CH672921A5 - - Google Patents

Description

BESCHREIBUNG Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Peptide sowie auf ein Verfahren zur Herstellung dieser Peptide durch Fermentation mittels eines neuen Mikroorganismus. Die erfindungs-gemässen Peptide sind als Antibiotika nützlich.

Es wurden verschiedene Mikroorganismen aus Bodenproben isoliert, in synthetischem Medium kultiviert und gefunden, dass sie Produkte mit antibiotischer Aktivität erzeugen. Es wurde eine neue Bakterienart K481-B101 gefunden, welche aus einer Boden-5 probe isoliert wurde, die in der Nähe des Parthenontempels in Athen, Griechenland, genommen wurde, und festgestellt, dass der Organismus eine Mischung von Peptiden mit antibiotischer Aktivität erzeugt.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Peptid- Anti-io biotika zur Verfugung zu stellen, welche insbesondere als antifun-gale und antitumor-wirksame Mittel nützlich sind.

Es ist ebenfalls Aufgabe der vorliegenden Erfindung, zweckmässige Methoden zur Herstellung dieser Antibiotika zur Verfügung zu stellen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demzufolge die Verbindungen der Formel

15

worin R CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH = CH(CH2)2 oder CH3-(CH2)8 bedeutet.

Diese Verbindungen können allein oder in Kombination als antifungal und/oder antitumor-aktive Wirkstoffe in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, gegebenenfalls zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass der Mikroorganismus Polyangium brachysporum sp. nov. in einem Nährmedium, welches eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert wird, die produzierten Mycelien abgetrennt und die Verbindung aus dem Nährmedium isoliert wird.

Die erfindungsgemässen Verbindungen sind ebenfalls durch die Verbindungen der folgenden Formeln zugänglich.

oh h

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Die Figuren 1,2 und 3 sind IR-Spektren der Verbindung Bu-2867TA, B bzw. C.

Die Eguren 4 und 5 sind die 'N-NMRund 13C-NMR-Spek-tren der Verbindung Bu-2867T A.

Die morphologischen, kulturellen und physiologischen Kennzeichen von K481-B101 wurden gemäss den Verfahren durchgeführt, die durch McCurdy, Jr. H.D., beschrieben wurden:

Studies on the Taxonomy of the Myxobacterales. II, Polyangium and the demise of the Sorangiaceae. Intl. J. Syst. Bacteriol. 20:283-296,1970; Reichenbach, H.: Nannocystis exedens gen.

nov., sp. nov., a new myxobacterium of the family Sorangiaceae Arch. Mikrobiol. 70:119-138,1970; Christensen, P. und F. D. Cook: Lysobacter, a new Genus of nonfraiting, gliding bacteria 30 with a high base ratio. Intl. J. Syst. Bacteriol. 28:367-393,1978; und Christensen, P.: Synonymy of Flavobacterium pectinovorum Dorey with Çytophaga johnsonae Stanier. Intl. J. Syst. Bacteriol. 27:122-132,1977. Die Aufrechterhaltung und Reinigung wurde gemäss den Verfahren durchgeführt, die durch Peteison, J.E.: Iso-35 lation, cultivation and maintenance of the myxobacteria. Methods in Microbiology 3B: 185-210,1969; Edit. J.R. Norris & D.W. Ribbons. Academic Press (London and New York); und Reichenbach, H. & M. Dworkin: The Order Mixobacterales. The Proka-iyotes. Volume I: 328-355, 1981. Edit. M. P. Starr et al. Springer-40 Verlag (Berlin, Heidelberg und New York), beschrieben worden sind. Die taxonomische Position wurde gemäss den Erläuterungen in Bergey's Manual, 8. Auflage, 1974 und «Ihe Prokaiyotes, Vol. I» bestimmt.

45 Morphologie

Casiton-Mg+ +-Agar, Chitin-Agar, Hefezellen-Agar und Kaninchendünger-Pellet-Wasser-Agar werden für die morphologischen Studien verwendet. K481-B101 ist ein gramnegatives, nichtflagellates Bakterium. Die vegetativen Zellen sind zylindrisch so (0,6-0,8 x 2-10 p,m) mit stumpfen, abgerundeten Enden. Die vegetativen Zellen sind beweglich und zeigen gleitende Bewegungen auf der feuchten Oberfläche des Agarmediums oder des weichen Agarmediums. Die Myxosporen unterscheiden sich Idar von den vegetativen Zellen, sie sind oval oder sphärisch, 0,6-55 0,8 x 0,6-1,5 Jim, nicht lichtbrechend oder lichtbrechend und gelegentlich gepaart. K481-B101 bildet auf den meisten beschriebenen Agarmedien sessile Sporangien, welche Myxosporen enthalten. Die Sporangien sind oval, sphärisch oder kissenartig, recht verschieden in der Grösse, 12 x 20 bis 80 x 120 um, oft an eine 60 gewöhnliche Hülle oder eine schleimige Schicht gebunden, weisen doppelte Konturen auf und kommen allein oder in Gruppen (sori) vor. Die Morphologie von K481-B101 wird in Tabelle 1 dargestellt.

65 Kulturelle Charakteristika

K481-B101 wächst mässig auf Casiton-Mg+ +-Agar (McCurdy, 1969) und Hefezellen-Agar (Christensen & Cook, 1978) jedoch schwach auf Bacto-Nähragar- oder Bacto-Herzinfu-

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sionsagar. Es werden wurzelartige oder federartige Schwärme auf YP-Weichagar beobachtet (Hefeextrakt 0,3%, Pepton 0,1%, NaCI 0,01%, Agar 0,3%, pH 6,6-6,8), jedoch nicht auf Casiton-Mg+ +-Agar. Die Kolonien auf Casiton-Mg+ +-Agar sind zirkulär, durchscheinend und schwach grünlichgelb und ätzen das Agar schwach an, erodieren es oder dringen ein. Die kulturellen Charakteristika sind in Tabelle 2 angegeben.

Physiologische Charakteristika

K481-B101 hydrolisiert Stärke, Chitin, Gelatine und Casein, jedoch nicht Cellulose und Agar. Er lysiert autoklavierte Hefezellen, jedoch nicht lebende Zellen des Micrococcus luteus. K481-B101 ist mesophil und empfindlich gegen 2% NaCI. Die physiologischen Charakteristika sind in Tabelle 3 angegeben.

Koexistenz von flagellaten Bakterien und Vorkommen von spontanen Varianten

Die Koexistenz von gramnegativen, stäbchenförmigen flagellaten Bakterien werden in der ursprünglichen Kultur beobachtet. K481-B101 wurde recht gut gereinigt durch Kombination der üblichen Techniken, der Verdünnung und Einzelzellenisolation mit Beschallung, Hitzeschockbehandlung oder antibiotische Empfindlichkeit (z.B. Pipemidinsäure bei 50 ug/ml) unter Verwendung der Myxosporen oder Fruchtkörper. In ungereinigten K481-B101-Kulturen kommen ebenfalls Mucoid-Varianten vor, welche weisse, kuppelartige Kolonien mit einem schwärmenden Lichtschein bilden. Die vegetativen Zellen dieser Mucoid-Varianten sind etwas grösser als der ursprüngliche Stamm und haben die Masse von 0,8-1,0 x 2,0-3,5 jjm. Die Gruppe von Sporangien (sorus) wird vorherrschend durch Mucoid-Varianten gebildet.

Taxonomische Position

K481-B101 ist ein fruchtiges, gleitendes Bakterium, welches aus einer Bodenprobe isoliert wurde. Die diagnostischen Hauptkennzeichen des Stammes sind folgende:

Vegetative Zellen:

1. zylindrisch, von einheitlichem Durchmesser

2. an den Enden nicht verjüngt

3. in Agarmedium eindringend

4. Kongorot, nicht absorbiert

Myxosporen:

1. von den vegetativen Zellen unterscheidbar

2. oval oder sphärisch

3. nicht lichtbrechend oder lichtbrechend

Sporangien:

1. sessil

2. oval, sphärisch oder unregelmässig

3. oft an eine gewöhnliche Hülle oder eine schleimige Schicht gebunden

4. besitzen doppelte Umrisse

5. schwach gelb (es fehlt eine bestimmte Farbe)

6. kommen allein oder in Gruppen (sori) vor

Kulturelle und physiologische Kennzeichen:

1. Kolonie goldgelb bis weisslich

2. die Kolonien ätzen Agar schwach, erodieren oder dringen sin

3. chitinolytisch, jedoch nicht cellulolytisch

4. hefezellenlysierend, Micrococcus luteus wird jedoch nicht lysiert

Die obenerwähnten morphologischen, kulturellen und physiologischen Charakteristika von K481-B101 zeigen, dass K481-B101 in die Ordnung der Myxobacterales zu klassifizieren st. Unter den Gattungen der Myxobacterales unterscheiden sich die Gattungen Myxococcus, Archangium und Çystobacter von K481-B101 bezüglich der vertagten vegetativen Zellen und der Morphologie des Fruchtkörpers. Die Gattungen Melittangium, Stigmatella und Chondromyces unterscheiden sich von 5 K481-B101 durch die gestielten Sporangien.

K481-B101 ist den Gattungen Polyangium und Nannocystis ähnlich. K481-B101 gleicht der Gattung Nannocystis bezüglich der Bildung von ovalen oder sphärischen Myxosporen und den ovalen oder sphärischen einzelnen Sporangien, unterscheidet sich io jedoch von den letzteren durch die zylindrischen, vegetativen Zellen einheitlichen Durchmessers und den Mangel der Fähigkeit, den Agar zu ätzen, zu erodieren oder hineinzudringen. K481-B101 gleicht der Gattung Polyangium in den zylindrischen, vegetativen Zellen mit stumpfen, abgerundeten Enden, der vor-15 herrschenden Bildung von nicht lichtbrechenden Myxosporen und der ovalen oder sphärischen Sporangien mit doppelten Konturen. Auf Basis der Resultate von komparativen Studien der Gattungen der Ordnung Myxobacterales wurde K481-B101 als eine Art der Gattung Polyangium betrachtet. Unter den Arten von 2o Polyangium ist P. luteum dem K481-B101 in seiner Grösse der vegetativen Zellen, der Farbe und der Form der Sporangien sowie der Farbe der vegetativen Kolonie ähnlich. K481-B101 unterscheidet sich jedoch von P. luteum durch die ovalen oder sphärischen Myxosporen, die kontraktierter sind, und durch den Man-25 gel der Fähigkeit, lebende Bakterienzellen wie die Zellen von Micrococcus luteus zu lysieren.

Demzufolge wird K481-B101 als neue Art der Gattung Polyangium der Familie der Polyangiaceae, der Ordnung der Myxobacterales betrachtet, und es wird vorgeschlagen, den Organismus 30 als Polyangium brachysporum sp., nov. zu bezeichnen. Die Stammbezeichnung ist die Nummer K481-B101 (Einzelisolat) und die Kultur ist am 1. April 1985 bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852-US, mit der Hinterlegungsnummer ATCC 53080 hinterlegt 35 worden.

Tabelle 1 Morphologie von K481-B101

gramnegativ, zylindrisch mit stumpfen, abgerundeten Enden (0,6-0,8 x 2,0-10 um, Kongorot, nicht absorbiert.

unterscheidbar von vegetativen Zellen. Stark geschrumpft, werden oval oder sphärisch, 0,6-0,8 x 0,6-1,5 um, nicht lichtbrechend. Eine längere Inkubation ergibt lichtbrechende.

sessil, kommen allein oder in Gruppen vor. Oval, sphärisch, kissenförmig oder ohne Form. Beträchtliche Grössenunterschiede: 12 x 20 bis 80 x 120 jxm. An eine gewöhnliche oder eine schleimige Schicht gebunden. Besitzen doppelte Konturen. Sind in Agar eingebettet. Gruppen von 2 bis 10 oder mehr Sporangien im Bereich von 50-300 um Grösse der gesamten Masse, auf Chitin-Agar nach Inkubation während 2 Wochen. Palisaden oder Zickzackanordnung von Ketten von vegetativen Zellen bei der Peripherie; es werden gleitende Bewegungen einzelner Zellen beobachtet, von den Zellmaschen wurden jedoch keine gesehen.

45 Vegatative Zellen: Myxosporen:

50

Sporangien:

60

Mikrokolonie:

5

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Tabelle 2

Kulturelle Merkmale von K481-B101-Kolonien auf Casiton-Mg+ +-Agar (McCurdy, 1969) bei 28 °C während 6 Tagen

Form: kreisförmig

Oberfläche: glatt, später etwas gerunzelt

Aufrichtung: aufgerichtet

Kante: gesamthaft oder etwas unregelmässig und

Abwesenheit von bestimmten hervorstehenden Teilen, wie Zungen-, Federoder Wurzelformen.

semitransparent oder opak schwach grünlichgelb

Optische Eigenschaften: Farbe der Kolonie: Difundierbares Pigment:

keines

Wachstum auf Chitin-Agar nach Inkubation bei 28 °C während 3 Wochen.

Dünn, duróhscheinend, schwach gelb oder farblos. Dick, opak und gelblichweiss an peripheren Teilen. Konzentrische Bildung von Sporangien an der Peripherie. Erodiert oder ätzt Agar schwach oder dringt ein.

Tabelle 3

Physiologische Charakteristika von K481-B101 Hydrolyse von löslicher Stärke +

Kartoffelstärke +

CMC-Natrium +

Cellulose —

Agar -

Chitin +

Natriumalginat —

Natriumpolypectat —

Gelatine +

Caseiri +

Wachstum auf

Citrat-Agar nach Simon —

Citrat-Agar nach Christensen -

Glukose-Ammoniumsalz-Agar -

Asparagin-Ammoniumsalz-Agar +

Herstellung von

Indol ~ —

H2S +

Acetoin (VP- Reaktion) —

Urease +

Oxidase +

Catalase +

Lysewirkung gegen lebende Zellen vom Micrococcus-luteus-Stamm PCI 1001 & ATCC 9341

autoklavierte Hefezellen +

Milchkoagulation:

Milchpeptonisierung:

NaCl-Toleranz:

pH-Toleranz:

Reaktionen

Wachstum: 1,0% NaCI oder weniger. Kein Wachstum: 2,0% NaCI Wachstumsbereich: pH 5,5-10,5. Spärliches Wachstum: pH 5,0.

Kein Wachstum: pH 4,5 und 11,5

Wachstumstemperatur: Max. Wachstum: 37 °C.

Wachstumsbereich: 15-42 °C.

Kein Wachstum: 10 und 45 °C.

Oxodative oder 5 fermentative Reaktion: Oxidative

(Hugh-und-Leifsen-Medium)

Antibiotische Herstellung

Die Stockkultur von Polyangium brachysporum K481-B101 io wurde bei 28 °C während 3 Tagen fortgepflanzt, auf einem Agar-Schrägkultur-Medium, das aus 0,5% löslicher Stärke, 0,5% Glukose, 0,1% Heischextrakt, 0,1% Hefeextrakt, 0,2% Nz-case, 0,2% NaCI, 0,1% CaC03 und 1,6% Agar (pH 7,0) besteht. Eine gut gewachsene Agar-Schrägkultur wurde zur Inokulation des vegeta-15 tiven Mediums verwendet, welches aus 2% Maisstärke, 3% Sojabohnenmehl, 0,3% MgS04- 7H20 und 1% CaC03 bestand (pH 7,0 vor der Sterilisierung). Nach Inkubation bei 28 °C während 3 Tagen auf einem Rotationsschüttelgerät (250 Umdrehungen/ Minute) wurden 5 ml der Kultur in einen 500-mI-Erlenmeyer-20 Kolben transferiert, der 100 ml des Produktionsmediums enthielt, das die gleiche Zusammensetzimg wie das vegetative Medium aufwies.

Die Antibiotika-Herstellung wurde durch das Papierdiskagar-Diffusionsverfahren unter Verwendung von Candida albicans 25 A9540 als Testorganismus überwacht. Die Fennentation wurde während 4 Tagen bei 28 ° C auf einem Rotationsschüttelgerät durchgeführt, und die Antibiotika-Produktion erreichte ein Maximum von 100 jig/ml.

Die Fermentation wurde ebenfalls in einem Rührkrug-Fer-30 menter durchgeführt. Ein 500-ml-Anteil der Stammkultur, die durch Flaschenfermentation erhalten wurde, wurde zur Inokulierung des 10-1-Produktionsmediums in einem 20-1-Kessel verwendet. Die Fermentation wurde bei 28 ° C unter Rühren bei 250 Umdrehungen/Minute und unter Einleiten von Luft mit 101 pro 35 Minute durchgeführt. Die Antibiotika-Produktion erreichte ein Maximum von 150 jxg/ml nach 40 Stunden Fennentation.

Isolierung und Reinigung der Antibiotika

Die Fermentationsbrühe (481) wurde mit Hilfe einer Sharp-40 less-Zentrifuge zentrifugiert. Der Mycelkuchen wurde mit 71 Methanol homogenisiert und die Mischung während 1 Stunde gerührt. Nach der Entfernung der unlöslichen Teile durch Filtration wurde der Methanol abgedampft, wobei eine wässrige Lösung erhalten wurde, welche mit dem Brühenfiltrat vereinigt 45 und mit n-Butanol (241) extrahiert wurde. Der Extrakt wurde auf 0,51 konzentriert und in n-Hexan (3,51) unter Rühren gegossen, wobei das rohe Antibiotikum (41 g) ausgefallt wurde. Dieser Feststoff wurde auf einer Silikagel-Säule C-200 (760 ml) chromatogra-phiert, wobei mit Ethylacetat und einem zunehmenden Anteil von Methanol (0-50%) eluiert wurde. Die eluierte Bioaktivität wurde durch eine Papierdisk- Probe unter Verwendung mit Candida albicans A9540 als Testorganismus überwacht. Die aktiven Fraktionen wurden kombiniert und abgedampft, wobei ein schwach gelbes Pulver (13 g) von BU-2867T-Komplex erhalten. Ein 200-55 mg-Anteil dieses Feststoffes wurde auf einer Umkehrphasensäule chromatographiert (Ci8, 100 ml) unter Verwendung von Ethanol-Wasser (3:7 bis 5:5) als Elutionsmittel. Das Eluat wurde durch einen antifungalen Bioassay und TLC (Silanized, EtOH:HzO = 55:45) überwacht. Die ersten aktiven Fraktionen wurden kombi-60 niert und unter reduziertem Druck abgedampft, wobei ein rein-weisser Feststoff von BU-2867T A (61 mg) erhalten wurde, welcher aus wässrigem Methanol auskristallisiert wurde, wobei farblose Nadeln (34 mg) erhalten wurden. Die Abdampfung der zweiten und dritten aktiven Fraktionen ergab BU2867T B (1 mg) bzw. C (11 mg). BU-2867T C wurde aus Methanol auskristallisiert, wobei feine Nadeln erhalten wurden. Die Wiederholung der obigen Umkehrphasen-Chromatographie ergab insgesamt 3,9 g BU-3867T A, 44 mg BU-2867T B und 342 mg BU-2867T C.

50

65

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6

Charakterisierung der antibiotischen Substanzen

BU-2867T A und C wurden als farblose Nadeln isoliert, während BU-2867T B als weisses amorphes Pulver erhalten wurde. Sie sind leicht löslich in Methanol, Ethanol, n-Butanol und Dimethylsulfoxid, schwach löslich in Chloroform, Acetonitril und Ethylacetat und praktisch unlöslich in n-Hexan und Wasser. Sie gaben eine positive Reaktion auf Rydon-Smith-Reagenz und färbten nach Besprühen von Jod oder Schwefelsäure auf der TLC-Platte. Sie waren negativ auf die Ninhydrin-, Sakaguchi-,

Anthron- und Dragendorff-Reaktion. BU-2867T A, B und C wurden analysiert, wobei die Summenformeln C27H44N4O6, bzw. Q9H4SN406 mittels Massenspektrographie und Mikroanalyse ermittelt wurden. Die UV-Spektren der 3 Komponenten in Methanol ergaben ein einziges Maximum bei 261 nm, welches sich in saurer oder alkalischer Lösung nicht verschob. Die physikalisch-chemischen Daten von BU-2867T A, B und C sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Ihre IR-Spektren in KBr (Figuren 1, 2 und 3) zeigten starke Ambidbanden um 1630 und 1540 cm-1 und eine OH und/oder NH-Absorption bei 3300 cm-1. Das 'H-NMR-Spektrum von BU-2867T A (Figur 4) zeigte die Gegenwart von 6 olefmischen Protonen (5:6,16,6,20 (2H), 6,28, 6,49 und 7,09 ppm) und vier Amidprotonen (8:7,49,7,82,7,87 und 8,72 ppm). Zwei Methylgruppen (S: 0,93 ppm, t und 1,07 ppm, d) wurden ebenfalls im Spektrum beobachtet Das 13C-NMR-Spek-trum von BU-28-67T A (Figur 5) zeigte mehr als 23 C-Signale einschliesslich 4 Carbonyl-Atome, 6 olefinische C-Atome und 3 Methyl-C-Atome. BU-2867T B und C zeigten sehr ähnliche 13C-NMR-Spektren, wie dasjenige von BU-2867T A, mit der Ausnahme der Gegenwart von 2 zusätzlichen olefinischen C-Atomen in BU-2867T B und 2 zusätzlichen Methylen-C-Atomen bei BU-2867T C verglichen mit BU-2867T A.

BU-2867T A wurde unter Rückfluss mit 6N HCl während 16 erwärmt. Nach der Entfernung des lipophilen Produktes (V)

durch Ethylacetatextraktion wurde das Hydrolysat zu einem öligen Rückstand konzentriert, welcher dann auf Dowex 50 Wx 4 Ionen-Austauscher-Harz unter Entwicklung mit Pyridin/Ameisensäure/Essigsäurepuffer (0,1-0,2 M, pH 3,1-5,1) chromatogra-phiert wurde. Durch Überwachung mit Ninhydrinreagenz wurden 4 Aminosäuren I, II, III und IV eluiert und in dieser Ordnung isoliert und als Hydrochloride kristallisiert. Die Aminosäure I ([a] 25°d: —12,7° in 5N HCl) wurde als L-threonin durch ihre physikalischen Eigenschaften identifiziert. Das 'H-NMR-Spektrum und das EI-MS (M+ +1 : m/z 134) der Aminosäure II zeigte,

dass es eine Mischung der Diastereoisomeren von 4-Amino-

I:

II:

III:

IV r

V:

BU-2867T A hat die Molekularformel C27H44N406 und zeigte 6 olefinische Kohlenstoffe und 4 Amidkohlenstoffe im 13C-NMR-Spektrum. Es ist demzufolge klar, dass die Aminosäure der Formel II ein Artifact war, der durch die Hydration der natürlichen Aminosäure der Formel III während der sauren Hydrolyse entstand. Die antibiotische Verbindung sollte ein cyclisches Peptid sein, da es eine negative Ninhydrin-Reaktion aufweist und keine titrierbare Funktion bei der potentiometrischen Titration zeigte.

3-hydroxy-n-valeriansäure war, Konishi, M.; K. Saito, K Numata, T. Tsuno, K Asama, H. Tsukiura, T. Naito und H. Kawaguchi: Tallysomycin, ein neuer antibiotischer Komplex, welcher mit Bleomycin verwandt ist. II. Strukturbestimmung von Tal-5 lysomycinen A und B. J. Antibiotics 30:789-805,1977, und ihre Identität wurde durch einen direkten Vergleich mit den authentischen Proben bestätigt. Die Molekularformel von III wurde als C5H9NO2 durch Elementaranalyse und EI-Massenspektrometrie (M+ : m/z 115) bestimmt. Das 'H-NMR zeigte die Gegenwart 10 eines Methyls (5:1,50 ppm, d, J: 6,0 Hz), eines Methins (5: 4,0-4,2, m) und 2 trans-olefinische Protonen (8:6,05 ppm, d, J: 15,0 Hz und 6,57 ppm, d-d, J: 6,0 und 15,0 Hz). Diese Spektraldaten zeigen klar, dass III 4-Amino-2(E)-pentensäure darstellt, T. Honoré, H. Hjeds, P. Krogsgaard-Larsen &T. R. Christiansen: 15 Synthesis and Structure-Activily Studies of Analogs of y-amino-butyricacid (GABA). Eur. J. Med. Chem., 13,429-434, 1978. Die 2(S)-Konfiguration wurde Verbindung III auf Basis ihrer spezifischen Drehung zugeschrieben ([a]D22-5: — 6° in 5N HCl). Die Aminosäure der Formel IV wurde als 4-Hydroxylysin identifiziert, 20 auf Basis ihrer Elementaranalyse (C6H14N2O3), ihres EI-MS (M + 1: m/z 163) und des 'H-NMR-Spektrums (8:1,8-2,1 ppm 4H, m, 3,18 ppm, 2H, t und 3,6-4,3 ppm, 2H, m) und der Bildung einer y-Lactonverbindung (UC=0:1770 cm-1) nach Behandlung mit 6N HCl. Izumiya, N.; Y. Fujita, F. Irreverre & B. 25 Witkop: Ihe Synthesis of Eiythro-y-hydroxy-L-lysine and its Nonoccurrence in Collagen. Biochemistiy 4,2501-2506,1965, beschrieben die Muta-Rotation von 4-Hydroxy-Lysinen und die Verschiebung, welche für die Verbindung IV die Erythro-L-Konfi-guration zeigte. Demzufolge wurde die Struktur der Aminosäure 30 der Formel IV als Eiythro-4-hydroxy-L-Lysin ermittelt.

Die lipophile saure Fraktion (V), welche durch die obige saure Hydrolyse erhalten wurde, wurde mit Diazomethan behandelt, wobei nach chromatographischer Reinigung ein öliger Methylester (VI) erhalten wurde. Das UV-Spektrum (k MeOH: 260 nm, 35 e: 22,000), EI-MS (M+: m/z 210) und 'H-NMR (vier - CH=, ein C-CH3 und sechs -CH2-) zeigten, dass die Verbindung VI Methyl, 2,4-Dodecadionoat war. Die Magnetisierung der Kupplungskonstante legte nahe, dass beide Doppelbindungen eine trans-Geometrie aufwiesen. Die ursprüngliche Säure der Formel 40 y war demzufolge 2(E), 4(E)-Dodecadionsäure, Bürden RS. & L. Crombie: Amides ofVegetable Origin, part XII. Eine neue Serie von Alka-2,4-dien Tyramin-Amin auf Anacyclus pyrethrum D. C. (Compositae). J. Chem. Soc. (C), 1969:2477-2481,1969.

Dies wird weiter durch die Tatsache unterstützt, dass BU-2867T A ein di-O-Acetylderivat (EI-MS: M+ = m/z 604, 'H-NMR: 2,02 ppm 3H und 2,08 ppm, 3H) nach Acetylierung in Pyridin ergab. Das Massenspektrum des Acetates zeigte ebenfalls starke Ionen-65 fragmente bei m/z 179 und 322, wonach man die Gegenwart einer V—>-1—+ Sequenz in der antibiotischen Substanz schliessen konnte.

L-Threonin CH-j-CH-CH-COOH

OH NH2

4-Ämino-3-hydroxy-n-valeriansäure CH--CH-CH-CH--COOH

3 I 1 2

NH2OH

4(S)-Amino-2(E)-pentensäure CH_-CH-CH=CH-COOH

J i nh2

Erythro-4-Hydroxy-L-lysin NH2-CH2~CH2-CH-CH2-CH-COOH

OH NH2

2(E), 4(E)-Dodecadiensäure CH3-(CH2)g-CH=CH-CH=CH-COOH

7

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BU-2867T A wurde einer enzymatischen Zersetzung mit Rein in O.Ol Phosphatpuffer (pH 7.0) unterworfen. Nach der Ansäue-rung auf pH 2.2 wurde die Reaktionsmischung mit n-Butanol extrahiert, wobei die saure Verbindung der VII erhalten wurde. Eine anschliessende Extraktion der wässrigen Lösung bei pH 10.0 mit n-Butanol ergab die ninhydrinpositive Substanz der Formel VIII. Die Verbindung der Formel VII erwies sich als 2,4-Dodecadienoyl-threonin (V—v I) durch das IR-Spektrum (vc=0: 1720 & 1650 cm"1), EI-MS (M+-0H20: m/z 279 und M+-Thr: m/z 179) und das 'H-NMR-Spektrum. Die Struktur wurde weiter durch die Tatsache festgelegt, dass die Verbindung der Formel VII, die Verbindungen der Formeln I und V ergab nach Hydrolyse in 6N HCl. Unter Rückfluss in 6N HCl ergab die Verbindung der Formel VIII die Aminosäuren der Formeln II, III und IV, wie dies durch TLC nachgewiesen wurde. Im EI-MS der Verbindung der Formel VIII wurde das Molekularion mit m/z 241 ermittelt, was auf eine cyclische Peptidstruktur schliessen liess. Das 'H-NMR (270 MHz in DMSO-de) zeigte zwei Amid NH-Protonen bei 7,43 ppm (Triplett) und 9,10 ppm (breit) in Übereinstimmung mit der obigen cyclischen Struktur. Extensive Dekupplungsexperimente zeigten, dass die Aminogruppe der Verbindung der Formel III und die e-Aminogruppe der Verbindung der Formel IV mit zwei Carbonylgruppen und der Bildung von Amiden verbunden war, während die a-Aminogruppe der Verbindung der Formel IV frei war. Demzufolge war die Struktur der Verbindungen VII und VIII wie nachstehend angegeben:

<fH3

çhoh e e vii ch3-(ch.,)g-ch=ch-ch=ch-co-nh-ch-cooh ch3

Die Verbindungen der Formeln VII und VIII werden ebenfalls erhalten, indem BU-2867T A einer enzymatischen Zersetzung oder Hydrolyse mit Papain oder Chymipapain unterworfen wird. Eine Mischung von BU-2867T A (4 g) und Papain (Sigma P-3375, 50 g) in 20110% wässrigem Methanol wurde während 22 Stunden bei 28 0 C gerührt. Die Mischung wurde dann auf einen pH-Wert von 3,3 durch Zugabe von Essigsäure angesäuert und mit Ethylacetat (101) extrahiert. Die Abdampfung des Extraktes ergab ein Öl (6,3 g), welches auf Silikagel (Wakogel C-200, 250 ml) mit einer Mischung von CH2C12 und Methanol (9 +1) chromatographiert wurde, wobei eine semi-reine, ölige Verbindung VII (3,3 g) erhalten wurde. Eine weitere Chromatographie des Öls durch Sephadex LH-20 und anschliessende Kristallisation, ergab farblose Nadeln der reinen Verbindung der Formel VII.

1,15 g (Ausbeute 50%). F. 90-91 °C. [a]rJ+ 17.4° (C0.5, MeOH), Anal, berechnet fur Ci6H27N04H20: C 60.93, H 9.27, N 4.44. Gefunden: C 61.36, H 9.03, N4.20. EI-MS: m/z 279 (M+~ H20). UVA^fOn nm (e): 260 (28.000). IR vraax (KBr) cm"1: 3520, 5 3410, 3300, 1720, 1690, 1655, 1630 usw. 'H-NMR 680 MHZ, DMSO-dfi) 8 0.88 (3H, t), 1.06 (3H, d), 6.20 (3H, m), 7.00 (1H, m), 7.84 (IH, d, NH) usw.

Nach der Extraktion mit Ethylacetat wurde die saure, wässrige Lösung bis zur Trockenheit konzentriert. Der Rückstand (36 g) 10 wurde in 50 ml Wasser aufgelöst, auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt und auf eine Umkehiphasensäule mit Siliciumdioxid (Qg, Merck, 1,61) gegeben, welche mit Wasser entwickelt wurde. Die Fraktionen, welche die Verbindung der Formel VIII enthielten, wurden gepoolt und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand 15 wurde auf Sephadex 1H-20 (250 ml) mit 50% wässrigem Methanol und dann auf Umkehiphasen-Siliciumdioxid (Qg) mit angesäuertem Wasser (pH 3,0 durch verdünnte HCl) chromatographiert, wobei das reine Hydrochlorid der Verbindung der Formel VIII erhalten wurde; 747 mg (Ausbeute 35%). F. 190 °C (Zers). 20 [aft6-113 °C (c 0.5, H20). EI-MS: m/z 241 (M+) UV: Endab-soiption. IR vmax(KBr) cm-1: 3400, 1660,1620,1530 usw. 'H-NMR680 MHZ, DMSO-d6) 8 1.27 (3H, d), 1.4-1.8 (4H), 2.98 (2H, m), 4.52 (1H, m), 7.19 (1H, d), 6.45 (1H, d-d), 7.43 (1H, t, NH), 9.46 (1H, d, NH). Analyse berechnet für ciih9n303 HCl 25 H20: C 44.67, H 7.50, N 14.21, Cl 11.99. Gefunden: C 45.04, H 7.82, N 13.81, CI 12.55.

Da BU-2867T A ninhydrinnegativ war und keine titrierbare Gruppe aufweist, geht nun logischerweise daraus hervor, dass diese Verbindung durch Kupplung der Substanzen VII und VIII 30 durch eine Peptidbindung gebildet werden kann.

Bei der Erwärmung mit 6N HCl ergaben sowohl BU-2867T B wie auch C den gleichen Aminosäurekomplex, wie er aus BU-2867T A erhalten wird. Die Fettsäurereste der beiden antibiotischen Verbindungen wurden aus dem Hydrolysat extrahiert, mit 35 Diazomethan behandelt und als Methylester IX (aus BU-'2867T B) und X (aus BU-2867T C) isoliert. Sie zeigten ein charakteristisches UV-Maximum (X^H: 260 nm), wie dies für die ursprünglichen antibiotischen Verbindungen ebenfalls der Fall war. Das EI-MS der Verbindung IX zeigte ein Molekularion bei 40 m/z 236, was auf einen Cw-Säureester mit drei Doppelbindunger schliessen liess. Die UV und 'H-NMR-Spektren zeigten eindeutig die 2(E), 4(E)-diensäurestruktur und die dritte isolierte Doppelbindung in EX. Der Ozonolyse der Verbindung IX folgte die reduktive Zersetzung des Ozonides unter Bildung von n-Hexanal, 45 welches isoliert und als 2,4-Dinitrophenyl-hydrazon identifiziert wurde (EI-MS M+ : m/z 280). Diese Beweise zeigen, dass IX Methyl 2(E), 4(E), 8-Tetradecatrienoat war. Das Molekulargewicht des Esters X (EI-MS; M+ m/z 238) wurde mit 28 Einheiten (C2H4) höher als dasjenige von VI ermittelt, was den Unter-50 schied der Molekülformel reflektierte, welcher zwischen BU-2867T A und C beobachtet wurde. In Kombination mit den 'H-NMR- und UV-Daten kann darauf geschlossen werden, dass die Verbindung X das Methyl 2(E), 4(E)-Tetradecadienoat war. Die Resultate der obigen Experimente zeigten die folgenden Strukturen für die Verbindungen BU-2867T A, B und C:

<672 921

e e h-ch=ck-ch=ch-co-nh-ch-co-nh'

BU-2867T A

a h ch3

r = ch3-(ch2)g_

BÜ-28 67T B BU-2867T C

r = ch3-(ch2)4-ch=ch-(ch2)2_

r = ch3-(ch2)8_

Tabelle 4

Physikalisch-chemische Eigenschaften von BU-2867T A, B und C

bu-2867t A

bu-2867t b bu-2867t c

Nature

Colorless needles

White powder

Colorless needles

F.

259-261°C

232-234°C

273-275 °C

[afe4" (c 0.5 MeOH)

-111°

-92°

-104°

Mikroanalyse

Berechnet für

C27H44N406-,/2H20

CÄNA-'ÄHzO

CÄNA

C61.22, H8.56, N10.58

C60.71,H8.61,N9.77

C63.48,H8.82,N10.21

Gefunden

C60.90,H8.65,N10.47

C60.89,H8.31,N9.23

C63.48.H8.91,N10.16

EI-MS m/z

520 (M+)

546 (M+)

548 (M+)

UV^i°Hnm(8)

261 (35,000)

261 (28,000)

261 (36,000)

TLC

Silanisierte Platte Rf

Et0H-H20 (55:45)

0.45

0.41

0.34

HPLC

Iichrosorb Rp-18 Rt

Et0H-H20 (65:35)

6.43

7.93

11.33

Der enzymatische Abbau von BU-2867T mit Pseudomonas acylase ergab verschiedene Produkte, als diejenigen, welche durch Hydrolyse mit Rein oder Papain, wie oben beschrieben, erhalten wurden. Der Pseudomonas-Stamm Pa-129 wurde in 101 eines Mediums bei 37 ° C während 3 Tagen fermentiert, welches 2% lösliche Stärke, 0,2% Glukose, 3% Sojabohnenmehl, 1% CaC03 und 0,3% MgS04 • 7H20 enthielt und die Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen. Nach zweimaligem Waschen mit Salzlösung (11) wurden die Zellen wiederum in 0,751 Salzlösung suspendiert. die Zellsuspension wurde mit einer vorautoklavierten Suspension (1,51) von Natriumalginat (75 g) und CM-Cellulose (75 g) gemischt, und die Mischung wurde unter Rühren in 301 0,1 M CaCl2-Lösung gegossen. Das zu den Zellen gegebene Gel verfestigte sich durch Rühren mit 25% Glutaraldehydlösung und wurde in eine Säule gepackt (4,0 x 175 cm). Eine Lösung von BU-2867T A (1.5) in 20% wässrigem Methanol (301) wurde mit einer Fliessrate von 0,4-0,81/h durch die Säule fliessen gelassen. Die gepoolte ausströmende Hüssigkeit wurde dann nacheinander durch eine Amberlite-IRC-50-Säule (70% NH4+-Form, pH 6,7, 300 ml) und durch eine HP-20-Säule (300 ml) durchmessen gelassen. Die IRC-50-Säule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit 1.5 N NH4-OH entwickelt. Die ninhydrinpositiven Fraktionen wurden gepoolt, konzentriert und lyophilisiert, wobei ein schwach gelber Feststoff (800 mg) erhalten wurde, welcher auf eine Umkehrphasen-Siliciumdioxid-Säule (Qg, 250 ml) gegeben wurde. Die Säule wurde mit Wasser unter mittlerem Druck entwickelt, und die ninhydrinpositiven Eluate wurden gepoolt und konzentriert, woei L-Threonylcyclinamin (XI, 612 mg) in Form

40

eines weissen Feststoffes erhalten wurde. Ausbeute 62%. F. 170 °C, [aß7-157 °C(c 0.5, H20). EI-MS;m/z342 (M+). UV: Endabsorption. IRvmax(KBr) cm-1:3350, 3280,1650, 1620,1530 usw. 'H-NMR (80 MHZ, DMSO-d6) Ô 1.05 (3H, d), 1.21 (3H, d) 451.4-2.2 (4H), 4.35 (2H, m), 4.47 (IH, m. OH), 4.62 (IH, d, OH), 6.6 (1H, d), 6.42 (1H, d-d), 7.36 (1H, t, NH), 7.97 (1H, d, NH), 8.62 (1H, d, NH).

50

xi : ch,-ch-ch-co-n: J I I oh nh2

55

Die obenerhaltene HP-20-Säule wurde mit Wasser (11) und dann mit einer Mischung von 0.1 N NaOH und Methanol (1:2) entwickelt. Die Fraktionen, die 2,4-Dodecadiensäure (V) enthiel-60 ten, wurden gepoolt und auf 300 ml konzentriert und auf pH 2,0 angesäuert. Die Lösung wurde mit Ethylacetat (300 ml) und n-Butanol (100 ml) extrahiert. Die Abdampfung des Ethylacetatex-traktes ergab einen öligen Rückstand, welcher auf einer Sepha-dex-LH-20-Säule (800 ml) Chromatographien wurde. Nach der 65 Elution mit Methanol und der Überwachung des Eluats durch UV-Absorbtion bei 260 nm wurden die zweckmässigen Eluate konzentriert, wobei die reine Verbindung der Formel V (259 mg) in Form von farblosen Plättchen erhalten wurde. Ausbeute 53%.

F. 48-49 °C. UV^H nm (e): 258 (24.000). IRvmax (KBr) cnr1: 1680,1630, 1605,1410,1300 usw. 'H-NMR (80 MHz, CD3OD) Ô 0.89 (3H, t), 2.0 (10H), 2.12 (2H, m), 5.75 (1H, d), 6.6 (2H, m), 7.21 (1 H, m). Diese Verbindung war identisch mit der durch Säurehydrolyse von BU-2867T A erhaltenen 2,4-Dodecadiensäure. Der n-Butanol-Extrakt wurde im Vakuum konzentriert und lyophilisiert, wobei das Ausgangsmaterial BU-2867T A (160 mg, 11%) erhalten wurde.

Aus der obigen Diskussion ist offensichtlich, dass die Verbindungen der Formel VIII und XI wertvolle Zwischenprodukte zur -

9 672 921

Herstellung von verschiedenen antibiotischen Verbindungen der vorliegenden Erfindung darstellen. Eine übliche Acylierung, beispielsweise mit einem gemischten Anhydrid einer Carbonsäure mit einem Alkylsäurecarbonat (HOCOOR) bildet die erforderli-5 che Peptidbindung, Advanced Organic Chemistiy, pp. 1039-1046, Reinhold Publishing Corporation, New York, 1965. Hydroxygruppen müssen in üblicher Weise geschützt werden, z.B. in Form von Tetrahydropyranyl- oder t-Butylether. Die Acylierung der Amingruppe von VIII mit den Säuren ch0-(ch„)c-ch=ch-ch=ch-co-nh-ch-choh-ch0

J 6 V J J

cooh ch3-(ch2)4-ch=ch-(ch2)2-ch=ch-ch=ch*co-nh-ch-choh-ch3

cooh und ch3-(ch2)8-ch=ch-ch=ch*co-nh-ch-choh-ch3

cooh ergeben BU-2867T A, B und bzw. C. Beispielsweise wird BU-2867T A durch Kupplung von VII mit VIII erhalten. Eine Mischung von VII (15 mg), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (10 mg) und 1-Hydroxy-l, 2,3-Benzotriazol (8 mg) in 2 ml Dime-thylformamid wurde während 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Die Verbindung der Formel VIII (10 mg) wurde dann zur Mischung zugegeben und über Nacht kontinuierlich gerührt. Die Lösung wurde zu einem Rückstand konzentriert, welcher auf Umkehrphasen-Siliciumdioxid (Ci8,40 ml) chromatographiert wurde, wobei mit 80% Methanol eluiert wurde. Die aktiven Eluate wurden abgedampft und der Rückstand durch präparative HPLC gereinigt (Säule: SSD-ODS-842, mobile Phase: 90% wäss-riger Methanol). Die Abdampfung der aktiven Peak-Fraktion ergab BU-2867T A (7.4 mg, Ausbeute 28%), welche in jeder Hinsicht mit dem natürlichen Antibiotikum identisch war. TLC (Sila-nisiert, Et0H-H20 = 55:45 Rf: 0.45. HPLC (Lichrosorb RP-18, Et0H-H20 = 65:35) Rt: 6,43 Min.

BU-2867T A kann ebenfalls durch Kupplung von Formel V mit Formel XI erhalten werden. Eine Dimethylformamid-Lösung (1 ml) der Verbindung der Formel V (3,4 mg), N,N'-Dicyclohex-ylcarbodiimid (3,7 mg) und 1-Hydroxy-l,2,3-benzotriazol (2,8 mg) wurde während 2 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Zur Lösung wurde XI (5 mg) zugegeben und die Mischung während zusätzlich 3 Stunden unter Rühren gehalten und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde in Methanol aufgelöst und durch präparative HPLC gereinigt, wobei die gleiche Kolonne und mobile Phase wie vorher beschrieben, verwendet wurden. BU-2867T A 4 mg, Ausbeute 45%. Die Identität mit dem natürlichen BU-2867T A wurde durch direkten Vergleich bestätigt.

Die Verbindung der Formel XI kann aus der Verbindung der Formel VIII unter Verwendung von üblichen Verfahren hergestellt werden. Zu einer gerührten Mischung von N-t-butoxycarbonyl-L-threonin (44 mg), N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (40 mg) und 1-Hydroxy-l,2,3-benzotriazol (30 mg) in Dimethylformamid (4 ml) wurde VIII (40 mg) bei Zimmertemperatur zugegeben. Die Mischung wurde im Vakuum konzentriert, wobei ein Rückstand erhalten wurde, welche auf einer Umkehrphasen-Siliciumdioxid-säule (C18, 40 ml) chromatographiert wurde, wobei eine Metha-nol-und-Wasser-Mischung (Verhältnisse 1:9 bis 2:3) verwendet wurde. Die zweckmässigen Fraktionen wurden gereinigt, in

Vakuum konzentriert und gefriergetrocknet, wobei N-BOC-L-threonyl-VIII ( = BOC-XI) erhalten wurde. 15 mg Ausbeute, so 69%. v0=0KBr: 1690 und 1540 am"1. »H-NMR (80 MHz) ôppm in DMSO-d6:1.00 (3H, d), 1.22 (3H, d), 1.35 (9H, s), 6.11 (1H, d), 6.33 (1H, d-d) usw. Eine Mischung von BOC-XI (36 mg) und Ameisensäure (1 ml) wurde während 1 Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Diese wurde konzentriert, mit Wasser (1 ml) ver-35 dünnt und auf pH 10.0 eingestellt und auf eine Umkehiphasen-Siliciumdioxidsäule (Ci8,20 ml) gegeben. Nach Entwicklung mit Wasser und Überwachimg des Eluates mit dem Ninhydrintest wurden die zweckmässigen Eluate vereinigt und gefriergetrocknet, wobei die Verbindung XI in Form eines weissen Feststoffes erhal-40 ten wurde. 25 mg Ausbeute 88%. vc=0 KBr: 1650 cm-1. 'H-NMR 8ppin in DMSO-d6:1.04 (3H, d), 1.22 (3H, d), 6:14 (1H, d), 6.42 (1H, d-d), 7.35 (1H, t, NH), 7.98 (1H, d, NH), 8.65 (1H, d, NH) usw. EI-MS: M+m/z 342.

Es ist demzufolge möglich, die erfindungsgemässen antibioti-45 sehen Verbindungen durch Umsetzen der Verbindungen VIII und XI mit den zweckmässigen Säuren herzustellen, unabhängig von ihrer Herkunft. Überdies können die erfindungsgemässen Verbindungen der Formeln VIII und XI, insbesondere diejenigen, welche ein höheren Ausbeuten erhalten werden, zur Herstellung 50 anderer erfindungsgemässer Verbindungen verwendet werden. Beispielsweise BU-2867T A, welche in höheren Ausbeuten durch Fermentation erhalten wird, kann zur Herstellung von BU-2867T B und BU-2867T C durch enzymatische Hydrolyse und Kuppeln mit der gewünschten Säure erhalten werden, wie dies ss vorher erläutert wurde.

Die Ausbeute von BU-2867T und die Verteilung der A, B und C-Fraktionen, die durch Fermentation, wie oben erwähnt, erhalten werden, kann durch Zugabe verschiedener Fette und Öle sowie oberflächenaktiver Mittel zum Medium, worin Polyangium so brachysporum K481-B101 kultiviert wird, modifiziert werden. Beispielsweise erhöht die Zugabe von Sojabohnenöl, Maisöl, Olivenöl, hydriertes Pflanzenöl, Schweinefett und Talg in kleinerem Ausmass die gesamte Ausbeute des erhaltenen BU-2867T. Fett und Öle, die einen hohen Gehalt an Iinolsäure (Ci8;2) ent-65 halten, wie Sojabohnenöl, Maisöl und Schweinefett, fuhren zu einer Zunahme bei der Herstellung des gebildeten BU-2867T B. Öle, wie Olivenöl, die einen hohen Oleinsäuregehalt aufweisen (Cis:i), fuhren zu einer Zunahme des gebildeten BU-2867T C im

672 921

IO

Verhältnis. Die hydrierten Pflanzenöle, die reich an Stearinsäure sind (C|8;o), erhöhen nur den Anteil des gebildeten BU-2867T A.

Antimikrobielle Aktivität

Die minimalen Hemmkonzentrationen (MICs) von BU-2867T A, B und C wurden gegen verschiedene Mikroorganismen bestimmt, in dem eine Serie von Agarverdiinnungsverfahren durchgeführt wurden. Nähragar (Eiken) wurde für Bakterien und Sabouraud-Dextrose-Agar (Difco) für Fungi verwendet. Die Grösse des Inokulums wurde auf IO4 CFU/ml für Bakterien und auf 105-7 CFU/ml für Fungi eingestellt.

Die Tabelle 5 zeigt die antibakteriellen Aktivitäten von BU-

2867T A, B und C in vitro. Die Komponenten A und C hemmen das Wachstum sowohl von grampositiven wie auch gramnegativen Bakterien bei 50 jig/ml nicht, während die Komponente B eine massige Aktivität gegen einige grampositive Bakterien zeigt. r> Die antifungalen Aktivitäten der BU-2867T-Komponenten sind in Tabelle 6 dargestellt. Die Komponenten C zeigten wirksame antifungaie Aktivität gegen klinisch wichtig pathogene Fungi, wie Candida albicans, Ciyptococcus neoformans, Aspergillus fumigatus, Trichophyton mentagrophytes und Mucor spino-io sus. Die Komponenten A und B waren etwas weniger aktiv als die Komponente C, jedoch war ihr antifungales Spektrum demjenigen der letzteren sehr ähnlich.

Tabelle 5

Antibakterielles Spektrum der BU-2867T-Komponenten

MIC (ng/ml)

BU-2867TA BU-2867B BU-2867C

Grampositive Organismen

Staphylococcus aureus

209P

>50

25

>50

Staphylococcus aureus

Smith

>50

3.1

>50

Staphylococcus aureus

Bx-1633

>50

50

>50

Staphylococcus epidermis

D153

>50

6.3

>50

Staphylococcus epidermis

A22152

>50

50

>50

Streptococcus faecalis

A9612

>50

>50

>50

Micrococcus luteus

PCI-1001

>50

50

>50

Bacillus subtiüs

PCI-219

>50

50

>50

Gramnegative Organismen

Escherichia coli

NIHJ

>50

>50

>50

Klebsiella pneumoniae

D-ll

>50

>50

>50

Proteus mirabilis

A9554

>50

>50

>50

Proteus vulgaris

A9436

>50

>50

>50

Morganella morganii

A9553

>50

>50

>50

Serratia marcescens

A20222

>50

>50

>50

Enterobacter cloacae

A9659

>50

>50

>50

Pseudomonas aeruginosa

A9930

>50

>50

>50

Medium: Nähragar

Tabelle 6

Antifungaie Spektren der BU-2867T-Komponenten

Testorganismus

MIC(ng/ml) BU-2867A

BU-2867B

BU-2867C

Candida albicans

IAM4888

3.1

3.1

1.6

Candida albicans

A 9540

1.6

1.6

0.8

Ciyptococcus neoformans

D 49

25

25

3.1

Ciyptococcus neoformans

IAM4514

25

25

3.1

Aspergillus fumigatus

IAM2530

1.6

3.1

0.8

Aspergillus fumigatus

IAM2034

1.6

3.1

0.8

Aspergillus flavus

FA 21436

25

25

50

Fusarium moniliforme

A 2284

>50

>50

>50

Kricularia oiyzae

D 91

>50

>50

>50

Trichophyton mentagrophytes

D 155

25

12.5

1.6

Trichophyton mentagrophytest

Nr. 4329

25

12.5

6.3

Blastomyces dermaditis

IF0 8144

50

50

>50

Sporothrix schenckii

IFÖ8158

>50

>50

>50

Petriellidium boydii

IFO8073

>50

>50

>50

Mucor spinosus

IFO5317

1.6

0.8

0.2

Medium: Sabouraud-Dextrose-Agar

11

672 921

Antitumor-Aktivität

Die Antitumor-Aktivität von BU-2867T A, B und C wurde bei weiblichen CDFrMäusen und männlichen BDFrMäusen bestimmt. Die Lymphocyten-Leukämie P388 (CDF|- und BDF)-Mäuse) und die Iymphiode Leukämie LI210 (BDFrMäuse) wurde durch intraperitoneale Injektion von 0,8 ml verdünnter Aszites-Flüssigkeit, die 106 bzw. 105 Zellen pro Maus enthielt, inokuliert. Das melanotische Melanom B16 (BDFrMäuse)

wurde in Form von 0,5 ml 10% Tumorbrei intraperitoneal implantiert. Die Testmaterialien wurden in 0,9% Salzlösung, die 10% Dimethylsulfoxid enthielt, aufgelöst und abgestimmte Dosen davon wurden intraperitoneal 24 Stunden nach der Tumorimplantation an Mäuse verabreicht. Als Referenzverbindungen wurden vergleichsweise entweder Olivomycin (NSC 38270) oder Mitomycin C verwendet.

BU-2867T A, B und C zeigten Antitumor-Aktivität gegen die Leukämie P388 durch Behandlungsschema 1 (einmal täglich am Tag 1,4 und 7). Die Tabelle 7 zeigt die Resultate als mittlere Überlebenszeit (MST) der Test (I) und der KontroIl-(C)-Tiere für verschiedene Dosispläne, ausgedrückt als Prozentsätze. Verschiedene Prozentsätze von 125 und darüber zeigen einen bedeutenden Antitumor-Effekt.

Tabelle 7

Antitumor-Aktivität von BU-2867T-Komponenten gegen die Leuklämie P388

T/C % MST

Dosis in mg/kg/Tag, ip

3 1

0,3

0,1

BU-2867T A

140

130

120

BU-2867T B

165

140

120

BU-2867T C

155

130

Olivomycin A

140

135

100

BU-2867T A und C waren hochaktiv gegen die Leukämie P388 mit dem Behandlungsplan 2 (einmal täglich an den Tagen 1-9); BU-2867T A war weniger aktiv gegen die Leukämie L1210 und das Melanom B16. Die Tabelle 8 zeigt die Resultate, welche für verschiedene Dosispläne erhalten wurden, wiederum ausgedrückt als Zunahme der mittleren Überlebenszeit in Prozent, wobei Werte von 125 und darüber einen bedeutenden Antitumor-Effekt anzeigen.

Tabelle 8

Antitumor-Aktivität von BU-2867T A und C

T/C % MST

Dosis in mg/kg/Tag, ip

2 1 0,5 0,25 0,13 0,063 0,031

P388-Leukämie BU-2867T A 67 BU-2867TC 234 Mitomycin C L1210-Leukämie BU-2867T A Mitomycin C B16-Melanom BU-2867A Tox.

Mitomycin C 63

Die akute Toxizität von BU-2867T A und C wurde bei männlichen ddY-Mäusen durch eine einzige intraperitoneale Verabreichung bestimmt. Die LD50-Werte betrugen 8,1 mg/kg bzw. 25 mg/kg.

5 Die pharmakologisch wirksamen Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung können durch übliche Verfahren der gale-nischen Pharmazie in eine pharmazeutische Zubereitung zur oralen oder parenteralen Verabreichung, z.B. am Menschen einschliesslich Säugetiere, verarbeitet werden. Übliche Exzipienten 10 sind pharmazeutisch annehmbare organische oder anorganische Trägersubstanzen, welche für die parenterale, enterale oder topische Verabreichung geeignet sind und zusammen mit den aktiven Verbindungen keine schädlichen Reaktionen bewirken, zweckmässige, pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen, sind 15 jedoch nicht darauf eingeschränkt, Wasser, Salzlösungen, Alkohole, Gummi arabicum, Manzenöle, Polyethylenglycole, Gelatine, Lactose, Amylose, Magnesiumstearat, Talg, Kieselsäure, Petrolatum, Parfumöle, Fettsäure- Monoglyceride und Diglyce-ride, Pentaeiythrit-Fettsäureester, Hydroxymethylcellulose, Poly-20 vinylpyrrolidon usw. Die pharmazeutischen Zubereitungen können sterilisiert und gewünschtenfalls mit Hilfsmitteln vermischt werden, z.B. Gleitmittel, Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Netzmittel, Emulgiermittel, Salze zur Beeinflussung des osmotischen Druckes, Pufferlösungen, Farbstoffe, Geschmacks-25 und Aromastoffe und dergleichen, welche mit den aktiven Verbindungen keine schädlichen Wirkungen zeigen.

Zur parenteralen Verabreichung sind insbesondere injizierbare, sterile Lösungen zweckmässig, vorzugsweise ölige oder wässrige Lösungen, ebenso wie Suspensionen, Emulsionen oder 30 Implantate einschliesslich Suppositorien. Ampullen sind übliche Einheitsdosen.

Für die enterale Verabreichung sind insbesondere zweckmässig Tabletten, Dragees, Suppositorien oder Kapseln, welche Talg und/oder Kohlenhydratträger oder Bindemittel oder dergleichen 35 enthalten, wobei der Träger vorzugsweise Lactose und/oder Maisstärke und/oder Kartoffelstärke darstellt. Ein Sirup, Elixier oder dergleichen kann verwendet werden, falls ein süsses Vehikulum verwendet werden muss. Zusammensetzungen mit Langzeitwirkung können ebenfalls formuliert werden und umfassen solche, 40 worin die aktive Komponente mit verschieden zersetzbaren Beschichtungen versehen ist, z.B. durch Mikroverkapselung, Mehrfachbeschichtungen usw.

Im allgemeinen werden die erfindungsgemässen Verbindungen in Einheitsdosisform dispensiert, in Form eines pharmazeu-45 tisch annehmbaren Trägers, welcher die benötigte Dosierung enthält. Die Dosis der erfindungsgemässen Verbindungen beträgt im allgemeinen 5 bis 250 mg/Tag, wenn sie an Patienten verabreicht werden, z.B. Menschen mit einem Gewicht von 75 kg. Zweckmässige Dosen und Dosenpläne für einen vorgegebenen Wert können 50 unter Verwendung von üblichen Betrachtungen bestimmt werden, beispielsweise durch einen üblichen Vergleich von verschiedenen Aktivitäten der vorliegenden Verbindungen mit bekannten antibiotischen oder Antitumor-Mitteln, z.B. Mittel eines zweckmässigen konventionellen pharmakologischen Protokolls. Aus der vor-55 hergehenden Beschreibung kann der Fachmann leicht die wesentlichen Merkmale der vorliegenden Erfindung entnehmen, und ohne vom Geist und Umfang davon abzuweichen, kann er verschiedene Änderungen und Modifikationen der Erfindung vornehmen, um sie an verschiedene Zwecke und Bedingungen anzulassen.

228 189 290

140

125 181

186 175 240

129 141

116 163

156 159 170

118 129

113 141

147 153 150

118 129

100 131

136 123 130

106 106

109 100 115

G

3 Blatt Zeichnungen

Claims (19)

1. 672921

   PATENTANSPRÜCHE 1. Verbindung der Formel

   *H-OH E E i

   R-CH=CH-CH=CH-CO-NH-CH-CO-NH

   XII

   worin R CH3-(CH2)6, CH3-(CH2)4-CH= CH-(CH2)2 oder CH3-(CH2)g bedeutet.
2. 2. Verbindung gemäss Anspruch 1, worin R CH3-(CH2)6 bedeutet.
3. 3

   672 921

   worin R wie im Ansprach 1 definiert ist, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

   3. Verbindung gemäss Anspruch 1, worin R CH3-(CH2)4-CH=CH-(CH2)2 bedeutet.
4. 4. Verbindung gemäss Anspruch 1, worin R CH3-(CH2)g bedeutet.
5. 5. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel XII gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Polyangium brachysporum sp. nov. in einem Nährmedium, welches eine assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquelle enthält, unter aeroben Bedingungen kultiviert, die produzierten Mycelien abgetrennt und die Verbindung der Formel XII aus dem Nährmedium isoliert wird.
6. 6. Verfahren gemäss Anspruch 5, worin der Mikroorganismus Polyangium brachysporum sp. nov. der Stamm K481-B101 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 53080 ist.
7. 7. Verfahren gemäss Anspruch 5 oder 6, worin ein Fett oder Öl zum Nährmedium gegeben wird.
8. 8. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die abgetrennten Mycelien mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert werden und der Extrakt vor der Gewinnung der Verbindung der Formel XII mit dem Nährmedium kombiniert wird.
9. 9. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel XII durch

   Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel aus dem Nährmedium gewonnen wird.
10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch
11. 11. Der Mikroorganismus Polyangium brachysporum sp. nov. als Mittel zur Durchfuhrung des Verfahrens nach Anspruch 5.

    20
12. 12. Polyangium brachysporum-Stamm K481-B101 mit der Hinterlegungsnummer ATCC 53080 gemäss Anspruch 11 als Mittel zur Durchfuhrung des Verfahrens nach Anspruch 6.
13. 13. Mikroorganismus gemäss Anspruch 11 oder 12 in Form einer biologisch reinen Kultur.

    25
14. 14. Verbindung der Formel

    30

    VIII

    als Zwischenprodukt für die Herstellung von Verbindungen 35 gemäss Anspruch 1.
15. 15. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel VIII, gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel

    R-CH=CH—CH=CH-CO-NH—ÒH-CO-NH

    XII.

    worin R wie im Anspruch 1 definiert ist, in Gegenwart von Ficin, Papain oder Chymopapain hydrolisiert wird.

    15 gekennzeichnet, dass die Herstellung der Verbindung der Formel XII durch Verwendung von Candida albicans als Testorganismus überwacht wird.
16. 16. Verbindung der Formel

    OH H

    so als Zwischenprodukt fur die Herstellung von Verbindungen gemäss Anspruch 1.
17. 17. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel XI gemäss Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass eine Verbindung der Formel XII in Gegenwart von Pseudomonas Acylase

    55 hydrolisiert wird.
18. 18. Antifungaie Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen antifungal wirksamen Anteil mindestens einer Verbindung der Formel
19. 19. Antitumor-Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine Verbindung der Formel XII enthält, worin R die im Anspruch 1 angegebene Bedeutung besitzt, welche als Antitumor-Mittel wirksam ist, in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.