI-Ms: M* m/z 342.
Det är således möjligt att framställa de antibiotiska fören- ingarna enligt uppfinningen genom omsättning av föreningar- na VIII och XI med de lämpliga syrorna ifråga, oberoende av deras ursprung. Vidare kan under användning av föreningarna VIII och XI föreningar enligt uppfinningen, i synnerhet så- dana som framställes i högre utbyten, användas för framställ- ning av andra föreningar enligt uppfinningen. Sâ exempelvis kan BU-2867T A, som erhålles i högre utbyte genom jäsning, användas för framställning av BU-2867T B och BU-2867T C ge- nom enzymatisk hydrolys och koppling med den önskade syran, såsom har âskådliggjorts ovan.
Utbytet av BU-2867T och den genom ovan beskrivna jäsning er- hållna fördelningen av A-, B- och C-fraktionerna kan modifi- eras genom tillsats av olika fetter och oljor och vissa yt- aktiva medel till det medium i vilket Polyangium brachyspo- rum K481-B101 odlas. Så exempelvis ökade tillsatsen av soja- bönolja, majsolja, olivolja, hydrerad vegetabilisk olja, is- ter och talg i mindre utsträckning det erhållna totalutbytet av BU-2867T. Fetter och oljor med en hög halt linolensyra (C18:2), såsom sojabönolja, majsolja och ister, gav upphov till en ökning av den bildade andelen BU-2867T B. Oljor, så- 10 15 20 25 ._ , M 23 46%, su som olivolja, med en hög halt oljesyra (C18_1) gav upphov till en ökning av den bildade andelen BU-2867T C. Hydrera- de vegetabiliska oljor, som är rika på stearinsyra (C18_0), ökade endast den bildade mängden BU-2867T A.
Antimikrobiell aktivitet De minsta inhiberande koncentrationerna (MIK) av BU-2867T A, B och C bestämdes för olika mikroorganismer medelst en serie- agarutspädningsmetod. Näringsagar (Eiken) användes för bak- terier och Sabourauds dextrosagar (Difco) försvann. Den ympade mängden inställdes på 104 CFU/ml för bakterier och 105 - 107 cFu/mi för svamp.
Tabell 5 visar de antibakteriella aktiviteterna in vitro för BU-2867T A, B och C. Komponenterna A och C inhiberade icke tillväxten av både grampositiva och gramnegativa bakterier vid 50 pg/ml, medan komponent B uppvisade måttlig aktivitet med avseende på vissa grampositiva bakterier.
De antifungala aktiviteterna hos BU-2867T-komponenterna visas i tabell 6. Komponent C visade potent antifungal aktivitet med avseende på kliniskt betydelsefulla patogena svampar såsom Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumi- gatus, Trichophyton mentagrophytes och ggggr spinosus. Kom- ponenterna A och B var något mindre aktiva än komponent C men deras antifungala spektra liknade spektrumet hos den sist- nämnda. 10 15 20 25 30 468 815 24 Tabell 5: Antibakteriella spektra för BU-2867T-kompønenterna Staphylococcus aureus I - I I I Sta h lococcus egidermïdïs I I Streptococcus faecalis 'crococcus luteus Bacillus subtilis Gram-positiva oraanismer 209P Smith Bx-1633 D153 A22l52 A96l2 PCI~l001 PCI-219 Gram-negativa organismer Escherichia coli lebsiella pneumoniae roteus mirabilis \ roteus vulgaris organella morganii erratia marcescens terobacter cloacae kseudomonas aeruginosa NIHJ D-ll A95S{ A9436 A9553 A20222 A9659 A9930 MIK (pg/ml) o '_'_su-2ss7m au-zssïs sU-zssïë >so zs > so >so 3.1 > so > so so > so > so 6.3 > so > so so > so >so > so > so >so so > so > so so > so > so >so >so >so > so > so >so >so . >so, >so > so >so >so >so . >so >so > so >so >so > so >so >so > so >so Medidm: Näringsagar 10 15 20 25 30 25 468 813 Tabell 6: Antifungala spektra för BU-2867T-komponenterna Testorganism Candida albicans C tococcus neoformans Aspergillus fumigatus Asgergíllus flavus Fusarium moniliforme Piricularia ogyzae Tríchoghgton mentagroghztes Blastomyces dermaditis Sporothrix schenckií Petriellidium boydíi Mucor sginosus IAM 4888 A 9540 D 49 IAM 4514 IAM 2530 IAM 2034 FA 21436 A 2284 D 91 ' D 155 84329 IFO 8144 IFO 8158 IFO 8073 IFO 5317 Medium; Sabourauds dextrosagar MIK (pg/ml) BU-2867A BU-28673 BU-2867C 3.1 3.1 1.6 1.6 1.6 0.8 25 25 3.1 25 25 3.1 1.6 3.1 0.8 1.6 3.1 0.8 25 25 50 > 50 >50 > 50 750 >50 >50 25 12.5 1.6 25 12.5 6.3 50 50 >S0 >50 >50 >50 >50 >50 50 1.6 0.8 0.2 10 15 20 25 30 35 468 815 26 - Antitumöraktivitet Antitumöraktiviteten hos BU-2867T A, B och C bestämdes på honmöss CDF1 och hanmöss BDF1. Lymfocytisk leukemi P388 (CDF1- och BDF1-möss) och lymfoid leukemi L1210 (BDF1-möss) inympades genom intraperitoneal injektion av 0,8 ml utspädd askitesvätska innehållande 106 respektive 105 celler per mus.
Melanotisk melanom B16 (BDF1-möss) implanterades i form av 0,5 ml av en 10%-ig tumörgröt intraperitonealt. Testfören- ingarna upplöstes i 0,9 % saltlösning innehållande 10 % di- metylsulfoxid och graderade doser därav administrerades till möss intraperitonealt 24 timmar efter tumörimplantation.
I jämförelse testades antingen olivomycin (NSC 38270) eller mytomycin C som referensförening vid försöken.
BU-2867T A, B och C uppvisade antitumöraktivitet med avse- ende på P388-leukemi vid behandlingsschema 1 ( en gång dag- ligen på dagarna 1, 4 och 7). Tabell 7 visar de erhållna re- sultaten som en ökning av medelöverlevnadstiden (MÖT) för test (T)- och kontroll (K)-djuren för olika doseringsssche- ma, uttryckt som ett procentuellt förhållande. Värden på det procentuella förhållandet av 125 och däröver antyder signifikant antitumöreffekt.
Tabell 7: Antitumöraktivitet hos BU-2867T-komponenterna med avseende på leukemi P388 T/K % av MÖT Dos i mg/kg/dag, ip 3 1 Q¿§ 0,1 BU-2867T A 140 130 120 " B 165 140 120 C 155 130 Olivomycin A 140 135 100 BU-2867T A och C var högaktiva med avseende på leumemi P388 vidbehandlingsschema2 (en gång dagligen på dagarna 1 - 9); BU-2867T A var mindre aktiv med avseende på L1210 leukemi 10 15 20 25 30 35 0 “f 27 460 och B16 melanom. Tabell 8 visar de resultat som erhölls för olika doseringsscheman, ånyo uttryckta som en procentuell förhâllandeökning i medelöverlevnadstid, där värden på 125 och däröver antyder signifikant antitumöreffekt.
Tabell 8: Antitumöraktivitet hos BU-2867T A och C T/K av MÖT Dos i mg/kg/dag, ip P388 leukemi 2 1 0,5 0,25 0,13 0,063 g¿gg1 BU-2867T A 67 228 186 156 147 136 109 " c 234 189 175 159 153 123 100 Mitomycin c 290 240 170 150 130 115 L1210 leukemi BU-2867T A 129 118 118 106 Mitomycin C 140 141 129 129 106 B16 melanom BU-2867T A Tox. 125 116 113 100 Mitomycin C 63 181 163 141 131 Den akuta toxiciteten hos BU-2867T A och C bestämdes på ddY- hanmöss genom en enda peritoneal administrering. LD50-värde- na var 8,1 mg/kg respektive 25 mg/kg.
De farmakologiskt effektiva föreningarna enligt denna uppfin- ning kan medelst konventionella metoder inom den galeniska farmacien beredas till farmaceutiska beredningar för oral el- ler parenteral administrering, exempelvis till däggdjur in- klusive människa. Konventionella excipienter är farmaceutiskt godtagbara organiska eller oorganiska bärarsubstanser lämpliga 10 15 20 25 30 35 468 813 - 28 för parenteral, enteral eller lokal applicering, vilka ej ogynnsamt reagerar med de aktiva föreningarna. Lämpliga farmaceutiskt godtagbara bärare innefattar, men begränsas ej till vatten, saltlösningar, alkoholer, gummi arabicum, vegetabiliska oljor, polyetylenglykoler, gelatin, laktos, amylos, magnesiumstearat, talk, kiselsyra, vaselin, par- fymolja, fettsyramonoglycerider och -diglycerider, penta- erytritol-fettsyraestrar, hydroximetylcellulosa, polyvinyl- pyrrolidon etc. De farmaceutiska preparaten kan sterilise- ras och om så önskas blandas med adjuvantia, exempelvis smörjmedel, konserveringsmedel, stabilisatorer, vätmedel, emulgatorer, salter för att påverka det osmotiska trycket, buffertämnen, färgämnen, smakämnen och/eller aromatiska sub- stanser och liknande, som icke ogynnsamt reagerar med de aktiva föreningarna.
För parenteral administrering är injicerbara sterila lösning- ar speciellt lämpliga, företrädesvis oljehaltiga eller vat- tenhaltiga lösningar, liksom suspensioner, emulsioner eller implantat innefattande suppositorier. Ampuller är lämpliga doseringsenheter.
För enteral administrering är tabletter, drageer, suppositori- er eller kapslar speciellt lämpliga med talk och/eller en kolhyd- ratbärare eller -bindemedel eller liknande, varvid bäraren företrädesvis är laktos och/eller majsstärkelse och/eller po- tatisstärkelse. En sirap, tinktur, mixtur eller liknande kan användas, i vilken en sötad vehikel användes. Beredningar med fördröjd frigöring kan framställas innefattande sådana där den aktiva föreningen är skyddad med differentierat nedbryt- bara beläggningar, exempelvis genom mikroinkapsling, belägg- ning i flera skikt, etc.
I allmänhet används föreningarna enligt denna uppfinning i enhetsdoseringsform i en farmaceutiskt godtagbar bärare in- nefattande den erforderliga dosen. Doseringen av förening- 29 '4-Öâš Salš arna enligt denna uppfinning är 1 allmänhet 5 - 250 mg/dag vid administrering till patienter, exempelvis humanpatien- ter med en vikt av 75 kg. Lämpliga doseringar och doserings- scheman för en given patient kan fastställas under utnytt- jande av konventionella bedömningar, exempelvis genom sedvan- lig jämförelse mellan de differentiella aktiviteterna hos en förening enligt uppfinningen och hos ett känt antibioti- kum eller antitumörmedel, exempelvis medelst lämpliga kon- ventionella farmakologiska protokoll.

Claims (15)

10 15 20 25 30 35 468 815 - 30 PATENTKRAV
1. Föreningar med formeln H3 H H H~OH N _ - - - H- H-CO'NH R CH=CH CH=CH CO N N\\r/<=å;>:=“O H o C33 vari R är CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 eller CH3-(CH2)8.
2. Förfarande för framställning av en förening enligt krav 1 med formeln H3 En-on n-cn-cn-cH=cH-co-Nn- H-co-NH vari R är CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)¿-CH=CH-(CH2)2 eller CH3-(CH2)8, k ä n n e t e o k n a t därav, att man odlar Polyangium brachzsæ- Egg sp. nov. 1 ett näringsmedium innehållande en assimilerbar kol- och kvävekälla under aeroba betingelser, separerar det bildade myceliet och utvinner föreningen från näringsmediet.
3. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att Polyangium brachysporum sp. nov. är stammen K481-B101.
4. Förfarande enligt kravf3, k ä n n e t e c k n a t därav, att stammen K481-B101 ytterligare karakteriserassomAECC 53080.
5. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att ett fett eller en olja sättes till näringsmediet. 10 15 20 25 30 35 N '468 813
6. Förfarande enligt krav 2, k~ä n n e t e c k n a t därav, att det separerade myceliet extraheras med ett organiskt lös- ningsmedel och extraktet kombineras med näringsmediet före utvinningen av föreningen.
7. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att föreningen utvinnes från näringsmediet genom extraktion med ett organiskt lösningsmedel.
8. Förfarande enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a t därav, att produktionen av föreningenlövervakas under användning av Candida albicans som testorganism.
9. En biologiskt ren kultur av mikroorganismstammen Polzangium brachysgorum K481-B101, deponerad under nummer ATCC 53080, för användning vid framställning av peptidantibiotika.
10. Förening med formeln H _/ x: 0 CH3
11. Förfarande för framställning av en förening enligt krav 10 med formeln \f7\/ / H /ši C NH2 /Bllzm O O H3 k ä n n e t e c k n a t därav, att man hydrolyserar en för- 10 15 20 25 30 35 468 813 32 ening med formeln (F33 n H-on R-CH=CH-CH=CH=CO-NH-EH-CO-NH 2112 šïzm CH3 vari R är CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 eller CH3-(CH2)8, i närvaro av ficin, papain eller chymopapain.
12. Föreningen med formeln OH [FJ za; CH3- H- -CO-NH- H 0/ CH3 OH NH2
13. Förfarande för framställning av en förening enligt krav åvx ~É 12 med formeln C33-CH-ÄH-CO-NH H H . O CH3 H2 k ä n n e t e c k n a t därav, att man hydrolyserar en för- ening med formeln 10 15 20 25 30 35 33 464; m3 H3 x-ou R-cH=cH-cH=cx-co-NH- H-co-Nu CH3 vari R är CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 eller CH3-(CH2)8, i närvaro av Pseudomonas-acylas.
14. Antifungal beredning innefattande en antifungalt effek- tiv mängd av minst en förening enligt krav 1 med formeln H3 H-os °H H n-cn=cn-cH=cn-co- - - N \§ E E Na H co Na H ' I ca; . vari R är CH3(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 eller CH3-(CH2)8, jämte en farmaceutiskt godtagbar bärare.
15. Antitumörberedning innefattande en mängd av minst en för- ening enligt krav 1 med formeln fa OH 3 E B ïH'°H _,/\\l/”\\~/”N n-cH=cH-cH=cn-co-Nn- H-co-NH N \¿::>¥=_o ;>?/H\ï,/'\ vari R är CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 eller CH3-(CH2)8, CH3 effektiv som antitumörmedel,i en farmaceutiskt godtagbar bärare.
SE8603634A 1985-08-30 1986-08-28 Nya peptidantibiotika, framstaellning av och nya mellanprodukter, foerfarande foer antibiotikaframstaellningen med polyangium brachysporum sp.nov. samt en antifungal- och en antitumoerberedning SE468813B (sv)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US77109085A 1985-08-30 1985-08-30
US06/855,649 US4692510A (en) 1985-08-30 1986-04-25 Peptide antibiotics

Publications (3)

Publication Number Publication Date
SE8603634D0 SE8603634D0 (sv) 1986-08-28
SE8603634L SE8603634L (sv) 1987-03-01
SE468813B true SE468813B (sv) 1993-03-22

Family

ID=27118403

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8603634A SE468813B (sv) 1985-08-30 1986-08-28 Nya peptidantibiotika, framstaellning av och nya mellanprodukter, foerfarande foer antibiotikaframstaellningen med polyangium brachysporum sp.nov. samt en antifungal- och en antitumoerberedning

Country Status (24)

Country Link
US (1) US4692510A (sv)
KR (1) KR950005134B1 (sv)
CN (1) CN86105469A (sv)
AT (1) AT396117B (sv)
AU (1) AU593836B2 (sv)
BE (1) BE905350A (sv)
CA (1) CA1260859A (sv)
CH (1) CH672921A5 (sv)
DE (1) DE3629465A1 (sv)
DK (1) DK414586A (sv)
ES (1) ES2002731A6 (sv)
FI (1) FI88053C (sv)
FR (1) FR2586688B1 (sv)
GB (1) GB2179662B (sv)
GR (1) GR862227B (sv)
HU (1) HU197945B (sv)
IL (1) IL79858A0 (sv)
IT (1) IT1198023B (sv)
LU (1) LU86564A1 (sv)
MY (1) MY102800A (sv)
NL (1) NL8602199A (sv)
PT (1) PT83279B (sv)
SE (1) SE468813B (sv)
YU (1) YU43899B (sv)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4777160A (en) * 1986-09-18 1988-10-11 Bristol-Myers BU-2867T peptide antibiotics
US4789731A (en) * 1986-10-10 1988-12-06 Bristol-Myers Company Semi-synthetic peptide antibiotics
US5096884A (en) * 1990-01-09 1992-03-17 Bristol-Myers Squibb Company Glidobactin pf-1 peptide antibiotics
JPH07501057A (ja) * 1991-10-31 1995-02-02 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション フィブリノーゲン・アンタゴニスト用c8−環状ペプチド模倣体
AU2180201A (en) * 1999-11-30 2001-06-12 Aventis Pharma S.A. Hydroxamic acid macrocyclic derivatives, preparation method and compositions containing same
FR2801591B1 (fr) * 1999-11-30 2002-03-01 Aventis Pharma Sa Derives macrocycliques de l'acide hydroxamique, leur preparation et les compositions qui les contiennent
EP2435019B1 (en) * 2009-05-29 2015-09-23 Dr. August Wolff GmbH & Co. KG Arzneimittel Dodeca-2e,4e-diene amides and their use as medicaments and cosmetics
GB0922108D0 (en) 2009-12-17 2010-02-03 Gene Bridges Gmbh Heterologous hosts
EP2597082A1 (de) 2011-11-24 2013-05-29 Symrise AG Verbindungen zur Maskierung eines unangenehmen Geschmacks
CN107235925B (zh) * 2017-06-30 2020-05-15 中国科学技术大学 抑制多重耐药菌的化合物、其制备方法及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CH672921A5 (sv) 1990-01-15
GB2179662A (en) 1987-03-11
GR862227B (en) 1986-12-31
CN86105469A (zh) 1987-06-10
BE905350A (fr) 1987-03-02
YU43899B (en) 1989-12-31
FI88053C (sv) 1993-03-25
PT83279B (pt) 1989-03-30
LU86564A1 (fr) 1987-03-06
DE3629465A1 (de) 1987-03-05
FI863473A (fi) 1987-03-01
FI863473A0 (fi) 1986-08-27
AU6208886A (en) 1987-03-05
HU197945B (en) 1989-06-28
NL8602199A (nl) 1987-03-16
FI88053B (fi) 1992-12-15
IT8621557A1 (it) 1988-02-29
HUT44804A (en) 1988-04-28
DK414586D0 (da) 1986-08-29
KR870002253A (ko) 1987-03-30
IL79858A0 (en) 1986-11-30
FR2586688A1 (fr) 1987-03-06
SE8603634D0 (sv) 1986-08-28
YU151086A (en) 1988-04-30
GB2179662B (en) 1989-09-13
AT396117B (de) 1993-06-25
ES2002731A6 (es) 1988-10-01
DK414586A (da) 1987-03-01
ATA233086A (de) 1992-10-15
CA1260859A (en) 1989-09-26
US4692510A (en) 1987-09-08
AU593836B2 (en) 1990-02-22
KR950005134B1 (ko) 1995-05-18
PT83279A (en) 1986-09-01
SE8603634L (sv) 1987-03-01
IT8621557A0 (it) 1986-08-29
IT1198023B (it) 1988-12-21
GB8620987D0 (en) 1986-10-08
FR2586688B1 (fr) 1989-06-02
MY102800A (en) 1992-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Umehara et al. Studies on WF-3161, a new antitumor antibiotic
Oka et al. Glidobactins A, B and C, new antitumor antibiotics I. Production, isolation, chemical properties and biological activity
HUT58820A (en) Process for producing new polypeptides
US4946941A (en) Novel glycopeptide antibiotics
SE468813B (sv) Nya peptidantibiotika, framstaellning av och nya mellanprodukter, foerfarande foer antibiotikaframstaellningen med polyangium brachysporum sp.nov. samt en antifungal- och en antitumoerberedning
EP0287110A2 (en) Glycopeptide antibiotics pa-45052
EP0001709A2 (en) Deoxynarasin antibiotics, their production and use
US5025023A (en) Peptide antibiotics
US4833076A (en) Peptide antibiotics
US4898940A (en) Peptide antibiotics
CA2401032C (en) Memno peptides, a process for their preparation and their use
US5854276A (en) Substance WF16616, process for production thereof, and use thereof
US5079148A (en) Peptide antibiotics
US4777160A (en) BU-2867T peptide antibiotics
KR860001497B1 (ko) 항생제 a51568 인자 a 및 b의 제조방법
CA1088441A (en) Antibiotics, neoviridogriseins, and their method of production
US4916063A (en) BU-2867T peptide antibiotics
NO155701B (no) Fremgangsmaate til fremstilling av et terapeutisk aktivt derivat av tallysomycin a eller b
US4789731A (en) Semi-synthetic peptide antibiotics
JP4095116B2 (ja) スクレロデルマ・テキセンスからの抗真菌性ペプチド
JPS6251697A (ja) ペプチド抗生物質
EP0818539A1 (en) Methylsulfomycin I, a process for its production and its use
CA2020878C (en) Antitumor antibiotic bu-3285t
KR0143769B1 (ko) 항균성 폴리펩티드 화합물과 그 제조방법 및 이를 함유하는 약학 조성물
US4314028A (en) Fermentation process for producing tallysomycin compounds

Legal Events

Date Code Title Description
NAV Patent application has lapsed

Ref document number: 8603634-0

Effective date: 19930920