AT396117B - Verfahren zur herstellung neuer peptidantibiotika - Google Patents

Description

AT396117B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)

worin R für CHj-fCH^* CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 oder CHj-CCH^g steht, sowie den für dieses fermentative Verfahren verwendeten neuen Mikroorganismus.

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Peptidantibiotika zur Verfügung zu stellen, die als antifungische IS und Antitumor-Mittel besonders brauchbar sind.

Es wurden bereits zahlreiche Mikroorganismen aus Bodenproben isoliert und in einem synthetischen Medium kultiviert Es hat sich gezeigt daß diese Mikroorganismen Verbindungen mit antibiotischer Aktivität produzieren. Es wurde nun ein neuer Bakterienstamm, nämlich K481-B101, aus einer Bodenprobe isoliert die in der Nähe des Parthenons in Athen, Griechenland, genommen wurde. Es hat sich gezeigt, daß dieses Bakterium eine Mischung von 20 Peptiden mit antibiotischer Aktivität produziert

Das erfindungsgemäße Verfahren ist daher dadurch gekennzeichnet daß man einen Mikroorganismus des Stammes K481-B101, ATCC 53080, der Species Polyangium brachysporum unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert das eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff enthält das gebildete Myzel abtrennt und die Verbindung aus dem Nährmedium gewinnt 25 Die erfindungsgemäß hergestellten Substanzen sind antifungisch und/oder antitumoral wirksam und können einzeln oder in Kombination, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden.

Aus den eifindungsgemäß hergestellten neuen Verbindungen können die Substanzen

30 35 40 45 50 gewonnen werden, die als Zwischenverbindungen zur Herstellung weiterer pharmazeutisch interessanter Verbindungen brauchbar sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren liefert den Verbindungskomplex Bu-2867T.

Die Figuren 1,2 und 3 zeigen das IR-Spektrum jeweils von Bu-2867T A, B und C.

Die Figuren 4 und 5 zeigen das ^H-NMR- und ^C-NMR-Spektrum von Bu-2867T A.

Die morphologische, kulturelle und physiologische Charakterisierung von K481 -B101 erfolgte anhand folgender Methoden: McCurdy, Jr. H.D.: Studies on the Taxonomy of the Myxöbacterales. Π, Polyangium and the demise of the Sorangiaceae. Intl. J. Syst. Bacteriol. 20:283-296,1970; H. Reichenbach: Nannocystis exedens gen. nov., sp. nov., a new myxobacterium of the family Sorangiacease. Arch. Mikrobiol. 70:119-138,1970; P. Christensen und F. D. Code: Lysobacter, a new Genus of non-fruiting, gliding bacteria with a high base ratio. Intl. J. Syst Bacteriol. 28: 367-393, 1978: und P. Christensen: Synonymy of Flavobacterium pectinovorum Dorey with Cytophaga johnsonae Stanier. Intl. J. Syst Bacteriol. 27:122-132,1977. Die Erhaltung und die Reinigung erfolgten anhand da1 -2- 55

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Verfahren, beschrieben von J.E. Peterson: Isolation, cultivation and maintenance of the myxobacteria Methode in Microbiology 3B: 185-210,1969. Edit. J.R. Norris & D.W. Ribbons. Academic Press (London undNew York); und Reichenbach, Η & M. Dworkin: The Order Mixobacterales. The Prokaryotes. Band 1:328-355,1981. Edit. M.P.Stair et al., Springer-Verlag (Berlin, Heidelberg und New York). Die taxonomische Stellung wurde gemäß der Beschreibung in Bergey’s Manual, 8th Ed., 1974 und „The Prokaryotes, Band I“ bestimmt

Morphologie:

Casiton-Mg++-Agar, Chitinagar, Hefezellenagar und Kaninchendung-Pellets-Wasseragar wurden für die morphologischen Untersuchungen verwendet. K-481-B101 ist ein gram-negatives Bakterium, das nicht den Flagellaten angehört Die vegetativen Zellen sind zylindrisch (0,6 - 8,8 mal 2-10 pm) mit stnmpfrunden Enden. Die vegetativen Zellen zeigen flexible und langsame Gleitbewegungen auf der feuchten Oberfläche von Agarmedium oder weichem Agarmedium. Die Myxosporen unterscheiden sich klar von den vegetativen Zellen und sind oval oder sphärisch, 0,6 - 0,8 mal 0,6-13 Mm, nicht-refraktil oder refraktil und zeigen gelegentlich Paaibildung. K481-B101 bildetauf den meisten descriptiven Agarmedien sessile Sporangia, die die Myxosporen umhüllen. DieSporangiasind oval, sphärisch oder kissenartig, ziemlich variabel in der Größe, 12 x 20 mal 80 x 120 pm, häufig durch eine übliche Umhüllung oder Schleimschicht gebunden, besitzen Doppelkontur und treten einzeln oder in Clustern (sori) auf. Die Morphologie von K481-B101 ist in Tabelle I zusammengestellt.

Eigenschaften der Kultur K481-B101 wächst mäßig auf Casiton-Mg++-Agar (McCurdy 1969) und Hefezellenagar (Christensen & Cook, 1978) und wächst schlecht auf Bacto-Nährmediumagar oder Bacto-Herzinfusionsagar. Rhizoide oder federige Schwärme beobachtet man auf YP-Weichagar (Hefeextrakt 0,3 %, Pepton 0,1 %, NaCl 0,01 %, Agar 0,3 %, pH 6,6 - 6,8), nicht jedoch auf Casiton-Mg++-Agar. Die Kolonien auf Casiton-Mg++-Agar sind kreisförmig, transluzent und schwach grün-gelb und ätzen, erodieren oder penetrieren schwach in Agar. Die Kultureigenschaften sind in Tabelle II gezeigt.

Physiologische Eigenschaften: K481-B101 hydrolysiert Stärke, Chitin, Gelatine und Casein, aber nicht Cellulose und Agar. Es lysiert autoklavierte Hefezellen, nicht jedoch lebende Micrococcus luteus-Zellen. K481-B101 istmesophil und sensitiv gegenüber 2 % NaCl. Die physiologischen Eigenschaften sind in Tabelle IH gezeigt

Konkomitanz von Flagellatbakterien und Auftreten von spontanen Varianten:

Man beobachtete Konkomitanz von gram-negativen, stabföimigen Flagellatbakterien in der ursprünglichen Kultur. Man reinigte K481-B101 ziemlich gut, indem man die üblichen Verdünnungs- und Einzelzellisolierungstechniken mit Schallbehandlung, Hitzeschockbehandlung oder antibiotischer Sensitivierung (z. B. Pipemidinsäure bei 50 mcg(ml) unter Verwendung der Myxosporen oder des Fruchtkörpers kombiniert Bei einer ungereinigten Kultur vonK481-B101findensichMukoidvarianten, die weißliche, domförmige Kolonien mit schwärmendem Halo bilden. Die vegetativen Zellen dieser Mukoidvarianten sind etwas größer als der ursprüngliche Stamm, sie besitzen eine Abmessung von 0,8 - 1,0 x 2,0 - 3,5 pm. Die Sporangia-Cluster (Sotus) werden überwiegend durch Mukoidvarianten gebildet.

Taxonomische Stellung: K481-B101 ist ein fruchtbildendes Gleitbakterium, das aus einer Bodenprobe isoliert wurde. Die wesentlichen Erkennungsmerkmale des Stammes sind folgende:

Vegetative Zellen: 1. Zylindrisch, einheitlicher Durchmesser; 2. die Enden sind nicht spitz zulaufend; 3. in Agarmedium penetrierbar, 4. Kongorot, nicht adsorbiert.

Myxosporen; 1. Differenziert von den vegetativen Zellen; 2. oval oder sphärisch; 3. nicht-refraktil oder refraktil. -3-

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Snorangia: 1. Sessil; 2. oval, sphärisch oder irregulär; 5 3. häufig durch eine übliche Hülle oder Schleimschicht gebunden; 4. Doppelkonturen; 5. Schwach-gelb (eine ausgeprägte Farbe ist nicht vorhanden); 6. treten einzeln oder in Clustern (sori) auf. 10 Kulturelle und physiologische Eigenschaften; 1. Goldgelbe bis weißliche Kolonie; 2. die Kolonien ätzen, erodieren und penetrieren schwach in Agar; 3. Chitinolytisch aber nicht cellulolytisch 15 4. lysiert Hefezellen, nicht aber Micrococcus luteus

Die oben beschriebenen morphologischen, kulturellen und physiologischen Eigenschaften von K481-B101 zeigen, daß K481-B101 in die Ordnung Myxobacterales einzuklassifizieren ist. Die zu den Genera Myxobacterales zählenden Genera Myxococcus, Archangium und Cystobacter unterscheiden sich von K481-B101 hinsichdich der 20 spitz zulaufenden vegetativen Zellen und der Morphologie des Fruchtkörpers. Die GeneraMelittangium, Stigmatella und Chondromyces unterscheiden sich von K481-B101 durch die gestelzten Sporangia. K481-B101 ähnelt den Genera Polyangium und Nannocystis. K481-B101 ähnelt dem Genus Nannocystis in der Bildung oval»: oder sphärischer Myxosporen und ovaler oder sphärischer solitärer Sporangia und unterscheidet sich davon durch die zylindrischen vegetativen Zellen mit gleichmäßigen Durchmesser und durch die mangelnde 25 Fähigkeit in Agar zu ätzen, aerodieren und penetrieren. K481-B101 ähnelt dem Genus Polyangium hinsichtlich der zylindrischen vegetativen Zellen mit stumpfrunden Enden, der überwiegenden Bildung nichtrefiraktiler Myxosporen und der ovalen oder sphärischen, doppelt konturierten Sporangia. Auf der Basis von Vergleichsuntersuchungen mit den Genera der Ordnung Myxobacterales wird K481-B101 als Spezies des Genus Polyangium klassifiziert. Unter den Spezien von Polyangium ähnelt P Luteum K481 -B101 hinsichtlich der Größe der vegetativen Zellen, der Farbe 30 und Gestalt der Sporangien und der Farbe der vegetativen Kolonie. K481-B101 unterscheidet sich jedoch von P Luteum durch die ovalen oder sphärischen Myxosporen, die stark kontrahiert sind und durch die mangelnde Fähigkeit, lebende Bakterienzellen, wie Micrococcus luteus-Zellen, zu lysieren.

Daraus wird geschlossen, daß K481-B101 eine neue Spezies des Genus Polyangium in derFamiliePolyangiaceae der Ordnung Myxobacterales ist Es wird vorgeschlagen, K481-B101 als Polyangium brachysporum sp. nov. zu 35 bezeichnen.DerTypdesStammesistNr.K481-B101 (Einzelisolat),dieKulturwurdebeider American TypeCulture

Collection unter der Nr. ATCC 53080 hinterlegt

Tabelle I: 40 Momholoeie von K481-B101

Vegetative Zellen: Gram-negativ. Zylindrisch mit stumpfen runden Enden (0,6 - 0,8 mal 2,0 -10 pm).

Kongorot wird nicht adsorbiert 45 50

Myxosporen: Unterscheidbar von den vegetativen Zellen. Stark geschrumpft, werden oval oder sphärisch, 0,6 - 0,8 mal 0,6 -1,5 pm, nicht-refraktil. Eine längere Inkubation ergibt reffaktile Myxosporen.

Sporangia: Sessil, treten einzeln oder in Clustern auf. Oval, sphärisch, kissenartig oder gestaltlos.

Die Größe ist ziemlich variabel, 12 x 20 mal 80 x 120 pm. Durch eine übliche Hülle oder Schleimschicht gebunden. Doppelkonturiert In Agar eingebettet Die Größe der Gesamtmasse von Cluster von zwei bis zehn oder mehr Sporangia liegt im Bereich von 50 - 300pm.

Mikrokolonie: Schwach auf Chitinagar nach 2wöchiger Inkubation. Palisadenförmige oder Zick-

Zack-Anordnung von Ketten vegetativer Zellen an der Peripherie. Gleitbewegung von Einzelzellen wird beobachtet, nicht jedoch von Zellenmassen. -4- 55 5

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Tabelle!!:

Kulturelle Eigenschaften einer K481-B101-Kolonie auf Casiton-Mg++-Agar (McCurdv 1969) bei 28 °C und 6 Tagen

Form: Zirkular. Oberfläche Glatt, später teilweise faltig. Elevation: ausgebildet 10 Ecken: Völlig oder etwas irregulär, ausgeprägte, hervorspringende Teile, wie Zungen, Federn oder Rhizoide, fehlen. Optische Eigenschaften: Semitransparent oder opak. Farbe der Kolonie: Schwach grün-gelb. 15 Diffusibles Pigment: Keines.

Wachstum auf Chitinagar nach 3-wöchiger Inkubation bei 28 °C. Dünn, transluzent, schwach-gelb oder farblos. Dick, opak und gelblich-weiß an den peripheren Teilen. Konzentrische Sporangia-Bildung an der Peripherie. Ätzt, erodiert oder penetriert schwach in Agar. 20

Tabelle ΙΠ:

Physiologische Eigenschaften von K481-B101 Hvdrolvse von löslicher Stärke + Kartoffelstärke + CMC Natrium + Cellulose - Agar - Chitin + Natriumalginat - Natriumpolypectat - Gelatine + Casein + Wachstum auf 25 30 35 40 45 50

Simon’s Citratagar Christensen-Citratagar Glucoseammoniumsalzagar Asparaginammoniumsalzagar + Produktion von Indol H2S + Acetoin (VP-Reaktion) Urease + Oxidase + Katalase +

Lytische Wirkung gegen lebende Zellen von Micrococcus luteus-Stämmen PCI 1001 & ATCC 9341 -autoklavierte Hefezellen + -5- 55

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Reaktionen

Milchkoagulation: Milchpeptonisierung: NaCl-Toleranz: pH-Toleranz: Wachstumstemperatur: Oxidative oder fermentative Reaktion: +

Wachstum: 1,0 % NaCl oder wenig» Kein Wachstum: 2,0 % NaCl oder mehr Wachstumsbereich pH 5,5 -10,5 Geringes Wachstum: pH 5,0 Kein Wachstum: pH 4,5 und 11,5 Maximales Wachstum: 37 °C Wachstumsbereich: 15 - 42 °C Kein Wachstum: 10 °C und 45 °C Oxidativ (Hugh und Leifson Medium)

Antibiotika-Produktion:

DieStammkultur vonPolyangiumbrachysporumK481-B lOlließ man sich3Tagebei28°CaufAgarschrägmedium vermehren, das aus 0,5 % löslicher Stärke, 0,5 % Glucose, 0,1 % Fleischextrakt, 0,1 % Hefeextrakt, 0,2 % Nz-Case, 0,2 % NaCl, 0,1 % CaCOß und 1,6% Agar (pH 7,0) bestand. Eine gutgewachsene Agarscluägkultur wurde dann dazu verwendet, ein vegetatives Medium zu inokulieren, das aus 2 % Maisstärke, 3 % Sojabohnenmehl, 03 % MgS04«7H20 und 1 % CaCOß (pH 7,0, vorder Sterilisation) bestand. Nach 3-tägiger Inkubation bei 28 °C auf einer Rotationsschüttelvorrichtung (250 Upm) wurden 5 ml der Kultur in einen 500 ml-Erlenmeyerkolben gegeben, der 100 ml des Produktionsmediums der gleichen Zusammensetzung wie das vegetative Medium enthielt.

Die Antibiotika-Produktion wurde mittels der Papierscheibenagardiffusionsmethode unter Verwendung von Candida albicans A9540 als Testorganismus verfolgt. Die Fermentation wurde 4 Tage bei 28 °C auf ein» Rotationsschüttelvorrichtung fortgesetzt, wobei die Antibiotika-Produktion einen maximalen Wert von 100 mcg/inl »reichte.

Die Fermentation wurde auch in einem Fermentergefäß mit Rührvorrichtung durchgefühlt 500 ml der durch Fermentation im Kolben erhaltenen Impfkultur wurden dazu verwendet, 101 des Produktionsmediums in einem 201-Gefäß zu inokuli»en. Die Fermentation erfolgte bei 28 °C unter Rühren mit 250 Upm und unter Belüftung mit 101/min. Die Antibiotika-Produktion »reichte ein Maximum von 150 mcg/ml nach 40-stündiger Fermentation.

Isolierung und Reinigung des Antibintikams:

Die Fermentationsbrühe (48 1) wird mit Hilfe einer Zentrifuge (sharpless centrifuge) abzentrifugiert. Den Myzelkuchen homogenisiert man mit 7 1 Methanol und die Mischung rührt man 1 h. Nach Abfiltrieren von unlöslichen Bestandteilen verdampft man den Methanolextxakt zu einer wäßrigen Lösung, die man mit dem Filtrat der Brühe vereinigt und mit n-Butanol (241) extrahiert. Der Extrakt wird auf 0,5 ml konzentriert und in n-Hexan (331) unter Rühren gegossen, wobei das rohe Antibiotikum ausfällt (41 g). Dies» Feststoff wird an einer Silikagel C-200-Säule (760 ml) chromatographiert, wobei mit Ethylacetat und einer steigenden Menge Methanol (0 - 50 %) eluiert wird. Die elui»te Bioaktivität wird mittels Papierscheiben- Assay unter Verwendung von Candida albicans A9540 als Testorganismus bestimmt. Die aktiven Fraküonen werden vereinigt und verdampft, wobei man den Bu-2867T-Komplex als schwach-gelbes Pulver (13 g) erhält. 200 mg dieses Feststoffes werden an ein» Umkehrphasensäule (Cjg, 100 ml) unter Verwendung von Elhanol/Wasser (3:7 bis 5:5) als Eluierungsmittel chromatographiert. Das Eluat wird mittels eines Bioassays auf antifungische Wirkung und mittels TLC (silanisiert, EtOH^O=55:45) verfolgt. Die ersten aktiven Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck verdampft, wobei BU-2867T A rein als weiß» Feststoff (61 mg) erhalten wird. Dies» wird aus wäßrigem Methanol umkristallisiert, wobei sich weiße Nadeln (34 mg) abscheiden. Verdampfen der zweiten und dritten aktiven Fraktion»! liefert BU-2867T B (1 mg) und C (11 mg). BU-2867T C wird aus Methanol in Form feiner Nadeln kristallisiert. Durch Wiederholen der öbig»i Umkehrphasenchromatographie erhält man dann insgesamt 3,9 g BU-2867T A, 44 mg BU-2867T B und 342 mg BU-2867T C. -6-

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Charakterisierung des Antibiotikums: BU-2867T A und C wurden als farblose Nadeln isoliert, wohingegen BU-2867T B als weißes amorphes Pulver erhalten wurde. Diese Verbindungen sind leicht löslich in Methanol, Ethanol, n-Butanol und Dimethylsulfoxid, etwas löslich in Chloroform, Acetonitril und Ethylacetat und praktisch unlöslich in n-Hexan und Wasser. Sie geben eine positive Reaktion auf Rydon-Smith-Reagens und färben sich beim Besprühen mit Jod oder Schwefelsäure auf Dünnschichtchromatographieplatten. Die sind negativ gegenüber der Ninhydrin-, Sakaguchi-, Anthron· und Dragendorff-Reaktion. Mittels Massenspektrometrie und Mikroanalyse wurde für BU-2867T A, B undC jeweils die Summenformel C27H44N4O5, C29H45N4O6 und C29H48N4O6 ermittelt. Die UV-Spektren dieser Verbindungen in Methanol zeigen ein einziges Maximum bei 261 nm, das sich in saurer oder alkalischer Lösung nicht verschiebt. Die physikalisch-chemischen Daten von BU-2867T A, B und C sind in Tabelle IV zusammengestellt. Ihre IR-Spektren in KBr (Fig. 1,2 und 3) zeigen starke Amidbanden bei ungefähr 1630und 1540cm'1 und OH- und/oder NH-Absorptionen bei 3300 cm'1. Das ^-NMR-Spektrum von BU-2867T A (Fig. 4) zeigt die Anwesenheit von sechs Olefinprotonen (5:6,16; 6,20 (2H); 6,28; 6,49 und 7,09 ppm) und vier Amidprotonen (δ: 7,49; 7,82; 7,87 und 8,72 ppm). Das Spektrum zeigt auch zwei Methylgruppen (δ: 0,93 ppm, t und 1,07 ppm, d). Das * ^C-NMR-Spektrum vonBU-2867TA(Fig. 5) zeigt mehr als23 Signale für Kohlenstoffatome, einschließlich4Carbonylkohlenstoffatome, 6 Olefirikohlenstoffatome und 3 Methylkohlenstoffatome. Die ^C-NMR-Spektren von BU-2867T B und C sind demjenigen von BU-2867T A sehr ähnlich, sie zeigen jedoch, im Vergleich zu BU-2867T A, die Anwesenheit von zwei weiteren Olefinkohlenstoffatomen bei BU-2867T B und zwei weiteren Methylenkohlenstoffatomen bei BU-2867TC. BU-2867T A wurde mit 6N HCl 16 h unter Rückfluß erhitzt. Nach Entfernen des lipophilen Produkts (V) durch Extraktion mit Ethylacetat wurde das Isolat zu einem öligen Rückstand konzentriert, der an Ionenaustauscherharz chromatographiert wurde, wobei mit Pyridin-Ameisensäure-Essigsäure-Puffer (0,1 - 0,2M,pH 3,1 - 5,1) entwickelt wurde. Die Chromatographie wurde mit Ninhydrin-Reagens verfolgt und es wurden die vier Aminosäuren I, Π, ΙΠ und IV, die in dieser Reihenfolge eluiert wurden, isoliert und als Hydrochloride kristallisiert. Die Aminosäure I ([<x]25°d :12,7 0 in 5N HCl) wurde anhand ihrer physikalisch-chemischen Eigenschaften als L-Threonin identifiziert. Das ^H-NMR-Spektrum und das EI-MS (M++l:m/z 134) der Aminosäure II zeigte, daß es eine Mischung der Diastereoisomeren von 4-Amino-3-hydroxy-n-valeriansäure, war (Konishi, Μ; K. Saito, K. Numata, T. Tsuno, K. Asama, H. Tsukiura, T. Naito und H. Kawaguchi: Tallysomycin, a new antibiotic complex related to bleomycin. Π. Structure determination of tallysomycins A and B. J. Antibiotics 30:789-805,1977). Die Identität dieser Verbindung wurde durch Vergleich mit ein» authentischen Probe bestätigt. Die Summenformel von IQ wurde mittels Elementaranalyse und EI-Massenspektrometrie (M+: m/z 115) zu C5H9NO2 ermittelt Das ^-NMR-Spektrum dieser Verbindung zeigte die Anwesenheit einer Methylgruppe (δ: 1,50 ppm, d, J: 6,0 Hz), eines Methinprotons (& 4,0 - 4,2, m) und zwei» trans-Olefinprotonen (δ: 6,05 ppm, d, J: 15,0 Hz und 6,57 ppm, d-d, J: 6,0 und 15,0 Hz). Die Daten dieser Spektren ergaben eindeutig, daß es sich bei ΠΙ um 4-Amino-2(E)-pentencarbonsäure handelt (Honore’, T.; H. Hjeds, P. Krogsgaard-Larsen und T.R. Christiansen: Synthesis and Structuie-Activitv Studies of Analogs of γ-amino-butyric Acid (GABA). Eur. J. Med. Chem., 13:429-434,1978). Aufgrund der spezifischen Drehung ([alD22^: -6° in 5N HCl) wird ΙΠ 2(S)-Konfiguration zugeschrieben. Die Aminosäure IV wurde als 4-Hydroxylysin bestimmt, und zwar auf der Grundlage der Elementaranalyse (C6H14N2O3), EI-MS (M +1: m/z 163) und *H-NMR-Spektrum (δ: 1,8 - 2,1 ppm, 4H, m, 3,18 ppm, 2H, t und 3,6 - 43 ppm, 2H, m) und d» Bildung ein»Y-Lactonverbindung (*C=0:1770cm"*) nach Behandlung mit 6N HCl (Izumiya, N.; Y. Fujita, F. Inevene und B. Witkop: The Synthesis of Erythro-y-hydroxy-L-lysine and its Nonoccunence in Collagen). In Biochemistry 4: 2501-2506,1965, ist die Mutarotation von 4-Hydroxylysinen beschrieben und die bei IV beobachtete V»schiebung wies auf Erythro-L-Konfiguration hin. Es wurde demnach gezeigt, daß die Aminosäure IV Erythro-4-hydroxy-L-lysin ist

Die lipophile saure Fraktion (V), die nach d» obigen sauren Hydrolyse erhalten wurde, wurde mit Diazomethan behandelt. Nach chromatographisch»Reinigung erhielt man einen öligen Methylester(VI), dessenUV-^^1,^: 26=nm,e: 22000), EI-MS- (M+: m/z210) und %-NMR- (vier-CH=,einC-CH3 und sechs -CHj-) Spektren zeigen, das VI Methyl-2,4-Dodecadienoat war. Die Größe der Kopplungskonstante legte die trans-Konfiguratioi beid» Doppelbindungen nahe. Die ursprüngliche Säure V war demnach 2(E), 4(E)-Dodecadiencarbonsäure, Bürden, R.S. und L. Crombie: Amides of Vegetable Origin, Part XII. A new series of alka-2,4-dienoic tyramine-amides from Anacyclus pyrethrum D.C. (Compositae). J. Chem. Soc. (C), 1969:2477-2481,1969.

I : L-Threonin -7- 1 : 4-Amino-3-hydroxy-n-valeriansäure AT396117B m : 4-(S)-Amino-2(e)-penten-carbonsäure CH3-CH-CH=CH-COOH nh2 IV : Eryhtro-4-Hydroxy-L-lysin NH2-CH2-CH2-CH-CH2-CH-COOH OB 6h, V : 2(E), 4(E)-Dodecandiencarbonsäure Φ CH3-(CH2)6-ch»ch-ch«ch-cooh BU-2867T A besitzt die Summenformel C27H44N4O5 und zeigt sechs Olefinkohlenstoffatome und vier Amidkohlenstoffatome im ^C-NMR-Spektrum. Es war deshalb klar, daß es sich bei der Aminosäure Π um ein Artefakt handelt, das durch Hydratisierung der natürlichen Aminosäure III während der sauren Hydrolyse produziert wurde. Bei dem Antibiotikum sollte es sich um ein cyclisches Peptid handeln, weil die Ninhydrin-Reaktion negativ war, und weil es keine potentiometrisch titrierbare Funktionen aufwies. Dies wurde darüber hinaus durch die Tatsache gestützt, daß BU-2867T A bei der Acetylierung in Pyridin ein Di-O-acetylderivat (EI-MS: M+=m/z604, *H-NMR: 2,02 ppm, 3H und 2,08 ppm, 3H) liefert. Das MS-Spektrum des Acetats zeigte starke Fragmentionen bei m/z 179 und 322, was auf das Vorliegen einer V —> I —> Sequenz im Antibiotikum hinwies. BU-2867T A wurde einem enzymatischen Abbau mit Ficin in 0.01M Phosphatpuffer (pH 7,0) unterzogen. Nach dem Ansäuern auf pH 2,2 wurde die Reaktionsmischung mit n-Butanol extrahiert, wobei eine saure Verbindung (VH) erhalten wurde. Anschließende Extraktion der wäßrigen Lösung bei pH 10,0 mit n-Butanol lieferte eine Substanz (VHI), die eine positive Reaktion mitNinhydrin ergab. Mittels IR- (vc=0:1720 und 1650cm**), EI-MS- (Μ+-Η2θ: m/z 279 und M+ - Thr: m/z 179) und ^H-NMR-Spektren wurde gezeigt, daß es sich bei Verbindung VH um 2,4-Dodecadienoyl-threonin (V —> I) handelt Diese Struktur wurde weiter durch die Tatsache erhärtet, daß VH bei der Hydrolyse in 6N HCl I und V liefert Beim Erhitzen unter Rückfluß in 6N HCl liefert die Verbindung VIII die Aminosäuren II, ΠΙ und IV, wie durch Dünnschichtchromatographie (TLC) gezeigt werden konnte. Im EI-MS-Spektrum von VIII war das Molekülion bei m/z 241 zu finden, was für eine cyclische Peptidstruktur spricht Das ^H-NMR-Spektrum (270 MHz, in DMSO-dg) zeigte in Übereinstimmung mit den obigen cyclischen Strukturen zwei Amid-NH-Protonen bei 7,43 ppm (Triplett) und 9,10 ppm (breit). Umfangreiche Entkopplungsversuche zeigten, daß die Aminogruppe ναι m und die ε-Aminogruppe von IV an Carbonylgruppen unter Bildung von Amiden gebunden waren, wohin gegen die α-Aminogruppe von IV in freier Form vorlag. VII und VIÜ wurden deshalb die folgenden Strukturen zugeschrieben:

VH: VIII:

Die Verbindungen VH und Vm wurden auch erhalten, wenn BU-2867T A einem enzymatischen Abbau oder einer enzymatischen Hydrolyse mit Papain oder Chymopapain unterzogen wurde. Eine Mischung von BU-2867T A (4 g) und Papa in (Sigma P- 3375,50 g) in 20110 %igem wäßrigem Methanol wurde 22 h bei 28 °C gerührt Die Mischung wurde dann mit Essigsäure auf pH 3,3 angesäuert und mit Ethylacetat (101) extrahiert Verdampfen des Extraktes lieferte ein Öl (63 g), das man an Silikagel (Wakogel C-200,250 ml) mit einer Mischung aus CH2CI2 und Methanol (9:1) chromatographierte, wobei man die halbreine, ölige Verbindung VII (33 g) erhielt Die weitere Chromatographie des Öls an einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid und die anschließende Kristallisation -8-

AT 396 117 B lieferte reines VII in Form farbloser Nadeln, 1,15 g (Ausbeute 5=%). Schmp. 90-91 °C. [<X]27D +17,4° (C 0,5 MeOH). Analyse für C16H27NO4 · H20: C H N ber.: 60,93 9X1 4,44 gef.: 61,34 9,03 4,20 EI-MS: m/z 279 (M+ - H20). UV nm (ε): 260 (28 000). R vmax (KB*) cm'1:3520,3410,3300,1720,1690,1655,1630, etc. !h-NMR (80 MHz, DMSO-dg): δ 0,88 (3H, t); 1,06 (3H, d); 6,20 (3H, m); 7,00 (1H, m); 7,84 (1H, d, NH) etc.

Nach der Extraktion mit Ethylacetat wurde die saure wäßrige Lösung zur Trockene eingeengt. Der Rückstand (36 g) wurde in 50 ml Wasser gelöst, derpH auf 9,0 eingestellt und auf eineUmkehrphasen-Silikasäule (C^g, Merck, 1,6 1) gegeben, die mit Wasser entwickelt wurde. Die die Verbindung VIII enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegeben und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde an einen dreidimensional vernetzten Polysaccharid (250 ml) mit 50 %igem wäßrigem Methanol und anschließend an Umkehrphasen Silika (Cjg) mit saurem Wasser (pH 3,0, eingestellt mit verdünnter HCl) Chromatographien. Man erhielt reines VQI-Hydrochlorid. 747 mg (Ausbeute 35 %); Schmp. 190 °C (Zers.).

[a]26D-113°(c04,H2O). EI-MS: m/z 241 (M+). UV: Endabsorption. IR vmax (KBr) cm-1:3400,1660,1620,1530 etc. iH-NMR (80 MHz, DMSO-dg): δ 1,27 (3H, d); 1,4 -1,8 (4H); 2,98 (2H, m); 4,52 (1H, m); 6,19 (1H, d); 6,45 (1H, d-d); 7,43 (1H, t, NH); 9,46 (1H, d, NH).

Analyse für C11H9N3O3 · HCl · H20: C H N CI ber.: 44,67 7,50 14,21 11,99 gef.: 45,04 7,82 13,81 12,55

Da BU-2867T A gegenüber Ninhydrin negativ war und keine titrierbaren Gruppen zeigte, mußte seine Struktur logischerweise auf einer Verknüpfung von VII und VIII mittels einer Peptidbindung beruhen.

Beim Erhitzen mit 6N HCl lieferten BU-2867T B und C den gleichen Aminosäurekomplex wie BU-2867T A. Die Fettsäureeinheiten der beiden Antibiotika wurden aus dem Hydrolysat extrahiert, mit Diazomethan behandelt und als Methylester isoliert, IX (aus BU-2867T B) und X (aus BU-2867T C). Sie haben das für ihre Stammantibiotika beobachtete charakteristische UV-Maximum (^MeOH^^. 260 nm) beibehalten. Das EI-MS von IX zeigte ein Molekülion bei m/z 236, was für einen C 14-Carbonsäureester mit drei Doppelbindungen spricht. Das UV- und ^H-NMR-Spektrum zeigten eindeutig, daß 2(E), 4(E)-Diencarbonsäure-Struktur vorlag und daß die dritte Doppelbindung isoliert in IX vorlag. Ozonolyse von IX und anschließender reduktiver Abbau des Ozonids ergaben n-Hexanal, das isoliert und als 2,4-Dinitrophenyl-hydrazon (EI-MS M+: m/z280) identifiziert wurde. Diese Befunde bestätigen, daß es sich bei IX um Methyl-2(E), 4(E), 8-Tetradecatrienoat handelt. Das Molekulargewicht des Esters X (EI-MS: M+: m/z 238) war 28 Einheiten (C2H4) höher als das von VI. Dies gibt den Unterschied in der Summenformel zwischen BU-2867T A und C wieder. In Kombination mit den ^-NMR- und UV-Daten zeigte dies, daß es sich bei X um Methyl-2(E), 4(E)-Tetradecadienoat handelt. Aufgrund der anhand der obigen Untersuchungen erhaltenen Ergebnisse besitzen BU-2867T A, B und C folgende Strukturformeln:

-9-

AT396117B

Phvsikalisch-chemische Eigenschaften von BU-2867T A. B und C

CS *-H »7 0 0 Z *-< 1-H u £ H r- 8 cs 1 O 03 £ Sy 1-SgS 0° 2* *1 (N i-i .. N4 00 00 00 00 Ϊ 00 vo 53 H CO CO cf f, tn n Tf vo nM U VO vo m cs o N-i r- co o o cs jxf 2 ©C os 03 c* H 8 s > V •g o CO d- Ä 00 00 Ä cs P* S o ύ 03 ee rs 2 sf <$ V 1—1 o\ i 00 ö Wei 232 -92° 00 u S § vo *n vO CS 0,41 7,93 oo r-m »7 O © Z i-ι ^ < £ Q H r» 8 cs ύ OQ o "ei U i-H • vo m in vo l^o l&s tt, cs 7 1 U C H 61,22 8, 60,90 8, E 8 in 261(3500( 0,45 6,43 4M «4M CU PS 00 | ä i £ ^ £ Q o Pi jo *ß in i CO >v 73 ε c K S Ά o co ft _ O 1 a •io .a o 1 ^ «CS Q. . 8 E |B «> _s « 3 o ^ s 8 ε v w ber.: gef.: c ? NM ω .1 sf «ο ώ 8§ esT as &§ o in o «n © ΙΛ rH cs CS CO CO -10-

AT 396117 B

Der enzymatische Abbau von BU-2867T mit Pseudomonas Acylase eigab Produkte, die von den durch die oben beschriebene Hydrolyse mit Ficin oder Papain erhaltenen Produkte verschieden waren. Der Pseudomonas-Stamm Pa-129 wurde 3 Tage bei 37 °C in 101 eines Mediums fermentiert, das 2 % lösliche Stärke, 0,2 % Glucose, 3 % Sojabohnenmehl, 1 % CaCOß und 03 % MgSC>4 · 7H2O enthielt Die Zellen wurden dann abzentrifugiert. Nach zweimaligem Waschen mit Kochsalzlösung (11) wurden die Zellen erneut in 0,751 Kochsalzlösung suspendiert. Die Zellsuspension wurde mit einer vorautoklavierten Suspension (1,51) von Nalriumalginat (75 g) und CM-Cellulose (75 g) vermischt Die Mischung wurde unter Rühren in 3010,1M CaCl2-Lösung gegossen. Das in die Zellen eingeschlossene Gel wurde durch Rühren mit 25 %iger Glutaraldehydlösung steifer gemacht und in eine Säule (4,0 x 175 cm) gepackt Eine Lösung von BU-2867T A (1,5 g) in 20 %igem wäßrigem Methanol (301) wurde mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,4 - 0,8 1/h über die Säule gegeben. Das vereinigte Effluenz wurde dann nacheinander über eine Amberlite IRC-50- (70 % NH4+-Form, pH 6,7; 100 ml) und HP-20-Säule (300 ml) gegeben. Die IRC-50-Säule wurde mit Wasser gewaschen und anschließend mit 1,5N NH4OH entwickelt Die Ninhydrinpositiven Fraktionen wurden zusammengegeben, konzentriert und lyophilisiert, wobei ein schwachgelber Feststoff (800mg) erhalten wurde, da-auf eineUmkehrphasen-Silikasäule (Cjg, 250ml) gegeben wurde. Die Säule wurde mitWasser unter mittlerem Druck entwickelt und die Ninhydrin-positiven Eluate wurden zusammengegeben und konzentriert, wobei die L-Threonylform des cyclischen Amins (XI, 612 mg) erhalten wurde. Ausbeute 62 %; Schmp. 170 °C.

[a]27D-157°(c03,H2O). EI-MS: m/z 342 (M+). UV: Endabsorption. ER vmax (KBr) cm'1:3350,3280,1650,1620,1530 etc. *H-NMR (80 MHz, DMSO-d^: 81,05 (3H, d); 1,21 (3H, d); 1,4 - 2,2 (4H); 4,35 (2H, m); 4,47 (1H, m, OH); 4,62 (1H, d, OH); 6,16 (1H, d); 6,42 (1H, d-d); 7,36 (1H, t NH); 7,97 (1H, d, NH); 8,62 (1H, d, NH).

Die obige HP-20-Säule wurde mit Wasser (11) und anschließend mit einer Mischung von 0,1N NaOH und Methanol (1:2) entwickelt Die2,4-Dodecadiencarbonsäure (V) enthaltenden Fraktionen wurdenzusammengegeben, auf 300 ml konzentriert und auf pH 2,0 angesäuert. Diese Lösung wurde mit Ethylacetat (300 ml) und n-Butanol (100 ml) extrahiert Verdampfen des Ethylacetatextraktes ergab einen öligen Rückstand, den man an einer Sephadex LH-20-Säule (800 ml) chromatographierte. Nach Eluieren mit Methanol und Verfolgen der Eluate anhand der UV-Absorption bei 260nm konzentrierte man die entsprechenden Eluate, wobei man reines V (259 mg) als farblose Platten erhielt. Ausbeute: 53 %. Schmp. 48 - 49 °C. UV XMe0Hmax: nm (£). 258 (24 000); IR Vmax (KBr) cm"1:1680,1630,1605,1410,1300 etc. iH-NMR (80 MHz, CD3OD): SO,89 (3H, t); 2,0 (10H); 2,12 (2H, m); 5,75 (1H, d); 6,16 (2H, m); 73 (1H, m).

Diese Verbindung war mit der durch saure Hydrolyse von BU-2867T A erhaltenen 2,4-Dodecadiencaibonsäure identisch. Der n-Butanolextrakt wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert um das Ausgangsmaterial BU-1867T A (160 mg, 11 %) zurückzugewinnen.

AusderobigenBesclueibungisteisichtlich,daß die Verbindungen VHIundXIwertvolleZwischenverbindungen sind, die zur Herstellung der verschiedenen erfindungsgemäßen antibiotischen Verbindungen brauchbar sind. Eine übliche Acylierung, beispielsweise miteinem gemischten Anhydrid einer Carbonsäure mit einem Kohlensäurealkylester (HOCOOR), ergibt die erforderliche Peptidbindung (Advanced Organic Chemistry, Fies» & Fieser, Seiten 1039-1046, Reinhold Publishing Corporation, New York, 1965). Die Hydroxygruppen kann man in üblicher Weise schützen, beispielsweise als Tetrahydropyranyl- oder t-Buty lether. Die Acylierung der Amingruppe von VE mit den Säuren -11-

AT396117B CH3- (CHj) 6-CH*CH-CH*CH-CO-NH-CH-CHOH-CH3

iooH

COOH CH3- (CHj) 4-CH*CH- (CH2) 2-CH«CH-CH«CH»CO-NH-|H-CHOH-CH3 und CH3- (CH2J 8-ch«ch-ch*ch«co-nh-ch-choh-ch3

COOH liefert BU-2867T A, B und C. BU-2867T A wird beispielsweise durch Umsetzen von VII und Vin hergestellt Eine Mischung von VII (15 mg), N^T-Dicyclohexylcarbodiimid (10 mg) und l-Hydroxy-l,2,3-benzotriazol (8 mg) in 2 ml Dimethylformamid wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt Anschließend gab man Verbindung Vm (10 mg) zu der Mischung und setzte das Rühren über Nacht fort. Die Lösung wurde zu einem Rückstand konzentriert der an Umkehrphasen-Silika (C}g, 40 ml) unter Eluieren mit 80 %igem Methanol Chromatographien wurde. Die aktiven Eluate wurden verdampft und der Rückstand wurde mittels präparativer HPLC (Säule: SSD-ODS-842, mobile Phase: 90 %iges wäßriges Methanol) gereinigt. Verdampfen der aktiven Peak-Fraktion ergab BU-2867T A (7,4 mg; Ausbeute 28 %), das in allen Belangen mit dem natürlichen Antibiotikum identisch war. TLC (silanisiert EtOH-H^O = 55:45); Rf: 0,45; HPLC (Lichrosorb RP-18, EtOH-H20 = 65:35) Rt: 6,43 min. BU-2867T A kann auch durch Umsetzung von V mit XI hergestellt werden. Eine Dimethylformamidlösung (1 ml) von V (3,4 mg), N,NDicyclohexylcarbodiimid (3,7 mg) und l-Hydroxy-l,2,3-benzotriazol (2,8 mg) wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Zu der Lösung gibt man XI (5 mg), man rührt die Mischung weitere 3 h und konzentriert dann im Vakuum. Der Rückstand wird in Methanol gelöst und mittels präparativer HPLC unter Verwendung der gleichen Säule und der gleichen mobilen Phase wie oben beschrieben gereinigt. Man erhält 4 mg BU-2867T A, Ausbeute 45 %. Die Identität mit natürlichem BU-2867T A wurde durch einen direkten Vergleich bestätigt.

Die Verbindung XI kann aus Verbindung VIII unter Anwendung üblicher Verfahren hergestellt werden. Zu einer Mischung von N-t-Butoxycarbonyl-L-threonin (44 mg), N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid (40 mg) und 1-Hydroxy-1,2,3-benzotriazol (30 mg) in Dimethylformamid (4 ml) gab man bei Raumtemperatur unter Rühren VIII (40 mg). Die Mischung wurde im Vakuum zu einem Rückstand eingeengt, der an einer Umkehrphasen-Silikasäule (Cjg, 40 ml) mit einer Methanol/Wasser-Mischung (Mischungsverhältnisse: 1:9 bis 2:3) chromatographiert wurde. Die entsprechenden Fraktionen wurden zusammengegeben, im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei man N-BOC-L-Threonyl-VHI (= BOC-XI) erhielt. Ausbeute 51 mg, 69%. vKBrc=0:1690 und 1640 cm**. *H-NMR (80 MHz): 6ppm in DMSO-d# 1,00 (3H, d); 1,22 (3H, d); 1,35 (9H, s); 6,11 (1H, d); 6,33 (1H, d-d) etc.

Eine Mischung von BOC-XI (36 mg) und Ameisensäure (1 ml) wurde 1 h bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Mischung konzentriert, mit Wasser (1 ml) verdünnt, der pH auf 10,0 eingestellt und die Mischung auf eine Umkehrphasen-Silikasäule (Cjg,20 ml) gegeben. Nach dem Entwickeln mit Wasser, wobei das Eluat mittels Ninhydrin-Test verfolgt wurde, wurden die entsprechenden Eluate vereinigt und gefriergetrocknet, wobei man XI als weißen Feststoff erhielt. Ausbeute 25 mg, 88 %. v^rc=0:1650 cm'l. 1H-NMR 5ppm in DMSO-dg: 1,04 (3H, d); 1,22 (3H, d); 6,14 (1H, d); 6,42 (1H, d-d); 735 (1H, t, NH); 7,98 (1H, d,NH); 8,65 (1H, d, NH) etc. EI-MS: M+ m/z 342.

Es istdemnach möglich,dieerfindungsgemäßen antibiotischen Verbindungen durch Umsetzung derVerbindungen Vm und XI mit den entsprechenden Säuren, gleich welcher Herkunft, herzustellen. Weiter kann man unter Benutzung der Verbindungen vm und XI erfindungsgemäße Verbindungen, insbesondere die in höherer Ausbeute erhältlichen Verbindungen, zur Herstellung anderer erfindungsgemäßer Verbindungen verwenden. Beispielsweise kann man BU-2867T A, das durch Fermentation in höherer Ausbeute erhalten wird, zur Herstellung von BU-2867T B und BU-2867T C, wie oben erläutert, durch enzymatische Hydrolyse und Umsetzung mit der gewünschten Säure verwenden. -12-

AT396117B

Die Ausbeute an BU-2867T und die Verteilung der, wie oben beschrieben, durch Fermentation erhaltenen Fraktionen A, B und C kann modifiziert werden, indem man verschiedene Fette und Öle und bestimmte grenzflächenaktive Mittel zu dem Medium gibt, in dem Polyangium brachysporum K481-B101 kultiviert wird. So «höht beispielsweise die Zugabe von Sojabohnenöl, Maisöl, Olivenöl, hydriertem Pflanzenöl, Schweinefett und, in geringerem Ausmaß, Talg die Gesamtausbeute von BU-2867T. Fette und öle mit einem hohen Gehalt an Linolsäure (Cig;2)> wie Sojabohnenöl, Maisöl und Schweinefettführen zu einer Vermehrung des bei der Herstellung gebildeten BU-2867T B. öle, wie Olivenöl, mit einem hohen Gehalt an Oleinsäure (Cjg·]) führen zu ein« Erhöhung des BU-2867T C-Anteils. Hydrierte Pflanzenöle, die reich an Stearinsäure (Cjg.g) sind, erhöhen lediglich die Menge an gebildetem BU-2867T A.

Antimikrobielle Aktivität

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC) von BU-286T A, B und C wurden gegenüber verschiedenen Mikroorganismen anhand der Reihen-Agar-Verdünnungsmethode bestimmLFürBakterienverwendetemanNähragar (Eiken) und für Pilze Sabourauddextroseagar (Difco). Die Inokulumgröße wurde für Bakterien auf 10* CFU/ml und für Pilze auf 10^ -10^ CFU/ml eingestellt.

Tabelle 5 zeigt die in vitro antibakteriellen Aktivitäten von BU-2867T A, B und C. Die Komponenten A und C inhibierten das Wachstum sowohl vom gram-positiven als auch gram-negativen Bakterien bei 50 mcg/ml nicht, während die Komponente B mäßige Aktivität gegenüber einigen gram-positiven Bakterien zeigte.

Die antifungische Aktivität der BU-2867T-Komponenten ist in Tabelle 6 zusammengestellt. Die Komponente C zeigte starke antifungische Aktivität gegenüber klinisch wichtigen pathogenen Pilzen, wie Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Trichophyton mentagrophytes und Mucor spinosus. Die Komponenten A und B waren etwas weniger aktiv als die Komponente C, ihrantifungisches Spektrum war jedoch ähnlich dem der Komponente C.

Tabelle V

Antibakterielles Spektrum der BU-2867T-Komponenten MIC (mcg/ml)

Gram-positive Organismen BU-2867TA BU-2867TB BU-2867TC Staohylococcus aureus 209P >50 25 >50 99 99 Smith >50 3.1 >50 99 99 Bx-1633 >50 50 >50 Staohylococcus £pid?rmidig D153 >50 6.3 >50 99 99 A22152 >50 50 >50 Streptococcus faecalis A9612 >50 >50 >50 Micrococcus luteus PCI-1001 >50 50 >50 Bacillus subtilis Gram-negative Organismen PCI-219 >50 50 >50

Escherichia coli NIHJ >50 >50 >50 Klebsiella pneumoniae D-ll >50 >50 >50 Proteus mirabilis A9554 >50 >50 >50 Proteus vulgaris A9436 >50 >50 >50 Morganella morganii A9553 >50 >50 >50 Serratia marcescens A20222 >50 >50 >50 Enterobacter cloacae A9659 >50 >50 >50 Pseudomonas aeruginosa A9930 >50 >50 >50

Medium: Nähragar -13-

AT396117B Tabelle VI

Antibakterielles Spektrum der BU-2867T-Komponenten 5 Testorganismus BU-2867A MIC (mcg/ml) BU-2867B BU-2867C Candida albicans IAM4888 3.1 3.1 1.6 10 H » A9540 1.6 1.6 0.8 Crvntococcus neoformans D49 25 25 3.1 tl » IAM4514 25 25 3.1 Aspergillus fumigatus IAM2530 1.6 3.1 0.8 H »9 IAM2034 1.6 3.1 0.8 15 Asp?rsilJus flavus FA 21436 25 25 50 Fusarium moniliforme A2284 >50 >50 >50 Piricularia orvzae D91 >50 >50 >50 Trichoohvton mentagrophvtes D 155 25 12.5 1.6 H « #4329 25 12.5 6.3 20 Blastomvces dermaditis IF0 8144 50 50 >50 Soorothrix schenckii IFO 8158 >50 >50 >50 Petriellidium bovdii IFO 8073 >50 >50 50 Mucorsoinosus IFO 5317 1.6 0.8 0.2 25

Medium: Sabouraud-Dextroseagar

Antitumoraktivität

Die Antitumoraktivität von BU-2867T A, B und C wurde bei weiblichen CDFj-und männlichen BDF j-Mäusen 30 bestimmL Lymphozytische Leukämiezellen P388 (CDFj- und BDFj-Mäuse) und lymphoide Leukämiezellen L 1210 (BDFj-Mäuse) wurden durch intraperitoneale Injektion vcm 0,8 ml verdünnter Ascites-Flüssigkeit, die 10^ bzw. lO^-Zellen pro Maus enthielt, inokuliert. Melanotisches Melanom B16 (BDFj-Mäuse) wurde mittels 0,5 ml eines 10 %-igen Tumorbreis intraperitoneal implantiert. Die Testmaterialien wurden in 0,9 %-iger Koch Salzlösung, die 10 % Dimethylsulfoxid enthielt, gelöst. Bestimmte Dosen dieser Lösung wurden den Mäusen intraperitoneal 35 24hnach der Tumorimplantation verabreicht. Als Vergleichsverbindungen wurden in diesen Versuchen Olivomycin (NSC 38270) oder Mitomycin C herangezogen. BU-2867T A, B und C zeigen nach dem Behandlungsschema 1 (einmalige tägliche Verabreichung an den Tagen 1, 4 und 7) Antitumoraktivität gegen P388-Leukämie. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt, ausgedrückt als prozentuales Verhältnis der Erhöhung der mittleren Überlebenszeit (MST) de- Testtiere (T) und der Kontrolltieie (C) bei verschiedenen Dosierungen. 40 Werte für das prozentuale Verhältnis von 125 und höher bedeuten signifikante Antitumorwirkung.

Tabelle VII

Antitumor-Aktivität der BU 2867 T-Komponenten gegen P388-Leukämie T/C%ofMST Dosis in mg/kg^Tag, ip 3 1 0.3 0.1 BU-2867T A * B „ c Olivomycin A 140 130 120 165 140 120 155 130 140 135 100 45 50 -14- 55

AT 396 117 B BU-2867T A und C waren im Behandlungsschema 2 (Verabreichung einmal täglich an den Tagen 1 bis 9) hoch wirksam gegen P388-Leukämie. BU-2867T A war weniger aktiv gegen L1210-Leukämie und B16-Melanom. In Tabelle VIII sind die erhaltenen Ergebnisse für verschiedene Dosierungen zusammengestellt, ebenfalls ausgedrückt als prozentuales Verhältnis der Erhöhung der mittleren Überlebenszeit, wobei Werte von 125 und höher signifikante Antitumorwirkung bedeuten.

Tabelle Vm

Antitumor-Aktivität von BU-2867T A und C T/C% MST Dosis in mg/kg/Tag, ip 2 1 0.5 0.25 0.13 0.063 0.031 P388-Leukämie BU-2867T A 67 228 186 156 147 136 109 c 234 189 175 159 153 123 100 Mitomycin C 290 240 170 150 130 115 L1210-Leukämie BU-2867T A 129 118 118 106 Mitomycin C 140 141 129 129 106 B16-Melanom BU-2867T A Tox. 125 116 113 100 Mitomycin C 63 181 163 141 131

Die akute Toxizität von BU-2867T A und C wurde bei männlichen ddY-Mäusen durch intraperitoneale Einzelverabreichung bestimmt. Die LD5Q-Werte waren 8,1 mg/kg und 25 mg/kg.

Die pharmakologisch wirksamen erfindungsgemäßen Verbindung»! können anhand herkömmlich» Methoden der pharmazeutischen Technik in pharmazeutische Präparate zur oralen oder parenteralen Verabreichung an z. B. Säugetieren einschließlich des Menschen verarbeitet werden. ÜblicheExzipientien sind pharmazeutisch verträgliche organische oder anorganische Trägersubstanzen, die geeignet sind zur parenteralen, enteralen oder topischen Verabreichung und die mit den Wirkstoffen nicht nachteilig reagieren. Geeignete pharmazeutische verträgliche Träg» umfassen beispielsweise und ohne darauf beschränkt zu sein, Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Gummi arabikum, Pflanzenöle, Polyethylenglykole, Gelatine, Lactose, Amylose, Magnesiumstearat, Talk, Kieselsäure, Petrolatum, Parfümöle, Fettsäuremonoglyceride und -diglyceride, Pentaerythrit-Fettsäureester, Hydroxymethyl-cellulose, Polyvinylpyrrolidon und dergleichen. Die pharmazeutischen Präparate können sterilisiert und gewünschtenfalls mit Hilfsstoffen vermischt werden, wie Gleitmitteln, Konservierungsmitteln, Stabilisierungsmitteln, Netzmitteln, Emulgatoren, Salzen zur Beeinflußung des osmotisch»i Drucks, Puffern, Farbstoffen, Geschmacksstoffen und/od» aromatischen Substanzen und d»gleichen, die die Wirkstoffe nicht nachteilig beeinflußen. Für diepaienterale Verabreichung besondersgeeignetsindinjizi»baresterileLösungen, vorzugsweiseölige od» wäßrige Lösungen, wie Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, einschließlich Suppositorien. Ampullen sind zweckmäßige Dosiseinheiten.

Zur enteralen V»abreichung besonders geeignet sind Tabletten, Dragees, Suppositorien od» Kapseln mit Talk und/od» einem Kohlehydrat als Träger oder Bindemittel oder dergleichen, wobei d» Träg» vorzugsweise Lactose und/od» Maisstärke und/oder Kartoffelstärke ist Man kann auch einen Sirup, ein Elixier oder d»gleich»i verwenden, wobei ein gesfißt»Träger zur Anwendung kommt Man kann auch Zusammensetzungen mitverzög»t» Wirkstofffreigabe, einschließlich derjenigen, bei denen d» Wirkstoff durch unterschiedlich abbaubare Überzüge geschützt ist, formulieren, z. B. durch Mikroverkapselung, Mehrfachbeschichtung usw. Im allg»neinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in Einheitsdosisform in einem pharmazeutisch v»träglichen Träger, d» die jeweilige Dosi»ung enthält, gegeben. Die Dosierung der Verbindungen beträgt »findungsgemäß im allgemein»! -15-

Claims (7)

1. AT396117B 5 bis 250 mg/Tag bei Verabreichung an Patienten, beispielsweise Menschen, mit einem Gewicht von 75 kg. Geeignete Dosierungen und Dosierungspläne bei einem bestimmten Wirt kann man anhand üblicher Betrachtungen erstellen,beispielsweise durch den Vergleich der unterschiedlichen Aktivitäten der jeweiligen Verbindung und eines bekannten Antibiotikums oder Antitumormittels beispielsweise anhand eines geeigneten, üblichen pharmakologischen Protokolls. Anhand der obigen Beschreibung kann der Fachmann das Wesen der Erfindung leicht feststellen und zur Anpassung an verschiedene Anwendungsgebiete und -bedingungen Veränderungen und Modifizierungen vornehmen, ohne den Bereich der vorliegenden Verbindung zu verlassen. PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung einer neuen Verbindung der allgemeinen Formel (I)

   worin R für 0%-((Ή2)6, CH3-(CH2)4’CH=CH-(CH2)2 oder CH3-(CH2)8 st&ht, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus des Stammes K481-B101, ATCC 53080, der Species Polyangium brachysporum unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium kultiviert, das eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und Stickstoff enthält, das gebildete Myzel abtrennt und die Verbindung aus dem Nährmedium gewinnt
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Fett oder ein Öl zu dem Nährmedium zusetzt
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das abgetrennte Myzel mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert und den Extrakt mit dem Nährmedium vor der Gewinnung der Verbindungen vereinigt
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindungen aus dem Nährmedium durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel gewinnt
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Produktion der Verbindungen unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus verfolgt.
6. 6. Polyangium brachysporum Stamm K481-B101, ATCC 53080.
7. 7. Biologisch reine Kultur des Mikroorganismus Polyangium brachysproum K481-B101, ATCC 53080. Hiezu 5 Blatt Zeichnungen -16-